NO854834L - Fremgangsmaate og sett for paavisning av aminer. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte og

et sett for påvisning av aminer. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte og et diagnostisk sett for påvisning av nærvær av aminer og polyaminer i biologiske væsker etter at interfererende materialer er blitt fjernet. Fremgangsmåten er enkel og pålitelig og gir en hittil uoppnåelig ømfintlighetsgrad. Fremgangsmåten kan anvendes til å påvise polyaminer for alle formål, men er spesielt anvendelig for påvisning av neoplastisk sykdom og for å kontrollere tera-peutiske tiltak som utføres for å behandle en slik sykdom.

De naturlig forekommende polyaminer, d.v.s. putrescin, spermidin og spermin, og noen av deres derivater foreligger i alle plante- og dyrevev eller celler. De har hovedsaklig til-knytning til kjernematerialet,og mengdene av dem øker i celler som raskt formerer seg.

Det er velkjent at kreftvev er rikt på polyaminer og at disse forbindelser eller deres konjugerte derivater utskilles i urinen til kreftpasienter. Mengden av polyaminer (eller av deres derivater) er også høyere i blodet til kreftpasienter og i cerebrospinalvæsken til pasienter som lider av hjernesvulster.

Nyere studier har vist at polyaminer kan brukes for å fast-slå reaksjonen på antitumor-behandling. Det er også blitt foreslått at oppfølgingsmålinger kan være nyttige for å fast-slå tilbakefall eller ny forekomst av sykdommen før de kliniske symptoner blir synlige. I slike undersøkelser kan polyaminana-lyse anvendes for tidlig påvisning av kreft.

Den kvantitative påvisning av polyaminer kan også være verdifull i biologisk forskning, ved styring av vekst eller differensieringsprosesser og ved undersøkelse av aktiviteten til interferoner, antivirus, antikreft og antiparasitmidler.

Flere typer målinger har vært anvendt for å måle polyaminer. Disse innbefatter separasjonsmetoder hvori papir-, gass-eller tynnskiktkromatografiske fremgangsmåter inngår, samt elektroforese og "high performance" flytende kromatografi-teknikker (HPLC).I nyere tid er biologiske målinger hvor oksydasjonen av polyaminer med spesifikke enzymer inngår, blitt foretrukket, spesielt fordi de er raske og ikke krever kompli-sert utstyr. I disse målinger inkuberes biologisk materiale som inneholder polyaminer med et spesifikt enzym, og oksyda-sjonshastigheten kontrolleres ved å bestemme konsentrasjonen til oksydasjonsproduktene. Under oksydasjonen av polyaminene dannes aldehyder, ammoniakk og hydrogenperoksyd.

Slike tidligere kjente metoder er ineffektive, imidlertid, da de krever relativt omstendelige prosedyrer for ekstraksjonen av polyaminene fra biologisk materiale (eller fra hydrolysater av slikt materiale). Forøvrig kan interfererende substanser så som legemidler o.s.v. inhibere oksydasjonen og gi falske resultater. Videre er de fleste kjente målinger ikke særlig ømfintlige og krever bruk av relativt store mengder biologisk materiale.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en målemetode og et sett for påvisning av polyaminer som kan anvendes rutine-messig i kliniske og forskningslaboratorier. Denne metoden er ømfintlig og enkel og kan utføres med små prøvevolumer. Urin-analyse kan for eksempel utføres med 0,1 til 0,2 ml prøver.

Så lite som 10 pmol polyaminer pr. prøve kan påvises.

I tillegg til høy ømfintlighet gir fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen en enkel prosedyre for å ekstrahere polyaminer fra biologiske materialer (eller fra hydrolysater av biologiske materialer), og gjør det derved lettere å fjerne substanser som kunne interferere med målingen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et diagnostisk prøvesett for påvisning av diaminer eller polyaminer i biologiske væsker, bestående av: a) et negativt ladet element for å absorbere positivt, ladede molekyler av aminer, diaminer og polyaminer; b) en elueringsløsning for å fjerne aminer, aminosyrer og derivater derav fra elementet; c) en sterk elektrolytt for å eluere diaminer og polyaminer fra elementet; d) diamin og polyamin-oksydasjonsenzymer for å overføre aminene til aldehyder, ammoniakk og hydrogenperoksyd;

e) en substans med peroksydativ aktivitet; og

f) en substans som gjennomgår luminescens i nærvær av oksydert hydrogenperoksyd for kvantitativt å bestemme nærvær

av diaminer og/eller polyaminer som er blitt oksydert til hydrogenperoksyd.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangs-for å påvise nærvær av diaminer og polyaminer i biologiske væsker omfattende: a) kontakt av en biologisk prøve med et negativt ladet element for å absorbere positivt ladede molekyler av aminer, diaminer og polyaminer; b) fjerning av aminer, aminosyrederivater derav fra elementer ved å rense med en amineluerende løsning; c) eluering av diaminer og polyaminer fra elementer ved kontakt med en sterk elektrolytt; d) oksydering av de eluerte diaminer og polyaminer med oksyderende enzymer som overfører aminene i aldehyder, ammoniakk og I^<C>^<;>og e) påvisning av f^C^ved omsetning med en substans med peroksydativ aktivitet i nærvær av en substans som gjennomgår luminescens i nærvær av oksydert 2 ^or kvantitativt a måle diaminene og/eller polyaminene som er blitt oksydert under dannelse av hydrogenperoksyd.

Foreliggende oppfinnelse kan også brukes for å påvise konjugerte diaminer eller polyaminer ved ganske enkelt å opp-varme væsken som inneholder de konjugerte aminer i nærvær av en uorganisk syre så som HC1 for å bevirke hydrolyse av de konjugerte diaminer og for derved å frigjøre aminene for ytter-ligere behandling ifølge trinn a-e ovenfor.

Denne oppfinnelse vedrører et nytt sett og en fremgangsmåte for å bruke settet til å kvantifisere mengden av diaminer og polyaminer i biologiske fluidumprøver. Et negativt ladet element bringes i kontakt med en biologisk fluidumprøve for å binde alle kationiske materialer i prøven så som aminosyrer, aminer, diaminer og polyaminer. Deretter fjernes aminosyrene, aminene og de andre forbindelsene med en svakt positiv ladning som kunne interferere med målingen fra elementet ved eluering i en buffer med lav ionestyrke. De høyere ladede diaminer og polyaminer som blir tilbake bundet til elementet, elueres deretter selektivt med en buffer med høyere ionestyrke, og eluatet behandles med et oksyderende/peroksydpåvisende system for å kvantifisere diaminene og polyaminene som er frigjort fra elementet.

Det negativt ladede element kan bestå av karboksymetyl-cellulose eller papir belagt med polymerer som det er festet funksjonelle sulfonsyregrupper til, eller andre faste underlag med andre negativt ladede funksjonelle grupper. I en foretrukket utførelsesform anvendes fosfocellulosestaver (Lev Scientific, Tel Aviv, Israel).

Fjerning av uønskede og muligens interfererende molekyl-typer så som aminer, aminosyrer og andre forbindelser fra det negativt ladede element utføres ved eluering med en sterk elektrolytt så som natriumklorid, magnesiumklorid eller ammonium-hydroksyd med lav ionestyrke. Disse elektrolytter brukes gjerne for dette første elueringstrinnet i en konsentrasjon på ca.

o,l M. Dette trinn utføres fortrinnsvis ved romtemperatur i ca.

30 minutter.

Etter at de negativt ladede elementer er blitt vasket med elektrolytten med lav ionestyrke, kan elektrolyttkonsentra - sjonen økes trinnvis til ca. 0,15 M, som eluererer diaminer, og deretter til ca, 1,0 M som eluererer polyaminer. Ved slik trinnvis eluering kan diaminene og polyaminene kvantifiseres adskilt. Alternativt kan elektrolytt med høyere ionestyrke brukes til å eluere både diaminene og polyaminene for en total polyaminbestemmelse.

Når de er eluert, kvantifiseres både diaminene og polyaminene med et enzymsystem bestående av enten diamin eller polyaminoksydase, og en substans med peroksydativ aktivitet. Den sistnevnte substans brukes i forbindelse med en substans som luminescerer i nærævær av oksydert hydrogenperoksyd.

Selv om ingen spesiell kilde for de diamin eller polyaminoksyderende enzymer er avgjørende for oppfinnelsen, kan diamin oksydase renset fra ertespirer, svinenyre, bakterier eller sopp og polyaminoksydase fra storfeplasma eller serum, bakterier eller sopp brukes. Disse enzymer overfører diaminer eller polyaminer i aldehyder, ammoniakk og hydrogenperoksyd.

I foretrukne utførelsesformer renses diaminoksydase fra ertespirer, hovedsaklig som beskrevet av Hill (Methods in Enzymology, Volum 17B, Academic Press, New York,s. 730-735

(1971)). Polyaminoksydase renses fortrinnsvis fra storfeplasma, i det vesentlige ifølge fremgangsmåten Tabor et al.

(Methods in Enzymology, Volume 2, Academic Press, New York,

s. 390-393 (1955)).

Substansen med peroksydativ aktivitet kan være et enzym som pepperrot eller fikenlateks-peroksydase. Alternativt kan urohemin, blod eller molybdationer brukes. Det oksyderte hydrogenperoksyd som produseres av disse substanser påvises med en substans som gjennomgår luminescens i nærvær av oksydert hydrogenperoksyd så som luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-ftalazindion). Luminescensen til forbindelsen kan påvises med et instrument så som en Lumac Model 2010 Biocounter (Lumac B.V., 6370 AC Schaesberg, Nederland).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er anvendelig på både fri og konjugerte aminer og polyaminer. Generelt hydrolyseres biologiske væskeprøver så som urinprøver først med en uorganisk syre så som saltsyre, fortrinnsvis med en sluttkonsentrasjon på 1 N. Denne hydrolysen utføres fortrinnsvis i ca. 10 - 12 timer ved en temperatur fra 100 til 110°C. Hvis hydrolysetrinnet utelates, vil de målte diamin og polyaminnivåer være betydelig lavere, hvilket tyder på at en del av forbindelsene utskilles som konjugater. Disse konjugatene er sannsynligvis acetylderivater. Så snart urinprøver er blitt hydrolysert, kan de holdes ved romtemperatur i flere uker uten tap av polyaminer og diaminer.

Foreliggende oppfinnelse vil være lettere å forstå under henvisning til de følgende, ikke begrensende eksempler.

EKSEMPEL 1: RENSING AV DIAMINOKSYDASE

Enzymet ble renset fra ertespirer, hovedsaklig som beskrevet av Hill (se ovenfor) som følger:

a) Fremstilling av råekstrakt.

Ertefrø (ca. 1 kg) bløtes i rennende springvann i 18 - 24

timer og sås i renset sand i en dybde på 4 - 6 mm. Frøene spirer i mørket. Når de bleke skudd er 2 - 5 mm høye (normalt 10 dager etter såing), høstes frøbladene og skuddene (2 - 2,5 kg), vaskes fri for sand med kaldt springvann og finhakkes i en Waring Blender. Homogenisatet plasseres i et bomullsklede og saften presses ut. Den faste rest blandes med 0,1 M kaliumfosfatbuffer, pH 7,0, og væsken presses ut igjen. De flytende ekstrakter slås sammen og fryses.

b) Fraksjonering med etanol-kloroformblanding.

Volumet av råekstraktet måles (generelt 2000 - 3000 ml)

og en 2:1 (v/v) etanol:kloroformblanding (30 ml for hver 100

ml ekstrakt) avkjølt til - 10°C tilsettes over et tidsrom på

30 min. Blandingen får stå kaldt 1 time, hvoretter den inaktive felling fjernes ved sentrifugering ved 3000 x g i 2 0 minutter. Supernatantvæsken slås fra og ammoniumsulfat (40 g/100 ml supernatantvæske) tilsettes ved 10°C. Et fast stoff skilles ut og stiger til overflaten. Det nedre skiktet tappes fra, og den gjenværende slam sentrifugeres i 10 min. ved 3000 x g. Sedimentet oppslemmes i 0,02 M kaliumfosfat-buf fer, pH 7,0 (1 ml/ 2 g opprinnelig ferske ertespirer) og holdes ved 2°C natten over.

c) Utfelling med ammoniumsulfat

Suspensjonen røres 1 time ved 20°C, og fellingen fjernes

ved sentrifugering i 20 min. ved 3000 x g. Supernatantvæsken behandles med ammoniumsulfat (45 g/100 ml) og etter å ha stått 1 time ved 10°C, samles fellingen ved sentrifugering ved 3000

x g i 20 minutter. Fellingen oppslemmes i ca. 20 ml 0,2 M kaliumfosfatbuffer, pH 7,0, og dialyseres først mot kaldt rennende springvann i 3 - 4 timer og deretter igjen 3 forand-ringer (2 liter hver) av 0,005 M kaliumfosfatbuffer, pH 7,0

over et tidsrom på 36 timer ved 0 - 4°C.

d) Utfelling ved pH 5,0

Det dialyserte materiale sentrifugeres ved 3000 x g, og

det inaktive sedimentet kastes. Supernatant kjøles til 5°C, justeres til pH 5,0 ved langsom tilsetting av 0,05 N eddik-syre og får stå 1 time ved 4°C. Fellingen samles ved sentrifugering, gnis med 10 - 15 ml destillert vann og bringes til pH 7,0 ved dråpevis tilsetting av 0,05 N kaliumhydroksyd. Fellingen ved pH 5,0 gjentas to ganger, og sluttløsningen fylles opp til et passende volum (1 ml for hver 100 g ertespirer) i 0,01 M kaliumfosfatbuffer, pH 7,0. Denne løsningen frysetørkes til slutt og holdes i vakuum i mørke glass.

EKSEMPEL 2:RENSING AV POLYAMINOKSYDASE

Enzymet ble renset fra storfeplasma, hovedsaklig som beskrevet av Tabor et al. som følger:

a) Samling av plasma.

Stutblod fra et slakterhus behandles umiddelbart med 1/6

volum citratløsning (8 g sitronsyre og 26,7 g natriumcitrat pr. liter løsning). Plasmaet samles ved sentrifugering.

b) Fraksjonering med ammoniumsulfat.

Til 3.930 ml plasma settes 2.118 ml mettet ammoniumsulfat-løsning under røring. Etter kjøling til 3°C fjernes fellingen ved filtrering gjennom et foldefilter. Filtratet tilsettes 3.760 ml mettet ammoniumsulfat. Fellingen samles ved filtrering og oppløses i vann (sluttvolum 800 ml).

En andre fraksjonering utføres med dette materialet under tilsetting av de følgende volumer mettet ammoniumsulfat og oppsamling av hver felling ved filtrering: (I) 185 ml, (II) 85 ml, (III) 75 ml, (IV) 100 ml og (V) 100 ml. Hver felling tas opp i vann og undersøkes med hensyn til aktivitet. Fellingene (III) og (IV) synes å ha de høyeste spesifikke aktiviteter. De slås sammen (totalvolum ca. 214 ml) og dialyseres i 48 timer mot 3 fyllinger av 0,01 M natriumacetatbuffer (2,0 1 hver).

c) Alkoholutfelling.

Porsjoner (50 ml) av dette dialyserte materiale oppvarmes

raskt i et vannbad til 65°C under røring og holdes ved denne temperaturen i 10 min. Porsjonene avkjøles så raskt til 0°C

og slås sammen. Alle alkoholutfellinger utføres ved 0°C med etylalkohol avkjølt til -10°C eller lavere. Etter tilsetting av 28,3 ml 0,1 M MnC^ fraksjoneres 283 ml med etanol. De følg-ende alkoho lfraksjoner erholdes ved langsom tilsetting av de angitte volumer av alkohol: (I) 142 ml 25% alkohol; (II) 71 ml 25% alkohol; (III) 71 ml 25% alkohol og 14,2 ml av absolutt alkohol og (V) 57 ml av absolutt alkohol. Fellingene samles ved sentrifugering og tas opp i 30 ml kaldt vann. Fraksjonen som viser den høyeste spesifikke aktivitet (normalt fraksjon IV) underkastes så en andre alkoholfraksjonering.

Til denne fraksjonen (ca. 37,5 ml) tilsettes 3,75 ml

0,1 M MnC^- De følgende påfølgende tilsetninger av avkjølt alkohol foretas deretter: (I) 1,91 ml; (II) 1,3 ml; (III)

1,13 ml; (IV) 1,63 ml; og (V) 1,63 ml. De resulterende fel-linger samles ved sentrifugering og oppløses i 0,05 M fosfat-buf f er, pH 7,0. Fraksjoner som inneholder de høyeste spesifikke aktiviteter (fraksjon (III), (IV) og (V)) slås sammen, frysetørkes og holdes i vakuum i mørke glass.

EKSEMPEL 3: MÅLING AV TOTALE DIAMINER OG POLYAMINER

a) Hydrolyse

1 ml biologisk væske så som urin, plasseres i et prøverør

med skrulokk sammen med 100 ul konsentrert saltsyre. Skru-lokket tettes og røret oppvarmes i en termoblokk ved 100 - 110°C natten over.

b) Påsetting av prøve

Fosfocellulosestaver (10 x 30 mm) festes til en plastholder,

og 55 fil av hydrolysaten settes på hver stav. Stavene tørkes ved romtemperatur ved varm luft eller i en vakuumovn.

c) Fjerning av interfererende substanser

Natriumboratbuffer (0,02 M, PH 8,6) i 5000 ml mengder

helles i en plastsylinder som plasseres på en magnetisk rører.

Holderen som inneholder stavene med hydrolysater neddykkes i bufferen, og løsningen røres ved romtemperatur i 30 minutter. Rensingen gjentas to ganger med en annen sats av 5000 ml natriumboratbuffer.

Holderen med stavene fjernes fra bufferen og stavene blottes forsiktig ved pressing på Whatman nr. 1 filterpapir. Stavene tørkes til slutt som visti(b) ovenfor.

d) Eluering av diaminer og polyaminer

De tørre staver fjernes fra holderen og hver overføres til

et plastrør inneholdende 1,0 ml 1 N natriumklorid i 0,2 M borat-buffer, pH 8,6.

Rørene inkuberes ved 37°C under rysting i 30 min., og stavene fjernes så fra væsken og tømmes, og overskudd buffer fjernes ved å presse hver stav mot veggene på sitt prøverør ved bruk av en plaststav eller tuppen av en plastpipette.

e) Luminescens

Aliquoter på 25, 50 og 100 p. 1 av de klare eluater overføres

til plastluminescens-målerør. Volumene fylles opp til 100 ul ved tilsetning av tilsvarende volumer (tabell 1) elueringsbuffer (som id).

Luminol (10 -4M) og peroksydase (30 )ig/ml) , 100 ul hver, og

-2

250 ;il 6,2 x 10 M glycinbuf f er, pH 8,6, settes til hvert rør, og rørene holdes i mørket i minst 5 minutter inntil bakgrunns-luminescensen svinner.

For bestemmelse av diaminer (f.eks. putrescin) anvendes diaminoksydase. Enzymer renset fra ertespirer (1-2 enheter/ ml) er best, men diaminoksydase renset fra svinenyrer, bakterier, sopp eller fra andre planter kan også brukes.

Rørene overføres til avlesningsrommet av en Model 2010'Biocounter (Lumac B.V., 6370 AC Schaesberg, Nederland) eller

et lignende luminometer, og bakgrunnsverdiene registreres ved 30°C. Luminescensgraden bør være mindre enn 300.

For måling av diaminer injiseres 100 ;il diaminoksydase (1-2 enheter/ml) i hvert rør. Integrert luminescens registreres øyeblikkelig over tidsrom på 60 sekunder hver, inntil

verdiene faller til grunnavlesningene (mindre enn 600 pr.

60 sekunder).

Polyaminer måles på lignende måte, bortsett fra at polyaminoksydase injiseres. Et enzym som er renset fra storfeplasma (5-10 enheter/ml) er best, men polyaminoksydase renset fra planter, bakterier og sopp eller fra andre planter kan likeledes anvendes.

f) Standarder og interne standarder

En standardkurve for putrescin, spermidin og spermin frem-stilles ved a sette løsninger (10 -4 M eller 10 -5M) på staver og gå frem som ovenfor. Om nødvendig kan interne standarder tas med i målingen ved å tilsette kjente mengder standard polyamin-løsninger til de biologiske væsker før de settes på stavene.

g) Beregning av resultater

Luminescensavlesninger for de biologiske væsker sammenlignes med slike som er oppnådd med standarder. Grensen for påvisning er minst 10 pmol pr. måling. For urin uttrykkes resultatene som nmol/mg kreatinin. Fordi spermidin utgjør det meste av de tilstedeværende polyaminer i urin, kan spermidin-standarder brukes for beregning av urinpolyaminer.

Sammensetningen til måleblandingen er vist i tabell 1.

EKSEMPEL 4: KVANTIFISERING AV TOTALE POLYAMINER HOS KREFTPASIENTER Ved å følge fremgangsmåten fra eksempel 3 ble urinprøver fra kreftpasienter periodisk undersøkt etter påbegynnelsen av behandlingen. Det normale nivå av samlede urinpolyaminer er 25,1 - 9,7 nmol/mg kreatinin. De oppnådde resultater er vist nedenfor i tabell 2.

EKSEMPEL 5: GRADVIS ELUERING AV DIAMINER OG POLYAMINER

a) Hydrolyse og påsetting av prøve

Fremgangsmåten er hovedsaklig som beskrevet i eksempel

3 a) og b) ovenfor.

b) Fjerning av interfererende substanser

Ammonium-hydroksydløsning (0,1 M) i 2000 ml mengder helles

i en plastsylinder som plasseres på en magnetrører i en hette. Holderen som inneholder stavene med hydrolysatene neddykkes i løsningen og røres ved romtemperatur i 30 minutter. Så fjernes holderen med stavene fra løsningen og stavene tørkes, først ved romtemperatur og deretter med varmluft i en vakuumovn.

e) Eluering av diaminer

Hver tørr stav fjernes fra holderen og plasseres i et

plastprøverør inneholdende 1,0 ml 0,15 M magnesiumkloridløsning. Rørene inkuberes under rysting i 30 minutter, og stavene fjernes fra væsken og tørkes som i trinn b) ovenfor.

d) Eluering av. polyaminer

De tørre staver plasseres i et plastrør inneholdende 1,0

ml av 1,0 M magnesiumkloridløsning. Rørene inkuberes under rysting ved 30°C i 30 minutter, og stavene tas ut og tørkes.

e) Luminescens

Diaminene måles i 0,15 M magnesiumkloridløsning ved bruk

av diaminoksydase som beskrevet i avsnitt 5.3 e) ovenfor.

Enzym renset fra ertespirer er best, men også andre diamin-oksydasekilder kan anvendes.

Polyaminer måles i 1,0 M magnesiumkloridløsning ved bruk av renset polyaminoksydase. Enzymet som er renset fra storfeplasma er best, men også andre polyaminoksydasekilder kan av-vendes.

Resten av målingen utføres i det vesentlige som beskrevet

i eksempel 3.

EKSEMPEL 6: MÅLING AV FRIE POLYAMINER

For å bestemme mengdene av fri diaminer eller polyaminer, kan hydrolysetrinnet utelates. Alle biologiske væsker eller celleekstrakter kan måles, og prøvene kan konsentreres eller til og med tørkes ved bruk av en Savant Evaporator. For målingen av fri diaminer'eller polyaminer i urin kan den følgende fremgangsmåte anvendes.

Aliquoter av 200 ul urin som ikke er hydrolysert med syre, settes på staver, og stavene tørkes som beskrevet ovenfor. Eluering og luminescensmålinger utføres så som beskrevet tidligere .

EKSEMPEL 7: ALTERNATIV LUMINESCENSPROSEDYRE

Når små mengder enzym brukes eller hvis prøvene inneholder forbindelser som gjør oksydasjonen av diaminer eller polyaminer langsommere, kan en alternativ metode for oksydasjon og luminescensavlesninger benyttes.

Prøvene settes på stavene og elueres som beskrevet ovenfor, og oksydasjonen av diaminer og polyaminer utføres som følger.

Eluater som inneholder diaminer eller polyaminer (50 til 100 ul volumer) settes til 100 ul-mengder av 0,2 M Tris-HCl buffer, pH 7,6, og diaminoksydase (for måling av diaminer) eller polyaminoksydase (for måling av polyaminer) settes til væsken i plastprøverørene. Kontroller med eluater uten enzym eller enzym uten eluat og standarder kjøres parallelt, og alle prøver inkuberes ved 30°C i 60 minutter.

Rørene overføres så til målerommet av et luminometer, og de følgende løsninger injiseres i hvert rør:

Luminescensen registreres inntil grunnleggende bakgrunnsverdier oppnås, og avlesninger som oppnås med kontroller (enzym uten eluater og eluater uten enzym) trekkes fra. Sluttverdiene sammenlignes med slike som oppnås med standardløsninger.

Mange modifikasjoner og variasjoner av foreliggende oppfinnelse kan foretas uten av man går ut over dens idé og om-fang, hvilket vil være klart for en fagmann. De spesifikke utførelsesformer som her er beskrevet, er bare angitt som eksempler, og oppfinnelsen er bare begrenset av omfanget av de vedlagte krav.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte ved påvisning av nærvær av diaminer og polyaminer i biologiske væsker, karakterisert ved at man a) kontakter en biologisk væskeprøve inneholdende konjugerte og ikke-konjugerte diaminer og polyaminer med et negativt ladet element utformet for å absorbere positivt ladede molekyler av aminer, diaminer og polyaminer; b) fjerner aminer, aminosyrer og derivater derav fra elementet ved rensing med en amineluerende løsning; c) eluerer diaminer og polyaminer fra elementet ved kontakt med en sterk elektrolytt; d) oksyderer de eluerte diaminer og polyaminer med oksyderende enzymer under overføring av aminene i aldehyder, ammoniakk og I^O^ ; og e) påviser f^ C^ produsert ved oksydasjon av diaminene og polyaminene ved reaksjon med en substans med peroksydativ aktivitet i nærvær av en substans som gjennomgår luminescens i nærvær av oksydert ^ 2^ 2'

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at man videre oppvarmer den biologiske væskeprøve som inneholder de konjugerte diaminer og polyaminer i nærvær av en uorganisk syre under fri-gjøring av diaminer og polyaminer før trinn a utføres.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at man som syre anvender 1 N HC1.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at hydrolysen utføres i ca. 10 til 12 timer ved ca. 100° til 110°C.

5. Diagnostisk prøvesett for påvisning av nærvær av diaminer eller polyaminer i biologiske væsker i' fremgangsmåten ifølge krav 1-4, karakterisert ved at den omfatter: a) et negativt ladet element for å absorbere positivt ladede molekyler av aminer, diaminer og polyaminer; b) en elueringsløsning for fjerning av aminer, aminosyrer og derivater derav fra elementet; c) en sterk elektrolytt for eluering av diaminer og polyaminer fra elementet; d) diamin og polyaminoksyderende enzymer for overføring av aminene til aldehyder, ammoniakk og hydrogenperoksyd; e) en substans med peroksydativ aktivitet; og f) en substans som gjennomgår luminescens i nærvær av oksydert hydrogenperoksyd for kvantitativt å bestemme nærværet av diaminer og/eller polyaminer som er blitt oksydert til hydrogenperoksyd.

6. Diagnostisk sett ifølge krav 5, karakterisert ved at det negativt ladede element er valgt fra gruppen fosfocellulose, karboksymetyl-cellulose og papir belagt med polymerer med funksjonelle sulfonsyregrupper.

7. Diagnostisk sett ifølge krav 6, karakterisert ved at det negativt ladede element er en fosfocellulosestav.

8. Diagnostisk sett ifølge krav 5, karakterisert ved at den sterke elektrolytt er valgt fra gruppen natriumklorid, magnesiumklorid og ammon-iumhydroksyd.

9. Diagnostisk sett ifølge krav 8, karakterisert ved at den sterke elektrolytt er natriumklorid.

10. Diagnostisk sett ifølge krav 5, karakterisert ved at de diamin- og polyaminoksyderende enzymer er valgt fra gruppen diaminoksydase, renset fra ertespirer, svinenyrer, bakterier eller sopp og polyaminoksydase renset fra storfeplasma eller serum, bakterier eller sopp.

11. Diagnostisk sett ifølge krav 5, karakterisert ved at substansen med peroksydativ aktivitet er valgt fra gruppen pepperrotperoksydase, fikenlateksperoksydase, urohemin, blodjern og molybdationer.

12. Diagnostisk sett ifølge krav 11, karakterisert ved at substansen med peroksydativ aktivitet er pepperrotperoksydase.

13. Diagnostisk sett ifølge krav 5, karakterisert ved at substansen som gjennomgår luminescens er luminol.

14. Diagnostisk sett ifølge krav 1, " karakterisert ved at det videre omfatter en uorganisk syre for hydrolysen av konjugert diaminer og polyaminer .