JPH06253841A - 架橋イソシアネート官能性ポリマー担体およびその製造法 - Google Patents
架橋イソシアネート官能性ポリマー担体およびその製造法Info
- Publication number
- JPH06253841A JPH06253841A JP6016950A JP1695094A JPH06253841A JP H06253841 A JPH06253841 A JP H06253841A JP 6016950 A JP6016950 A JP 6016950A JP 1695094 A JP1695094 A JP 1695094A JP H06253841 A JPH06253841 A JP H06253841A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- carrier
- isocyanate
- enzyme
- monomer
- polymer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
- C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
- C08G18/70—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen characterised by the isocyanates or isothiocyanates used
- C08G18/72—Polyisocyanates or polyisothiocyanates
- C08G18/728—Polymerisation products of compounds having carbon-to-carbon unsaturated bonds and having isocyanate or isothiocyanate groups or groups forming isocyanate or isothiocyanate groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
- C08F20/00—Homopolymers and copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride, ester, amide, imide or nitrile thereof
- C08F20/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms, Derivatives thereof
- C08F20/10—Esters
- C08F20/34—Esters containing nitrogen, e.g. N,N-dimethylaminoethyl (meth)acrylate
- C08F20/36—Esters containing nitrogen, e.g. N,N-dimethylaminoethyl (meth)acrylate containing oxygen in addition to the carboxy oxygen, e.g. 2-N-morpholinoethyl (meth)acrylate or 2-isocyanatoethyl (meth)acrylate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
- C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
- C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
- C08G18/28—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen characterised by the compounds used containing active hydrogen
- C08G18/40—High-molecular-weight compounds
- C08G18/64—Macromolecular compounds not provided for by groups C08G18/42 - C08G18/63
- C08G18/6415—Macromolecular compounds not provided for by groups C08G18/42 - C08G18/63 having nitrogen
- C08G18/6446—Proteins and derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/093—Polyurethanes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
- Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
- Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
Abstract
(57)【要約】
【目的】 架橋されたイソシアネート官能性担体および
その製造法を提供する。 【構成】 エチレン系不飽和モノマーからラジカル重合
により誘導された架橋されたポリマー骨格上に分散した
イソシアネート基を含む不溶性ポリマー担体であって、
その製造法は、ａ）少なくとも１種類のエチレン系不飽
和イソシアネート官能性モノマーおよび少なくとも１種
類のポリエチレン系不飽和架橋用モノマー、前記のモノ
マーのためのラジカル開始剤、並びに前記のモノマーお
よび前記の開始剤のための溶媒（前記のモノマーおよび
その重合物に非反応性である）を含む混合物を共重合す
ること、および、ｂ）架橋されたイソシアネート官能性
ポリマー担体生成物を単離すること、の工程を含む。
その製造法を提供する。 【構成】 エチレン系不飽和モノマーからラジカル重合
により誘導された架橋されたポリマー骨格上に分散した
イソシアネート基を含む不溶性ポリマー担体であって、
その製造法は、ａ）少なくとも１種類のエチレン系不飽
和イソシアネート官能性モノマーおよび少なくとも１種
類のポリエチレン系不飽和架橋用モノマー、前記のモノ
マーのためのラジカル開始剤、並びに前記のモノマーお
よび前記の開始剤のための溶媒（前記のモノマーおよび
その重合物に非反応性である）を含む混合物を共重合す
ること、および、ｂ）架橋されたイソシアネート官能性
ポリマー担体生成物を単離すること、の工程を含む。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は架橋されたイソシアネー
ト官能性ポリマー担体およびその製造法に関する。もう
一つの態様において、生体高分子（特にタンパク質）
は、本発明の架橋されたイソシアネート官能性担体に共
有結合して、担体／生体高分子結合を形成する。得られ
た担体／生体高分子結合は、生体分離に、または有機合
成反応のための触媒として有用である。
ト官能性ポリマー担体およびその製造法に関する。もう
一つの態様において、生体高分子（特にタンパク質）
は、本発明の架橋されたイソシアネート官能性担体に共
有結合して、担体／生体高分子結合を形成する。得られ
た担体／生体高分子結合は、生体分離に、または有機合
成反応のための触媒として有用である。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】タン
パク質は非常に多芸な生体高分子である。酵素として知
られるある種のタンパク質は、おそらく複雑な有機合成
を行うための天然の最も効果的な触媒として機能する。
酵素は低濃度で非常に効果的に機能し、極端に穏やかな
温度およびｐＨ条件で、反応物から生成物への高い変換
を起こし、比類のない程度の特異性（影響される官能基
の点で）をもってこのように機能するので、有機化学者
により化学反応を行う触媒として研究されてきた。医薬
および薬品化学者は、酵素がしばしば可能な化合物の光
学異性体の１種類のみを合成することができることによ
り更に興味をそそられた。ここで、特定の炭素原子上の
４つの異なる置換基の簡単な空間配置は、特殊な薬理作
用を引き起こす。合成の目的での酵素への興味は、近
年、特定の酵素の高純度で、比較的大規模で、実質的に
低いコストでの製造を可能にした分子遺伝学の進歩によ
っても高まった。
パク質は非常に多芸な生体高分子である。酵素として知
られるある種のタンパク質は、おそらく複雑な有機合成
を行うための天然の最も効果的な触媒として機能する。
酵素は低濃度で非常に効果的に機能し、極端に穏やかな
温度およびｐＨ条件で、反応物から生成物への高い変換
を起こし、比類のない程度の特異性（影響される官能基
の点で）をもってこのように機能するので、有機化学者
により化学反応を行う触媒として研究されてきた。医薬
および薬品化学者は、酵素がしばしば可能な化合物の光
学異性体の１種類のみを合成することができることによ
り更に興味をそそられた。ここで、特定の炭素原子上の
４つの異なる置換基の簡単な空間配置は、特殊な薬理作
用を引き起こす。合成の目的での酵素への興味は、近
年、特定の酵素の高純度で、比較的大規模で、実質的に
低いコストでの製造を可能にした分子遺伝学の進歩によ
っても高まった。
【０００３】触媒活性を失うことなく酵素を不溶化する
ことは、触媒系を反応混合物中から簡単な濾過により容
易に取り出すことができるという非常に実際的で明らか
な利点のために、多くの研究者の目的となっていた。更
に、固定化は酵素にとって「不自然」のようであるが、
酵素はしばしば細胞器官中で水性および脂質領域の間の
界面に物理的に所在（即ち、固定化) するので、固定化
または不均質の状態は、しばしばそれらの固有の「活性
（vivo) 」な状態で起こる。
ことは、触媒系を反応混合物中から簡単な濾過により容
易に取り出すことができるという非常に実際的で明らか
な利点のために、多くの研究者の目的となっていた。更
に、固定化は酵素にとって「不自然」のようであるが、
酵素はしばしば細胞器官中で水性および脂質領域の間の
界面に物理的に所在（即ち、固定化) するので、固定化
または不均質の状態は、しばしばそれらの固有の「活性
（vivo) 」な状態で起こる。
【０００４】酵素は、従来、３つの方法、１）疎水また
はイオン力による担体への非共有結合吸着；２）ポリマ
ーマトリックス中への封じ込め；３）共有結合、により
不溶性担体上に固定化された。担体からの酵素の浸出お
よび損失は重大な問題であり、このことは吸着および封
じ込め法でしばしば起こる。浸出は、通常、系の最も高
価な成分である固定化酵素の物理的な損失を招き、遊離
酵素により生成物溶液が汚染されるために分離コストも
増加する。共有結合は、一般に酵素の浸出が最も低く、
高い酵素の安定化により触媒寿命が増加することにもな
る。共有結合法の欠点は、酵素を結合するのに必要な化
学操作が複雑であること、および、より重要には、比較
的低い触媒効率、例えば、しばしば固定化酵素は遊離酵
素に比較して１０〜１５％であることが観測されるこ
と、を含む。
はイオン力による担体への非共有結合吸着；２）ポリマ
ーマトリックス中への封じ込め；３）共有結合、により
不溶性担体上に固定化された。担体からの酵素の浸出お
よび損失は重大な問題であり、このことは吸着および封
じ込め法でしばしば起こる。浸出は、通常、系の最も高
価な成分である固定化酵素の物理的な損失を招き、遊離
酵素により生成物溶液が汚染されるために分離コストも
増加する。共有結合は、一般に酵素の浸出が最も低く、
高い酵素の安定化により触媒寿命が増加することにもな
る。共有結合法の欠点は、酵素を結合するのに必要な化
学操作が複雑であること、および、より重要には、比較
的低い触媒効率、例えば、しばしば固定化酵素は遊離酵
素に比較して１０〜１５％であることが観測されるこ
と、を含む。
【０００５】酵素の反応性担体への共有結合は、一般に
酵素の構造中のリシン残基の求核性４−アミノブチル基
と担体中に存在する電子親和基との反応を含む。幅広い
種類の電子親和基が結合のために担体上に用いられ、ア
ズラクトン、オキシラン、シアネート、スルホニルクロ
リド、カルボニルイミダゾール、イソチオシアネートお
よびイソシアネートを含む。前記の電子親和基中でイソ
シアネートは、加水分解または水溶媒との反応がリシン
残基による反応と激しい競争をしなければ、タンパク質
の結合に最も反応性があり、最も望ましい。加水分解は
結合のためのイソシアネート基を失うだけでなく、究極
的にアミン基を作り、有用な結合ｐＨでプロトン化し、
正電荷を帯びる。酵素上の負電荷による引力は、この正
電荷を帯びた担体にイオン結合により一時的な結合を引
き起こす。しかし、媒体のｐＨまたはイオン力が次いで
変化すると、イオン交換が起こり、酵素は開放され、即
ち、担体から浸出するであろう。
酵素の構造中のリシン残基の求核性４−アミノブチル基
と担体中に存在する電子親和基との反応を含む。幅広い
種類の電子親和基が結合のために担体上に用いられ、ア
ズラクトン、オキシラン、シアネート、スルホニルクロ
リド、カルボニルイミダゾール、イソチオシアネートお
よびイソシアネートを含む。前記の電子親和基中でイソ
シアネートは、加水分解または水溶媒との反応がリシン
残基による反応と激しい競争をしなければ、タンパク質
の結合に最も反応性があり、最も望ましい。加水分解は
結合のためのイソシアネート基を失うだけでなく、究極
的にアミン基を作り、有用な結合ｐＨでプロトン化し、
正電荷を帯びる。酵素上の負電荷による引力は、この正
電荷を帯びた担体にイオン結合により一時的な結合を引
き起こす。しかし、媒体のｐＨまたはイオン力が次いで
変化すると、イオン交換が起こり、酵素は開放され、即
ち、担体から浸出するであろう。
【０００６】酵素の担体への結合の実践における認めら
れている見解は、骨格担体の親油性は全体の活性および
結合酵素触媒の安定性に重要な役割を担うということで
ある。それ故、担体の親油性の制御および操作は重要で
あり、それは与えられる酵素により変化しうる。ラジカ
ル付加重合において、親水性および疎水性モノマーの性
質および相対量を変化させる簡単な操作は、特に、担体
の親油性の効果的な制御に助けになる。対照的に、ポリ
ウレタンおよびポリ尿素のような段階重合ポリマーの親
油性の制御は、特に水からの担体およびタンパク質の結
合の生成が同時に達成される場合、容易には達成できな
い。
れている見解は、骨格担体の親油性は全体の活性および
結合酵素触媒の安定性に重要な役割を担うということで
ある。それ故、担体の親油性の制御および操作は重要で
あり、それは与えられる酵素により変化しうる。ラジカ
ル付加重合において、親水性および疎水性モノマーの性
質および相対量を変化させる簡単な操作は、特に、担体
の親油性の効果的な制御に助けになる。対照的に、ポリ
ウレタンおよびポリ尿素のような段階重合ポリマーの親
油性の制御は、特に水からの担体およびタンパク質の結
合の生成が同時に達成される場合、容易には達成できな
い。
【０００７】Bozelli らは、米国特許第4,582,805 号中
で、熱可塑性の、例えば、有機溶媒に可溶な( 架橋され
ていない) 、生体材料を固定化するのに有用なイソシア
ネート基を含むビニル付加モノマーのホモ−およびコポ
リマーを開示している。
で、熱可塑性の、例えば、有機溶媒に可溶な( 架橋され
ていない) 、生体材料を固定化するのに有用なイソシア
ネート基を含むビニル付加モノマーのホモ−およびコポ
リマーを開示している。
【０００８】
【課題を解決するための手段】簡単には、本発明はラジ
カル重合によりエチレン系不飽和モノマーから誘導され
た架橋されたポリマー骨格上に分散したイソシアネート
基を含む不溶性ポリマー担体を提供する。
カル重合によりエチレン系不飽和モノマーから誘導され
た架橋されたポリマー骨格上に分散したイソシアネート
基を含む不溶性ポリマー担体を提供する。
【０００９】別の態様において、少なくとも一種類のエ
チレン系不飽和イソシアネート官能性モノマー、ポリエ
チレン系不飽和架橋用モノマーおよびラジカル開始剤の
共重合反応生成物を含む不溶性ポリマー担体をも提供す
る。このようなイソシアネート官能性ポリマー担体は、
担体上でのイソシアネート基の全体での供給性を制御す
る架橋用モノマーの存在下で、また、任意に、担体の全
体での親油性を制御する他のアクリル系モノマーの存在
下で、製造される。
チレン系不飽和イソシアネート官能性モノマー、ポリエ
チレン系不飽和架橋用モノマーおよびラジカル開始剤の
共重合反応生成物を含む不溶性ポリマー担体をも提供す
る。このようなイソシアネート官能性ポリマー担体は、
担体上でのイソシアネート基の全体での供給性を制御す
る架橋用モノマーの存在下で、また、任意に、担体の全
体での親油性を制御する他のアクリル系モノマーの存在
下で、製造される。
【００１０】更に別の態様において、本発明は、ラジカ
ル重合によりエチレン系不飽和モノマーから誘導された
架橋されたポリマー骨格上に分散したイソシアネート基
またはその加水分解生成物を含み、且つ、少なくとも１
種の生体高分子、好ましくはタンパク質が共有結合した
不溶性ポリマー担体を含む不溶性の担持触媒を提供す
る。
ル重合によりエチレン系不飽和モノマーから誘導された
架橋されたポリマー骨格上に分散したイソシアネート基
またはその加水分解生成物を含み、且つ、少なくとも１
種の生体高分子、好ましくはタンパク質が共有結合した
不溶性ポリマー担体を含む不溶性の担持触媒を提供す
る。
【００１１】更に別の態様において、本発明の担持触媒
を用いて補足反応体(complementaryreactants) の反応
を触媒する方法を開示する。補足反応体はあらゆる共反
応体(coreactants) であり、その反応は本発明の担持触
媒により触媒される。
を用いて補足反応体(complementaryreactants) の反応
を触媒する方法を開示する。補足反応体はあらゆる共反
応体(coreactants) であり、その反応は本発明の担持触
媒により触媒される。
【００１２】本発明のポリマー担体は、付随する加水分
解を殆どなしに水性溶液からタンパク質（好ましくは酵
素）を有効な共有結合をさせるための比較的高い表面積
を有する。結果として、高レベルの触媒活性を保持し、
長期間の使用のために安定である効果的に結合したタン
パク質を有する触媒が提供される。下記の反応式は、本
発明のポリマー担体および担持触媒の製造を要約する。
解を殆どなしに水性溶液からタンパク質（好ましくは酵
素）を有効な共有結合をさせるための比較的高い表面積
を有する。結果として、高レベルの触媒活性を保持し、
長期間の使用のために安定である効果的に結合したタン
パク質を有する触媒が提供される。下記の反応式は、本
発明のポリマー担体および担持触媒の製造を要約する。
【００１３】
【表１】
【００１４】本明細書において、「アルキル」は、１〜
２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖炭化水素か
ら水素原子一つを除去した後に残る一価の残基を意味
し、「親油性」は「脂質親和性」を意味し、広い含蓄お
よび当業界で用いられる語への関連性を有し、本明細書
中、「疎水性」に置き換えて用いることもでき、「疎水
性力」はタンパク質上の「親油基」の親油性担体との相
互作用を意味し、これは、同様のものは同様のものを溶
解する（相互作用する）という溶解性原理に似ている。
２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖炭化水素か
ら水素原子一つを除去した後に残る一価の残基を意味
し、「親油性」は「脂質親和性」を意味し、広い含蓄お
よび当業界で用いられる語への関連性を有し、本明細書
中、「疎水性」に置き換えて用いることもでき、「疎水
性力」はタンパク質上の「親油基」の親油性担体との相
互作用を意味し、これは、同様のものは同様のものを溶
解する（相互作用する）という溶解性原理に似ている。
【００１５】本発明において、担体の親油性の適切な定
義および制御は有効な触媒構造のために重要である。イ
ソシアネート官能性ポリマー担体（および、ここに記載
される結合手続き）は素早くタンパク質の疎水性結合に
従事し、次いで担体のイソシアネートの求核基、例え
ば、タンパク質上のアミン、ヒドロキシルおよびチオー
ルとの反応によりタンパク質の共有結合を起こす。望ま
しくない水溶媒との副反応は、本発明の担体に非常に低
い程度で起こる。直接的に製造され、高レベルの活性を
有し、反応生成物溶液中にタンパク質を遊離しないよう
な有機合成のための触媒は、このように製造される。
義および制御は有効な触媒構造のために重要である。イ
ソシアネート官能性ポリマー担体（および、ここに記載
される結合手続き）は素早くタンパク質の疎水性結合に
従事し、次いで担体のイソシアネートの求核基、例え
ば、タンパク質上のアミン、ヒドロキシルおよびチオー
ルとの反応によりタンパク質の共有結合を起こす。望ま
しくない水溶媒との副反応は、本発明の担体に非常に低
い程度で起こる。直接的に製造され、高レベルの活性を
有し、反応生成物溶液中にタンパク質を遊離しないよう
な有機合成のための触媒は、このように製造される。
【００１６】本発明は、水性溶液からタンパク質（好ま
しくは酵素）を共有結合するためにイソシアネート基が
容易に供給される不溶性イソシアネート官能性担体を提
供し、それにより不溶性触媒を提供する。この触媒は高
度の触媒活性およびタンパク質に安定な環境を提供す
る。本発明とは対照的に、上記のBozelli(米国特許第4,
582,805 号) の架橋されていないイソシアネート官能性
ポリマーおよびコポリマーは、バクテリア細胞との結合
をするように多少付着性の有機溶媒中に溶解して用いら
れるが、本発明のように酵素が結合しうる不溶性担体ほ
ど実際的な反応性はない。Bozelli らは、架橋されたイ
ソシアネート官能性担体または酵素の結合操作における
比較的高い水の濃度の使用を考慮しなかった。
しくは酵素）を共有結合するためにイソシアネート基が
容易に供給される不溶性イソシアネート官能性担体を提
供し、それにより不溶性触媒を提供する。この触媒は高
度の触媒活性およびタンパク質に安定な環境を提供す
る。本発明とは対照的に、上記のBozelli(米国特許第4,
582,805 号) の架橋されていないイソシアネート官能性
ポリマーおよびコポリマーは、バクテリア細胞との結合
をするように多少付着性の有機溶媒中に溶解して用いら
れるが、本発明のように酵素が結合しうる不溶性担体ほ
ど実際的な反応性はない。Bozelli らは、架橋されたイ
ソシアネート官能性担体または酵素の結合操作における
比較的高い水の濃度の使用を考慮しなかった。
【００１７】本発明は、イソシアネート基が比較的高レ
ベルの酵素と共有結合を行うために担体上で効果的に分
散した、架橋されたイソシアネート官能性ポリマー担体
を提供し、これにより有機反応を行うための高度に活性
な不溶性触媒を提供する。本発明の新規のポリマー担体
は、 ｉ）１〜９９（重量）部のイソシアネート官能性モノマ
ー、 ｉｉ）９９〜１部の架橋用モノマー、および、 ｉｉｉ）０〜９８部の他の共重合性モノマー、 の共重合により得られる。
ベルの酵素と共有結合を行うために担体上で効果的に分
散した、架橋されたイソシアネート官能性ポリマー担体
を提供し、これにより有機反応を行うための高度に活性
な不溶性触媒を提供する。本発明の新規のポリマー担体
は、 ｉ）１〜９９（重量）部のイソシアネート官能性モノマ
ー、 ｉｉ）９９〜１部の架橋用モノマー、および、 ｉｉｉ）０〜９８部の他の共重合性モノマー、 の共重合により得られる。
【００１８】本発明の反応性担体を合成するのに用いる
重合法は、「分散」重合および「沈殿」重合である。こ
れらの方法は、R.Arshady による J. Microencapsulati
on,1988,5 ,101〜114 により詳細に記載されており、モ
ノマーおよび開始剤の両方の溶媒として当初機能した媒
体からの生長しているポリマーの沈殿を含む。ポリエチ
レン系不飽和架橋用モノマーを用いるため、また、多く
の適切な架橋用モノマーは２より大きい重合性官能価を
有するために沈殿した粒子上で主要な生長は起こりうる
が、開始および生長は溶液中で主に起こる。分散重合の
ために有用な安定剤は、アリルアルコール、３−ヒドロ
キシプロピルアクリレート、または２−ヒドロキシエチ
ルメタクリレート（好ましい）と、アクリレート／メタ
クリレートおよび２−ビニル−４，４−ジメチルアズラ
クトンのアルキルコポリマーとの反応生成物を含む。こ
れらの材料は米国特許第4,304,705 号により詳細に記載
されており、ここに参考文献として取り入れる。他の有
用な安定剤は、ポリ（Ｎ−ビニルピロリジノン）および
ヒドロキシエチルセルロースのような親水性ポリマー並
びにコポリ（イソ−オクチルアクリレート：アクリル
酸）（９０：１）のような疎水性ポリマーを含む。安定
剤の望ましいレベルは、１〜２０重量％、好ましくは５
〜１５重量％である。安定剤の混入によりポリマー担体
の粒子サイズに特定の利点または効果は観測されていな
いが、安定化されたポリマー粒子は界面活性剤をより良
好に受入れるようであり、次いで起こるタンパク質の水
溶液からの結合の間に、より「濡れ」やすい。それ故、
分散重合が望ましい。
重合法は、「分散」重合および「沈殿」重合である。こ
れらの方法は、R.Arshady による J. Microencapsulati
on,1988,5 ,101〜114 により詳細に記載されており、モ
ノマーおよび開始剤の両方の溶媒として当初機能した媒
体からの生長しているポリマーの沈殿を含む。ポリエチ
レン系不飽和架橋用モノマーを用いるため、また、多く
の適切な架橋用モノマーは２より大きい重合性官能価を
有するために沈殿した粒子上で主要な生長は起こりうる
が、開始および生長は溶液中で主に起こる。分散重合の
ために有用な安定剤は、アリルアルコール、３−ヒドロ
キシプロピルアクリレート、または２−ヒドロキシエチ
ルメタクリレート（好ましい）と、アクリレート／メタ
クリレートおよび２−ビニル−４，４−ジメチルアズラ
クトンのアルキルコポリマーとの反応生成物を含む。こ
れらの材料は米国特許第4,304,705 号により詳細に記載
されており、ここに参考文献として取り入れる。他の有
用な安定剤は、ポリ（Ｎ−ビニルピロリジノン）および
ヒドロキシエチルセルロースのような親水性ポリマー並
びにコポリ（イソ−オクチルアクリレート：アクリル
酸）（９０：１）のような疎水性ポリマーを含む。安定
剤の望ましいレベルは、１〜２０重量％、好ましくは５
〜１５重量％である。安定剤の混入によりポリマー担体
の粒子サイズに特定の利点または効果は観測されていな
いが、安定化されたポリマー粒子は界面活性剤をより良
好に受入れるようであり、次いで起こるタンパク質の水
溶液からの結合の間に、より「濡れ」やすい。それ故、
分散重合が望ましい。
【００１９】単独または組み合わせで用いる適切なイソ
シアネート官能性モノマーは、重合性エチレン系不飽和
イソシアネート官能性モノマーであり、好ましくは２−
イソシアナトエチルメタクリレートおよび２−イソシア
ナトエチルアクリレートのようなエチレン系不飽和カル
ボン酸のイソシアナトアルキルエステル、およびメタク
リロイルイソシアネートのようなアクリロイルイソシア
ネートを含む。２−イソシアナトエチルメタクリレート
（ＩＥＭ）が好ましい。担体配合中のこれらのモノマー
の量（１００部の総モノマー重量基準で）は、１〜９９
部、好ましくは１〜２５部、より好ましくは５〜２０
部、最も好ましくは７〜１２部の範囲になりうる。非常
に高い量のイソシアネート官能性モノマーは、一般には
タンパク質の結合のためには不必要であり、加水分解／
アニオン交換の可能性が実際上増加する。
シアネート官能性モノマーは、重合性エチレン系不飽和
イソシアネート官能性モノマーであり、好ましくは２−
イソシアナトエチルメタクリレートおよび２−イソシア
ナトエチルアクリレートのようなエチレン系不飽和カル
ボン酸のイソシアナトアルキルエステル、およびメタク
リロイルイソシアネートのようなアクリロイルイソシア
ネートを含む。２−イソシアナトエチルメタクリレート
（ＩＥＭ）が好ましい。担体配合中のこれらのモノマー
の量（１００部の総モノマー重量基準で）は、１〜９９
部、好ましくは１〜２５部、より好ましくは５〜２０
部、最も好ましくは７〜１２部の範囲になりうる。非常
に高い量のイソシアネート官能性モノマーは、一般には
タンパク質の結合のためには不必要であり、加水分解／
アニオン交換の可能性が実際上増加する。
【００２０】少なくとも二つのエチレン系不飽和部分の
ために架橋を可能性にする単独または組み合わせで用い
る適切なモノマーは、好ましくは少なくとも一つのアク
リル酸およびメタクリル酸のポリエチレン系不飽和エス
テル、例えば、エチレングリコールジメタクリレート
（ＥＧＤＭＡ）、トリメチロールプロパントリメチルア
クリレート（ＴＭＰＴＭＡ）、ペンタエリトリトールテ
トラアクリレート、ペンタエリトリトールトリメタクリ
レート、ジペンタエリトリトールヒドロキシペンタアク
リレート（ＤＰＥＨＰＡ）、１，６−ヘキサンジオール
ジアクリレートおよび１，４−ブタンジオールジメチル
アクリレート；ポリエチレン系不飽和アミド、例えば、
メチレンビス（アクリルアミド）、メチレンビス（メタ
クリルアミド）、Ｎ，Ｎ’−ジメタクリロイル−１，２
−ジアミノエタンおよびビス（メタクリルアミドメチ
ル）エーテル；並びに、ポリビニルベンゼン誘導体、例
えば、１，３−および１，４−ジビニルベンゼンを含
む。ポリエチレン系不飽和エステルが好ましい。担体中
の架橋用モノマーの量は、１〜９９部の範囲にある。多
くの場合、高表面積を有する、開放された、（水または
有機溶媒中で）比較的非膨張性のフィラメント状構造で
あることが望ましく、有用な濃度は用いる架橋用モノマ
ーにより幾分変化するが、一般に全体の溶媒和構造中で
のフィラメントの非膨張性のための特定の低限界を伴っ
て３０重量部を越え、好ましくは４０重量部を越える。
ために架橋を可能性にする単独または組み合わせで用い
る適切なモノマーは、好ましくは少なくとも一つのアク
リル酸およびメタクリル酸のポリエチレン系不飽和エス
テル、例えば、エチレングリコールジメタクリレート
（ＥＧＤＭＡ）、トリメチロールプロパントリメチルア
クリレート（ＴＭＰＴＭＡ）、ペンタエリトリトールテ
トラアクリレート、ペンタエリトリトールトリメタクリ
レート、ジペンタエリトリトールヒドロキシペンタアク
リレート（ＤＰＥＨＰＡ）、１，６−ヘキサンジオール
ジアクリレートおよび１，４−ブタンジオールジメチル
アクリレート；ポリエチレン系不飽和アミド、例えば、
メチレンビス（アクリルアミド）、メチレンビス（メタ
クリルアミド）、Ｎ，Ｎ’−ジメタクリロイル−１，２
−ジアミノエタンおよびビス（メタクリルアミドメチ
ル）エーテル；並びに、ポリビニルベンゼン誘導体、例
えば、１，３−および１，４−ジビニルベンゼンを含
む。ポリエチレン系不飽和エステルが好ましい。担体中
の架橋用モノマーの量は、１〜９９部の範囲にある。多
くの場合、高表面積を有する、開放された、（水または
有機溶媒中で）比較的非膨張性のフィラメント状構造で
あることが望ましく、有用な濃度は用いる架橋用モノマ
ーにより幾分変化するが、一般に全体の溶媒和構造中で
のフィラメントの非膨張性のための特定の低限界を伴っ
て３０重量部を越え、好ましくは４０重量部を越える。
【００２１】上記の架橋用モノマーおよびイソシアネー
ト官能性モノマーと異なる他のモノマーは、本発明の担
体中に任意に含んでもよく、一般に担体の親油性を操作
するために加えられる。疎水性結合を容易にするため
の、触媒活性を増加するための、そして例えば、酵素触
媒の活性の有効寿命を増加するための担体の親油性の制
御の重要性は既に言及した。他のモノマーは、二つの一
般的なタイプ；親水性および親油性である。本発明で単
独または組み合わせで用いる適切な親水性モノマーは、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−ビニ
ルピロリジノン、２−ヒドロキシエチルメタクリレート
（ＨＥＭＡ；イソシアネート官能性モノマーと潜在的に
反応性であるが、ヘプタン中で適切な希釈での比較運転
では７０℃で２時間の後にＩＥＭとの反応は見られなか
った。）および２−アセトキシエチルメタクリレート
（ＨＥＭＡＣ）を含み、ＤＭＡおよびＨＥＭＡが好まし
い。単独または組み合わせで用いる親油性モノマーは、
ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）、イソ−ブチルメ
タクリレート（ＩＢＭＡ）、メチルメタクリレート（Ｍ
ＭＡ）、２−フェノキシエチルメタクリレート（ＰｈＯ
ＥＭ）、シクロヘキシルメタクリレート（ＣＹＭＡ）、
ラウリルメタクリレート（ＬＭＡ）を含む。
ト官能性モノマーと異なる他のモノマーは、本発明の担
体中に任意に含んでもよく、一般に担体の親油性を操作
するために加えられる。疎水性結合を容易にするため
の、触媒活性を増加するための、そして例えば、酵素触
媒の活性の有効寿命を増加するための担体の親油性の制
御の重要性は既に言及した。他のモノマーは、二つの一
般的なタイプ；親水性および親油性である。本発明で単
独または組み合わせで用いる適切な親水性モノマーは、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−ビニ
ルピロリジノン、２−ヒドロキシエチルメタクリレート
（ＨＥＭＡ；イソシアネート官能性モノマーと潜在的に
反応性であるが、ヘプタン中で適切な希釈での比較運転
では７０℃で２時間の後にＩＥＭとの反応は見られなか
った。）および２−アセトキシエチルメタクリレート
（ＨＥＭＡＣ）を含み、ＤＭＡおよびＨＥＭＡが好まし
い。単独または組み合わせで用いる親油性モノマーは、
ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）、イソ−ブチルメ
タクリレート（ＩＢＭＡ）、メチルメタクリレート（Ｍ
ＭＡ）、２−フェノキシエチルメタクリレート（ＰｈＯ
ＥＭ）、シクロヘキシルメタクリレート（ＣＹＭＡ）、
ラウリルメタクリレート（ＬＭＡ）を含む。
【００２２】一般的なラジカル開始剤が用いられてよ
く、これらは当業界で公知の、例えば、アゾビス（イソ
−ブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）、ベンゾイルペルオキ
シド、ラウリルペルオキシド、ｔ−ブチルペルオキシピ
バレートおよびアゾビス（（１−シクロヘキサンカルボ
ニトリル）を含み、０．５〜５．０重量％（総モノマー
基準で）、好ましくは１．０〜３．０重量％の濃度で用
いられる。ラジカル重合の分野の当業者に明らかなよう
に、非酸素化雰囲気は特に好ましく、それ故、系は窒素
またはアルゴンのような適切な不活性ガスにより酸素を
取り除くためにパージされる。必要な重合温度および時
間は選択された開始剤に依存し、重合が素早く開始する
ように開始剤の均一開裂が可能なように調整されるべき
である。ＡＩＢＮ（２．０重量％）では、例えば、約７
０℃の温度が、重合を促進して、高い変換率を得るため
に、例えば、粒子の沈殿の開始から約２時間で、＞９８
％のモノマーが担体ポリマーへ変換するために効果的で
ある。担体粒子は、その後濾過により単離され、下記の
非反応性有機溶媒により洗浄され、従来のように減圧下
で若干高めの温度にて乾燥させられることができる。
く、これらは当業界で公知の、例えば、アゾビス（イソ
−ブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）、ベンゾイルペルオキ
シド、ラウリルペルオキシド、ｔ−ブチルペルオキシピ
バレートおよびアゾビス（（１−シクロヘキサンカルボ
ニトリル）を含み、０．５〜５．０重量％（総モノマー
基準で）、好ましくは１．０〜３．０重量％の濃度で用
いられる。ラジカル重合の分野の当業者に明らかなよう
に、非酸素化雰囲気は特に好ましく、それ故、系は窒素
またはアルゴンのような適切な不活性ガスにより酸素を
取り除くためにパージされる。必要な重合温度および時
間は選択された開始剤に依存し、重合が素早く開始する
ように開始剤の均一開裂が可能なように調整されるべき
である。ＡＩＢＮ（２．０重量％）では、例えば、約７
０℃の温度が、重合を促進して、高い変換率を得るため
に、例えば、粒子の沈殿の開始から約２時間で、＞９８
％のモノマーが担体ポリマーへ変換するために効果的で
ある。担体粒子は、その後濾過により単離され、下記の
非反応性有機溶媒により洗浄され、従来のように減圧下
で若干高めの温度にて乾燥させられることができる。
【００２３】重合溶媒の性質は、主として最終の担体構
造の密度に関して重要である。一般に、生長するポリマ
ーのための「貧」溶媒、例えば、ヘプタンまたはヘキサ
ンでは、非常に早い生長段階で沈殿を起こし、比較的高
い表面積および低い密度を有する、より開放された担体
構造になる。一方、溶解度因子がより密接に適合する場
合、即ち、ポリマーに対してより「良」溶媒の場合、沈
殿は遅い段階で起こり、より高密度の担体が得られる。
重合溶媒の選択は、それ故、特定の用途に適合するよう
に担体の物理的構造を調整することができる。イソシア
ネート官能価が、コラムまたはピストン流系で用いられ
るような開放された構造において非常に高いレベルで効
率的に分散されることが望ましいときは、ヘプタンが溶
媒として選択されうる。別に、より高密度の構造が、攪
拌されたタンク反応器中で用いる均質触媒のために望ま
しい高度な物理強度およびより速い沈降特性を導く場
合、トルエン、テトラヒドロフランまたはエチルアセテ
ートが重合触媒のよりよい選択である。
造の密度に関して重要である。一般に、生長するポリマ
ーのための「貧」溶媒、例えば、ヘプタンまたはヘキサ
ンでは、非常に早い生長段階で沈殿を起こし、比較的高
い表面積および低い密度を有する、より開放された担体
構造になる。一方、溶解度因子がより密接に適合する場
合、即ち、ポリマーに対してより「良」溶媒の場合、沈
殿は遅い段階で起こり、より高密度の担体が得られる。
重合溶媒の選択は、それ故、特定の用途に適合するよう
に担体の物理的構造を調整することができる。イソシア
ネート官能価が、コラムまたはピストン流系で用いられ
るような開放された構造において非常に高いレベルで効
率的に分散されることが望ましいときは、ヘプタンが溶
媒として選択されうる。別に、より高密度の構造が、攪
拌されたタンク反応器中で用いる均質触媒のために望ま
しい高度な物理強度およびより速い沈降特性を導く場
合、トルエン、テトラヒドロフランまたはエチルアセテ
ートが重合触媒のよりよい選択である。
【００２４】特定の配合で用いる全てのモノマーのため
の溶媒として作用する以外に、溶媒はイソシアネート官
能基および他のモノマー並びにポリマー生成物と非反応
性であることが必要である。単独または組み合わせで用
いる有用な有機溶媒は、ヘキサン、ヘプタン、Isopar
（商標) 炭化水素溶媒（Houston,TXのExxon から入手可
能) 、トルエン、キシレン、１，２−ジクロロエタン、
テトラヒドロフラン、エチルアセテート、ブチルアセテ
ート、アミルアセテート、メチルエチルケトンおよびア
セトニトリルを含む。総モノマーの溶媒に対する重量比
は、一般に１：５〜１：１０である。高い変換率を得る
ためにはモノマーの濃度は高いほど望ましいが、特に、
比較的開放された低密度のポリマー構造に寄与する溶媒
では、重合の間に良好な混合を容易にするために少量ず
つ溶媒を加える必要があるかもしれない。攪拌は効率的
であるべきで、頭上かい形攪拌機で３００ｒｐｍの速度
が望ましい。
の溶媒として作用する以外に、溶媒はイソシアネート官
能基および他のモノマー並びにポリマー生成物と非反応
性であることが必要である。単独または組み合わせで用
いる有用な有機溶媒は、ヘキサン、ヘプタン、Isopar
（商標) 炭化水素溶媒（Houston,TXのExxon から入手可
能) 、トルエン、キシレン、１，２−ジクロロエタン、
テトラヒドロフラン、エチルアセテート、ブチルアセテ
ート、アミルアセテート、メチルエチルケトンおよびア
セトニトリルを含む。総モノマーの溶媒に対する重量比
は、一般に１：５〜１：１０である。高い変換率を得る
ためにはモノマーの濃度は高いほど望ましいが、特に、
比較的開放された低密度のポリマー構造に寄与する溶媒
では、重合の間に良好な混合を容易にするために少量ず
つ溶媒を加える必要があるかもしれない。攪拌は効率的
であるべきで、頭上かい形攪拌機で３００ｒｐｍの速度
が望ましい。
【００２５】本発明の架橋されたイソシアネート官能性
ポリマー担体（一般に、凝集塊構造）は、１０μｍより
大きく、好ましくは２０〜１０００μｍの範囲の粒子サ
イズ（最大直径）を有する。裸眼で粉末として観測され
る凝集塊構造は、クラスター状またはフィラメント状で
あり、１〜５００以上の規則的な、または不規則な形状
のビーズを含むことができる。
ポリマー担体（一般に、凝集塊構造）は、１０μｍより
大きく、好ましくは２０〜１０００μｍの範囲の粒子サ
イズ（最大直径）を有する。裸眼で粉末として観測され
る凝集塊構造は、クラスター状またはフィラメント状で
あり、１〜５００以上の規則的な、または不規則な形状
のビーズを含むことができる。
【００２６】本発明の有用なイソシアネート官能性ポリ
マー担体は、２０ｍ2 ／ｇより大きく４００ｍ2 ／ｇま
で、好ましくは５０〜３５０、最も好ましくは１００〜
３００ｍ2 ／ｇの範囲の表面積を有する。
マー担体は、２０ｍ2 ／ｇより大きく４００ｍ2 ／ｇま
で、好ましくは５０〜３５０、最も好ましくは１００〜
３００ｍ2 ／ｇの範囲の表面積を有する。
【００２７】イソシアネート官能性ポリマー担体 ＴＭＰＴＭＡ：ＩＥＭ（８０：２０）担体の製造法を次
に示す。機械攪拌機、温度計、ガスインレット、滴下漏
斗および凝縮器を備えた３リットルの３つ口丸底フラス
コに、ＴＭＰＴＭＡ（８０．０ｇ：Exton,PAのSartomer
Co., Inc.から入手可能) ＩＥＭ（２０．００ｇ：Mkidl
and, MIのDow ChemicalCo.から購入) 、１．６７ｇの安
定剤溶液［Isopar G中３３％固体であり、ＨＥＭＡと反
応したラウリルメタクリレート：２−ビニル−４，４−
ジメチルアズラクトン（９６：６ｗ／ｗ）コポリマーか
らなる］およびヘプタン（８００ｍＬ）を加えた。この
溶液を攪拌し（５００ｒｐｍ）、７０℃に加熱する前に
１０分間窒素によりスパージした。ＡＩＢＮ（２．５
ｇ：Warrington, PAのPolysciencesInc. から入手可能)
を熱い溶液に加え、数分以内に粒子が反応容器中で見
られた。重合が進むにつれて、混合を容易にするために
１００ｍＬの脱酸素ヘプタンを７回、別々に加えた。粒
子の観測から２時間後、白色のクリーム状凝集塊ポリマ
ー集合体となった反応混合物を冷却した。その固体物を
濾過して、ヘプタンにより洗浄した。それからこのポリ
マー生成物を４Ｌビーカーに入れ、１２００ｍＬのエチ
ルアセテートおよび１．０ｇのPluronic（商標) Ｌ−３
１ポリアルキレンオキシド界面活性剤（Parsippany,NJ
のBASFから入手可能) からなる溶液を加えた( ときどき
攪拌しながら行ったこの洗浄操作は、未反応モノマーを
除去し、最終的な乾燥担体で問題になる静電気を最小化
した。) 。１時間後に混合物を濾過して、ポリマーフィ
ルターケークを７０℃で乾燥窒素下で１９時間、次いで
＜１トールで３時間、恒量まで乾燥した。このポリマー
は９７．８ｇ（９７．８％収率）であり、１３４ｍ2 ／
ｇ（ＢＥＴ法）の表面積を有した。この担体の略記また
は略名を“Ｔ／２０”とする。
に示す。機械攪拌機、温度計、ガスインレット、滴下漏
斗および凝縮器を備えた３リットルの３つ口丸底フラス
コに、ＴＭＰＴＭＡ（８０．０ｇ：Exton,PAのSartomer
Co., Inc.から入手可能) ＩＥＭ（２０．００ｇ：Mkidl
and, MIのDow ChemicalCo.から購入) 、１．６７ｇの安
定剤溶液［Isopar G中３３％固体であり、ＨＥＭＡと反
応したラウリルメタクリレート：２−ビニル−４，４−
ジメチルアズラクトン（９６：６ｗ／ｗ）コポリマーか
らなる］およびヘプタン（８００ｍＬ）を加えた。この
溶液を攪拌し（５００ｒｐｍ）、７０℃に加熱する前に
１０分間窒素によりスパージした。ＡＩＢＮ（２．５
ｇ：Warrington, PAのPolysciencesInc. から入手可能)
を熱い溶液に加え、数分以内に粒子が反応容器中で見
られた。重合が進むにつれて、混合を容易にするために
１００ｍＬの脱酸素ヘプタンを７回、別々に加えた。粒
子の観測から２時間後、白色のクリーム状凝集塊ポリマ
ー集合体となった反応混合物を冷却した。その固体物を
濾過して、ヘプタンにより洗浄した。それからこのポリ
マー生成物を４Ｌビーカーに入れ、１２００ｍＬのエチ
ルアセテートおよび１．０ｇのPluronic（商標) Ｌ−３
１ポリアルキレンオキシド界面活性剤（Parsippany,NJ
のBASFから入手可能) からなる溶液を加えた( ときどき
攪拌しながら行ったこの洗浄操作は、未反応モノマーを
除去し、最終的な乾燥担体で問題になる静電気を最小化
した。) 。１時間後に混合物を濾過して、ポリマーフィ
ルターケークを７０℃で乾燥窒素下で１９時間、次いで
＜１トールで３時間、恒量まで乾燥した。このポリマー
は９７．８ｇ（９７．８％収率）であり、１３４ｍ2 ／
ｇ（ＢＥＴ法）の表面積を有した。この担体の略記また
は略名を“Ｔ／２０”とする。
【００２８】Ｔ／２０の走査型電子顕微鏡写真を図１お
よび図２に示す。裸眼では担体は微粒子粉末に見える。
拡大下では、各々の粒子はビーズのクラスターに見え、
通常、最大寸法で約１μｍである。このことは、一般に
白色または色の悪い白色（off-white)のポリマー担体の
表面積が非常に高いことを表す。
よび図２に示す。裸眼では担体は微粒子粉末に見える。
拡大下では、各々の粒子はビーズのクラスターに見え、
通常、最大寸法で約１μｍである。このことは、一般に
白色または色の悪い白色（off-white)のポリマー担体の
表面積が非常に高いことを表す。
【００２９】この方法で製造した他の担体は次のようで
ある。
ある。
【００３０】
【表２】
【００３１】タンパク質、好ましくは酵素のイソシアネ
ート官能性担体への共有結合 前記に言及したように、結合操作の目的は、本質的に全
ての酵素が最初に担体上に疎水性結合するように、水媒
体中に溶解した酵素を親油性を有する本発明の担体に負
荷することであり；共有結合は幾分低めの速度で起こ
り、室温で数時間、例えば、２〜４時間で完了すると信
じられている。理想的には、担体は共有結合を容易にす
るためにイソシアネート基の反応性を向上するという観
点からは（極性および／または局部濃度効果のために）
親水性であるべきだが、あまり親水性すぎてはならな
い。というのは、担体が非常に反応性になりすぎて加水
分解が競い、究極的に逆にイオン結合を生じて浸出する
ことになるからである。また、極端に親水性の担体は、
必要な疎水性結合段階で酵素を引きつけなくなる。反対
に、担体が親油性になりすぎると疎水結合は起こるが、
共有結合を起こさなくなるまでイソシアネートの反応性
は減少し、結果として不安定な疎水性結合した酵素は担
体から浸出するであろう。また、過度に親油性環境のた
めに、結合した酵素も活性が低く、不安定になるであろ
う。
ート官能性担体への共有結合 前記に言及したように、結合操作の目的は、本質的に全
ての酵素が最初に担体上に疎水性結合するように、水媒
体中に溶解した酵素を親油性を有する本発明の担体に負
荷することであり；共有結合は幾分低めの速度で起こ
り、室温で数時間、例えば、２〜４時間で完了すると信
じられている。理想的には、担体は共有結合を容易にす
るためにイソシアネート基の反応性を向上するという観
点からは（極性および／または局部濃度効果のために）
親水性であるべきだが、あまり親水性すぎてはならな
い。というのは、担体が非常に反応性になりすぎて加水
分解が競い、究極的に逆にイオン結合を生じて浸出する
ことになるからである。また、極端に親水性の担体は、
必要な疎水性結合段階で酵素を引きつけなくなる。反対
に、担体が親油性になりすぎると疎水結合は起こるが、
共有結合を起こさなくなるまでイソシアネートの反応性
は減少し、結果として不安定な疎水性結合した酵素は担
体から浸出するであろう。また、過度に親油性環境のた
めに、結合した酵素も活性が低く、不安定になるであろ
う。
【００３２】推薦される結合操作または手順は、共有結
合過程を良好にする上記の因子をしとめるように設計さ
れる。第一に酵素は始めに、ＰＣＴ国際公報第WO92/078
79号に開示されるような高濃度のポリアニオン緩衝塩溶
液中に溶解される。ポリアニオン塩の目的は、酵素が本
発明の有機ポリマー担体と疎水性結合するのに従事する
ように、酵素を殆ど塩析することである。有用な結合タ
ンパク質濃度は、担体の乾燥重量基準で１〜２０重量％
の範囲であり、好ましくは３〜１０重量％である。有用
なポリアニオン塩は、硫酸ナトリウムのような無機塩並
びにマロン酸、マレイン酸、酒石酸およびクエン酸のよ
うな有機酸のアルカリ金属塩を含む。好ましい有機塩は
クエン酸ナトリウムである。
合過程を良好にする上記の因子をしとめるように設計さ
れる。第一に酵素は始めに、ＰＣＴ国際公報第WO92/078
79号に開示されるような高濃度のポリアニオン緩衝塩溶
液中に溶解される。ポリアニオン塩の目的は、酵素が本
発明の有機ポリマー担体と疎水性結合するのに従事する
ように、酵素を殆ど塩析することである。有用な結合タ
ンパク質濃度は、担体の乾燥重量基準で１〜２０重量％
の範囲であり、好ましくは３〜１０重量％である。有用
なポリアニオン塩は、硫酸ナトリウムのような無機塩並
びにマロン酸、マレイン酸、酒石酸およびクエン酸のよ
うな有機酸のアルカリ金属塩を含む。好ましい有機塩は
クエン酸ナトリウムである。
【００３３】一般に周囲温度（約２０〜２５℃）にて約
２〜４時間で起こる疎水性結合および共有結合操作に続
いて、浸出を排除するための更なる予防として、全ての
非共有結合酵素は水性界面活性剤溶液の適用により担体
から洗い落とすことができる。適切な界面活性剤は、担
体から非共有結合酵素を洗い落とすことができることお
よび検定反応の性能において遊離酵素の触媒活性に影響
を与えることができないことにより決定される。本発明
において結合した酵素に用いる有用な界面活性剤は、非
イオン性ポリアルキレンオキシド材料、例えば、Triton
（商標）界面活性剤(Philadelphia,PAのRohm and Haas
Co. より入手可能) およびPluronic（商標）界面活性剤
(Parsippany,NJのBASF Corp.より入手可能) を含む。こ
れらの界面活性剤材料は、水性溶液中０．００１〜３．
０重量％、好ましくは０．１〜１．５重量％の濃度で用
いる場合に有効である。酵素／担体付加物がこれらの界
面活性剤により１〜２４時間、好ましくは３〜１６時間
処理された後に、不均質混合物は濾過され、酵素／担体
付加物は界面活性剤および未結合酵素を除去するために
水により洗浄される。最後に、製造された酵素／担体付
加物は、特定の酵素のために最良の安定性を与えるｐＨ
を与える緩衝溶液を加えることによりスラリーまたは懸
濁液として貯蔵されてもよい。スラリーは１〜５℃に冷
却され、一般にアリコート形式で反応混合物中に分配し
てもよい。別に、洗浄された酵素／担体付加物は親液化
されて、冷却貯蔵（−３０〜５℃）されて、乾燥固体と
して分配されてもよい。
２〜４時間で起こる疎水性結合および共有結合操作に続
いて、浸出を排除するための更なる予防として、全ての
非共有結合酵素は水性界面活性剤溶液の適用により担体
から洗い落とすことができる。適切な界面活性剤は、担
体から非共有結合酵素を洗い落とすことができることお
よび検定反応の性能において遊離酵素の触媒活性に影響
を与えることができないことにより決定される。本発明
において結合した酵素に用いる有用な界面活性剤は、非
イオン性ポリアルキレンオキシド材料、例えば、Triton
（商標）界面活性剤(Philadelphia,PAのRohm and Haas
Co. より入手可能) およびPluronic（商標）界面活性剤
(Parsippany,NJのBASF Corp.より入手可能) を含む。こ
れらの界面活性剤材料は、水性溶液中０．００１〜３．
０重量％、好ましくは０．１〜１．５重量％の濃度で用
いる場合に有効である。酵素／担体付加物がこれらの界
面活性剤により１〜２４時間、好ましくは３〜１６時間
処理された後に、不均質混合物は濾過され、酵素／担体
付加物は界面活性剤および未結合酵素を除去するために
水により洗浄される。最後に、製造された酵素／担体付
加物は、特定の酵素のために最良の安定性を与えるｐＨ
を与える緩衝溶液を加えることによりスラリーまたは懸
濁液として貯蔵されてもよい。スラリーは１〜５℃に冷
却され、一般にアリコート形式で反応混合物中に分配し
てもよい。別に、洗浄された酵素／担体付加物は親液化
されて、冷却貯蔵（−３０〜５℃）されて、乾燥固体と
して分配されてもよい。
【００３４】全てのイソシアネート基は結合過程に消費
されるわけではなく、特に水性スラリーとして貯蔵され
るときに続いて加水分解されうることも当業者に明らか
である。加水分解は、酵素結合が起こった後に間接的な
利点を与えうる荷電群を形成する。というのは、水分子
は荷電群に引き寄せられ、より水和した媒体を与えるこ
とができるからである。他の利点は結合した酵素の向上
した活性および向上した触媒寿命を含む。
されるわけではなく、特に水性スラリーとして貯蔵され
るときに続いて加水分解されうることも当業者に明らか
である。加水分解は、酵素結合が起こった後に間接的な
利点を与えうる荷電群を形成する。というのは、水分子
は荷電群に引き寄せられ、より水和した媒体を与えるこ
とができるからである。他の利点は結合した酵素の向上
した活性および向上した触媒寿命を含む。
【００３５】本発明の目的は、１）できるだけ多くの酵
素を共有結合すること、２）過程において高活性酵素を
維持すること、および３）有機合成反応を行うために非
浸出性触媒を提供すること、を含む。これらの目的を達
成するために、与えられた酵素に適合するように効果的
な結合手順および用いる担体の選択が幾分調整されなけ
ればならない。
素を共有結合すること、２）過程において高活性酵素を
維持すること、および３）有機合成反応を行うために非
浸出性触媒を提供すること、を含む。これらの目的を達
成するために、与えられた酵素に適合するように効果的
な結合手順および用いる担体の選択が幾分調整されなけ
ればならない。
【００３６】豚肝エスタラーゼ 豚肝エスタラーゼ（ＰＬＥ：カルボキシルエスタラー
ゼ、ＥＣ３．１．１．１）を３．２Ｍ硫酸アンモニウム
中に懸濁液として、Sigma Chemical Co.(St. Louis,MO)
から購入した。その固有の活性は２００単位／ｍｇタン
パク質であった（１単位はｐＨ８．０で２５℃におい
て、１分間に１マイクロモルのエチルブチレートを加水
分解するのに必要な量として定義される。）。結合の前
に、酵素を先ず、ｐＨ７．５に調整した０．７Ｍのクエ
ン酸ナトリウムおよび０．０５Ｍの燐酸水素二ナトリウ
ムおよび０．０５Ｍの燐酸水素ナトリウムからなる溶液
を３回変えて透析した。この操作は望ましいｐＨおよび
イオン強度を酵素に与え、アンモニウムイオンを除去し
た。この透析液を０．４５ミクロンのセルロースシリン
ジフィルターで濾過し、酵素の濃度を、２８０ｎｍで１
４．８の吸光係数（１％，１ｃｍ）を用いて分光分析的
に測定した。これは重量分析的に決定されたが、Bioche
mistry,1969,8,3879-3889 中にBarkerおよびJencksによ
り報告される１３．８に近い。
ゼ、ＥＣ３．１．１．１）を３．２Ｍ硫酸アンモニウム
中に懸濁液として、Sigma Chemical Co.(St. Louis,MO)
から購入した。その固有の活性は２００単位／ｍｇタン
パク質であった（１単位はｐＨ８．０で２５℃におい
て、１分間に１マイクロモルのエチルブチレートを加水
分解するのに必要な量として定義される。）。結合の前
に、酵素を先ず、ｐＨ７．５に調整した０．７Ｍのクエ
ン酸ナトリウムおよび０．０５Ｍの燐酸水素二ナトリウ
ムおよび０．０５Ｍの燐酸水素ナトリウムからなる溶液
を３回変えて透析した。この操作は望ましいｐＨおよび
イオン強度を酵素に与え、アンモニウムイオンを除去し
た。この透析液を０．４５ミクロンのセルロースシリン
ジフィルターで濾過し、酵素の濃度を、２８０ｎｍで１
４．８の吸光係数（１％，１ｃｍ）を用いて分光分析的
に測定した。これは重量分析的に決定されたが、Bioche
mistry,1969,8,3879-3889 中にBarkerおよびJencksによ
り報告される１３．８に近い。
【００３７】３ｍＬの石英キュベット中に２．４ｍＬの
５０ｍＭのＥＰＰＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピ
ペラジン−Ｎ’−［３−プロパンスルホン酸］；Sigma
Chemical Co.) 緩衝液（ｐＨ８．０）およびマグネティ
ックキュベット攪拌棒を入れた。このキュベットをHewl
ett Packard 8450A ダイオードアレー分光分析計用の温
度調整された攪拌キュベットホルダーに入れ、２５℃に
平衡させた。溶液中の遊離酵素には、１０〜２０マイク
ロリットルのアリコートをセルに入れて、次いで、無水
アセトニトリル中ｐ−ニトロフェニルアセテートの１．
０ｍｇ／ｍＬ溶液を８０マイクロリットル入れた。４０
０ｎｍでの吸収の直線増加速度（ｐ−ニトロフェノラー
トの生成による）（ミリ吸収単位／秒として報告）が酵
素活性の測定であった。酵素濃度は２５ミリ吸収単位／
秒より低い測定速度を保つように調整された。この検定
において、エステラーゼは典型的には１３〜１５ミリ吸
収単位／秒／μｇの固有活性を有した。固定化酵素の活
性を同様の方法で測定したが、結合酵素を含む担体の
１．０％固体スラリー２０マイクロリットルを用いた。
攪拌されたキュベット中の担体粒子による光散乱による
吸収の誤差は、実験を通して平均したが、問題にはなら
なかった。典型的には、遊離酵素および結合酵素のいず
れかを用いるこの検定は１０％以内で再現性があった。
実施例のセクションで報告されるデータは「第一濾液」
（反応性担体にさらした後に残った遊離酵素の量の測
定）、「スラリー」（上記のような固定化酵素の実活
性）および「上層液」（完全に加工された担持触媒から
共有結合酵素の浸出の兆候）の２０マイクロリットル試
料の３回の平均を含む。「第一濾液」試料は、遊離酵素
を反応性担体にさらした後の最初の濾過（焼結ガラス、
１０〜２０μｍ）から得られる濾液を試験することによ
り得られた。値は反応した酵素のｍｇ当たりのミリ吸収
単位として報告し、かっこ内の値は最初の負荷で残った
残留の未結合ＰＬＥのパーセントを意味する（第一濾液
として参照される）。「スラリー」試料は０．５ＭのＥ
ＰＰＳ中に良好に分散した担体粒子（１．０％不溶性固
体）からアリコートを取り出すことにより上記のように
得られる。「上層液」の値は０．５ＭのＥＰＰＳスラリ
ーが製造された後少なくとも２４時間後に、０．４５ミ
クロンのフィルターを用いてスラリー部分を濾過して得
られた濾液の活性を試験することにより得られる。かっ
こ内のパーセントはスラリー値に寄与する上層液の活性
レベルを示す。全ての３種の試料のために報告する値
は、検定条件下で酵素が存在しないときに観測される小
さな自然加水分解速度のバックグランドで補正する。
５０ｍＭのＥＰＰＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピ
ペラジン−Ｎ’−［３−プロパンスルホン酸］；Sigma
Chemical Co.) 緩衝液（ｐＨ８．０）およびマグネティ
ックキュベット攪拌棒を入れた。このキュベットをHewl
ett Packard 8450A ダイオードアレー分光分析計用の温
度調整された攪拌キュベットホルダーに入れ、２５℃に
平衡させた。溶液中の遊離酵素には、１０〜２０マイク
ロリットルのアリコートをセルに入れて、次いで、無水
アセトニトリル中ｐ−ニトロフェニルアセテートの１．
０ｍｇ／ｍＬ溶液を８０マイクロリットル入れた。４０
０ｎｍでの吸収の直線増加速度（ｐ−ニトロフェノラー
トの生成による）（ミリ吸収単位／秒として報告）が酵
素活性の測定であった。酵素濃度は２５ミリ吸収単位／
秒より低い測定速度を保つように調整された。この検定
において、エステラーゼは典型的には１３〜１５ミリ吸
収単位／秒／μｇの固有活性を有した。固定化酵素の活
性を同様の方法で測定したが、結合酵素を含む担体の
１．０％固体スラリー２０マイクロリットルを用いた。
攪拌されたキュベット中の担体粒子による光散乱による
吸収の誤差は、実験を通して平均したが、問題にはなら
なかった。典型的には、遊離酵素および結合酵素のいず
れかを用いるこの検定は１０％以内で再現性があった。
実施例のセクションで報告されるデータは「第一濾液」
（反応性担体にさらした後に残った遊離酵素の量の測
定）、「スラリー」（上記のような固定化酵素の実活
性）および「上層液」（完全に加工された担持触媒から
共有結合酵素の浸出の兆候）の２０マイクロリットル試
料の３回の平均を含む。「第一濾液」試料は、遊離酵素
を反応性担体にさらした後の最初の濾過（焼結ガラス、
１０〜２０μｍ）から得られる濾液を試験することによ
り得られた。値は反応した酵素のｍｇ当たりのミリ吸収
単位として報告し、かっこ内の値は最初の負荷で残った
残留の未結合ＰＬＥのパーセントを意味する（第一濾液
として参照される）。「スラリー」試料は０．５ＭのＥ
ＰＰＳ中に良好に分散した担体粒子（１．０％不溶性固
体）からアリコートを取り出すことにより上記のように
得られる。「上層液」の値は０．５ＭのＥＰＰＳスラリ
ーが製造された後少なくとも２４時間後に、０．４５ミ
クロンのフィルターを用いてスラリー部分を濾過して得
られた濾液の活性を試験することにより得られる。かっ
こ内のパーセントはスラリー値に寄与する上層液の活性
レベルを示す。全ての３種の試料のために報告する値
は、検定条件下で酵素が存在しないときに観測される小
さな自然加水分解速度のバックグランドで補正する。
【００３８】バクテリアリパーゼ リパーゼＰＳ−８００（グリセロールエステルヒドロラ
ーゼ、ＥＣ３．１．１．３）をAmano International En
zyme Co.(Troy,VA) から入手した。その記載された固有
活性は＞８００単位／ｍｇ（ここで、１単位は１分間に
トリグリセリドから１マイクロモルの脂肪酸を開放でき
る酵素の量として定義される。）である。この酵素を、
結合の研究のために燐酸緩衝塩類似物（ＰＢＳ；０．８
５％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）、０．０１Ｍ燐酸ナトリウム、
ｐＨ７．２）中に２ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁させた。
ーゼ、ＥＣ３．１．１．３）をAmano International En
zyme Co.(Troy,VA) から入手した。その記載された固有
活性は＞８００単位／ｍｇ（ここで、１単位は１分間に
トリグリセリドから１マイクロモルの脂肪酸を開放でき
る酵素の量として定義される。）である。この酵素を、
結合の研究のために燐酸緩衝塩類似物（ＰＢＳ；０．８
５％ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）、０．０１Ｍ燐酸ナトリウム、
ｐＨ７．２）中に２ｍｇ／ｍＬの濃度で懸濁させた。
【００３９】分光分析検定 リパーゼの活性の決定のための分光分析検定は、ＰＬＥ
の活性の決定で用いた検定と同一であったが、アセトニ
トリル原料溶液中のｐ−ニトロフェニルアセテートの濃
度は２０ｍｇ／ｍＬに増加した。
の活性の決定で用いた検定と同一であったが、アセトニ
トリル原料溶液中のｐ−ニトロフェニルアセテートの濃
度は２０ｍｇ／ｍＬに増加した。
【００４０】ペニシリンアシラーゼ ペニシリンアシラーゼ（ＰＧＡ；ペニシリンアミドヒド
ロラーゼ，ＥＤ３．５．１．１１）を、０．１Ｍの燐酸
ナトリウム、ｐＨ７．５中６０〜７０ｍｇ／ｍＬの典型
的なタンパク質含有率で溶液として、Pharma Biotechno
logie Hannover(Hannover,Germany)より購入した。固有
活性は１７〜２４単位／ｍｇタンパク質であり、１国際
単位は３７℃、ｐＨ７．８で１分間あたりにペニシリン
Ｇを１マイクロモルのフェニル酢酸に分解するのに必要
な酵素の量として定義され、水酸化ナトリウムと開放さ
れた酸を滴定することにより決定される。
ロラーゼ，ＥＤ３．５．１．１１）を、０．１Ｍの燐酸
ナトリウム、ｐＨ７．５中６０〜７０ｍｇ／ｍＬの典型
的なタンパク質含有率で溶液として、Pharma Biotechno
logie Hannover(Hannover,Germany)より購入した。固有
活性は１７〜２４単位／ｍｇタンパク質であり、１国際
単位は３７℃、ｐＨ７．８で１分間あたりにペニシリン
Ｇを１マイクロモルのフェニル酢酸に分解するのに必要
な酵素の量として定義され、水酸化ナトリウムと開放さ
れた酸を滴定することにより決定される。
【００４１】滴定検定 温度調整された（３７℃）マグネティック攪拌棒を含む
３０ｍＬビーカーに２０ｍＬの２．０ｗｔ％のペニシリ
ンＧ溶液（ペニシリンＧ（ナトリウム塩、St.Lous,MO
のSigma Chemical Co.) を０．０１Ｍの燐酸／０．０１
Ｍの塩化ナトリウム溶液にｐＨ７．８で溶解することに
より製造した）をピペットで加えた。それから温度計、
ｐＨ電極および自動滴定ビューレットチップを挿入し
た。得られるペニシリンＧ溶液のｐＨは０．１Ｍの水酸
化ナトリウムを加えることにより７．８に調整した。
３０ｍＬビーカーに２０ｍＬの２．０ｗｔ％のペニシリ
ンＧ溶液（ペニシリンＧ（ナトリウム塩、St.Lous,MO
のSigma Chemical Co.) を０．０１Ｍの燐酸／０．０１
Ｍの塩化ナトリウム溶液にｐＨ７．８で溶解することに
より製造した）をピペットで加えた。それから温度計、
ｐＨ電極および自動滴定ビューレットチップを挿入し
た。得られるペニシリンＧ溶液のｐＨは０．１Ｍの水酸
化ナトリウムを加えることにより７．８に調整した。
【００４２】ＰＧＡスラリーおよび濾液のアリコート
は、最大で２００μｇの酵素を送れるように調整され
た。酵素反応の進行は、開放されたフェニル酢酸と標準
水酸化ナトリウム溶液の滴定によりモニターした。ＰＧ
Ａのアリコートを直接ペニシリンＧ溶液に加え、反応速
度をMitsubishi GT 06自動滴定機および滴定液として
０．０５Ｍの水酸化ナトリウムを用いて決定した。活性
は国際単位／ｍｇ負荷酵素として表記した。
は、最大で２００μｇの酵素を送れるように調整され
た。酵素反応の進行は、開放されたフェニル酢酸と標準
水酸化ナトリウム溶液の滴定によりモニターした。ＰＧ
Ａのアリコートを直接ペニシリンＧ溶液に加え、反応速
度をMitsubishi GT 06自動滴定機および滴定液として
０．０５Ｍの水酸化ナトリウムを用いて決定した。活性
は国際単位／ｍｇ負荷酵素として表記した。
【００４３】固定化する媒体としての利用の説明におい
て、簡単化のために、ヒドロラーゼ酵素のみが補助要
因、補酵素および他の補助剤を必要としなかったので、
それのみを本発明の新規の反応性担体により処理した。
しかし、オキシドレダクターゼ、トランスファラーゼ、
リアーゼ、キナーゼ、イソメラーゼ、リガーゼおよび他
のヒドロラーゼを含む全ての主要な種類の酵素は反応性
担体およびここに開示される結合操作を用いる固定化に
扱われうることが当業者に明らかなはずである。更に、
他のタンパク質、リポタンパク質、アミノサッカリド、
細胞、抗体および抗原のような他の生体高分子も同様に
固定化することができる。
て、簡単化のために、ヒドロラーゼ酵素のみが補助要
因、補酵素および他の補助剤を必要としなかったので、
それのみを本発明の新規の反応性担体により処理した。
しかし、オキシドレダクターゼ、トランスファラーゼ、
リアーゼ、キナーゼ、イソメラーゼ、リガーゼおよび他
のヒドロラーゼを含む全ての主要な種類の酵素は反応性
担体およびここに開示される結合操作を用いる固定化に
扱われうることが当業者に明らかなはずである。更に、
他のタンパク質、リポタンパク質、アミノサッカリド、
細胞、抗体および抗原のような他の生体高分子も同様に
固定化することができる。
【００４４】本発明の目的および利点は、更に次の実施
例により例示されるが、実施例で引用される特定の材料
およびその量並びに他の条件および詳細は過度に本発明
を制限するように解釈されるべきではない。
例により例示されるが、実施例で引用される特定の材料
およびその量並びに他の条件および詳細は過度に本発明
を制限するように解釈されるべきではない。
【００４５】比較例Ａ 本比較例は効果的な量の酵素を結合するためにはイソシ
アネート基が必要であることを教示する。また、ＰＬＥ
のかなりの量の疎水性結合にもかかわらず、スラリーお
よび上層液の両方での実質的な活性の欠如は、操作にお
ける非常に効果的な洗浄操作を示す。
アネート基が必要であることを教示する。また、ＰＬＥ
のかなりの量の疎水性結合にもかかわらず、スラリーお
よび上層液の両方での実質的な活性の欠如は、操作にお
ける非常に効果的な洗浄操作を示す。
【００４６】イソシアネート基を有しない、１６８ｍ2
／ｇの表面積の「Ｔ」ホモポリマー（１００ｍｇ）を豚
肝エステラーゼ（ＰＬＥ：上記の透析操作で記載したク
エン酸／燐酸媒体中に４．０ｍｇ溶解した）、６．０ｍ
ＬのｐＨ７．５での０．７Ｍクエン酸ナトリウム／０．
１Ｍ燐酸ナトリウム溶液、および０．１５ｍＬの４％Pl
uronic（商標) Ｌ−３１ポリアルキレンオキシド界面活
性剤の水溶液、を含む溶液にさらし、２２℃で２時間振
動した。この混合液を濾過して、それから蒸留水で洗浄
（３回）した。フィルターケークを水中で１％のTriton
（商標）界面活性剤に再懸濁させ、混合物を２２℃で１
６時間振動した。この混合液を濾過して、フィルターケ
ークを水で洗浄（４回）し、１０ｍＬの０．５ＭのＥＰ
ＰＳ中で４℃で貯蔵した。上記のＰＬＥセクションで記
載したように検定反応を行うときに、「第一濾液」の値
は０．１であり、ＰＬＥの＞９９％が「Ｔ」担体上に疎
水性結合したことを示した。更なる洗浄操作の後、スラ
リーの値はわずか０．５であり、最初の結合は実質的に
全て疎水性結合であり、洗浄プロトコールは非共有結合
ＰＬＥを除去するのに非常に効率的であったことを示し
た。上層液は自然加水分解のバックグランドの０．１で
あった。
／ｇの表面積の「Ｔ」ホモポリマー（１００ｍｇ）を豚
肝エステラーゼ（ＰＬＥ：上記の透析操作で記載したク
エン酸／燐酸媒体中に４．０ｍｇ溶解した）、６．０ｍ
ＬのｐＨ７．５での０．７Ｍクエン酸ナトリウム／０．
１Ｍ燐酸ナトリウム溶液、および０．１５ｍＬの４％Pl
uronic（商標) Ｌ−３１ポリアルキレンオキシド界面活
性剤の水溶液、を含む溶液にさらし、２２℃で２時間振
動した。この混合液を濾過して、それから蒸留水で洗浄
（３回）した。フィルターケークを水中で１％のTriton
（商標）界面活性剤に再懸濁させ、混合物を２２℃で１
６時間振動した。この混合液を濾過して、フィルターケ
ークを水で洗浄（４回）し、１０ｍＬの０．５ＭのＥＰ
ＰＳ中で４℃で貯蔵した。上記のＰＬＥセクションで記
載したように検定反応を行うときに、「第一濾液」の値
は０．１であり、ＰＬＥの＞９９％が「Ｔ」担体上に疎
水性結合したことを示した。更なる洗浄操作の後、スラ
リーの値はわずか０．５であり、最初の結合は実質的に
全て疎水性結合であり、洗浄プロトコールは非共有結合
ＰＬＥを除去するのに非常に効率的であったことを示し
た。上層液は自然加水分解のバックグランドの０．１で
あった。
【００４７】
【実施例】実施例１〜１１ 比較例Ａに記載したように結合手続きをして、次の実施
例は広く本発明を説明する。担体の表面積およびイソシ
アネート基の分散の重要性は、第一濾液コラムの試験に
よって分かる。表面積が＜１００ｍ2 ／ｇであるとき
は、負荷溶液中にかなりの量のＰＬＥが残った。一方、
表Ｉにおいて低い第一濾液およびスラリーの値の両方に
より示されるように、より活性な触媒は、一般に＞１０
０ｍ2 ／ｇの表面積を有する触媒であり、特に、より親
水性ポリマー骨格を有するものである。いずれの例にお
いても、本発明の担体で浸出は特に問題にはならなかっ
た。
例は広く本発明を説明する。担体の表面積およびイソシ
アネート基の分散の重要性は、第一濾液コラムの試験に
よって分かる。表面積が＜１００ｍ2 ／ｇであるとき
は、負荷溶液中にかなりの量のＰＬＥが残った。一方、
表Ｉにおいて低い第一濾液およびスラリーの値の両方に
より示されるように、より活性な触媒は、一般に＞１０
０ｍ2 ／ｇの表面積を有する触媒であり、特に、より親
水性ポリマー骨格を有するものである。いずれの例にお
いても、本発明の担体で浸出は特に問題にはならなかっ
た。
【００４８】
【表３】
【００４９】比較例Ｂ〜Ｄ ＰＬＥの結合を実施例１〜１１に記載したのと同じ手順
を用いて比較例の担体に行った。下記の表ＩＩのデータ
は、架橋用モノマーを用いない場合には非常に低い表面
積になったことを示す。比較的高い濃度のイソシアネー
ト官能性モノマー例えば、８０重量％まで、を用いた場
合でさえ、殆どのＰＬＥは結合されずに負荷溶液中に未
結合のまま残り、劣悪な触媒になった。
を用いて比較例の担体に行った。下記の表ＩＩのデータ
は、架橋用モノマーを用いない場合には非常に低い表面
積になったことを示す。比較的高い濃度のイソシアネー
ト官能性モノマー例えば、８０重量％まで、を用いた場
合でさえ、殆どのＰＬＥは結合されずに負荷溶液中に未
結合のまま残り、劣悪な触媒になった。
【００５０】
【表４】
【００５１】実施例１２〜１５ これらの実施例は、担体上に望ましいＰＬＥローディン
グは４〜５重量％であることを示す。より高い濃度で、
ＰＬＥは反応性担体によって完全には除去されずに、浸
出が認められた。
グは４〜５重量％であることを示す。より高い濃度で、
ＰＬＥは反応性担体によって完全には除去されずに、浸
出が認められた。
【００５２】「Ｔ／２０」担体（１００ｍｇ）は、２、
４、６および８重量％のＰＬＥにより実施例１〜１１に
示した操作を用いて負荷された。データを下記の表ＩＩ
Ｉに示す。
４、６および８重量％のＰＬＥにより実施例１〜１１に
示した操作を用いて負荷された。データを下記の表ＩＩ
Ｉに示す。
【００５３】
【表５】
【００５４】実施例１６〜１９ これらの実施例は、本発明の担体中の好ましいイソシア
ネート含有率は約１０重量％である。但し、調べた５〜
２０重量％の濃度の全範囲で、許容できるようほど良好
に性能を発揮した。
ネート含有率は約１０重量％である。但し、調べた５〜
２０重量％の濃度の全範囲で、許容できるようほど良好
に性能を発揮した。
【００５５】下記の表ＩＶにおける担体は、ＩＥＭ濃度
を変化させながら、おおよそ一定の担体親油性を維持す
るように処方された。ＰＬＥの結合は実施例１〜１１に
記載したように行った。データを表ＩＶに示す。
を変化させながら、おおよそ一定の担体親油性を維持す
るように処方された。ＰＬＥの結合は実施例１〜１１に
記載したように行った。データを表ＩＶに示す。
【００５６】
【表６】
【００５７】１００ｍｇの下記の表に示すイソシアネー
ト官能性担体試料に、４．０ｍＬのＰＢＳ中に４．０ｍ
ｇのリパーゼ、４．０ｍＬのＰＢＳ、およびPluronic
（商標）L-31ポリアルキレンオキシド界面活性剤（１８
ｍｇ）からなるリパーゼ溶液２．０ｍＬを加えた。この
混合物を室温にて１８時間振動した。「第一濾液」を得
るための濾過の後に、フィルターケークを脱イオン水で
洗浄（３回）して、あらゆる未結合の酵素を除去するた
めに１％のTriton（商標）X-100 ポリアルキレンオキシ
ド界面活性剤を含む１０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させ
た。５時間振動した後にこの混合物を濾過して、フィル
ターケークを水により洗浄（４回）した。最後に、固体
を１０ｍＬの０．５ＭのＥＰＰＳ緩衝液中に再懸濁させ
て４℃で貯蔵して活性の決定を待った。データを下記の
表Ｖに示す。
ト官能性担体試料に、４．０ｍＬのＰＢＳ中に４．０ｍ
ｇのリパーゼ、４．０ｍＬのＰＢＳ、およびPluronic
（商標）L-31ポリアルキレンオキシド界面活性剤（１８
ｍｇ）からなるリパーゼ溶液２．０ｍＬを加えた。この
混合物を室温にて１８時間振動した。「第一濾液」を得
るための濾過の後に、フィルターケークを脱イオン水で
洗浄（３回）して、あらゆる未結合の酵素を除去するた
めに１％のTriton（商標）X-100 ポリアルキレンオキシ
ド界面活性剤を含む１０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させ
た。５時間振動した後にこの混合物を濾過して、フィル
ターケークを水により洗浄（４回）した。最後に、固体
を１０ｍＬの０．５ＭのＥＰＰＳ緩衝液中に再懸濁させ
て４℃で貯蔵して活性の決定を待った。データを下記の
表Ｖに示す。
【００５８】
【表７】
【００５９】実施例２２〜２３ 種々の担体へのＰＧＡの結合能力を評価するために、１
００ｍｇの担体試料を、０．３３ｗ／ｖ％のPluronic
（商標）L-31ポリアルキレンオキシド界面活性剤を含む
ｐＨ７．４の１．０Ｍクエン酸／０．１Ｍ燐酸緩衝液
０．６ｍＬ中で４重量％のＰＧＡにさらした。この混合
物を１５ｍＬのバイアル中に入れ、２２℃で２．５時間
振動した。この混合物を濾過（焼結ガラス、１０〜２０
μｍ）し（反応性担体にさらした後に残存する遊離酵素
の量を決定するために、この濾液はＰＧＡ活性の検定を
された。）、フィルターフレークをＰＢＳ（ｐＨ７．
２、１０ｍＬで２回）および水（１０ｍＬで２回）によ
り洗浄した。得られた担体を、貯蔵のためにｐＨ７．５
（１０ｍＬ）の０．０１Ｍ ＥＰＰＳ／０．０１Ｍ塩化
ナトリウム溶液で再懸濁させた。このスラリーを検定し
て、固定化ＰＧＡの活性を決定し、スラリー部分を０．
４５ミクロンのフィルターで濾過して得たスラリー上層
液を検定して、非共有結合ＰＧＡの浸出レベルを決定し
た。結果を表ＶＩに示す。
００ｍｇの担体試料を、０．３３ｗ／ｖ％のPluronic
（商標）L-31ポリアルキレンオキシド界面活性剤を含む
ｐＨ７．４の１．０Ｍクエン酸／０．１Ｍ燐酸緩衝液
０．６ｍＬ中で４重量％のＰＧＡにさらした。この混合
物を１５ｍＬのバイアル中に入れ、２２℃で２．５時間
振動した。この混合物を濾過（焼結ガラス、１０〜２０
μｍ）し（反応性担体にさらした後に残存する遊離酵素
の量を決定するために、この濾液はＰＧＡ活性の検定を
された。）、フィルターフレークをＰＢＳ（ｐＨ７．
２、１０ｍＬで２回）および水（１０ｍＬで２回）によ
り洗浄した。得られた担体を、貯蔵のためにｐＨ７．５
（１０ｍＬ）の０．０１Ｍ ＥＰＰＳ／０．０１Ｍ塩化
ナトリウム溶液で再懸濁させた。このスラリーを検定し
て、固定化ＰＧＡの活性を決定し、スラリー部分を０．
４５ミクロンのフィルターで濾過して得たスラリー上層
液を検定して、非共有結合ＰＧＡの浸出レベルを決定し
た。結果を表ＶＩに示す。
【００６０】
【表８】
【図１】本発明のポリマー担体を示す図面に代わる粒子
構造の走査型電子顕微鏡写真であって、１０３，０００
倍の拡大倍率である（実施例１中のＴ／２０）。
構造の走査型電子顕微鏡写真であって、１０３，０００
倍の拡大倍率である（実施例１中のＴ／２０）。
【図２】図１のポリマー担体を示す図面に代わる粒子構
造の走査型電子顕微鏡写真であって、５１０，０００倍
の拡大倍率である。
造の走査型電子顕微鏡写真であって、５１０，０００倍
の拡大倍率である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ルイス チャールズ ハダッド アメリカ合衆国，ミネソタ，セントポー ル，スリーエム センター（番地なし) (72)発明者 フレドリック ライト ハイデ アメリカ合衆国，ミネソタ，セントポー ル，スリーエム センター（番地なし) (72)発明者 ディーン マイケル モレン アメリカ合衆国，ミネソタ，セントポー ル，スリーエム センター（番地なし) (72)発明者 ロバート アラン プラニス アメリカ合衆国，ミネソタ，セントポー ル，スリーエム センター（番地なし)
Claims (4)
- 【請求項１】 エチレン系不飽和モノマーからラジカル
重合により誘導された架橋されたポリマー骨格上に分散
したイソシアネート基を含む不溶性ポリマー担体。 - 【請求項２】 架橋されたポリマー骨格上に分散したイ
ソシアネート基またはその加水分解生成物を含む請求項
１に記載の不溶性ポリマー担体を含む不溶性担持触媒で
あって、前記のポリマー担体がエチレン系不飽和モノマ
ーからラジカル重合により誘導され、且つ、それに共有
結合している少なくとも１種類の生体高分子を有するよ
うな触媒。 - 【請求項３】 請求項１に記載の架橋されたイソシアネ
ート官能性ポリマー担体を製造する方法であって、前記
の方法が ａ）少なくとも１種類のエチレン系不飽和イソシアネー
ト官能性モノマーおよび少なくとも１種類のポリエチレ
ン系不飽和架橋用モノマー、前記のモノマーのためのラ
ジカル開始剤、並びに前記のモノマーおよび前記の開始
剤のための溶媒（前記のモノマーおよびその重合生成物
と非反応性である）を含む混合物を共重合すること、お
よび、 ｂ）架橋されたイソシアネート官能性ポリマー担体生成
物を単離すること、の工程を含む方法。 - 【請求項４】 請求項２に記載の不溶性担持触媒を補足
反応体（complementary reactants)と反応させる工程を
含む反応を触媒する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US734493A | 1993-01-21 | 1993-01-21 | |
| US007344 | 1993-01-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06253841A true JPH06253841A (ja) | 1994-09-13 |
Family
ID=21725629
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6016950A Pending JPH06253841A (ja) | 1993-01-21 | 1994-01-18 | 架橋イソシアネート官能性ポリマー担体およびその製造法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5679779A (ja) |
| EP (1) | EP0607963B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06253841A (ja) |
| CZ (1) | CZ4294A3 (ja) |
| DE (1) | DE69412651T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002292386A (ja) * | 2001-01-26 | 2002-10-08 | Hitachi Plant Eng & Constr Co Ltd | 水中の外因性内分泌攪乱化学物質の除去方法 |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20010055762A1 (en) * | 1998-10-11 | 2001-12-27 | Osamu Suzuki | Carrier for immobilizing biologically active substance |
| US20040126900A1 (en) * | 2001-04-13 | 2004-07-01 | Barry Stephen E | High affinity peptide- containing nanoparticles |
| AT501581B1 (de) * | 2002-03-28 | 2007-07-15 | Arc Seibersdorf Res Gmbh | Verfahren zur aktivierung einer zusammensetzung umfassend vinylbenzylthiocyanat und/oder vinylbenzylselenocyanat |
| KR100516824B1 (ko) * | 2002-06-12 | 2005-09-26 | 학교법인 경희대학교 | 불포화지방산을 이용한 생체분자 고정용 고체 지지체의 제조방법, 이에 의해 제조된 고체 지지체, 및 이를 이용한 효소 고정화 방법 |
| US7157283B2 (en) * | 2002-08-02 | 2007-01-02 | 3M Innovative Properties Company | Continuous process for the production of combinatorial libraries of modified materials |
| US20040120901A1 (en) * | 2002-12-20 | 2004-06-24 | Dong Wu | Dental compositions including enzymes and methods |
| GB0229696D0 (en) * | 2002-12-20 | 2003-01-29 | Amersham Biosciences Ab | Separation medium |
| DE10261241A1 (de) * | 2002-12-20 | 2004-07-15 | 3M Espe Ag | Dentalmaterial mit bakteriostatischen und/oder bakteriziden Substanzen |
| US20040122126A1 (en) * | 2002-12-20 | 2004-06-24 | Dong Wu | Free-radical initiator systems containing enzymes, compositions, and methods |
| EP1787627A1 (en) * | 2005-11-17 | 2007-05-23 | 3M Innovative Properties Company | Anti-microbial dental impression material |
| KR20080078860A (ko) * | 2005-12-30 | 2008-08-28 | 쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니 | 기능화 기판 |
| US7653455B2 (en) * | 2006-07-28 | 2010-01-26 | 3M Innovative Properties Company | Computer-aided implanting of orthodontic anchorage devices using surgical guides |
| WO2009102386A1 (en) * | 2008-02-12 | 2009-08-20 | 3M Innovative Properties Company | Composite polymeric filtration media |
| EP2446077B1 (en) | 2009-06-23 | 2016-05-18 | 3M Innovative Properties Company | Functionalized nonwoven article |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB190552A (en) * | 1921-09-27 | 1922-12-27 | Robert Joseph Orr | Writing machines particularly adapted for writing music notation |
| US3694416A (en) * | 1970-11-30 | 1972-09-26 | Dow Chemical Co | Interpolymers of aliphatic conjugated dienes and blocked vinyl isocyanates |
| US4237229A (en) * | 1975-06-10 | 1980-12-02 | W. R. Grace & Co. | Immobilization of biological material with polyurethane polymers |
| US4582805A (en) * | 1982-05-03 | 1986-04-15 | The Dow Chemical Company | Immobilization of biological matter via copolymers of isocyanatoalkyl esters |
| JPS59135887A (ja) * | 1983-01-25 | 1984-08-04 | Konishiroku Photo Ind Co Ltd | 生理活性物質固定化用担体 |
| DE3501493A1 (de) * | 1985-01-18 | 1986-07-24 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Verfahren zur herstellung von pulverlackvernetzern |
| US5200471A (en) * | 1990-11-05 | 1993-04-06 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Biomolecules covalently immobilized with a high bound specific biological activity and method of preparing same |
-
1994
- 1994-01-07 CZ CZ9442A patent/CZ4294A3/cs unknown
- 1994-01-18 JP JP6016950A patent/JPH06253841A/ja active Pending
- 1994-01-20 EP EP94100789A patent/EP0607963B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-01-20 DE DE69412651T patent/DE69412651T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-23 US US08/447,852 patent/US5679779A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-30 US US08/453,316 patent/US5760152A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-12-23 US US08/771,889 patent/US6018009A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002292386A (ja) * | 2001-01-26 | 2002-10-08 | Hitachi Plant Eng & Constr Co Ltd | 水中の外因性内分泌攪乱化学物質の除去方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69412651T2 (de) | 1999-02-11 |
| US5679779A (en) | 1997-10-21 |
| EP0607963B1 (en) | 1998-08-26 |
| DE69412651D1 (de) | 1998-10-01 |
| EP0607963A1 (en) | 1994-07-27 |
| CZ4294A3 (en) | 1994-11-16 |
| US5760152A (en) | 1998-06-02 |
| US6018009A (en) | 2000-01-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4070348A (en) | Water-swellable, bead copolymer | |
| JPH06253841A (ja) | 架橋イソシアネート官能性ポリマー担体およびその製造法 | |
| US5914367A (en) | Polymer protein composites and methods for their preparation and use | |
| US4038140A (en) | Process for binding biologically active proteins | |
| US4737560A (en) | Polymer beads | |
| US4568706A (en) | Macroporous bead polymers, a process for their preparation and their use | |
| CA1202748A (en) | Hydrophilic polymer carrier for proteins | |
| US6291582B1 (en) | Polymer-protein composites and methods for their preparation and use | |
| JPH0412952B2 (ja) | ||
| JPH02294308A (ja) | アズラクトン官能基含有支持体及びその製造方法 | |
| Piskin et al. | Monosize microbeads based on polystyrene and their modified forms for some selected medical and biological applications | |
| CA1211597A (en) | Vinylene carbonate polymers, a process for their preparation and their use | |
| US4931476A (en) | Crosslinked polymers and a process for their preparation | |
| JPH0554379B2 (ja) | ||
| DE2366180C2 (de) | Enzymanlagerungsprodukt | |
| JP2002507242A (ja) | ポリマー性材料及びそれらの用途 | |
| US4767620A (en) | Crosslinked polymers with carbonate ester groups, and a process for their preparation | |
| JPS5948488A (ja) | 固定化補酵素及びその製造方法 | |
| JPS59232101A (ja) | 巨孔性ビ−ズ重合体およびその製造方法 | |
| JPS58116683A (ja) | 固定化菌体又は固定化酵素及びその製造法 | |
| JPS58165790A (ja) | 生理活性を有するヒドロゾル組成物 | |
| Krepski et al. | United States Patent p9 | |
| JPS5945888A (ja) | 固定化酵素の製造方法 | |
| MXPA99003366A (es) | Materiales mixtos de polimero-proteina y metodos para su preparacion y uso |