CZ4294A3

CZ4294A3 - Crosslinkable polymer carrier with isocyanate functional groups, process of its preparation, a supported catalyst based thereon and method of its use

Info

Publication number: CZ4294A3
Application number: CZ9442A
Authority: CZ
Inventors: Steven M Heilmann; Louis C Haddad; Dean M Moren; Gary J Drtina; Frederick W Hyde; Robert A Pranis
Original assignee: Minnesota Mining & Mfg
Priority date: 1993-01-21
Filing date: 1994-01-07
Publication date: 1994-11-16
Also published as: EP0607963A1; US6018009A; JPH06253841A; US5679779A; DE69412651D1; US5760152A; EP0607963B1; DE69412651T2

Description

Oblast techniky

ř*’
1	<	σ
	f—	70
	>	O
I“'	ίΛ	2	G
	-1

	O	ó	□
	1	c
		ΓΡι
	<	X
	—i	O

O to σ

o czx

Oť

Vynález se týká zesilovaného polymerního nosiče s isokyanátovými funkčními skupinami a způsobu jeho výroby. Dále se vynález týká katalyzátorů, které se skládají z konjugátů tohoto nosiče s kovalentně navázanými biomakromolekulami. Konečně se vynález také týká použití těchto konjugátů při bioseparacích a jako katalyzátorů při provádění syntetických organických reakcí.

Dosavadní stav techniky

Proteiny jsou nesmírné všestranné biomakromolekuly. Proteiny z jedné třídy, známé jako enzymy, pravděpodobně fungují jako v přírodě nej účinnější katalyzátory při provádění složitých organických syntéz. Vzhledem k tomu, že enzymy pracují tak účinně při nízkých koncentracích, přičemž způsobují vysokou konverzi reakčních složek na výsledné produkty za éxtFémněnnířnyčh^podminek^teploty^_a~pH a^činř tak s nesrovnatelným stupněm specifičnosti (pokud se týče funkčních skupin, které se na reakci podílejí), hledají organičtí chemici již dlouho možnosti, jak jich využít při provádění chemických reakcí. Lékařské a farmaceutické chemiky kromě toho láká schopnost enzymů syntetizovat často pouze jeden z možných optických isomerů sloučeniny, v těch případech, kdy pouhé prostorové uspořádání c*yř různých substituentů na určitém atomu uhlíku má za následek vznik jedinečného farmaceutického chování. Zájem o enzymy pro syntetické účely se také nedávno zvýšil tím, že došlo k pokroku v molekulární genetice, který umožňuje vyrábět určité enzymy ve vysoce čistém stavu, v poměrně velkém měřítku a za podstatné snížených nákladů.

Insolubilizace enzymů bez 2tráty katalytické účinnosti je cílem mnoha výzkumníků, poněvadž má praktickou a zřejmou výhodu v tom, že takový katalytický systém je možno snadno.z reakční směsi odstranit jednoduchou filtrací. Přestože se imobilizace může zdát pro enzymy jako nepřirozená, není tomu tak, poněvadž s imobilizovanými nebo heterogenními podmínkami se enzymy často setkávají ve svém přírodním stavu in . vivo; enzymy jsou často fyzicky umístěny (doslova imobilizovány) na fázovém rozhraní mezi vodnou a lipidovou oblastí v buněčných organellových strukturách. ........Tradiční ^..způsoby imobilizace enzymů-se- provádějí* třemi metodami: 1) nekoválentní adsorpcí na nosič, ke které dochází na základě hydrofobní nebo iontové atrakce; 2) -zachycením ' (uvězněním)* v'polymerní matrici a 3) kovalentním připojením. Vyluhování nebo ztráta enzymu z nosiče je vážným problémem, ke kterému často dochází při způsobech, které se zakládají na adsorpcí nebo. zachycování —enzymu—v—polymerní matrici; Vyluhovaní má za následek —fyzické-ztráty—-navázaného-enzymuT-který—obvykle^_tvoří^_he*j“^_ nákladnější složku celého systému a kromě toho zvyšuje náklady na separaci, poněvadž roztok produktu je znečištěn uvolněným enzymem. Při kovalentním navázání se obvykle dosáhne nej nižšího stupně vyluhování enzymu a často se také dosahuje zvýšené životnosti katalyzátoru díky zlepšené stabilizaci enzymu. Nevýhodou kovalentních postupů je složitost chemických operací, které jsou nutné pro vazbu enzymu a, což je důležitější, poměrně nízký stupeň katalytické účinnosti (například 10 až 15 %) pozorovaný u vázaných enzymů, ve srovnání s volnými enzymy.

Kovalentni připojení enzymů k reaktivním nosičům obvykle zahrnovalo reakci nukleofilních 4-aminobutylových skupin lysinových zbytků, obsažených ve struktuře enzymu, s elektrofilními skupinami, přítomnými v nosiči. Na nosičích bylo použito celé řady elektrofilních skupin pro vazbu enzymů, jako například azlaktonových, oxiranových, kyanátových, sulfonylchloridových, karbonylimidazolových, isothiokyanátových a isokyanátových skupin. Z vyjmenovaných elektrofilních skupin jsou snad nejreaktivnější isokyanátové skupiny a těmto skupinám se dává největší přednost při vazbě proteinu, za předpokladu, že hydrolýza nebo reakce s vodným rozpouštědlem vážně ňesoutěží s reakcí, na které se podílejí lysinové zbytky. Hydrolýza způsobuje nejen ztrátu isokyanátových skupin pro vazebné reakce, nýbrž vede nakonec ke se při hodnotě pH vhodné pro a nabíjejí kladným nábojem.

Přitahování záporných nábojů na enzymu může mít za následek dočasnou vazbu enzymu k těmto kladně nabitým místům nosiče prostřednictvím iontové vazby. Když se však hodnota pH nebo iontová síla média později změní, může dojít k iontovém výměně a enzym se z nosiče uvolní, tj. vyluhuje.

Obecně přijímaným názorem odborníků,.... kteří se vzniku aminoskupin, které vazebné reakce protonují zabývají vazbou enzymů na nosiče, je, že lipofilita hlavního řetězce nosiče hrají důležitou úlohu při celkové účinnosti a stabilitě katalyzátoru obsahujícího vázaný enzym. Z těchto důvodů je regulace a modifikace lipofilniho chování nosiče důležitá a pro daný enzym se může měnit. Účinnou regulaci lipofility nosiče je možno zajistit jednoduchým postupem změny druhu a relativních množství hydrofilních a hydrofobních monomerů při radikálové adiční polymerací. Naproti tomu, regulace lipofility u polyadičních polymerů, jako jsou polyuretany a polymočoviny, se nedosahuje snadno, zejména v tom případě, kdy tvorba nosiče a vazba proteinu z vody probíhají současně.

Bozelli a další v US patentu č. 4 582 805 popisují termoplastické (například v organických rozpouštědlech rozpustné, tedy nezesilované) homopolymery a kopolymery vinylových adičních monomerů, obsahujících isokyanátové skupiny, které jsou užitečné po imobilizaci biologických materiálů.

Podstata vynálezu _______________

Předmětem vynálezu je nerozpustný polymerní nosič, který obsahuje isokyanátové skupiny dispergované na zesítovaném hlavním řetězci polymeru, získaném polymeraci ethylenicky nenasycených monomerů iniciovanou volnými radikály...........

Předmětem vynálezu.je také nerozpustný polymerní nosič, který je tvořen kopolymerním reakčním produktem alespoň jednoho ethylenicky nenasyceného monomeru s íšókýáňatovoů fůhkcňi’skupinou, polyethyíenicky nenasyceného sítujicího monomeru a iniciátoru na bázi volných radikálů._

Takové polymerní nosiče s isokyanátovými funkčními skupinami se připravují za přítomnosti síťuj ících-monomerů, které reguluj“! celkovou dostupnost isokyanátových skupin na nosiči -a-popřípadě-též za^-přftomno'sťi~jiných akrylových? monomerů, které regulují celkovou lipofilitu nosiče.

Podle ještě dalšího aspektu je předmětem vynálezu nerozpustný nosičový katalyzátor obsahující nerozpustný , . polymerní nosič s isokyanátovými skupinami nebo produkty í' jejich hydrolýzy, které jsou dispergovány na zesítovaném hlavním ’ pclymerním řetězci, získaném z ethylenicky nenasycených monomerů radikálovou polymeraci, přičemž k tomuto polymernímu nosiči je kovalentné vázána alespoň jedna biomakromolekula, přednostně protein.

Podle dalšího aspektu je předmětem vynálezu také způsob katalýzy reakce komplementárních reakčních složek za použití nosičového katalyzátoru podle tohoto vynálezu. Komplementárními reakčními činidly mohou být jakákoliv vzájemně reagující reakční činidla, jejichž reakce je katalyzována nosičovými katalyzátory podle vynálezu.

Polymerní nosiče podle tohoto vynálezu mají poměrně vysokou povrchovou plochu pro účinnou kovalentní vazbu proteinů, kterými jsou přednostně enzymy, z vodných roztoků, která je doprovázena jen malým rozsahem současné hydrolýzy. Díky tomu se získají nerozpustné katalyzátory s účinně vázanými proteiny, které si zachovávají vysokou úroveň katalytické účinnosti a mají vysokou stabilitu umožňující dlouhodobé použití. Výrobu polymerního nosiče a nosičového katalyzátoru podle vynálezu souhrnně ilustrují reakční rovnice, které jsou uvedeny dále. 3 .« .Λ c n i ... ř_Q.y...n i ethylenicky nenasycený isokyanátový funkční monomer

R-N=C=O polyfunkční nenasycený síťující monomer popřípadě jakýkoliv hydrofilní nebo lipofilní monomer rozpouštědlo radikálový iniciátor;

popřípadě stabilizátor ,* zesítovaný

------------------polymerní--nos-i-č-------------------s isokyanátovými funkčními skupinami



	protein vs voGnejn prostředí

♦ nerozpustný nosičovy katalyzátor (konjugát polymerního nosiče a proteinu představuje organickou skupinu obsahující ethylenicky nenasycenou va2bu ________Následuje__definice některých pojmů, kterých se používá v tomto popisu.

Pod pojmem alkylskupina se rozumí jednomocný zbytek odvozený odštěpením atomu vodíku od lineárního nebo rozvětveného uhlovodíku s 1 až 20 atomy uhlíku.

Pod pojmem lipofilní látka se rozumí látka, která má afinitu k lipidům. Tento termín má četné konnotace a vztahy k termínům používaným v tomto oboru a v tomto popisu se ho může používat zaměnitelně s pojmem hydrofobní··.

Pod pojmem hydrofobní atrakce se rozumí, že lipofilní skupiny na proteinu interagují s lipofilním nosičem; jedná se o stejný princip, jaký se uplatňuje u rozpustnosti, kdy podobný rozpouští podobný (interaguje s podobným).

Pro vytvoření účinného katalyzátoru podle vynálezu je .nutno řádně definovat a regulovat fipofilitu nosiče. Polymerní nosiče s isokyanátovými funkčními skupinami (viz vazebné protokoly uvedené v tomto popisu) se rychle podílejí na- hydrofobní vazbě proteinů a posléze u nich dochází ke kovalentnímu připojení proteinu reakcí isokyanátových skupin nosiče s nukleófilními skupinami, například aminovými, hydroxylovými a thiolovými skupinami proteinu. Neproduktivní vedlejší reakce s vodným rozpouštědlem probíhá v případě nosičů podle vynálezu v podstatně menším rozsahu. Způsobem podle vynálezu je tedy možno přímo vyrobit katalyzátory pro organické syntézy, které vykazují vysokou úroveň účinnosti a neuvolňuji protein do roztoků, v nichž jsou obsaženy reakční produkty.

Předmětem vynálezu je nerozpustný nosič s isokyanátovými funkčními skupinami, v němž jsou isokyanátové skupiny snadno dostupné pro kovalentní vazbu proteinů, kterými jsou přednostně enzymy, z vodného roztoku, za vzniku nerozpustného katalyzátoru. Takový katalyzátor obsahuje účinně imobilizovaný enzym, který vykazuje vysoký stupeň katalytické účinnosti a stabilní prostředí pro protein.

Narozdíl od tohoto - vynálezu se výše uvedených nezesítovaných ^polymerů a kopolymerů s isokyanátovými funkčními skupinami [Bozelli a další v US patentu č. 4 582 805] používá rozpuštěných v organickém rozpouštědle, víceméně jako adhesiva pro vzájemné spojení bakteriálních buněk a nikoliv jako skutečné reaktivního nerozpustného nosiče, na který lze navázat enzymy, jako je tomu' v případě ' tohoto ¹ vynálezu. Bozelli a další nepředpokládají používání zesítovaných nosičů s isokyanáto vými funkčními skupinami an-i-poměrně vysokých koncentrací vody při navazování enzymu.

' ~Přehled~ obrna výkrese ..... ^- .....— - - Na obr. 1 je uvedena elektronová mikrografie (SEM) polymerního nosiče podle tohoto vynálezu ve 103tisícnásobném zvětšení (tento nosič je označen v příkladu 1 :— -——zneěkou-T/-2.oj—’----------- ~ ~

Na obr. 2 je uvedena elektronová mikrografie (SEM) polymerního nosiče z cbr. 1 ve SlOtisíc-násobném zvětšení.

Následuje podrobný popis vynálezu.

Uvedenu vyŠé ie prearoecem vynalezu zesítovaný skupinami, polymerní nosič s isokyanátovými funkčními v němž jsou isokyanátové skupiny účinné dispergovány na nosiči, za účelem kovalentní vazby poměrné velkých množství enzymů, při které vznikají vysoce účinné nerozpustné katalyzátory pro provádění organických reakcí. Nové polymerní nosiče podle tohoto vynálezu se získávají kopolymerací následujících monomerů:

i) 1 až 99 dílů hmotnostních monomerů s isokyanátovými funkčními skupinami;

ii) 99 až 1 dílu hmotnostního síťujících monomerů a iii) 0 až 98 dílů hmotnostních jiných kopolymerovatelných monomerů.

Při syntéze reaktivních nosičů podle tohoto vynálezu se používá polymeračních postupů, které bývají označovány názvem disperzní a srážecí polymerace. Tyto postupy, které jsou plně popsány v publikaci R. Arshady, J*. Microencapsulation, 1988, 5, 101 až 114, zahrnují srážení rostoucích polymerů z médií, která původně sloužila jako rozpouštědlo jak pro monomery, tak pro iniciátor. Iniciace a propagace probíhají hlavně v roztoku, přestože počáteční propagace může probíhat na vysrážených částicích, poněvadž se používá polyethylenicky nenasycených síťujících monomerů a mnohé vhodné síťující monomery obsahují více než 2 polymerovatelné funkční skupiny. Jako vhodné stabilizátory pro polymerace v disperzi je možno uvést reakční produkty allylalkoholu, 3-hydroxypropylakrylátu nebo 2-hydroxyethylmethakrylátu (této látce se dává přednost) a kopolymery alkylakrylátů a/nebo alkylmethakrylátů a 2-vinyl-4,4-dimethylazlaktonu; tyto látky jsou podrobněji popsány v US patentu č. 4 304 705, který je zde citován náhradou za přenesení celého jeho obsahu do popisu tohoto vynálezu. Z jiných užitečných stabilizátorů je možno uvést hydrofilní polymery, jako poly-(N-vinylpyrrolidon) a hydroxyethylcelulózu a hydrofobní polymery, jako je kopolymer isooktylakry» látu s kyselinou akrylovou v poměru 90 : 10. Vhodná

- ±u koncentrace^-’stabilizátoru leží v ' rozmezí od I ~ d o^_ ~2 0 ’, přednostně 5 až 15 % hmotnostních. Přestože nebyl pozorován žádný zvláštní přínos nebo účinek stabilizátorů na velikost částic polymerního nosiče, zdá se, že stabilizované polymerní. částice lépe přijímají povrchové aktivní látky a snadněji se smáčí v průběhu následující vazby proteinu z vodného roztoku. Proto se dává přednost disperzní polymeraci.

Jako vhodné monomery s isokyanátovými funkčními skupinami, kterých se_ může používat jednotlivě nebo v kombinacích, je možno uvést polymerovatelné ethylenicky nenasycené monomery s isokyanátovými funkčními skupinami, které přednostně zahrnují isokyanatoalkylestery ethylenicky nenasycených karboxylových kyselin, jako je 2-isokyanatoethylmethakrylát a 2-isokyanatoethylakrylát; a akryloylisokyanáty, jako je methakryloylisokyanát. Přednost se dává 2-isokyanatoethylmethakrýláťu (IEM). Množství těchto —monomerů -(-v-z ta ž ené - na -100- ďí lů-hmotnos tni ch vš ech-monome r ů) v monomerní směsi pro výrobu nosiče může ležet v rozmezí od ΓΊΙο^-9’9~d’íTů“hmotnostních, přednostně oď 1 do 25, ještě .lépe

5~~do 20 a nej výhodně jiod 7do 12 dilů“ hmotnostní ch.7^-

-Vysoký-obsah—monomeru-s—isokyanátovými—funkčními^-skupinami _není_obvykle—pro—vazbu-proteinu—nutný-ave—skutečnosti-se při jeho použití zvyšuje pravděpodobnost hydrolýzy a iontové výměny.

Jako vhodné síťující monomery (kterých se používá jednotlivě nebo v kombinacích), jejichž síťující schopnost je dána obsahem přinejmenším dvou ethylenicky nenasycených skupin, je možno uvést polyethylenic-ky nenasycené estery, které jsou odvozeny od kyseliny akrylové nebo kyseliny methakrylové, jako je ethylenglykoldimethakrylát (EGDMA), trimethylolpropantrimethakrylát (TMPTMA), pentaerythritoltetraakrylát, pentaerythritoltrimethakrylát, dipentaerythri11 tolhydroxypentaakrylát {DPEHPA), 1,6-hexandioldiakrylát a ^_Íf4^_-bútáhdYoldimethakrýlát; “'polyethyíěnícký Nenasyceně amidy, jako je methylenbis(akrylamid), methylenbis(methakrylamid), N,N'-dimethakryloyl-l,2-diaminoethan a bis(methakrylamidomethyl)ether; a deriváty polyvinylbenzenu, jako je 1,3- a 1,4-divinylbenzen. Přednost se dává polyethylenicky nenasyceným esterům. Obsah síťujících monomerů v nosiči leží v rozmezí od 1 do 99 dílů. V mnoha případech se požaduje získání otevřené, poměrné nebotnavé (ve vodě nebo organických rozpouštědlech) vláknité struktury s vysokou povrchovou plochou; v tomto případě je užitečná koncentrace síťujícího monomeru obvykle vyšší než 30 % hmotnostních, přednostně vyšší než 40 % hmotnostních, přičemž specifická dolní hranice koncentrace síťujícího monomeru, která zajišťuje, aby vlákna v úplně solvatované struktuře nebotnala, se poněkud mění, v závislosti na druhu použitého síťujícího monomeru. **”

Do monomerní směsi pro výrobu nosiče podle vynálezu se popřípadě mohou přidávat i jiné přídavné monomery, které nespadají ani do souboru síťujících monomerů ani do souboru monomerů s isokyanátovými* funkčními skupinami, které j sou popsány výše. Tyto monomery se obvykle přidávají za účelem “modifikace ripofilTty nosicěT“Důležitost regulace ripofiriťý“ nosiče pro usnadnění hydrofobní vazby, zvýšení katalytické *· řřif například enzymových Přídavné monomery jsou monomery a lipofilní účinnosti a zvýšení životnosti, katalyzátorů, již byla zmíněna výše dvou základních typů: hydrofilní monomery. Jako vhodné hydrofilní monomery, kterých lze používat jednotlivé nebo v kombinacích při způsobu podle vynálezu, je možno uvést Ν,Ν-dimethylakrylamid (DMA), N-vinylpyrrolidon, 2-hydroxyethylmethakrylát (HEMA; tato látka je sice potenciálně reaktivní s monomery obsahujícími isokyanátové funkční skupiny, srovnávací zkoušky při vhodném zředění v heptanu však ukazují*, že nedochází k žádné reakci s 2-isokyanatoethylmethakrylátem (IEM) po dvou hodinách při 70 °C) a 2-acetoxyethylmethakrylát (HEMAC). N,N-dimethy1akrylamidu a 2-hydroxyethylmethakrylátu se dává přednost.

Jako lipofilní monomery, kterých se používá jednotlivě nebo v kombinaci, je možno uvést n-butyImethakrylát (BMA), isobutylmethakrylát (IBMA), methylmethakrylát (MMA), 2-fenoxyethýlmethákrylát (PhOEM), cyklohexy Imethakrylát (CYMA) a —laurylmethakrylát -(-LMA)-.......—........... ...... - - --- —

Muže se používat obvyklých radikálových.iniciátorů (iniciátorů, které se rozpadají na volné radikály), které zahrnují iniciátory známé v tomto oboru, jako je azobis(isobutyronitril) (AIBN), benzoylperoxid, laurylperoxid., terč. butyIperoxopivalát a azobis (1-cyklohexankarbonitril) v koncentracích od 0,5 do 5,0 % hmotnostního (vztaženo na ^všechny monomery), přednostně ód 1,0 do 3,0 % hmotnostního.

Jak je zřejmé odborníkům v oboru radikálových polymerací, je vysoce žádoucí používat_ bezkyšlikate atmosféry, takže se _ _______ systém proplachuje vhodným inertním plynem, jako je dusík

_.ne_bo_argon.,^aby_se_odstr.anil-kyslík----:_Potřebné polymerační teploty a doby jsou závislé na zvoleném iniciátoru a měly by být přizpůsobeny tak, aby umožňovaly homolytický rozpad iniciátoru, aby polymerace rychle začala. V případě použití AIBN (v množství 2,0 % hmotnostního) je například pro vyvolání polymerace a dosažení vysoké konverze (například více než 98 %) monomerů na nosičový polymer zapotřebí teploty asi 70 °C a uvedené konverze se dosáhne za asi 2 hodiny od začátku srážení částic. Částice nosiče je potom možno izolovat filtrací, promyt nereaktivními organickými rozpouštědly, která jsou uvedena dále a běžným způsobem vysušit za sníženého tlaku a/nebo zvýšené teploty.

Druh použitého polymeračního rozpouštědla je “důlež iťý“>řě“děvším pro ‘hustótú“výšlědhěsťřúktúřý“ňósičě'. v obecně ^Mšpatných rozpouštědlech pro rostoucí polymer, jako je heptan nebo hexan, dochází ke srážení velmi časně ve fázi propagace a to má za následek otevřenější strukturu nosiče, který má poměrné vysoký měrný povrch, a nízkou hustotu. Na druhé straně, když jsou parametry rozpustnosti lepší, tj. když se používá lepších” rozpouštědel pro polymer, ke srážení dochází později a získá se nosič s vyšší hustotou. Volby polymeračního rozpouštědla se tedy může používat pro vytvoření nosiče s fyzikálními vlastnostmi uprávenými na míru tak, aby se hodil pro konkrétně zamýšlenou aplikaci.

Má-li být koncentrace isokyanátových funkčních skupin na velmi vysoké úrovni a mají-li být tyto skupiny účinně dispergovány v otevřené struktuře tak, aby bylo možno nosiče používat při kolonovém uspořádání nebo v systému, s pístovým tokem, je vhodným rozpouštědlem heptan. Alternativně, když struktura s vyšší hustotou může vést ke 2lepšení fyzikální pevnosti a rychlejšímu usazování, což bývá žádoucí u heterogenních katalyzátorů, kterých se používá v reaktorech typu míchaných nádrží, může .být vhodnějším rozpouštědlem pro polymeraci toluen, tetrahydrofuraíTneBo^tfiyláčetaC ~~

Kromě toho, že má rozpouštědlo sloužit pro rozpuštění všech monomerů použitých pro výrobu polymeru, musí splňovat ještě další požadavek, že totiž nesmí být reaktivní vzhledem k isokyanátovým funkčním skupinám, jiným monomerům a polymernímu produktu. Jako vhodná organická rozpouštědla, kterých je možno používat jednotlivě nebo v kombinaci, je možno uvést hexan, heptan, uhlovodíková rozpouštědla Isopar^) (výrobek firmy Exxon, Houston, TX, USA), toluen, xylen, 1,2-dichlorethan, tetrahydrofuran, ethylacetát, butylacetát, amylacetát, methylethylketon a acetonitril. Hmotnostní' poměr směsi všech ' monomerů k ~ rozpouštědlu leží zpravidla v rozmezí od 1 : 5 do 1 : 10, Je žádoucí, aby byla koncentrace monomerů co nej vyšší, aby bylo možno dosáhnout vysoké konverze. Někdy však může být zapotřebí přidávat malá množství přídavných rozpouštědel pro usnadnění dobrého míchání během polymerace, zejména v tom případě, když rozpouštědla , přispívají ke vzniku poměrně otevřené polymerní struktury s nízkou hustotou. Míchání by mělo být dostatečné, vhodná frekvence míchání zavěšeného míchadla lopatkovítého typu je například 300 min^-1 nebo vyšší, podle potřeby.

Zesítované polymerní nosiče s isokyanátovými - funkčními' - skupinami (které obvykle - tvoří aglomerované struktury) podle vynálezu mají velikost částic (největší rozměr.) nad 10 um, přednostně v rozmezí od 20 do 1000 um. Aglomerované struktury, které se jeví při pozorování pouhým okem jako prásek, mohou mít podobu shluků nebo;vláken a ^mohou^- obsahovat—r*až“500^nebo· více^perel· pravidelného-nebo- — nepravidelného tvaru.

“Užitečné polymerní nosiče s isokyamátovýmT

-funkčními^-skupinami—podie-vynálezu-mají—měrný-povrch—vyš ší--než—20-m~/g-a-horní™hranice-měrného-povrchu-je_přibližně_4_0f>„ m²/g. Přednostně leží měrný povrch v rozmezí od 50 do 35Q a nejvýhodněji do 100 do 300 m²/g.

Polymerní nosiče s isokyanátovými funkčními skupinami

Dále je pro ilustraci uveden způsob výroby nosiče o složení TMPTMA ; IBM (80 : 20):

Do třílitrové tříhrdlé baňky s kulatým dnem, která je vybavena mechanickým míchadlem, teploměrem, přívodem •Φ _Λ plynu, kapací nálevkou a zpětným chladičem se předloží

TMPTMA (80,0 g, výrobek firmy Sartomer Co., Inc. Exton, PA, “USA),IEM'(20,O‘g', 'výrobeK fířmýDow'Chelničár*Co77^_Midráhd7 MI, USA), 1,67 g roztoku stabilizátoru [sušina 33 % Isopar G, který se skládá z kopolymeru laurylmethakrylátu a 2-vinyl-4,4-di-methylazlaktonu (94 : 6 - hmotnostně), který byl nechán reagovat s HEMA] a heptan (800 ml). Roztok se 10 minut míchá (frekvence otáčení 500 min^-1) za současného probublávání dusíkem a potom se zahřeje na 70 °C. K horkému roztoku se přidá AIBN (2,5 g, výrobek firmy Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA) a za několik minut jsou v reakční nádobě patrné částice. Během pokračující polymerace se v různou dobu přidá sedm stomililitrových dávek heptanu, který je zbaven kyslíku, pro usnadnění míchání směsi. Po 2 hodinách od zjištění částic se reakční směs, která má nyní podobu bílé krémovíté vločkovité polymerní hmoty, nechá zchladnout. Pevná látka se odfiltruje a promyje heptanem. Polymerní produkt se přenese do čťyřlitrové kádinky a překryje roztokem, který se skládá z 1200 ml ethylacetátu a 1,0 g polyalkylenoxidové povrchově aktivní látky Pluroníc^^R^ L-31 (výrobek firmy BASF, Parsippany, NJ, USA) (při této promývací operaci, která se provádí za příležitostného míchání, se odstraní nezreagované monomery a minimalizují problémy se statickou elektřinou, které^vznika j T“s^nosiTšem—který je~ nakonec^ v~suchéin~s ta vu)M Po 1 hodině se smés přefiltruje a filtrační koláč polymeru se vysuší do konstantní hmotnosti při 70 °C pod atmosférou suchého dusíku (19 hodin), načež se ještě další 3 hodiny suší za tlaku nižšího než 13 3,3 Pa. Polymer se získá ve výtěžku 97,8 g (97,8 % theorie) a má měrný povrch (stanovený metodou BET) 134 m²/g. Zkrácené označení tohoto nosiče je T/20”.

Elektronové mikrografie (SEM) nosiče T/20 jsou uvedeny na obr. 1 a 2. Při pozorování pouhým okem má polymerní nosič podobu jemnozrnného prášku. Při zvětšení je zřejmé, žě každé žřňošě skládá že shluku perel s největším rozměrem obvykle asi 1 μη. Tím je vysvětlen velmi vysoký měrný povrch tohoto polymerního nosiče, který má obvykle bílé nebo špinavě bílé zbarvení.

Stejným způsobem byly vyrobeny také následující nosiče: .

Nosič Značka Měrný povrch (m²/g)

TMPTMA .	T	168
{100) - ........	- - . . ... ..
TMPTMA:IEM:LMA (70:10:20)	T/10LMA-20	81
TMPTMA:IEM:BMA	T/20BMA-20 ..	64

(60:20:20)

TMPTMAYIEMYBMA -T-/20BMA-10^---------------13.6_ (70:20:10)

TMPTMA:IEM:HEMAC T^SHEMXC-riTS

TMPTMA: lEMřHEMAC-T-/-l-OHEMAC--7-,-6 (82,4:10:7,6)___

TMPTMA:IEM:HEMAC	T/15H-EMAC-4	120
/pn . 1 R · 4\		*
TMPTMA · I : DMA (80:10:10)	T/lODMA-10	¹³⁰
TMPTMA:IEM:PHOEM (40:10:50)	T/10PHOEM-50	43
* ΤΓΜ * DMU XlTlť* XZin · ’ —--- (70:15:15)	T/15DMA-15-	89
TMPTMA:IEM:DMA (60:20:20)	T/20DMA-20	73
EGDMA:IEM (80:20)	E/20	116

1/ TMPTMA:IEM:HEMA T/20HEMA-30 (50:20:30)

DPEHPA: ΙΕΜ^ D/20 — (80:20)----------------------84

345

Srovnávací nosiče

MMA:IEM (80:20)	20MMA-80	9
IEM:MMA (40:60)	40MMA-60	8
IEM:DMA (80:20)	80DMA-20	4

(a) Disperzní polymerace byla provedena v ethylacetátu, jako rozpouštědle.

Kovalentní vazba proteinů, přednostně enzymů, na nosiče s isokyanátovými funkčními skupinami

Jak již bylo naznačeno dříve, cílem vazebného postupu je uvést do kontaktu enzym, který je' rozpuštěn ve vodném médiu, s lipofilním nosičem podle vynálezu tak, aby se v podstatě všechen enzym nejprve hydrofobně navázal na nosič. Vznik kovalentní vazby probíhá poněkud menší rych±ostí“a“přeďpokládá-se—že-je-ukončen-v-priibéhu-něko-l-i-kahodin, například 2 až 4 hodin při teplotě místnostiV ideálním stavu by měl být nosič hydrofilní z toho důvodu, aby se zvýšila reaktivita isokyanátových skupin (díky polaritě a/nebo místním koncentračním efektům) pro usnadněni kovalentní vazby, ale nikoliv příliš hydrofilní, poněvadž v takovém případě by se mohl nosič stát tak reaktivním, že by se jako konkurenční reakce uplatňovala hydrolýza, což by nakonec vedlo ke vzniku reversibilní iontové vazby a následnému vyluhování. Extrémně hydrofilní nosiče jsou také méně atraktivní pro enzym v nezbytném hydrofobním vazebném stupni. Při opačném extrému, *je-li nosič příliš lipofilní, xo dojde sice k hydrofobní vazbě, ale reaktivita isokyanátu se může snížit na takovou hodnotu, že nedojde ke kovalentní vazbě, což bude mít za důsledek opět vyluhování nestabilně hydrofobně vázaného enzymu z nosiče. Díky nadměrně lipofilnímu prostředí bude také vázaný enzym méně reaktivní a méně stálý.

Výše uvedené faktory, které favorizují vznik kovalentní vazby, jsou zohledněný v doporučených vazebných postupech či protokolech. Nejprve se enzym rozpustí zpočátku na vysokou koncentraci v tlumeném polyaniontovém solném roztoku, jako jsou roztoky popsané v mezinárodní publikaci PCT, přihlášce WO 92/07879. Polyaniontová sůl má za cíl

......- téměř -vysolit enzym tak, aby se snadno- podílel-na hydro-.

fobní vazbě s organickým polymerním nosičem podle vynálezu, vhodné . koncentrace proteinu leží v rozmezí od 1 do 20 % hmotnostních, vztaženo na sušinu nosiče, . přednostně v rozmezí od 3 do 10 % hmotnostních. Vhodné po lyan iontové

-_zahrnuj í - anorganické solij ako —je— síran-sodný a -soli alkalických kovů s organickými kyselinami, jako s kyselinou iňalonovou, malěinovou, vinnou a citrónovou^-; Přednostnícrganickousolfiecitran sodný;--—

-Po_.hydrofobním_ako_valentnim navázáni,___která obé proběhnou obvykle v průběhu 2 až 4 hodin -při teplotě okolí (obvykle 20 až 25 °C), se může, jako další předběžné opatření pro eliminaci vyluhování, všechen enzym, který není kovalentně vázán, z nosiče vymýt pomocí vodného roztoku povrchově aktivní látky. Vhodné povrchově aktivní látky se určují podle schopnosti vymývat nekovalentně vázaný enzym z nosiče a_: neschopnosti ovlivňovat katalytickou účinnost volného enzymu při provádění zkušební reakce.

Jako užitečné povrchově aktivní látky, kterých se používá s enzymy vázanými potfle tohoto vynálezu, je možno uvést neiontové polyalkylenoxidové látky, jako jsou povrchově“' aktivnílátky Třiťdh('^R^(vyřoběk~^frřmý”Řofim^_and Haas Co., Philadelphie, PA, USA) a Pluronic(^R^ (výrobek firmy BASF Corp., Parsippany, NJ, USA). Tyto povrchově aktivní látky jsou účinné při použití ve vodných roztocích v koncentraci od 0,001 do 3,0 % hmotnostního, přednostně od 0,1 do 1,5 % hmotnostního. Po 1 až 24 hodinách, přednostně až 16 hodinách zpracování aduktu enzymu s nosičem těmito roztoky povrchově aktivní látky se heterogenní směsi mohou přefiltrovat a adukty enzymu s nosičem se mohou promýt vodou, aby se odstranila povrchově aktivní látka a případné přítomný zbytek nenávázaného enzymu.

Nakonec se může vyrobený adukt enzymu s nosičem skladovat ve formě suspenze, přičemž se přidá roztok tlumiče pH, kterým se upraví hodnota pH na hodnotu, při níž'má * , použitý enzym optimální stabilitu. Suspenze se ochladí na 1 ^# až 5 °C a do reakčních směsí se později přidává ve formě alikvotních dílů. Alternativně se mohou promyté adukty enzymu s nosičem lyofilizovat, skladovat za chladu (-30 až 5 °C) a později dávkovat ve formě suchých pevných látek.

Odborníkům v tomto oboru je také zřejmé, že při vazebném-postupu—se nespotřebuji všechny isokyanatové skupiny a nespotřebované skupiny se mohou později hydrolyzovat, zejména v tom případě, že se produkty skladují ve formě vodné suspenze. Při hydrolýze vzniknou nabité skupiny, které jsou nepřímo užitečné po navázání enzymu, poněvadž k nabitým skupinám jsou přitahovány molekuly vody, což zajištuje hydratovanější prostředí. Dalším přínosem je zvýšená aktivita navázaného enzymu a zvýšená životnost katalyzátoru.

- - --- Cílem tohoto vynálezu.je:. . ......... .....

1) kovalentně navázat co nejvyšší množství enzymu;

2) zachovat při postupu vysoce aktivní enzym; a

3) vytvořit nevyluhovatelný katalyzátor vhodný pro provádění syntetických organických reakcí.

Zjistilo se, že pro dosažení těchto cílů je zapotřebí .. _ -efektivní ' vazebné''“protokoly ’a^-“Výběr -konkrétních- nosičů ·----· poněkud přizpůsobit, aby vyhovovaly danému enzymu. .

Esterasa z jater vepře

............... Est.erasa z jater vepře (PLE; Carboxyl esterase, EC

3.1.1.1) byla zakoupena od firmy Sigma Chemical Co., St.

Louis, MO, USA ve formě suspenze v 3,2 M síranu amonném.

Její specifická aktivita byla přibližně 200 U/mg proteinu [1 U (jednotka) je definována jako množství potřebné pro

..... ~___________„ hydrolýzu..... 1 ^mikromglu.. ethy.l.butyrátu _.za_ minutu při_ _8,0 a 25 °Cj. Před vazebnou reakcí byl enzym nejprve dialýzován

--proti—třem-dávk-ám—r-oztoku-obsahu-j-ící-ho,—θ-,-7-M-citran-sodný-,-0,05M—hydrogenf osf orečnan-dvoj sodný—a~0v-0SM_hydr.og.enfosf.o-_ _rečnan_s.o.dný_,_jejichž pH bylo nastaveno na 7,5. Při tomto _ _postupu byl enzym uveden na požadovanou hodnotu pH a iontovou.sílu a byly odstraněny amonné ionty. Dialysát byl potom přefiltruje přes celulozový filtr s póry o rozměrech 0,45 jim, který byl umístěn v injekční stříkačce a koncentrace enzymu se stanovila spektrofotometricky za použití extinkčního koeficientu 14,8 při 280 nm (1%, 1 cm).

Ten byl stanoven gravimetricky a byl v těsném souhlasu s hodnotou 13,8, kterou publikovali Barker a Jencks v Biochemistry, 1969, 8, 3879 až 3889.

Spektrofotometrické stanovení

Do 3ml kyvety z křemenného skla bylo předloženo 2,4 ml 50mM EPPS (N-[2-hydroxyethyl]piperazin-N'-[3propansulfonová kyselina]; Sigma Chemical Co.) pufru o pH 8,0 a magnetická tyčinka pro míchání obsahu kyvety. Kyveta byla umístěna do termostatovaného držáku, který zároveň sloužil jako magnetické míchadlo, spektrofotometru se soustavou diod Hewlett Packard 8450A a nechala se ekvilibrovát na 25 °C.

V případě volného enzymu v roztoku byl do kyvety přidán 10 až 20μ1 alikvot a potom 80 μΐ roztoku p-nitrofenylacetátu v bezvodém acetonitrilu o koncentraci l/θ yg/ml. Měřítkem aktivity enzymu byla lineární rychlost nárůstu absorbance při 400 nm (díky tvorbě p-nitrofenolátu) uváděná jako jednotky milliabsorbance za sekundu. Koncentrace enzymu byla nastavena tak, aby se naměřená rychlost udržovala na hodnotě nižší než 25 jednotek milliabsorbance za sekundu. Při tomto pokusu měla esterasa typickou specifickou aktivitu 13 až 15 jednotek milliabsorbance za sekundu na mikrogram. Aktivita zmobilizovaného enzymu byla měřena stejným způsobem, pouze .s_t í m_r.o zdí 1 em ,_ž e_^by 1 o_použ i.to_20_μ 1—_ suspenz e_ nosiče:

s navázaným enzymem o koncentraci pevných látek 1,0 % hmotnostního. Odchylky absorbance, k nimž docházelo díky rozptylu světla na částicích nosiče v míchané kyvetě se v průběhu trvání pokusu zprůměrovaly, takže nepředstavovaly žádný problém.

Obvykle bylo toto stanovení, prováděné s volným nebo vázaným enzymem, reprodukovatelné s přesností 10 %. Data uvedená v příkladové části zahrnují průměry ze tří pokusů s 20 μΐ vzorky 1. filtrátu (měřítko množství volného enzymu, který zbývá po expozici reaktivnímu nosiči) ύ£ suspenze (skutečná — aktivita imo bili z ováného enzymu, popsaná výše) a supernatantu (měřítko vyluhování nekovalentně vázaného enzymu z úplně dohotoveného nosičového katalyzátoru). Vzorky 1. filtrátu·' byly získány zkoušením filtrátu získaného při počáteční filtraci (přes skleněnou fritu s průměrem otvorů 10 až 20 μιη) po expozici roztoku volného enzymu reaktivnímu nosiči. Hodnoty jsou uváděny v jednotkách milliabsorbance na milligram zreagovaného enzymu a hodnoty uváděné v závorce se vztahují k procentickému obsahu zbytkového nenavázaného PLE, který zbývá po původním kontaktování (nyní 1. filtrát). Vzorky suspenze” byly získány výše uvedeným způsobem odebráním alikvotů z dobře dispergovaných částic nosiče v 0,5M EPPS (1,0 % nerozpustných pevných látek)-. Hodnoty supernatantu”- byly získány po přinejmenším 24 hodinách od přípravy suspenze v 0,5M EPPS, zkoušením aktivity.filtrátu získaného filtrací filtr s otvory o průměru 0,45 μιη; závorkách ukazují úroveň příspěvku aktivity - supernatantu- -k -hodnotě- -celé- -suspenze-.- -Hodnoty uvedené pro všechny 3 druhy vzorků jsou opraveny na malou rychlost autohydřoíyzy pozadí) pozorovanou za nepřítomnosti“ enzymu při pcdmínkáchzkoušení, části suspenze přes procentické údaje v

--~ -—,-——----—Bakteriální-lipasa

Lipasa F5-800 (glycexol estex hydrolsse, EC 3.1.1.3) byla získána od firmy Amano International Enzyme Co., (Troy, VA, USA) ve formě suchého prášku. Její uváděná specifická aktivita byla nad 800 U/μς (kde 1 U (jednotka) je definována jako množství enzymu, které uvolní 1 μιηοΐ mastné kyseliny z triglyceridů za 1 minutu). Pro studie -vazby bvl enzym suspendován ve fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS; chlorid sodný v množství 8,5 g/1, 0,01M fosforečnan sodný, pH 7,2) o koncentraci 2 mg/ml.

Spektrofotometrické stanovení

Spektrofotometrické stanovení pro zjištění aktivity lipasy bylo totožné se stanovením, kterého bylo použito pro stanovení aktivity PLE, pouze s tím rozdílem, že koncentrace p-nitrofenylacetátu. v zásobním acetonitrilovém roztoku byla zvýšena na 20 mg/ml.

Penicilín acylasa

Penicilín acylasa (PGA; penicilín amidOhydrolase, ED 3.5.1.11) byla zakoupena od firmy Pharma Biotechnologie Hannover (Hanover, Německo) ve formě roztoku v O,1M fosforečnanu sodném o pH 7,5 s typickým obsahem proteinu v rozmezí 60 až 70 mg/ml. Specifická aktivita byla v rozmezí od 17 do 24 U/mg proteinu (1 U (mezinárodní jednotka) je definována jako množství enzymu potřebné pro odštěpení 1 p,mol fenyloctové kyseliny z penicilinu G za minutu při 37 °C a pH 7,8 na základě titrace uvolněné kyseliny hydroxidem sodným. Enzymu bylo použito v tom stavu, v jakém byl získán.

Titrační stanovení

Do termostatované f37“°C) 3Orní“kádinky obsahující' magnetickou míchací tyčinku bylo napipetováno 20 ml roztoku penicilinu G o koncentraci 2,0 % hmotnostního, připraveného rozpuštěním penicilinu G (sodné soli, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) v roztoku 0,01M fosfátu a 0,01M chloridu sodného o pH 7,8. Potom byl do kádinky vložen teploměr, pH - elektroda a vyústění byrety autotitračního zařízení. Hodnota pH výsledného roztoku penicilinu G byla nastavena na 7,8 přídavkem 0,lM roztoku hydroxidu sodného.

Alikvoty suspenzí PGA a filtrátů byly nastaveny tak, aby se s nimi nadávkovali nejvýše 200 μς enzymu. Postup enzymatické reakce byl sledován titrací uvolněné fenyloctové kyseliny standardním roztokem hydroxidu sodného. Alikvoty PGA byly přímo přidány k roztoku penicilinu G a reakční rychlosti byly stanovovány za použití automatického titrátoru Mitsubishi GT 06 a 0,05M hydroxidu sodného jako titračního činidla. Aktivita byla vyjádřena v IU (mezinárodní jednotky) na milligram nasazeného enzymu.

Při ilustraci použitelnosti jako imobi.lizuj ícího činidla byly pro jednoduchost (poněvadž nebylo zapotřebí používat žádných kofaktorú, koenzymů nebo jiných pomocných činidel) uváděny s novými reaktivními nosiči podle tohoto vynálezu pouze hydrolasové enzymy. Odborníkům v -tomto -oboru však musí být zřejmé, že za použití reaktivních nosičů a postupů (vazebných protokolů), které jsou uvedeny v tomto popisu je možno imobilizovat všechny hlavních třídy, enzymů, jako jsou oxidoreduktasy, transferasy, lyasy, kinasy, isoraerasy , ligasy .a.jiné hyqroiasy.._Stejně tak..lze. imobilizovat .......— také další biomakromolekuly, jako jsou jiné proteiny,

-lipoprotei-ny-,—am-i-nosaeha-r-i-dy—buňky—proti-l-átky-a~antigeny;

_Vynález a jeho výhody jsou blíže objasněny v násie-dující ch příkladech. Tyto příklady maji výhradně ilustra-_ tivní charakter a údaje, které jsou v nich uvedeny a vztahují se ke konkrétním materiálům a jejich množstvím, stejně tak jako jiné podmínky a podrobnosti, v žádném rozsahu neomezují rozsah vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Srovnávací příklad A

Tento srovnávací přiklad ukazuje, že isokyanátové skupiny jsou nutné pro navázání účinného množství enzymu.

Také je zřejmé, že použitý protokol zahrnuje velmi účinné promývací operace,pohěvadž'přěsv podštátěkváňtítativní hydrofobní vazbu PLE, se nenaměří podstatná aktivita ani v suspenzi, ani v supernatantu.

Homopolyner T (100 mg), který neobsahuje žádné isokyanátové skupiny a který má měrný povrch 168 m²/g, se uvede do styku s roztokem obsahujícím esterasu z jater vepře (PLE; 4,0 mg, rozpuštěná v citrátovém/fosfátovém médiu, které bylo popsáno výše v souvislosti s dialýzou), 6,0 ml 0,7M natriumcitrátového/natriumfosfátového roztoku o pH 7,5 a 0,15 ml 4% roztoku polyalkylenoxidové povrchově aktivní látky Pluronic (R) L-31 ve vodě a směs se nechá 2 hodiny převalovat při 22 °C. Potom se směs přefiltruje a promyje destilovanou vodou (3x). Filtrační koláč se resuspenduje v 1% roztoku polyalkylenoxidové povrchově aktivní látky Triton^ X-100 ve vodě a směs se 16 hodin převaluje při 22 °C. Potom se směs přefiltruje a filtrační koláč se promyje vodou (4x) a vloží do 10 ml 0,5M EPPS o teplotě 4 °C. Po provedení zkušební reakce, popsané výše v části, která se zabývá PLE, je hodnota 1. filtrátu 0,1, což ukazuje, že se více než 99 % PLE hydrofobně navázalo na nosič T. Hodnota suspenze po důkladných promývacích postupech byla pouze 075, což^-ukazuje^ že počáteční vazba má_v podstat*ě^_v“celém rozsahu hydrofobní charakter a že promývací postupy jsou velmi účinné při snižování obsahu nekovalentně vázané PLE; hodnota supernatantu byla na úrovni autohydrolýzy pozadí, 0,1.

Příklady 1 až 11

Tyto příklady, které široce ilustrují vynález, se provádějí za použití vazebných postupů popsaných ve srovnávacím příkladu A. Důležitost měrného povrchu nosiče a dispergace isokyanátových sKUpin je zřejmá při prohlídce sloupce '*1. filtrát. V případě, že byl měrný povrch nižší než 100 m²/g, zůstávala podstatná množství PLE v kontaktním roztoku. Na druhé straně, jak ukazují nízké hodnoty 1. filtrátu a hodnoty suspenze v tabulce 1, jsou obecně účinnějšími katalyzátory ty katalyzátory, které mají měrný povrch vyšší než 100 m²/g, zvláště v tom případě, že mají hydrofilnější základní řetězec polymeru. Vyluhování enzymu nepředstavovalo problém v žádném případě nosiče podle, vynálezu.

“O

4=

Srovnávací příklady B až D

Vazba PLE na nosiče se provádí za použití stejného protokolu, jaký je popsán v příkladech 1 až 11. Data uvedená v tabulce II ukazují, .že když se vypustí síťující monomery, má to za následek velmi nízký měrný povrch. I když se použije . poměrně vysokých. koncentrací monomeru - s isokyanátovými funkčními skupinami, například až do 80 % hmotnostních, většina PLE zůstane nenavázána v kontaktním roztoku a získá se špatný katalyzátor.

...... 1 1 — Supernatant^	#> cn M * o	Λ» o N rt * O	riP ΙΛ OJ *» O
Suspenze®	n (\	Ifi H	n ta, rH
<C 4J Xť Úl 4J rt -rd m • rH	% (ffi N \D CN rt rt	co - co sz* OJ in H	o¥> ř-i r* OJ r4
C υ £4 > 0 — ft cr c E	σι	00	fl·
Měr i
Nosič	20MMA-80	40MMA-60	80DMA-20
Příklad číslo	CO	U	Q

- JU ’

..................- p f r k 1 a d y 12 až 15

Tyto příklady ukazují, že žádoucí koncentrace PLE při vazbě na nosič, je 4 až 5 % hmotnostních. Při vyšších koncentracích nebyl enzym PLE úplně odstraněn navázáním na reaktivní nosič a bylo možno pozorovat jeho vyluhování.

Nosič T/20 (100 mg) byl kontaktován s roztokem o koncentraci PLE 4, 6 a 8 % hmotnostních za použití protokolu uvedeného v příkladech 1 až 11. Naměřená data jsou uvedena v tabulce III.

-Tabulka III

Příklad 'číslo-	PLE (¾ - hmotnostní^	1.. filtrátA.	.. Suspenze®.	.Supernatant^
12	2,0	0	8,3	0
13	4,0	0,2	11,4	0
14	6,0	1,7	14,2	0,3
'15	8,0	21,8	14,8

—a-—b—G-v-i-z—fe abu-lk a -I

Příklady 16 až i 9 ^Tyto^ příklady ukazují^-; žě přednostní obsah isokyanátu v nosiči podle vynálezu je přibližně 10 : % hmotnostních, přestože celý rozsah zkoušených koncentrací (5 až 20 % hmotnostních) byl vyhovující.

Složení nosičů popsané v tabulce IV bylo upravováno tak, aby se udržela přibližně konstantní lipofilita nosiče při změnách koncentrace IEm. vazba PLE byla prováděna způsobem popsaným v příkladech 1 až 11. Naměřená data jsou uvedena v tabulce IV.

Tabulka IV

Příklač čírsTo'	—r-—Označení—	l^filtrátA	Suspenze®	„Super natant
16	T/5HEMAC-11,5	0	13,7	0
17	T/10HEMAC-7,6	0	15,5	0
18	-T/15HEMAC-4	0	16,0	0
19	T/20	0,3	13,0	0

A, B, C viz tabulka I

Příklady 20 až 21

Ke 100 mg vzorkům nosiče s isokyanátóvými funkčními skupinami, které jsou uvedeny v tabulce V se přidá vždy 2,0 ml roztoku lipasy, který obsahuje 4,0 mg lipasy v 4,0 ml PBS, 4,0 ml PBS a polyalkylenoxidovou povrchově aktivní látku Pluronic^¹*) L-31 (18 mg). Směs se převaluje 18 hodin při teplotě místnosti. Po filtraci, kterou se získá 1. filtrát se filtrační koláč promyje deionizovanou vodou (3x) a potom resuspenduje v 10 ml PBS, který také obsahuje 1 % polyalkylenoxidové povrchově aktivní látky Triton^ X-100, za účelem odstranění jakéhokoliv nenavázaného enzymu. Po 5 hodinách převalování se směs přefiltruje a filtrační koláč se promyjě-vodbu^-(^_4jf)“Nakonec“se^_pevná~Tátka-resuspendu-je-v 10 ml 0,5M pufru EPPS a uloží se při 4 °C až do určování aktivity. Zjištěná data jsou uvedena v tabulce V.

Tabulka V

Příklad Číslo	Označení	1. filtrát^	Suspenze®	Supernatant^c
20	T/20	1,0(6%)	13,2	0
n 4«	E/20	0,3(2%)	7/5	0

A, B, C viz tabulka I

P ř í k 1 ady 2 2 a ž 2 3

Vyhodnocování schopnosti různých nosičů vázat PGA se provádí tak, že se vždy 100 mg vzorek nosiče kontaktuje s 4% (hmotnostně) PGA v 6,0 ml pufru o pH 7,4, který obsahuje citran sodný v l,0M koncentraci a fosfát v O,1M koncentraci a který také obsahuje, polyalkylenoxidovou povrchově aktivní látku Pluronic L-31 v koncentraci 3,3 g/1. Směs se umístí do Í5 ml baňky a 2,5 hodiny se převaluje při 22 °C. Potom se směs přefiltruje přes skleněnou fritu s velikostmi otvorů 10 až 20 (im a filtrát se zkouší na aktivitu PGA, aby se zjistilo množství volného enzymu, který zbývá po expozici reaktivnímu nosiči. Filtrační koláč se propláchne PBS o -pH 7,2 ('2x10 ml) a vodou (2x10' mlj’ Oddělený nosič se resuspenduje v roztoku, který obsahuje EPPS v 0,01M koncentraci a chlorid sodný v 0,01M koncentraci a má pH 7,5 (10 ml), -v němž se skladuje;¹ Tato suspenze se zkouší, za účelem zjištění aktivity immobilizované PGA. Supernatant suspenze,-^J který se získá^-po“přefiltrováni’části suspenze přes filtr s otvory o průměru 0,45 μιη, se zkouší na úroveň vyluhování nekovalentně vázané PGA. Naměřená data jsou uvedena v tabulce VI. ~

Tabulka VI

Příklač číslo	Nosič	1. filtrátů	Suspenze²	Supernatant^c
22	T/20	0,5(2,5%)	12,7	0,4
23	E/20	0,5(2,5%)	11,1	0,3

A, B, C viz tabulka I

Odborníkům v tomto oboru je zřejmé, že vynález je možno různými způsoby modifikovat a pozměňovat a všechny takové modifikace a obměny spadají do rozsahu tohoto vynálezu, pokud se neodchylují od ducha vynálezu a pokud jsou pokryty následujícími patentovými nároky, které jsou jedině určující pro rozsah ochrany.

Claims

1. Způsob výroby zesilovaného polymerního nosiče s isokyanátovými funkčními skupinami, vyznačuj ící se tím, že se

a) kopolymeruje směs obsahující alespoň_ jeden ethylenicky nenasycený monomer s isokyanátovými funkčními skupinami a alespoň jeden polyethylenicky nenasycený sítující monomer, radikálový iniciátor pro tyto monomery a rozpouštědlo pro tyto monomery a iniciátor, které je nereaktivní vůči použitým monomerům a jejich polymeračním

-produktům- a popřípadě.....alespoň jeden 2 hydrofilních a lipofilních monomerů, které se liší od výše uvedených monomerů.a ....... .....

b) izoluje se výsledný zesítovaný polymerní nosič obsahující -isokyanátové funkční skupiny“. —

2“Způsob podle nároku 1, vyznačující s~e t~~í m ; že se získaný polymerní nosič nechá reagovat -s—vodným—roztokem—obsahujícím protein, za vzniku konjugátu -polymerníhonosičeaproteinu. --—·—----------

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že monomer s isokyanátovými mi skupinami je přítomen v množství v rozmezí od dílů hmotnostních a sítující monomer je přítomen v v rozmezí od 99 do 1 dílu hmotnostního.

4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků vyznačující se tím, že směs dále

0 až 98 % hmotnostních jiných kcpolymerovatelných monomerů a funkcni1 do 99 množství

1 až 3, obsahuje popřípadě účinné množství stabilizátoru polymerační disperze.

5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že se radikálový iniciá- ί tor volí ze souboru zahrnujícího azobis(isobutyronitril), benzoylperoxid, laurylperoxid, terc.butylperoxopivalát a * azobis(1-cyklohexankarbonitril). I

6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že se jako monomeru s isokyanátovými funkčními skupinami použije isokyanatoalkylesteru ethylenicky nenasycené karboxylové kyseliny.

7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 v y, značující se tím, že se polyethylenicky nenasycený síťující monomer volí ze souboru zahrnujícího polyethylenicky nenasycené estery, polyethylenicky nenasycené i amidy a deriváty polyvinylbenzenu. j

8. Polymerní nosič podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, který má podobu přášku.

--97“Způsob—podle^kteréhokoliv-z—nároků—1—až—8-pro ' výrobu zesíťovaného nosiče obsahujícího isokyanátové funkční skupiny vyznačující se tím, že dále zahrnuje stupeň, ve kterém se k tomuto nosiči kovalentně připojí alespoň jedna biomakromolekula, za vzniku nerozpustného nosičového katalyzátoru.

10. Nosičovy katalyzátor podle nároku 9, v němž biomakromolekulou protein.

II. Způsob katalýzy reakce, v yVň a~čuj’i c i se tím, že se nerozpustný nosičovy katalyzátor připra vený podle nároku 9 nébo 10 nechá reagovat s komplementárními reakčnimi činidly.