JPH06153999A

JPH06153999A - 電荷移動型色素を用いた標的核酸の検出方法及びそれに用いるプローブ

Info

Publication number: JPH06153999A
Application number: JP32050092A
Authority: JP
Inventors: Nobuko Yamamoto; 伸子山本; Hisashi Okamoto; 尚志岡本; Masahiro Kawaguchi; 正浩川口; Yoshinori Tomita; 佳紀富田; Keisuke Makino; 圭祐牧野; Akira Murakami; 章村上
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1992-11-30
Filing date: 1992-11-30
Publication date: 1994-06-03
Anticipated expiration: 2020-02-09
Also published as: JP3618768B2

Abstract

(57)【要約】【目的】Ｂ／Ｆ分離の必要がなく、より簡易化された
工程からなり、良好な測定感度を得ることができるハイ
ブリダイゼーションを利用した核酸ハイブリッドの検出
方法を提供すること。【構成】標的一本鎖核酸・プローブ・ハイブリットに
おける２重らせん構造を介した電荷移動により検出可能
な光学的変化を起す２種の色素をプローブに所定の間隔
で結合して用いて試料の分析を行い、試料中の標的核酸
の有無を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウイルス、微生物、動
植物、ヒトなどの核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の所望の
塩基配列を検出、同定、もしくは各種塩基配列における
変異の有無を検出する方法及びそれに用いるプローブに
関する。

【０００２】

【従来の技術】核酸の分析技術の発達により種々の変異
遺伝子が数多く見つけ出され、遺伝子の変異に基づく各
種遺伝病の解明も進みつつある。そのなかには、遺伝子
中の塩基が部分的に欠失したものや塩基が点突然変異を
起こしたものがあり、それによって蛋白質に変異が生
じ、さまざまな症状を引き起こすものがあることが明ら
かにされてきている。現在のところ、これらの遺伝病
は、症状が現れてから、酵素によるアッセイや、抗体を
用いた免疫的な方法により発見されることが主流である
が、早期治療という観点から、重篤な症状が現れる前に
遺伝子上で変異の有無を早期に発見することの重要性が
指摘されている。

【０００３】その有力な方法の一つとして、ＲＦＬＰ
（restriction fragment length polymorphism：制限酵
素断片長多型）が挙げられる。この方法は、例えばヒト
の全遺伝子を制限酵素によって切断して得られるＤＮＡ
断片をアガロ−スゲル電気泳動で展開し、サザンブロッ
ト法を用いてフィルタ−上に固定した後、放射性同位元
素等により標識したＤＮＡ（またはＲＮＡ）からなるプ
ロ−ブとハイブリッドさせ、正常なＤＮＡと検体ＤＮＡ
の切断パタ−ンの相違から、これらの疾患と関連する遺
伝子の有無を検出するものである。

【０００４】また、ＤＮＡ診断は、必ずしもヒトの遺伝
子に用いられるだけでなく、感染した細菌の同定にもお
いても利用しうる。

【０００５】従来は、分離した細菌の形態学的性状およ
び生化学的性状から、類似性に基づいて菌種を同定する
方法が取られていた。この方法では、培養に時間がかか
る上に、検査法の違いによって性状の判定が異なった
り、どの性状に重点を置くかによって同定の結果が異な
る等の問題があった。

【０００６】そこで、近年、特に、細菌感染症における
原因細菌の検出や同定の分野において、ＤＮＡ−ＤＮＡ
ハイブリダイゼ−ション法、あるいはＤＮＡ−ＲＮＡハ
イブリダイゼ−ション法を用いる試みがなされてきてい
る。この方法は、細菌から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）
を抽出し、細菌由来の核酸のうち特定部分に着目して、
その部分の塩基配列とホモロジ−の高い塩基配列が、対
象とする被検核酸サンプル中に存在するか否かをハイブ
リダイゼ−ション法によって調べ、サンプル中に問題と
なる細菌が存在するか否かを判定する方法である。

【０００７】これらの基礎技術であるハイブリダイゼ−
ションという方法は、一般的には、次のような工程から
構成される。（１）ＤＮＡを切断し、それをゲル電気泳動で展開する
工程。（２）展開した各ＤＮＡ断片をニトロセルロ−スフィル
タ−に吸着させる工程（サザンブロット）。（３）（２）で得たニトロセルロ−スフィルタ−をプロ
−ブと反応させ、ハイブリッド体を形成させる工程。（４）ハイブリッド体を形成したＤＮＡ断片を検出する
工程。

【０００８】例えばＤＮＡどうしのハイブリダイゼ−シ
ョン反応では、標識を施したプロ−ブＤＮＡと標的ＤＮ
Ａとがお互いの相補的な配列の部分で水素結合によりハ
イブリッド体を形成する。

【０００９】これらのハイブリダイゼ−ション反応に供
せられるプロ−ブも時代とともに変化してきている。最
も初期の頃は、長いＤＮＡ断片をニックトランスレ−シ
ョン反応により放射性同位元素で標識することが行なわ
れてきた。ＤＮＡ合成機の発達にともない、長いＤＮＡ
の代わりに合成オリゴヌクレオチドが用いられるように
なり、標識物質も、危険な放射性物質からより安全なビ
オチン−アビジン系、そして、さらに、種々の化学発光
系へと推移している。

【００１０】ハイブリダイゼ−ション反応において相補
的な配列間で正確にハイブリッド体を形成させるために
は、反応の温度、イオン強度を最適に選ぶ必要がある。
つまり、温度が高すぎると、プロ−ブと相補的配列をも
つ核酸とが結合できず、逆に低すぎると、プロ−ブが非
特異的に核酸に結合してしまう。さらに、より正確さを
期するために、溶液の塩濃度を下げて、或はまた、溶液
の温度を上げて、不安定な水素結合を除き、非特異的に
結合したプロ−ブやミスマッチしているプロ−ブを洗い
流すことが重要となる。従って、適当な反応条件、洗浄
条件の設定には、かなりの試行錯誤が必要になる。

【００１１】遺伝子診断では、ハイブリッド体形成反
応、及び、洗いの条件設定に、一塩基対レベルのミスマ
ッチをも除去する精度が更に要求される。

【００１２】ハイブリダイゼーション反応において、標
的核酸をニトロセルロ−スのような担体に固定させて用
いる場合は、反応後、プロ−ブの非特異的結合等を除去
するための洗浄が行ないやすいという利点はあるもの
の、操作が煩雑で検査の自動化を困難にしている。しか
も、時間がかかるという欠点を持つため、検体大量処理
には向かない。

【００１３】そこで、核酸の固定化なしに溶液中でハイ
ブリッド体を検出する方法によれば、自動化の可能性が
開けることが期待されており、種々の試みがなされてい
る。核酸の固定化を行わない方法における最大の課題
は、標的核酸に結合しているプロ−ブと、結合していな
い過剰なプロ−ブをどのようにして区別するか（Ｂ／Ｆ
分離）というところにある。さらに、この場合にも、上
述の固定化核酸を用いたハイブリダイゼ−ション反応と
同様に、プロ−ブの非特異的吸着やミスマッチを除くた
めの適当な反応条件、洗浄条件設定が重要な課題とな
る。

【００１４】Ｂ／Ｆ分離を行わずに標的核酸とプローブ
とのハイブリッド体を検出するための方法としては、蛍
光偏光解消法を用いた検出方法がいくつか提案されてい
る（特開平２−２９５４９６号公報、特開平２−７５９
５８号公報等参照）。これらの方法は、蛍光標識された
一本鎖ＤＮＡプロ−ブを、分析検体中のＤＮＡと接触さ
せて二本鎖ＤＮＡを形成させ、二本鎖形成前の蛍光偏光
と二本鎖形成後の蛍光偏光との変異を測定して検体中の
ＤＮＡに、プロ−ブの塩基配列に対応する塩基配列が存
在するかどうかを検出する方法である。この方法は、一
本鎖のプロ−ブに結合した蛍光物質が、二本鎖になった
ことによって動きにくくなり、蛍光異方性が増大するこ
とがその検出の原理となっている。

【００１５】ところが、これらの方法では、検体中に蛋
白質等の夾雑物が含まれていて、それがプロ−ブＤＮＡ
に非特異的に吸着すると、ハイブリッド体検出のバック
グランドを上昇させる原因となるため、あらかじめ完全
に除去するという煩雑な作業が必要となる。また、非特
異的吸着、及び、塩基のミスマッチは他の溶液系の場合
と同様、それをあらかじめ除去する操作が必要である。
さらに、確かにＢ／Ｆ分離は必要ないもののプローブ濃
度が標的ＤＮＡ濃度と同程度であることが蛍光の変異を
測定する上で必要となる。

【００１６】ところで、最近、ＤＮＡの二本鎖に二種類
の色素を遊離の状態で混合した時に、これらの色素間で
ＤＮＡを介した電荷移動が検出されたという報告がある
（J.Am.Chem.Soc.1992,114,3656-3660) 。それは、蛍光
を持つ電子供与体（エチジウムブロマイド、あるいは、
アクリジンオレンジ）にそれぞれの励起波長に対応する
波長の光を照射すると、もう一つの色素（電子受容体；
N,N'-dimetyl-2,7-diazapyrenium dichloride ）存在下
では、その蛍光強度が減少するというもので、両色素が
インターカレーターと考えられていることから電子がＤ
ＮＡの二重らせんを介して電子供与体から電子受容体の
ほうへ流れているというものである。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、ハイブ
リダイゼ−ション反応を用いた標的核酸の検出法でＢ／
Ｆ分離を必要とする場合は、標的核酸を固定した場合
も、固定しない溶液系の場合も、Ｂ／Ｆ分離（過剰なプ
ローブの除去）、非特異吸着やミスマッチの除去などの
操作を数多く含み、かなり煩雑である。しかも、これら
の操作の最適条件はプロ−ブの長さ、或は、それぞれの
塩基配列によって異なるため、それぞれの場合で条件を
検討し、設定していく必要がある。特に、ミスマッチし
ている塩基のプロ−ブ上の位置もハイブリッド体の安定
性に影響を与える重要な因子となり、その位置によって
はミスマッチしているハイブリッド体を除去できない場
合も生じるため、ミスマッチの可能性を考慮して、ハイ
ブリダイゼ−ション反応の条件を個々のケースに応じて
設定するという更に煩雑な作業が必要となる。

【００１８】また、上述のＢ／Ｆ分離を必要としない蛍
光の変異を測定する方法でも、非特異吸着やミスマッチ
の発生を防止する、あるいは発生した非特異吸着やミス
マッチを除去するための煩雑な処理が必要である。しか
も、夾雑物の存在によって測定感度が影響を受けたり、
プロ−ブ濃度が標的核酸濃度と同程度であることが必須
であるので、十分な量の試料を確保する必要があり、少
量しか採れない試料の分析に適用できない場合があると
いった問題がある。

【００１９】また、先にあげた、二種類の色素を遊離の
状態で２本鎖ＤＮＡに加え、インターカレートさせて得
られる相互作用は、ＤＮＡにインターカレートしている
色素間、及びＤＮＡにインターカレートしている色素と
遊離の色素間、及び遊離色素間の電荷移動の平均値であ
る。すなわち、ＤＮＡに２種類の色素がインターカレー
トしていて、ＤＮＡを介した電荷移動のみが相互作用と
して得られるではなく、遊離の色素に由来する測定のバ
ックグランドが必ず生じる。また、２種類の色素がＤＮ
Ａにインターカレートしている系でも、両色素間の距離
はまちまちで、得られる相互作用はそれらの平均値とな
る。

【００２０】本発明は、以上のような従来技術における
問題に鑑みなされたものであり、Ｂ／Ｆ分離の必要がな
く、より簡易化された工程からなり、良好な測定感度を
得ることができるハイブリダイゼーションを利用した標
的核酸の検出方法及びそれに用いるプローブを提供する
ことにある。

【００２１】本発明の他の目的は、ミスマッチしている
ハイブリッド体が存在する場合でも所望のハイブリッド
体のみを正確に検出できる標的核酸の検出方法及びそれ
に用いるプローブを提供することにある。

【００２２】

【課題を解決するための手段】本発明の標的核酸の検出
方法は、試料溶液中に少なくとも２種の色素を結合させ
たプローブを加えてこれらを反応させる過程と、該試料
溶液中に標的核酸が存在する場合に得られるプローブと
標的核酸とのハイブリッド体の２重らせん構造の検出
を、該２重らせん構造を介した前記色素間の電荷移動に
より生じる光学的変化を検出することにより行うことを
特徴とする。

【００２３】本発明の検出方法は、従来の方法とはまっ
たく異なる原理に基づいてハイブリッド体を検出するも
のである。すなわち、本発明の方法は、ハイブリッド体
形成にともなう二重らせん構造の形成を検出するもので
あり、Ｂ／Ｆ分離が不要である。さらに、本発明におい
ては、正確な２重らせん構造のみ検出できる条件を設定
することで、非特異吸着やミスマッチが生じでいてもそ
のまま所望の核酸ハイブリッド体の形成が検出可能とな
り、測定精度を向上させることが可能である。なお、本
発明は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、ＤＮ
Ａ−ＲＮＡハイブリダイゼーションなど２重らせん構造
を形成する場合に適用される。

【００２４】以下、本発明について詳細に説明する。

【００２５】ハイブリダイゼ−ションという現象は、こ
れまで単に、互いに相補的な核酸塩基間の水素結合とい
う視点でとらえられていたにすぎない。それは、核酸
（ＤＮＡやＲＮＡ）を固定化させてからハイブリダイゼ
−ション反応を行なうことが一般的であったからであ
る。しかし、溶液中でのハイブリダイゼ−ション反応の
場合には、核酸がある長さで二本鎖を形成すれば、二重
らせん構造をとることが期待される。本発明者らは、核
酸が一本鎖の場合と二本鎖（ハイブリッド体）の場合
に、その高次構造や化学的性質が異なることに着目し、
その検出システムを確立し、本発明を完成した。

【００２６】２重らせん構造では、核酸塩基部分が水素
結合により塩基対を形成し、リン酸部分及び糖の部分は
外側に向いた形でらせんを巻く。核酸塩基はお互いに積
み重なりスタッキングにより安定化してらせん軸の中心
に位置する。二重らせん構造としては、Ａ、Ｂ、Ｃ及び
Ｚ型、そして、これらの変形が知られている。それぞれ
の構造は、塩基配列だけでなく、アニーリングの際に用
いるイオン種や塩濃度によって、ピッチ長、らせんの対
称性、溝の幅、溝の深さなどが異なり、同じ配列を用い
た場合でも条件によって２重らせん構造が変化するとい
われている。一般的には、ＤＮＡはＢ型構造をとるとい
われ、その場合、ピッチ長は３３．８オングストロ−
ム、１ピッチ当たりの核酸塩基対数は１０塩基といわれ
ている。

【００２７】本発明は、ハイブリッド体の有する２重ら
せん構造を、該２重らせん構造との電荷移動により検出
可能な光学的変化を起し得る色素を用い、該色素の光学
的変化を測定することで２重らせん構造の形成を検出す
る方法である。

【００２８】この色素としては、２重らせん構造を介す
る電荷移動による変化を起すものなどが利用できる。こ
の場合、２種以上の色素には、少なくとも電子供与体と
なる色素と、電子受容体となる色素のセットが含まれ
る。

【００２９】この電子供与体と電子受容体の組合せを用
いる方法は、一本鎖から二本鎖、つまり、二重らせんへ
の構造変化にともない、電子供与体と電子受容体との間
の２重らせん構造を介した電荷移動により起る電子供与
体または電子受容体の光学的変化を測定することでハイ
ブリッド体を検出するものである。

【００３０】本発明において、電子受容体と電子供与体
の関係は、両者のエネルギ−状態の関係で決まるもので
ある。従って、本発明においては、電子供与体または電
子受容体として一般に定義された物質が、その定義のと
おりに用いられるのではなく、これらの電荷移動におけ
る関係において、電子供与体または電子受容体となり得
る色素を適宜選択して用いる。例えば、アントラセンは
典型的な電子供与体として、その酸化還元電位が測られ
ている一方で、電子受容体としてもその特性が調べられ
ていることはよく知られたことである。

【００３１】電子受容体と電子供与体の間の２重らせん
構造を介した電荷移動は、核酸塩基対のスタッキングを
介して行われる。この核酸塩基間のスタッキングを介す
る場合とは、２重らせん構造と反応できる位置に置かれ
た電子供与体と電子受容体の距離が本来相互作用できな
いほど離れている時、電子供与体から放出された電子
が、核酸塩基対上に広がる電子雲を介して、電子を次々
隣接する核酸塩基対に受け渡され、最終的に電子受容体
にまで電子を到達させるというものである。また、逆
に、電子受容体が核酸塩基対から電子を引き抜き、それ
が連鎖的に行われて最終的に電子供与体から電子が奪い
取られるという機構も成り立つ。つまり、電荷移動にお
けるメディエ−タ−が、核酸塩基対ということになる。

【００３２】なお、２重らせん構造を介した電子供与体
と電子受容体の間での電荷移動が起こりにくい場合に
は、これらの間に電荷移動を仲介するようなメディエー
ター、或は、センシタイザーと称される物質を介在させ
てもよい。

【００３３】上記のように、本発明においては色素（電
子供与体と電子受容体）が２重らせん構造と反応できる
位置に配置されて、これらの相互作用が生じる必要があ
る。色素が二重らせん構造と反応可能な位置に配置され
る方式としては、インターカレーターのように核酸塩基
対の間に入り込む場合、二重らせん構造の溝に埋め込ま
れる場合、更に、二重らせん構造に寄り添う形で配置さ
れる場合等が利用できる。いずれの場合も、一本鎖であ
るプロ−ブと標的核酸とによって形成されたハイブリッ
ド体の２重らせん構造に特異的に配置されることが本発
明にとって本質的に必要なことである。

【００３４】これらの中では、インターカレーターは、
スタッキングを介する電荷移動を利用する場合に最も有
利である。つまり、インターカレーターは、一般には、
電子の広がりを持つ平面状の化合物で、核酸塩基対の積
み重なりの延長線上に、核酸塩基対間の距離と同じよう
な距離で、核酸塩基対と平行な位置に配向する。例え
ば、電子供与体としてインターカレーターを用い、２重
らせん構造の反対側に電子受容体を配置すれば、電子供
与体から放出された電子が、隣接する核酸塩基対に電子
が送られ、それがそれぞれの核酸塩基対の電子雲を経由
して、一直線に電子受容体に向かって流れ得る。或は、
この逆に、電子受容体としてインターカレーターを用
い、２重らせん構造を挟んだ反対側に電子受容体を配置
すれば、電子受容体上の電子孔により隣接する核酸塩基
対から電子を引き抜き、この電子の引き抜きが他の核酸
塩基対間に次々と生じて最終的に最終的に電子供与体か
ら電子を引き抜き、電荷移動が行われる場合もある。こ
れらの点から考えると、プローブに結合すべき少なくと
も２種の色素は共にインターカレーターであることが重
要である。インターカレーターは二重らせん構造を安定
化させ、その融解温度を上昇させることが知られてお
り、電子供与体や電子受容体がインターカレーターであ
ることは、プロ−ブと標的核酸間のハイブリッド体を安
定化させるという点でも有利である。

【００３５】本発明においては、２重らせん構造を介し
た少なくとも２種の色素（電子供与体と電子受容体）間
での電荷移動が、２重らせん構造が存在しない場合には
生じないように条件を設定することも必要である。この
ような条件は、たとえば、（ａ）２重らせん構造に伴な
うスタッキングを介してのみ電荷移動が起るような酸化
還元電位をもつ色素のセットを選択する、（ｂ）２重ら
せん構造の存在がなくても電荷移動が可能な色素のセッ
ト（電子供与体と電子受容体のセット）を用いた場合
は、これらの色素の間の距離をこれらの間での電荷移動
が起きないようにこれらをプローブに結合させ、かつ複
数のプローブ分子間でのこれらの反応が生じないように
プローブの濃度を適宜選択する等の方法により達成でき
る。

【００３６】なお、電子供与体と電子受容体のセットを
用いる場合に、これらを２重らせん構造の存在しない状
態で反応させたときに、これらの間での電荷移動が生じ
る場合でも、その電荷移動に基づく光学的変化が、２重
らせん構造の存在下での光学的変化に比べて小さく、２
重らせん構造の存在下での光学的変化を十分に検出でき
る場合はこの限りではない。

【００３７】本発明に用いる色素の光学的変化の検出法
は、その光学的変化によっていくつかの種類に分類でき
る。

【００３８】例えば、電荷移動吸収帯のように、新しい
吸収スペクトルの出現、或は、変化としてとらえること
もできる。電荷移動の結果、溶液が着色、変色するよう
な系は、直接その変化を目でとらえることができ、簡便
な系として、さらに有効である。蛍光やリン光のような
発光系も利用できる。この場合、蛍光やリン光が新たに
生じる反応や、発光していたものが相互作用の結果消失
する反応を利用できる。

【００３９】本発明では、電子供与体としての色素が光
によって活性化されて電子を放出し電荷移動が開始され
る場合のほか、電子供与体としての色素が他の物質によ
って刺激されて電子を発生させるようなものでもよい。

【００４０】さらに、電子受容体である色素の方を活性
化して、それに誘起されて電子が電子受容体から引き抜
かれてもよい。そして、その開始剤としては、電子供与
体における場合と同様、光の他、何らかの開始剤であっ
てもよい。

【００４１】また、先に述べたように、電子供与体であ
る色素と電子受容体である色素との間の電荷移動を仲介
するようなメディエ−タ−、或は、センシタイザ−と称
される物質が介在しても良い。そして、これらの物質が
２重らせん構造との電荷移動反応を行う結果として、直
接２重らせん構造とは結合していないその他の電子供与
体や電子受容体に電荷移動を促しても良い。

【００４２】色素のプローブへの結合は、必要に応じて
例えば（ＣＨ₂ ）_n のようなリンカーを介して行い、そ
の際これらの相互作用が最も効率よくなされるようにこ
れらの位置関係等を配慮する。

【００４３】電子供与体である色素と電子受容体である
色素の両方がプロ−ブに結合していることで、相互作用
するこれら色素間の位置関係が明確となるため、その相
互作用の制御を、プローブでのこれらの位置関係によっ
て行うことができる。この場合、電子供与体である色素
と電子受容体である色素のプローブ上での距離は、用い
る色素の種類に応じて適宜選択されるが、例えば、２０
〜１５０オングストロームであることが好ましく、５０
〜８０オングストロームであることがより好ましい。こ
れらをプローブに結合する場合の位置は、プローブの長
さにもよるが、プローブの両端に分けて結合するのが、
結合の容易性の点から有利である。

【００４４】なお、プローブの長さは、標的核酸との良
好なハイブリダイゼーションが可能で、安定した２重ら
せん構造が得られる長さが個々のケースにおいて適宜選
択されるが、例えば近接していると２重らせん構造の存
在しない場合でも相互作用を起こす２種の色素を用いる
場合にはこれらの距離を考慮して決定されるが、例え
ば、８塩基長以上、好ましくは１２塩基長以上とされ
る。

【００４５】しかしながら、２重らせん構造の安定化に
は、プローブ長の他に、塩基配列自体、反応系の塩濃度
やイオン強度も大きく影響する。Ｇ−Ｃ塩基対は、Ａ−
Ｔ塩基対よりも水素結合数が多いため、ＧＣが多い配列
ではより安定な２重らせん構造が形成される。また、Ｋ
Ｃｌのモル濃度を０．０１Ｍから１Ｍに上昇させるとＤ
ＮＡの融点温度は３０℃上昇するといわれている。ま
た、インターカレーターの存在も安定に大きく寄与す
る。従って、これらの安定化因子を適宜利用することに
よって、８塩基長未満のプローブを用いることも可能で
ある。

【００４６】色素の電荷移動による変化は、不可逆的な
ものであることが望ましい。すなわち、変化が不可逆的
なものであれば、変化を蓄積して検出することも可能で
あり、その場合感度の点で有利である。

【００４７】

【実施例】以下実施例により本発明を更に詳細に説明す
る。

【００４８】実施例１（１）N,N'-Dimetyl-2,7-diazapyrene bis(tetrafluoro
borate) （ＤＡＰ²⁺）のスクシイミドエステル化ＤＡＰ²⁺はHunig らの方法（Ann.Chem.1973,339)により
合成した。次に、精製後のＤＡＰ²⁺と無水コハク酸とを
Friedel-Crafts反応させ、カルボキシル基を導入して精
製物(I)を得た。さらに、精製物(I)の０．５ｇをアルゴ
ン気流下、１００ｍｌの遮光した反応容器に入れ、乾燥
ＤＭＦ３０ｍｌに溶解した。−１０℃に冷却した後、
Ｎ，Ｎ'-ジスクシイミジルカーボネート０．４ｇを添加
した。同温度で５時間反応させた後、クロロホルム１５
０ｍｌに反応液を注入し、食塩水２００ｍｌで３回洗
浄、水洗し溶媒留去した。残渣をシリカゲルカラムで精
製後、エタノール−イソプロピルエーテルから結晶化さ
せて、ＤＡＰ²⁺(II)を得た。

【００４９】（２）核酸へのアミノ基、チオ−ル基の導
入標的核酸としてのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（一本鎖）の塩
基配列の一部に相補的な塩基配列を有する２０量体オリ
ゴヌクレオチドを、ＡＢＩ社製３８１Ａ、ＤＮＡ自動合
成機で合成した。合成時、通常のアミダイド試薬ＣＰＧ
の代わりにミリジェン社製Ｆｍｏｃ３’−アミノ−モデ
ィファイア−ＣＰＧカラム(III) を用いて３’側にアミ
ノ基を導入した。さらに、合成後、通常のアミダイド試
薬の代わりにミリジェン社製５’−ヘキサノールチオ−
ルリンカー(III') を用いて５′側にチオ−ル基を１個
導入した。

【００５０】ＣＰＧ−サポートからの切り出し、脱保
護、高速液体クロマトグラフィーによる精製は、所定の
プロトコールに従った。オリゴヌクレオチドの塩基配列
は次のとおりである。

【００５１】５’−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣ
ＣＡＧＴ−３’ （３）プローブとＤＡＰ²⁺との結合アミノ基およびチオール基を結合させた上記オリゴヌク
レオチド５００μｇ、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
＝７．０）１００μｌ、水７００μｌを混合溶解した
後、これに、あらかじめ２００μｌのＤＭＦに溶解した
ＤＡＰ²⁺ (II) ２ｍｇを攪拌下ゆっくりと添加した。４
０℃で２４時間反応させたところ、高速液体クロマトグ
ラム上で核酸のピークが消え新たに核酸とＤＡＰ²⁺の吸
収を合わせ持ったピークが出現したので反応液をゲル濾
過カラム（ファルマシア社製ＮＡＰ−５０）で粗精製
した後、高速液体クロマトグラフィーで精製した。４５
０μｇの３’ＤＡＰ²⁺・プローブ複合体(IV)を得た。

【００５２】（４）プローブとアクリジンとの結合上記（３）で得た５´側にチオール基を有するプローブ
複合体(IV)４００μｇ、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ＝６．０）１００μｌ、水７００μｌを混合溶解
した後、これにあらかじめ２００μｌのＤＭＦに溶解し
たＮ−９−アクリジニルマレイミド（Ｖフナコシ）１
ｍｇを攪拌下ゆっくりと添加した。４０℃で２４時間反
応させた後、反応液をゲル濾過カラムで粗精製し、更に
高速液体クロマトグラフィーで精製した。４１０μｇの
５’アクリジン・３’ＤＡＰ²⁺・プローブ複合体(VI)を
得た。

【００５３】（５）色素プロ−ブとＭ１３ｍｐ１８ＤＮ
Ａとのハイブリッド体形成反応上記（４）で作製されたプローブ複合体(VI)０．２μＭ
と、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（宝酒造社製）０．２μＭを
１ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）／１４５ｍＭＮ
ａＣｌ／５ｍＭＫＣｌ中で８０度に加熱し、その後、
徐々に冷却して室温まで下げて、プロ−ブ複合体(VI)と
Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡとのハイブリッド体を形成した。
アクリジンの吸収スペクトルはハイブリッド体形成に伴
って約２０ｎｍ長波長にシフトした。

【００５４】（６）アクリジンの蛍光消光モノクロメ−タ−のついた光照射装置を用いてアクリジ
ンの励起波長である４９０ｎｍの光を当てながら５３３
ｎｍの蛍光をモニタ−した。プロ−ブ単独の時には、光
を長時間照射すると若干蛍光消光が見られた。各照射時
間でのプロ−ブ単独の蛍光強度を１として、プロ−ブ複
合体(VI)とＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡとのハイブリッド体の
蛍光強度比を求めた（図１）。

【００５５】ハイブリッド体の蛍光は時間と共に減少し
た。このことは、プロ−ブ複合体(ＶＩ)／Ｍ１３ｍｐ１
８ＤＮＡ二本鎖を介してアクリジンからＤＡＰ²⁺へ電荷
が移動した結果、アクリジンの蛍光が消光したことを示
している。つまり、Ｂ／Ｆ分離なしに、プロ−ブ複合体
(VI)／Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡハイブリッド体が検出でき
たことになる。

【００５６】（７）アクリジンの吸収スペクトルの経時
変化プロ−ブ複合体(VI)単独の場合と、プロ−ブ複合体(VI)
／Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡハイブリッド体の形成の場合に
ついて４９０ｎｍの光照射後のアクリジンの吸収スペク
トルの経時変化を観測した。プロ−ブ複合体(VI)単独で
も、長時間の光照射を行うとアクリジン−ＤＡＰ²⁺間の
電荷移動に伴う吸収スペクトリの減少が見られる。しか
しながら、各時間でのプロ−ブ複合体(VI)の吸収強度を
１として、それぞれの照射時間に対するプロ−ブ複合体
(VI)／Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡハイブリッド体の吸収減少
比を測定した（図２）。すると、プロ−ブ複合体(VI)単
独の場合に対して有意なプロ−ブ複合体(VI)／Ｍ１３ｍ
ｐ１８ＤＮＡハイブリッド体での吸収強度の減少が見ら
れ、アクリジンからＤＡＰ²⁺への電荷移動がＤＮＡのス
タッキングを介して行われた事が示された。

【００５７】実施例２下記の塩基配列のオリゴヌクレオチドをプローブとして
用いる以外は、実施例１と同様にして、５’末端にアク
リジンを、３’末端にＤＡＰ²⁺を結合させたプローブを
作成し、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡと反応させ、蛍光消光及
び吸収強度の減少の測定を行った。

【００５８】５’−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＧＧＡＣＧＧＣ
ＣＡＧＴ−３’ なお、この塩基配列は、実施例１で用いたプローブ用塩
基配列の５’末端から１０番目のＣをＧに変換したもの
であり、Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡとミスマッチするもので
ある。

【００５９】その結果、実施例１で観測された蛍光消
光、吸収強度の減少はともに観測されず、ハイブリッド
体の形成による電荷移動はおこらなかったことが確認さ
れた。このことは、ハイブリッド体のミスマッチが生じ
ても検出されないことを示している。

【００６０】

【発明の効果】本発明の標的核酸の検出方法は、Ｂ／Ｆ
分離が必要ないという利点を持つ。その結果、従来法で
不可欠であった過剰なプロ−ブの除去、非特異吸着を除
くための繁雑な処理、その条件検討等、数多くの操作が
不要になった。

【００６１】さらに、正確なハイブリッド体でのみ信号
変化が観測されるように試薬物質選択することで、反応
系中にミスマッチが発生している場合でも、正確な２重
らせん構造を形成しているハイブリッド体のみを検出す
ることが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１において得られたアクリジンの蛍光消
光を示すグラフである。

【図２】実施例１において得られたアクリジンの吸収強
度比の減少を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ 7055−2Ｊ // Ａ６１Ｂ 10/00 (72)発明者富田佳紀東京都大田区下丸子３丁目30番２号キヤノン株式会社内 (72)発明者牧野圭祐京都府京都市左京区上高野西明寺山33−24 (72)発明者村上章京都府京都市左京区岩倉中町363−１

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料溶液中に少なくとも２種の色素が結
合したプローブを加えてこれらを反応させる過程と、該
試料溶液中に標的核酸が存在する場合に得られるプロー
ブと標的核酸とのハイブリッド体の２重らせん構造の検
出を、該２重らせん構造を介した前記色素間の電荷移動
により生じる光学的変化を検出することにより行うこと
を特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項２】プローブに電子供与体である色素と、電
子受容体である色素が結合している請求項１に記載の方
法。
【請求項３】電荷移動が、２重らせん構造を構成する
塩基対のスタッキングを介して行われる請求項１または
２に記載の方法。
【請求項４】色素の少なくとも１種が、２重らせん構
造を構成する核酸塩基に対するインターカレーターであ
る請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】電荷移動が、光照射により開始される請
求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】プローブの一方の端部に電子供与体であ
る色素が、他方の端部に電子受容体である色素が結合し
ている請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】色素の光学的変化が不可逆的である請求
項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】標的核酸とのハイブリダイズのための配
列を有する標的核酸検出用プローブであって、該プロー
ブに、前記標的核酸のハイブリダイゼーションにより形
成される２重らせん構造を介した電荷移動により検出可
能な光学的変化を起こす少なくとも２種以上の色素が結
合されてなることを特徴とする標的核酸検出用プロー
ブ。
【請求項９】電子供与体である色素と電子受容体が結
合している請求項８に記載のプローブ。
【請求項１０】電荷移動が、２重らせん構造を構成す
る塩基対のスタッキングを介して行われる請求項８また
は９に記載の方法。
【請求項１１】色素の少なくとも１種が、２重らせん
構造を構成する核酸塩基に対するインターカレーターで
ある請求項８〜１０のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１２】電荷移動が、光照射により開始される
請求項８〜１１のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１３】一方の端部に電子供与体である色素
が、他方の端部に電子受容体である色素が結合している
請求項８〜１２のいずれかに記載のプローブ。
【請求項１４】色素の光学的変化が不可逆的である請
求項８〜１３のいずれかに記載のプローブ。