JP2007215477A - 蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ - Google Patents

Abstract

【課題】ＤＮＡを含めた標的核酸の検出を、均一系および不均一系のいずれにおいても可能にする蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブならびに当該プローブを用いた標的核酸の検出方法および一塩基多型の識別方法を提供すること。
【解決手段】２’ピレン修飾ヌクレオチドおよびそれに隣接して配置されるＡ型構造を誘起する核酸を含む蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブおよび当該プローブを使用する標的核酸の検出方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブならびに当該プローブを使用した標的核酸の検出方法および一塩基多型の識別方法に関する。

プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションは、インサイチュハイブリダイゼーションのような基礎研究から、疾患関連遺伝子の検出のような臨床検査まで広い用途に用いられている。従来のハイブリダイゼーションでは、標的核酸またはプローブのいずれかを固相に固定化していた。このようなハイブリダイゼーション系を不均一系と称する。不均一系において、ハイブリダイゼーションの有無にかかわらずシグナルを発する標識を使用する場合には、標的核酸とハイブリダイズしたプローブを特異的に検出するために、標的核酸とハイブリダイズしたプローブとハイブリダイズしていない遊離のプローブとを洗浄によって分離する操作（Ｂ／Ｆ分離）が必要である。

固定化／洗浄操作を要する不均一系の問題点を解決するために、標的核酸とプローブがハイブリダイズした場合のみに信号が発せられるような標識を使用する方法が開発された。このようなハイブリダイゼーション系は均一系と称する。例えば、蛍光共鳴エネルギー転移（fluorescence resonance energy transfer、ＦＲＥＴ）を利用したモレキュラー・ビーコンと呼ばれる方法では、標的配列とアニールする１本鎖ＤＮＡのループと、このプローブ配列を挟むように設計された相補配列（アーム）がアニールした２本鎖のステムからなるヘアピン型オリゴヌクレオチドプローブの末端をレポーター色素およびクエンチャー色素で標識したものを使用する。ここで、標的配列とプローブ配列がアニールすると、レポーター色素とクエンチャー色素が近接していたステムの形が崩れ、レポーター色素から蛍光が放出される（非特許文献１）。この方法では、プローブがステム構造をとるよう設計する必要があるので、配列の選択に制約があり、またプローブがステム構造をとっている場合と標的配列とアニールした場合の安定性の差異を利用するため、反応・検出において厳密な温度管理を要するといった問題があった。このような問題のために、例えば、遺伝子中の一塩基のみの変異（一塩基多型、single nucleotide polymorphism（ＳＮＰ））の識別への適用は困難であった。

本発明者らは、単独では青い蛍光を発する多環式芳香族化合物であるピレンをＲＮＡプローブに導入すると蛍光活性が失われ、このピレン修飾ＲＮＡプローブを相補的な塩基配列を持つ標的ＲＮＡにハイブリダイズさせると蛍光活性が回復することを見出した（特許文献１）。さらに、この技術を利用して細胞内でのＲＮＡの検出を可能とした（特許文献２）。このＲＮＡプローブでは、上記モレキュラー・ビーコンにおいて使用されるプローブのようにステムを形成する必要がないので、任意の配列を使用することができ、幅広い温度で検出を実施できるなどの利点がある。従って、ＳＮＰの識別にも適用することができる。さらに、ピレンは発光寿命が長く、熱にも安定であるので、例えば、ＰＣＲ反応の間にリアルタイムで増幅産物をモニターするなど多様な目的に利用することができる。しかし、上記のような蛍光活性の回復は標的核酸がＤＮＡの場合では見られないので標的ＤＮＡの検出には利用できず、また標的核酸の特異的な検出のためには、より高い蛍光強度を示すプローブが求められていた。なお、標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションに際して蛍光の発光が見られないことの原因を示唆する研究としては、ＤＮＡ二重鎖ではピレンがインターカレートされているが、ＲＮＡ二重鎖ではピレンがインターカレートされずに二重鎖の外側に位置することを示したものがある（非特許文献２）。しかし、ピレン修飾ＲＮＡプローブを用いて標的ＤＮＡを検出するために有効な手段は知られていなかった。

特開２０００−３２９９９号公報 特開２００４−８１０５７号公報 国際公開第０２／０６２９７号パンフレット 特開２００１−８９４９６号公報 Tyagi, S. et al., Nat. Biotechnol., 14:303-308 (1996) Nakamura, M. et al., Nucleic Acids Res., 33:5887-5895 (2005) Hrdlicka, P.J. et al., J. Am. Chem. Soc., 127:13293-13299 (2005) Kalyanasundaram, K. et al., J. Am. Chem. Soc., 99:2039-2044 (1977) Cho, N. et al., J. Am. Chem. Soc., 115:6349-6356 (1993)

本発明は上記のような従来技術の問題を解決するものである。すなわち本発明の主な目的は、ＤＮＡを含めた標的核酸の検出を、均一系および不均一系のいずれにおいても可能にする蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブならびに当該プローブを用いた標的核酸の検出方法および一塩基多型の識別方法を提供することである。

すなわち本発明は、
［１］２’ピレン修飾ヌクレオチドおよびそれに隣接して配置されるＡ型構造を誘起する核酸を含む蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ；
［２］Ａ型構造を誘起する核酸が２’ピレン修飾ヌクレオチドの３’側に配置される［１］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ；
［３］Ａ型構造を誘起する核酸が２’ピレン修飾ヌクレオチドの５’側に配置される［１］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ；
［４］Ａ型構造を誘起する核酸が２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン核酸（ＥＮＡ）または２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン核酸（ＢＮＡ）である［１］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ；
［５］Ａ型構造を誘起する核酸が２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン核酸（ＥＮＡ）である［４］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ；
［６］標的核酸としてのＤＮＡとハイブリダイズした際に蛍光を発する［２］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ；
［７］標的核酸としてのＲＮＡとハイブリダイズした際に蛍光を発する［１］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ；
［８］標的核酸とハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしていない遊離の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとの分離（Ｂ／Ｆ分離）を行わない均一溶液中での標的核酸の検出に使用される［１］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ；
［９］標的核酸または蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブのいずれかが固相に固定化されている標的核酸の検出に使用される［１］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ；
［１０］一塩基多型（ＳＮＰ）の識別に使用される［１］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ；
［１１］以下の工程を包含する標的核酸の検出方法：
（１）標的核酸に［１］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程；および
（２）標的核酸にハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが発する蛍光を検出する工程；
［１２］Ａ型構造を誘起する核酸が２’ピレン修飾ヌクレオチドの３’側に配置される蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを使用し、標的核酸がＤＮＡである［１１］記載の標的核酸の検出方法；
［１３］標的核酸がＲＮＡである［１１］記載の標的核酸の検出方法；
［１４］工程（１）において、均一溶液中でハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしていない遊離の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとの分離（Ｂ／Ｆ分離）を行わない［１１］記載の標的核酸の検出方法；
［１５］工程（１）において、標的核酸または蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブのいずれかが固相に固定化されている［１１］記載の標的核酸の検出方法；
［１６］以下の工程を包含する標的核酸における一塩基多型の識別方法：
（１）標的核酸に［１］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程；および
（２）標的核酸にハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが発する蛍光を検出する工程であって、ここで蛍光発光の有無に基づいて一塩基多型が識別される工程；
［１７］Ａ型構造を誘起する核酸が２’ピレン修飾ヌクレオチドの３’側に配置される蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを使用し、標的核酸がＤＮＡである［１６］記載の一塩基多型の識別方法；
［１８］標的核酸がＲＮＡである［１６］記載の一塩基多型の識別方法；
［１９］工程（１）において、均一溶液中でハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしていない遊離の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとの分離（Ｂ／Ｆ分離）を行わない［１６］記載の一塩基多型の識別方法；
［２０］工程（１）において、標的核酸または蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブのいずれかが固相に固定化されている［１６］記載の一塩基多型の識別方法；
［２１］［１］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを含有する標的核酸検出用組成物；
［２２］［１］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを含有する標的核酸検出用キット；
［２３］［１］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを含有する一塩基多型識別用組成物。
［２４］［１］記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを含有する一塩基多型識別用キット。；
に関する。

ＤＮＡを含めた標的核酸の検出を、均一系および不均一系のいずれにおいても可能にする蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブならびに当該プローブを用いた標的核酸の検出方法および一塩基多型の識別方法が提供される。

本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブは、２’ピレン修飾ヌクレオチドおよびそれに隣接して配置されるＡ型構造を誘起する核酸を含むことを特徴とする。

本明細書において、「２’ピレン修飾ヌクレオチド」とは、２’位のＯＨ基にピレンを共有結合したヌクレオチドをいう。

本発明によれば、ピレンの代わりに、蛍光を発するその他の多環式芳香族化合物を使用することもできる。そのような多環式芳香族化合物としては、限定するものではないが、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン、キノリン、フルオランテン、クリセン、ベンゾ［ａ］ピレン、ペリレン、５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルフォネート等が例示される。また、上記化合物は、置換基を有していてもよい。そのような置換基としては、限定するものではないが、炭素数１〜４で表される炭化水素基、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、エステル、カルボニル、ニトリル、アミド、ハロゲン元素等が例示される。上記化合物は、このような置換基を１又は２以上有していてもよく、２以上有する場合は、同じ置換基を有していても異なる置換基を有していてもよい。

２’ピレン修飾ヌクレオチドの作製方法は公知であり、特許文献１および特許文献２などに記載されている。例えば、本発明によれば、２’−Ｏ−（１−ピレニルメチル）シチジン（2'-O-(1-pyrenylmethyl)cytidine、Ｃｐｙ）が好適に使用される。

本明細書において、「Ａ型構造を誘起する核酸」とは、核酸の二重鎖においてＡ型構造を誘起する核酸をいう。核酸の二重らせん構造としては「Ａ型」、「Ｂ型」および「Ｚ型」が知られている。二重鎖を形成していない一本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、フラノース環は主に２つの配座、Ｓ型（２’−エンド配座）およびＮ型（３’−エンド配座）の平衡状態で存在する。一方、二重鎖を形成すると配座は固定化される。ＤＮＡ：ＤＮＡの二重鎖ではフラノース環は一般にＳ型（２’−エンド配座）に固定化されて二重鎖はＢ型構造をとり、ＲＮＡ：ＤＮＡやＲＮＡ：ＲＮＡの二重鎖ではフラノース環は一般にＮ型（３’−エンド配座）に固定化されて二重鎖はＡ型構造をとることが知られている。すなわち、本発明のＡ型構造を誘起する核酸は、核酸の二重鎖が、Ｂ型構造ではなく、Ａ型構造をとりやすいように作用する任意の核酸である。

元来、生体内での安定性を付与するために開発された２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン核酸（2'-O,4'-C-methylene nucleic acid、bridged nucleic acid（ＢＮＡ）またはlocked nucleic acid（ＬＮＡ））（特許文献３）や２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン核酸（2'-O,4'-C-ethylene nucleic acid、ＥＮＡ）（特許文献４）においては、フラノース環はＮ型（３’−エンド配座）に固定化されている。その結果、このような核酸を含むオリゴヌクレオチドにはＡ型構造をとる性質が付与される。従って、本発明においてこれらの核酸をＡ型構造を誘起する核酸として使用することができる。好ましくは、ＥＮＡをＡ型構造を誘起する核酸として使用することができる。

本明細書において「標的核酸」とは、検出しようとする配列を含む任意の核酸をいう。標的核酸はＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよい。特に、下記のように、Ａ型構造を誘起する核酸を、２’ピレン修飾ヌクレオチドの３’側に隣接して配置した蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを使用することによって、標的ＤＮＡの検出が可能であることが本願によって示された。

本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブは、上記２’ピレン修飾ヌクレオチドおよびＡ型構造を誘起する核酸を含むものであれば特に限定はされない。１つの実施態様において、本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブは、２’ピレン修飾ヌクレオチドおよびＡ型構造を誘起する核酸を含む２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（2'-O-methylribonucleotide、２’−ＯＭｅＲＮＡ）オリゴマーであってもよい。２’ピレン修飾ヌクレオチドおよびＡ型構造を誘起する核酸以外の全てのヌクレオチドを２’位をメチル化したＲＮＡとすることにより、ヌクレアーゼに対して耐性を付与し、目的とする核酸と安定にハイブリダイズさせることができる。本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブの長さは特に限定されない。長さは、例えば、１０〜１０００ヌクレオチド、好ましくは１２〜５００ヌクレオチド、より好ましくは１５〜１００ヌクレオチドである。本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ中の２’ピレン修飾ヌクレオチドおよびＡ型構造を誘起する核酸の位置は、２’ピレン修飾ヌクレオチドとＡ型構造を誘起する核酸との相対的な位置関係が規定のものであれば特に限定はない。

本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブの１つの実施態様において、Ａ型構造を誘起する核酸は、２’ピレン修飾ヌクレオチドの３’側に隣接して配置される。別の実施態様において、Ａ型構造を誘起する核酸は２’ピレン修飾ヌクレオチドの５’側に隣接して配置される。

本発明者らは、Ａ型構造を誘起する核酸を、２’ピレン修飾ヌクレオチドの３’側および／または５’側に隣接して配置することにより、標的ＲＮＡにハイブリダイズした際にピレンから発せられる蛍光が増強されることを見出した。この蛍光の増強は、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸との間で形成された二重鎖の安定化に部分的に起因する可能性があることが示唆されている。二重鎖の安定化は、例えば、二重鎖のＵＶ融解曲線を作成して決定された融点（Ｔｍ）の上昇によって特徴付けることができる。このような融点の決定方法は当該分野において公知である。

さらに本発明者らは、Ａ型構造を誘起する核酸を、２’ピレン修飾ヌクレオチドの３’側に隣接して配置することにより、標的ＤＮＡにハイブリダイズした際にピレンから蛍光が発せられることを見出した。本願以前には、２’ピレン修飾ヌクレオチドを含む蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブは、標的ＲＮＡとハイブリダイズした場合のみに蛍光を発することが知られていたので、このような知見は予想外であった。さらに、２’ピレン修飾ヌクレオチドと、Ａ型構造を誘起する核酸との相対的位置関係（３’側または５’側）が蛍光の発光に及ぼす影響も本願以前は知られていなかった。この効果はＡ型構造を誘起する核酸を、２’ピレン修飾ヌクレオチドの５’側に隣接して配置した場合には見られないことから、上記のような二重鎖の安定化に起因するのではなく、核酸との相互作用によって形成されるピレンの周辺環境の変化に起因すると考えられる。詳細には、Ａ型構造を誘起する核酸が２’ピレン修飾ヌクレオチドの３’側に配置される蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて標的核酸とのハイブリダイゼーションを行った際に、一本鎖の状態では塩基間にインターカレートしていたピレンが二重鎖の外に位置するようになることによって蛍光を発するようになった可能性が示唆される。このようなピレンの周辺環境の変化は、ピレン周辺の誘電率を測定してハム効果を検討することによって、またはＵＶスペクトルにおけるピークトップ波長シフトを調べることによって決定することができる。なお、ピレンおよびＬＮＡの両方を有する核酸２’−Ｎ−（ピレン−１−イル）カルボニル−２’−アミノＬＮＡ（2'-N-(pyren-1-yl)carbonyl-2'-amino-LNA）を含むプローブが非特許文献３に記載されている。このプローブの場合、単一の塩基にピレンおよびＬＮＡの両方が付加されているので、Ａ型構造を誘起する核酸を２’ピレン修飾ヌクレオチドの３’側に隣接して配置することを特徴とする本願発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとは構造が異なる。この文献に記載されるプローブの場合、標的ＤＮＡおよび標的ＲＮＡのいずれを添加した場合でも蛍光を発するので、本願発明のように、Ａ型構造を誘起する核酸と２’ピレン修飾ヌクレオチドとの位置関係を任意に選択することによって標的ＲＮＡのみに特異的な発光や標的ＲＮＡおよび標的ＤＮＡの両方についての発光を得るように設定することはできない。また、この文献に記載されるプローブが蛍光を指標とした一塩基多型の識別に使用できるかどうかは不明である。

本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを標的核酸の検出方法に使用することができる。本発明の標的核酸の検出方法は、以下の工程を包含することを特徴とする：
（１）標的核酸に上記本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程；および
（２）標的核酸にハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが発する蛍光を検出する工程。

本発明の標的核酸の検出方法の１つの実施態様においては、工程（１）において、均一溶液中でハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしていない遊離の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとの分離（bound-free separation、Ｂ／Ｆ分離）を行わない、すなわち均一系での検出が可能である。本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブは標的核酸とハイブリダイズしていない状態では蛍光を発しないが、標的核酸とハイブリダイズした際に蛍光を発するようになるので、Ｂ／Ｆ分離を必要としない。

あるいは、工程（１）において、標的核酸または蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブのいずれかを固相に固定化し、不均一系での検出を行うことも可能である。この場合もＢ／Ｆ分離は必ずしも必要ではないが、例えば、ハイブリッドを形成して固相に固定化されたもの以外の遊離状態の標的核酸または蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを洗浄によって除去するなど公知の手段によりＢ／Ｆ分離を行ってもよい。

本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを標的核酸における一塩基多型の識別方法に使用することができる。本発明の標的核酸における一塩基多型の識別方法は以下の工程を包含する：
（１）標的核酸に上記本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程；および
（２）標的核酸にハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが発する蛍光を検出する工程であって、ここで蛍光発光の有無に基づいて一塩基多型が識別される工程。

上記の本発明の標的核酸の検出方法と同様に、本発明の一塩基多型の識別方法は均一系および不均一系のいずれにおいても行うことができる。

一塩基多型の識別方法に用いる本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ中の２’ピレン修飾ヌクレオチドおよびＡ型構造を誘起する核酸の位置は、２’ピレン修飾ヌクレオチドとＡ型構造を誘起する核酸との相対的な位置が規定のものであれば特に限定はない。例えば、多型部位にＡ型構造を誘起する核酸を含み、それが２’ピレン修飾ヌクレオチドの３’側および／または５’側に配置されるように蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを設計することができる。

本発明によれば、上記本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを含有する標的核酸検出用組成物、標的核酸検出用キット、一塩基多型識別用組成物、一塩基多型識別用キットが提供される。

このような組成物またはキットには、本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ以外の任意の成分を含めることができる。例えば、ハイブリダイゼーション用の緩衝液や、コントロールの標的核酸を成分として含めてもよい。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１
（１）オリゴヌクレオチドの合成
本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブにおける、２’ピレン修飾ヌクレオチドと、Ａ型構造を誘起する核酸としてのＥＮＡとの相対的な位置関係が及ぼす影響を調べるために、４種類の２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（2'-O-methylribonucleotide、２’−ＯＭｅＲＮＡ）オリゴマーＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４を合成した。

これらのプローブの塩基配列を配列番号１〜４に示す。これらの配列はいずれもヒトｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ．Ｖ０１５１２）の２７９５−２８０９ｎｔと相補的である。Ｅ２、Ｅ３およびＥ４において、２’−Ｏ−（１−ピレニルメチル）シチジン（2'-O-(1-pyrenylmethyl)cytidine、Ｃｐｙ）の、３’側、５’側、または３’側および５’側のウリジンを２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンチミジン（2'-O,4'-C-ethylenethymidine、ＥＮＡ塩基Ｔ）に置き換えた。

２’−ＯＭｅＲＮＡの合成には自動合成機を用い、Ｃｐｙの導入はガスタイトシリンジを用いたマニュアル合成により行った。ＥＮＡ塩基Ｔの導入は、シグマアルドリッチジャパン（株）に委託した。常法により脱保護反応を行い、精製にはＨＰＬＣを用いた。

さらにヒトｃ−ｆｏｓ ｍＲＮＡの配列に基づいて標的ＲＮＡおよび標的ＤＮＡとして使用するオリゴリボヌクレオチドｃＯＲＮおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドｃＯＤＮを常法に従い合成した。これらのオリゴヌクレオチドの塩基配列を配列番号５および６に示す。

（２）標的核酸とのハイブリダイゼーション
上記（１）で合成した４種類の２’−ＯＭｅＲＮＡオリゴマーの各々０．７５μＭを、標的ＲＮＡとしてのオリゴリボヌクレオチドｃＯＲＮまたは標的ＤＮＡとしてのオリゴデオキシリボヌクレオチドｃＯＤＮ ０．７５μＭと、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１Ｍ ＮａＣｌ中１１℃でハイブリダイズさせ、励起波長３４２ｎｍの条件で３７５ｎｍにおける蛍光強度を測定した。結果を図１に示す。図１中、白軸は標的核酸非存在下での結果を、斜線軸は標的ＲＮＡ存在下での結果を、黒軸は標的ＤＮＡ存在下での結果を表す。１〜４の数字はそれぞれ２’−ＯＭｅＲＮＡオリゴマーＥ１〜Ｅ４を用いた場合の結果を表す。

図１に示すように、ＥＮＡ塩基Ｔを含まないＥ１の場合には標的ＲＮＡを用いた場合のみに蛍光の発光が見られた。同様に、Ｃｐｙの５’側に隣接してＥＮＡ塩基Ｔを含むＥ３の場合も標的ＲＮＡを用いた場合のみに蛍光の発光が見られたが、その強度はＥ１の場合よりも高かった。Ｃｐｙの３’側に隣接してＥＮＡ塩基Ｔを含むＥ２およびさらにＣｐｙの５’側にもＥＮＡ塩基Ｔを含むＥ４の場合には、標的ＲＮＡのみならず標的ＤＮＡを用いた場合にも蛍光の発光が見られた。

（３）二重鎖の融点の測定
上記（１）で合成した４種類の２’−ＯＭｅＲＮＡオリゴマーの各々０．７５μＭを、標的ＲＮＡとしてのオリゴリボヌクレオチドｃＯＲＮ ０．７５μＭと、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１Ｍ ＮａＣｌ中でハイブリダイズさせ、温度を３０℃から上昇させながら２６０ｎｍにおける紫外吸収を測定した。得られた結果に基づいてＵＶ融解曲線を作成し、それぞれの二重鎖の融点（Ｔｍ）を決定した。結果を表１に示す。

表１に示すように、ＥＮＡ塩基Ｔを含まないＥ１に比較して、ＥＮＡ塩基Ｔを含むＥ２〜Ｅ４の場合、Ｔｍが２〜６．５℃上昇した。これらの結果は、Ｅ２〜Ｅ４が、Ｅ１に比較して、標的ＲＮＡとより安定な二重鎖を形成することを示す。しかし、上記（２）において標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションに際して蛍光を発することが示された、Ｃｐｙの３’側に隣接してＥＮＡ塩基Ｔを含むＥ２およびＥ４について、Ｃｐｙの５’側に隣接してＥＮＡ塩基Ｔを含むＥ３と比較して特に高いＴｍが示されたわけではなかった。

（４）ハム効果に基づくピレン周辺環境の検討
ピレンは、周辺の環境によってその蛍光特性が変化する性質を有している。詳細には、蛍光スペクトルにおける各ピークの強度比が溶媒に依存して変化することが知られている。この効果はハム効果（Ham effect）といわれている（非特許文献４）。この性質を利用して本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ中のピレンの周辺環境を以下のように検討した。

ピレンモノマーは３７４ｎｍ、３８５ｎｍおよび３９４ｎｍの３つのピーク波長を示す。それぞれのピークをバンドＩ、バンドＩＩおよびバンドＩＩＩとする。上記（１）において合成した４種類の２’−ＯＭｅＲＮＡオリゴマーの各々と、標的ＲＮＡとしてのオリゴリボヌクレオチドｃＯＲＮまたは標的ＤＮＡとしてのオリゴデオキシリボヌクレオチドｃＯＤＮとを含む上記（２）および（３）と同じ組成を有する溶液について、バンドＩ、バンドＩＩおよびバンドＩＩＩの蛍光強度を測定し、バンドＩ／バンドＩＩおよびバンドＩＩＩ／バンドＩＩの蛍光強度の比率を算出した。

各種溶媒（シクロヘキサン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、ピリジン、アセトン、アセトニトリル、水）中でのピレンについてもバンドＩ／バンドＩＩおよびバンドＩＩＩ／バンドＩＩの蛍光強度の比率を算出するとともに、これらの溶媒の誘電率を測定し、バンドＩ／バンドＩＩおよびバンドＩＩＩ／バンドＩＩの蛍光強度の比率と、誘電率との関係を表す標準曲線を作成した。この標準曲線に基づいて、上記の蛍光標識オリゴヌクレオチドと標的核酸との二重鎖について得られた比率から、それぞれの場合のピレン周辺の誘電率を決定した。決定した誘電率の値を表２に示す。なお、水の誘電率は８０．１であり、誘電率の値がそれより低い場合はピレンがより疎水性の環境にあることが示される。

表２に示すように、ＥＮＡ塩基Ｔを含まないＥ１およびＣｐｙの５’側に隣接してＥＮＡ塩基Ｔを含むＥ３の場合には、標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションの場合にのみ高い誘電率を示した。なお、プローブＥ１と標的ＤＮＡ ｃＯＤＮとの組み合わせの場合に４０という比較的高い誘電率が示されたが、これは低い蛍光強度の値に基づいて得られた結果であるので、誤差を含む可能性がある。従って、この結果は必ずしもこの場合のピレンが親水性環境にあることを示すものではないが、少なくとも標的ＲＮＡ ｃＯＲＮＡとの二重鎖の場合よりも疎水性環境にあることは示唆された。一方、Ｃｐｙの３’側に隣接してＥＮＡ塩基Ｔを含むＥ２およびＥ４の場合は、標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションおよび標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションのいずれの場合も高い誘電率を示した。すなわち、標的核酸非存在下ではいずれの蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ中のピレンも疎水性環境にあるが、標的ＲＮＡとハイブリダイズしたＥ１およびＥ３、ならびに標的ＲＮＡまたは標的ＤＮＡとハイブリダイズしたＥ２およびＥ４中のピレンは親水性環境にあることが示された。これらの誘電率に基づくピレンの親水性環境に関する結果と、上記（２）で得られた蛍光発光の結果から、ピレンが親水性環境に置かれることによって蛍光が発せられるようになることが示唆された。

（４）ＵＶスペクトル測定によるピレン周辺環境の検討
ピレンが核酸塩基にスタッキングされると、ＵＶスペクトルにおけるピークトップの波長が長波長側にシフトすることが知られている（非特許文献５）。そこで、本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブと標的核酸とによって形成される二重鎖についてピークトップ波長を測定して、ピレンの周辺環境を検討した。測定したピークトップ波長（ｎｍ）を表３に示す。なお、コントロールとしてピレンメタノールのピークトップ波長を測定したところ３４１ｎｍであった。

表３に示すように、ＥＮＡ塩基Ｔを含まないＥ１およびＣｐｙの５’側に隣接してＥＮＡ塩基Ｔを含むＥ３の場合には、標的ＲＮＡとハイブリダイズした場にのみ、ピレンメタノールとほぼ同じ３４２ｎｍのピークトップ波長を示し、その他の場合はピークトップ波長が９〜１０ｎｍ長波長側にシフトしていた。すなわち、標的ＲＮＡとハイブリダイズした場合以外では、ピレンが核酸塩基にスタッキングされていることが示された。一方、Ｅ２およびＥ４の場合は比較的大きなピークトップ波長の変化は見られず、標的核酸の有無にかかわらず核酸によるピレンへの影響が少ないことが示唆された。なお、Ｅ２およびＥ４のいずれの場合も、標的ＲＮＡおよび標的ＤＮＡの両方の場合に短波長側へのシフトが見られた。これらのピークトップ波長の変化に関する結果と、上記（２）で得られた蛍光発光の結果から、ピレンが核酸塩基によるスタッキングから解放されることによって蛍光が発せられるようになることが示唆された。

実施例２
（１）オリゴヌクレオチドの合成
リウマチ患者における一塩基多型（ＳＮＰ）として見出されたｒｓ２２６８２７７を識別するための２’−ＯＭｅＲＮＡオリゴマーＯＭＣｐｙ−Ｃ_ＥおよびＯＭＣｐｙ−Ｇ_Ｅを合成した。ＯＭＣｐｙ−Ｃ_Ｅはｒｓ２２６８２７７における５’−ＧＧＧ−３’型ＳＮＰに相補的な配列を有し、ＯＭＣｐｙ−Ｇ_Ｅはｒｓ２２６８２７７における５’−ＧＣＧ−３’型ＳＮＰに相補的な配列を有する。これらのプローブの塩基配列を配列番号９および１０に示す。これらの蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを、多型部位に２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンシチジン（2'-O,4'-C-ethylenecytidine、ＥＮＡ塩基Ｃ）または２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレングアノシン（2'-O,4'-C-ethyleneguanosine、ＥＮＡ塩基Ｇ）を含み、それがＣｐｙの３’側に配置されるように設計した。また、５’−ＧＧＧ−３’型ＳＮＰの塩基配列および５’−ＧＣＧ−３’型ＳＮＰの塩基配列を有する標的ＤＮＡ ＯＤＮ−ＧおよびＯＤＮ−Ｃを合成した。ＯＤＮ−ＧおよびＯＤＮ−Ｃの塩基配列を配列番号７および８に示す。オリゴヌクレオチドは実施例１に記載した方法に準じて合成を委託した。

（２）一塩基多型の識別
上記（１）で合成した２種類の２’−ＯＭｅＲＮＡオリゴマーの各々０．７５μＭを、標的ＤＮＡとしてのオリゴデオキシリボヌクレオチドＯＤＮ−ＧまたはＯＤＮ−Ｃ ０．７５μＭと、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．１Ｍ ＮａＣｌ中１１℃でハイブリダイズさせ、励起波長３４２ｎｍの条件で３７５ｎｍにおける蛍光強度を測定した。結果を図２に示す。図２中、１〜３は５’−ＧＧＧ−３’型ＳＮＰに相補的な配列を有する２’−ＯＭｅＲＮＡオリゴマーＯＭＣｐｙ−Ｃ_Ｅを用いた場合の結果を、４〜６は５’−ＧＣＧ−３’型ＳＮＰに相補的な配列を有する２’−ＯＭｅＲＮＡオリゴマーＯＭＣｐｙ−Ｇ_Ｅを用いた場合の結果を表す。１、４は標的ＤＮＡ非存在下での結果を、２、５は５’−ＧＣＧ−３’型標的ＤＮＡ ＯＤＮ−Ｃを用いた場合の結果を、３、６は５’−ＧＧＧ−３’型標的ＤＮＡ ＯＤＮ−Ｇを用いた場合の結果をそれぞれ表す。

図１に示すように、５’−ＧＧＧ−３’型ＳＮＰに相補的な配列を有する２’−ＯＭｅＲＮＡオリゴマーＯＭＣｐｙ−Ｃ_Ｅと５’−ＧＧＧ−３’型ＳＮＰの塩基配列を有する標的ＤＮＡ ＯＤＮ−Ｇとの組み合わせ（図２の３）および５’−ＧＣＧ−３’型ＳＮＰに相補的な配列を有する２’−ＯＭｅＲＮＡオリゴマーＯＭＣｐｙ−Ｇ_Ｅと５’−ＧＣＧ−３’型ＳＮＰの塩基配列を有する標的ＤＮＡ ＯＤＮ−Ｃとの組み合わせ（図２の５）の場合にのみ特異的な蛍光の発光が見られた。このように、本発明の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが一塩基多型の識別に有効であることが示された。

ＤＮＡを含めた標的核酸の検出を、均一系および不均一系のいずれにおいても可能にする蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブならびに当該プローブを用いた標的核酸の検出方法および一塩基多型の識別方法が提供される。

標的ＲＮＡまたは標的ＤＮＡ存在下での各種蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブの発する蛍光を表す図である。 一塩基多型（ＳＮＰ）ｒｓ２２６８２７７の識別の結果を表す図である。

SEQ ID NO:1: Oligonucleotide probe E1 for detecting human c-fos; n at position 10 represents 2'-O-(1-pyrenylmethyl)cytidine; other nucleotides are 2'-O-methylribonucleotides
SEQ ID NO:2: Oligonucleotide probe E2 for detecting human c-fos; n at position 10 represents 2'-O-(1-pyrenylmethyl)cytidine; n at position 11 represents 2'-O,4'-C-ethylenethymidine; other nucleotides are 2'-O-methylribonucleotides
SEQ ID NO:3: Oligonucleotide probe E3 for detecting human c-fos; n at position 10 represents 2'-O-(1-pyrenylmethyl)cytidine; n at position 9 represents 2'-O,4'-C-ethylenethymidine; other nucleotides are 2'-O-methylribonucleotides
SEQ ID NO:4: Oligonucleotide probe E4 for detecting human c-fos; n at position 10 represents 2'-O-(1-pyrenylmethyl)cytidine; n's at positions 9 and 11 represent 2'-O,4'-C-ethylenethymidine; other nucleotides are 2'-O-methylribonucleotides
SEQ ID NO:5: Oligonucleotide cORN designed for human c-fos
SEQ ID NO:6: Oligonucleotide cODN designed for human c-fos
SEQ ID NO:7: Oligonucleotide ODN-G designed for SNP rs2268277 (type 5'-GGG-3')
SEQ ID NO:8: Oligonucleotide ODN-C designed for SNP rs2268277 (type 5'-GCG-3')
SEQ ID NO:9: Oligonucleotide probe OMCpy-CE for detecting SNP rs2268277 (type 5'-GGG-3'); n at position 10 represents 2'-O-(1-pyrenylmethyl)cytidine; n at position 11 represents 2'-O,4'-C-ethylenecytidine; other nucleotides are 2'-O-methylribonucleotides
SEQ ID NO:10: Oligonucleotide probe OMCpy-GE for detecting SNP rs2268277 (type 5'-GCG-3'); n at position 10 represents 2'-O-(1-pyrenylmethyl)cytidine; n at position 11 represents 2'-O,4'-C-ethyleneguanosine; other nucleotides are 2'-O-methylribonucleotides

Claims (24)

1. ２’ピレン修飾ヌクレオチドおよびそれに隣接して配置されるＡ型構造を誘起する核酸を含む蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ。
2. Ａ型構造を誘起する核酸が２’ピレン修飾ヌクレオチドの３’側に配置される請求項１記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ。
3. Ａ型構造を誘起する核酸が２’ピレン修飾ヌクレオチドの５’側に配置される請求項１記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ。
4. Ａ型構造を誘起する核酸が２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン核酸（ＥＮＡ）または２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン核酸（ＢＮＡ）である請求項１記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ。
5. Ａ型構造を誘起する核酸が２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン核酸（ＥＮＡ）である請求項４記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ。
6. 標的核酸としてのＤＮＡとハイブリダイズした際に蛍光を発する請求項２記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ。
7. 標的核酸としてのＲＮＡとハイブリダイズした際に蛍光を発する請求項１記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ。
8. 標的核酸とハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしていない遊離の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとの分離（Ｂ／Ｆ分離）を行わない均一溶液中での標的核酸の検出に使用される請求項１記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ。
9. 標的核酸または蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブのいずれかが固相に固定化されている標的核酸の検出に使用される請求項１記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ。
10. 一塩基多型（ＳＮＰ）の識別に使用される請求項１記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ。
11. 以下の工程を包含する標的核酸の検出方法：
    （１）標的核酸に請求項１記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程；および
    （２）標的核酸にハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが発する蛍光を検出する工程。
12. Ａ型構造を誘起する核酸が２’ピレン修飾ヌクレオチドの３’側に配置される蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを使用し、標的核酸がＤＮＡである請求項１１記載の標的核酸の検出方法。
13. 標的核酸がＲＮＡである請求項１１記載の標的核酸の検出方法。
14. 工程（１）において、均一溶液中でハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしていない遊離の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとの分離（Ｂ／Ｆ分離）を行わない請求項１１記載の標的核酸の検出方法。
15. 工程（１）において、標的核酸または蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブのいずれかが固相に固定化されている請求項１１記載の標的核酸の検出方法。
16. 以下の工程を包含する標的核酸における一塩基多型の識別方法：
    （１）標的核酸に請求項１記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイズさせる工程；および
    （２）標的核酸にハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが発する蛍光を検出する工程であって、ここで蛍光発光の有無に基づいて一塩基多型が識別される工程。
17. Ａ型構造を誘起する核酸が２’ピレン修飾ヌクレオチドの３’側に配置される蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを使用し、標的核酸がＤＮＡである請求項１６記載の一塩基多型の識別方法。
18. 標的核酸がＲＮＡである請求項１６記載の一塩基多型の識別方法。
19. 工程（１）において、均一溶液中でハイブリダイズした蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズしていない遊離の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブとの分離（Ｂ／Ｆ分離）を行わない請求項１６記載の一塩基多型の識別方法。
20. 工程（１）において、標的核酸または蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブのいずれかが固相に固定化されている請求項１６記載の一塩基多型の識別方法。
21. 請求項１記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを含有する標的核酸検出用組成物。
22. 請求項１記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを含有する標的核酸検出用キット。
23. 請求項１記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを含有する一塩基多型識別用組成物。
24. 請求項１記載の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを含有する一塩基多型識別用キット。

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