JPH06121681A - 形質転換された枯草菌によるネオプルラナーゼの製造法 - Google Patents
形質転換された枯草菌によるネオプルラナーゼの製造法Info
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- JPH06121681A JPH06121681A JP5085761A JP8576193A JPH06121681A JP H06121681 A JPH06121681 A JP H06121681A JP 5085761 A JP5085761 A JP 5085761A JP 8576193 A JP8576193 A JP 8576193A JP H06121681 A JPH06121681 A JP H06121681A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 この発明は、多糖体プルラン及びでん粉のα
−１，４およびα−１，６グリコシド結合を切断する能
力をもつネオプルラナーゼ（本願においてネオプルラナ
ーゼとは、後述する通り、バチルスサーモフイルスＴＲ
Ｓ４０が生産するプルラナーゼ類似の酵素をいう）をコ
ードするＤＮＡ断片を有するプラスミドを使ってネオプ
ルラナーゼを効率よく製造する方法に関するものであ
る。 【構成】 バチルス ステアロサーモフイルス（Bacill
us stearothermophilus)ＴＲＳ４０（微工研菌寄託第９
６０９号）の染色体ＤＮＡを制限酵素ヒンドIII（Ｈｉ
ｎｄ III）により処理して得られるネオプルラナーゼを
コードするＤＮＡ断片とヒンドIII で処理して得られた
ベクター断片を結合させた分子量２，２Ｍｄの組換えＤ
ＮＡを複製維持した枯草菌を栄養培地で培養し、その培
養物からネオプルラナーゼを回収することを特徴とする
形質転換された枯草菌によるネオプルラナーゼの製造
法。
−１，４およびα−１，６グリコシド結合を切断する能
力をもつネオプルラナーゼ（本願においてネオプルラナ
ーゼとは、後述する通り、バチルスサーモフイルスＴＲ
Ｓ４０が生産するプルラナーゼ類似の酵素をいう）をコ
ードするＤＮＡ断片を有するプラスミドを使ってネオプ
ルラナーゼを効率よく製造する方法に関するものであ
る。 【構成】 バチルス ステアロサーモフイルス（Bacill
us stearothermophilus)ＴＲＳ４０（微工研菌寄託第９
６０９号）の染色体ＤＮＡを制限酵素ヒンドIII（Ｈｉ
ｎｄ III）により処理して得られるネオプルラナーゼを
コードするＤＮＡ断片とヒンドIII で処理して得られた
ベクター断片を結合させた分子量２，２Ｍｄの組換えＤ
ＮＡを複製維持した枯草菌を栄養培地で培養し、その培
養物からネオプルラナーゼを回収することを特徴とする
形質転換された枯草菌によるネオプルラナーゼの製造
法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、多糖体プルラン及び
でん粉のα−１，４およびα−１，６グルコシド結合を
切断する能力をもつネオプルラナーゼ（本願においてネ
オプルラナーゼとは、後述する通り、バチルスサーモフ
イルスＴＲＳ４０が生産するプルラナーゼ類似の酵素を
いう）をコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドを使
ってネオプルラナーゼを効率よく製造する方法に関する
ものである。
でん粉のα−１，４およびα−１，６グルコシド結合を
切断する能力をもつネオプルラナーゼ（本願においてネ
オプルラナーゼとは、後述する通り、バチルスサーモフ
イルスＴＲＳ４０が生産するプルラナーゼ類似の酵素を
いう）をコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドを使
ってネオプルラナーゼを効率よく製造する方法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術および本発明が解決しようとする問題点】
従来、プルランに作用する酵素としては、プルランの末
端からグルコース単位で作用するグルコアミラーゼ、α
−１，６グルコシド結合だけを切断するプルラナーゼ、
プルラン中のα−１，４グルコシド結合を切断しイソパ
ノースを与えるイソプルラナーゼ、パノース（６2 −α
−Ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｍａｌｔｏｓｅ）を生成するサー
モアクチノミセス ヴルガリカス（Thermoactinomyces
vulgaricus) のアミラーゼ（ＴＶＡ）などが知られてい
る。
従来、プルランに作用する酵素としては、プルランの末
端からグルコース単位で作用するグルコアミラーゼ、α
−１，６グルコシド結合だけを切断するプルラナーゼ、
プルラン中のα−１，４グルコシド結合を切断しイソパ
ノースを与えるイソプルラナーゼ、パノース（６2 −α
−Ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｍａｌｔｏｓｅ）を生成するサー
モアクチノミセス ヴルガリカス（Thermoactinomyces
vulgaricus) のアミラーゼ（ＴＶＡ）などが知られてい
る。
【０００３】本発明の酵素はプルランに作用してパノー
スを生成する点ではＴＶＡと同様であるが、同時に本酵
素はグルコース、マルトースを生成する点で全くＴＶＡ
と異り、新しい作用特異性をもつ新規酵素である。また
本酵素はでん粉にも作用しα−アミラーゼの一種ともい
える。α−アミラーゼはでん粉糖化産業などにおいて広
く用いられる酵素であるので、本酵素単独乃至は他の各
種酵素と混合使用することにより色々な用途が開発され
るものと期待される。
スを生成する点ではＴＶＡと同様であるが、同時に本酵
素はグルコース、マルトースを生成する点で全くＴＶＡ
と異り、新しい作用特異性をもつ新規酵素である。また
本酵素はでん粉にも作用しα−アミラーゼの一種ともい
える。α−アミラーゼはでん粉糖化産業などにおいて広
く用いられる酵素であるので、本酵素単独乃至は他の各
種酵素と混合使用することにより色々な用途が開発され
るものと期待される。
【０００４】
【問題点を解決するための手段および作用】本発明は新
規なプラスミドを有する枯草菌を利用して耐熱性のネオ
プルラナーゼを製造する方法に関するものである。
規なプラスミドを有する枯草菌を利用して耐熱性のネオ
プルラナーゼを製造する方法に関するものである。
【０００５】本発明者等は、プルランを分解し主として
パノースを生成する耐熱性のあるネオプルラナーゼを分
泌するバチルス ステアロサーモフイルスＴＲＳ４０を
大阪市鶴見区の堆肥より分離したのであるが、本酵素は
従来報告されているどのプルラナーゼともその活性が異
っており、本発明者等によってネオプルラナーゼと命名
された酵素である。なお、バチルス ステアロサーモフ
イルスＴＲＳ４０は次のような菌学的性質を有してい
る。
パノースを生成する耐熱性のあるネオプルラナーゼを分
泌するバチルス ステアロサーモフイルスＴＲＳ４０を
大阪市鶴見区の堆肥より分離したのであるが、本酵素は
従来報告されているどのプルラナーゼともその活性が異
っており、本発明者等によってネオプルラナーゼと命名
された酵素である。なお、バチルス ステアロサーモフ
イルスＴＲＳ４０は次のような菌学的性質を有してい
る。
【０００６】一、形態学的性質 １）細胞の形及び大きさ……（０．６〜１．０）×（２
〜３．５）μの桿菌。連鎖性なく莢膜は少い。加糖肉汁
寒天培地では肉汁寒天培地と同一の桿菌の形を示す。 ２）運動性……あり。 ３）胞子……（０．４〜０．５）×（０．５〜０．６）
μの長円形で末端付近に存在し膜壁はうすい。６０℃・
１６時間で形成するものが多い。胞子のうのふくらみは
認められる。 ４）グラム染色性……陽性。
〜３．５）μの桿菌。連鎖性なく莢膜は少い。加糖肉汁
寒天培地では肉汁寒天培地と同一の桿菌の形を示す。 ２）運動性……あり。 ３）胞子……（０．４〜０．５）×（０．５〜０．６）
μの長円形で末端付近に存在し膜壁はうすい。６０℃・
１６時間で形成するものが多い。胞子のうのふくらみは
認められる。 ４）グラム染色性……陽性。
【０００７】二、生育状態 １）肉汁寒天平板培養……生育良好。表面はやや乾き白
色に近い。 ２）肉汁寒天斜面培養……拡布状となり表面の光沢な
し。 ３）肉汁液体培養……ＰＨ７．０で生育良好。液は混濁
する。 ４）ゼラチン穿刺培養……ゼラチンを液化する。 ５）食塩肉汁液体培養……７％の食塩水濃度では生育し
ない。 ６）グルコース・アスパラギン寒天培地……生育不良。 ７）グルコース・ナイトレイト寒天培地……僅かに生
育。
色に近い。 ２）肉汁寒天斜面培養……拡布状となり表面の光沢な
し。 ３）肉汁液体培養……ＰＨ７．０で生育良好。液は混濁
する。 ４）ゼラチン穿刺培養……ゼラチンを液化する。 ５）食塩肉汁液体培養……７％の食塩水濃度では生育し
ない。 ６）グルコース・アスパラギン寒天培地……生育不良。 ７）グルコース・ナイトレイト寒天培地……僅かに生
育。
【０００８】三、生理学的性質 １）硝酸塩の還元……陽性。 ２）でん粉の加水分解……でん粉を含むシヤーレ上で生
育させるときヨード呈色は陰性。 ３）クエン酸の醗酵性……陽性。 ４）カタラーゼの生成……陰性。 ５）生育の範囲……トリプシン、酵母エキス、食塩を含
む培地で６５℃まで生育。最適生育温度は６０℃。 ６）糖の醗酵性……グルコース、ラクトース、しょ糖か
ら酸を形成。ただし、ガス発生を伴わない。 ７）アセチルメチルカルビノールの生成……陽性。 ８）ゼラチンの分解……陽性。
育させるときヨード呈色は陰性。 ３）クエン酸の醗酵性……陽性。 ４）カタラーゼの生成……陰性。 ５）生育の範囲……トリプシン、酵母エキス、食塩を含
む培地で６５℃まで生育。最適生育温度は６０℃。 ６）糖の醗酵性……グルコース、ラクトース、しょ糖か
ら酸を形成。ただし、ガス発生を伴わない。 ７）アセチルメチルカルビノールの生成……陽性。 ８）ゼラチンの分解……陽性。
【０００９】以上の結果をバージエーのマニアル・オブ
・システマテイック・バクテリオデターミネーション第
２巻（Bergey's Manual of Systematic Bacteriodeterm
ination vol 2.(1986)) と照合して本菌はバチルス ス
テアロサーモフイルス（Bacillus stearothermophilus)
と同定した。
・システマテイック・バクテリオデターミネーション第
２巻（Bergey's Manual of Systematic Bacteriodeterm
ination vol 2.(1986)) と照合して本菌はバチルス ス
テアロサーモフイルス（Bacillus stearothermophilus)
と同定した。
【００１０】つぎに本菌株の生産する酵素を詳細に説明
する。 一、作用及び基質特異性 本酵素はプルランに作用し、最終的にパノース、グルコ
ース、マルトースを生じる。量的にはパノースが最も多
い。
する。 一、作用及び基質特異性 本酵素はプルランに作用し、最終的にパノース、グルコ
ース、マルトースを生じる。量的にはパノースが最も多
い。
【００１１】でん粉に作用させると主としてマルトース
とグルコースを生じるが、反応後期には分枝デキストリ
ンとしてパノース及びイソマルトシルマルトース（isom
altosyl maltose 略称ＩＭＭ）を生成する。還元糖の生
成に較べてヨード呈色の減少が速かでα−アミラーゼの
一種と考えられる。一般にα−アミラーゼは比較的でん
粉をよく加水分解する糖化型と、でん粉の液化速度は大
きいが糖化度の低い液化型に大別される。そして、前者
をでん粉に作用させた場合、得られる最小の低分子リミ
ットデキストリンはＩＭＭである。本発明の酵素はでん
粉に作用させると最初からグルコースやマルトースを生
成し、糖化型のグループに属するが、最小のリミットデ
キストリンはＩＭＭではなくパノースである。この点に
おいて著だ特異なα−アミラーゼである。更に、本酵素
はプルランとでん粉に同濃度、同条件で作用させると、
プルランに対してでん粉に対すると同等もしくはそれ以
上に作用する。ＴＶＡはでん粉への作用の方がプルラン
への作用より著しく大きい。この意味でＴＶＡはα−ア
ミラーゼの一種と考えられるのに対し、本酵素はプルラ
ナーゼの一種であり、これを従来のプルラナーゼと区別
するため、ネオプルラナーゼと命名した。
とグルコースを生じるが、反応後期には分枝デキストリ
ンとしてパノース及びイソマルトシルマルトース（isom
altosyl maltose 略称ＩＭＭ）を生成する。還元糖の生
成に較べてヨード呈色の減少が速かでα−アミラーゼの
一種と考えられる。一般にα−アミラーゼは比較的でん
粉をよく加水分解する糖化型と、でん粉の液化速度は大
きいが糖化度の低い液化型に大別される。そして、前者
をでん粉に作用させた場合、得られる最小の低分子リミ
ットデキストリンはＩＭＭである。本発明の酵素はでん
粉に作用させると最初からグルコースやマルトースを生
成し、糖化型のグループに属するが、最小のリミットデ
キストリンはＩＭＭではなくパノースである。この点に
おいて著だ特異なα−アミラーゼである。更に、本酵素
はプルランとでん粉に同濃度、同条件で作用させると、
プルランに対してでん粉に対すると同等もしくはそれ以
上に作用する。ＴＶＡはでん粉への作用の方がプルラン
への作用より著しく大きい。この意味でＴＶＡはα−ア
ミラーゼの一種と考えられるのに対し、本酵素はプルラ
ナーゼの一種であり、これを従来のプルラナーゼと区別
するため、ネオプルラナーゼと命名した。
【００１２】また、本酵素をβ−サイクロデキストリン
にマルトースがα−１，６グルコシル結合で結合したマ
ルトシル−β−サイクロデキストリンに作用させると、
まずそのα−１，６結合を切断し、マルトースとβ−サ
イクロデキストリンを生じる。ついでβ−サイクロデキ
ストリンも再分解を受け、グルコース、マルトース及び
マルトトリオースを与える。
にマルトースがα−１，６グルコシル結合で結合したマ
ルトシル−β−サイクロデキストリンに作用させると、
まずそのα−１，６結合を切断し、マルトースとβ−サ
イクロデキストリンを生じる。ついでβ−サイクロデキ
ストリンも再分解を受け、グルコース、マルトース及び
マルトトリオースを与える。
【００１３】即ち、本酵素は主としてマルトースを認識
し、マルトースがα−１，４結合で結合していてもα−
１，６結合で結合していても、その結合を切断する新し
い作用特異性をもつ酵素と考えることができる。
し、マルトースがα−１，４結合で結合していてもα−
１，６結合で結合していても、その結合を切断する新し
い作用特異性をもつ酵素と考えることができる。
【００１４】二、作用ＰＨ ＰＨ５．０〜７．５。測定は０．０５Ｍ酢酸ナトリウム
−酢酸緩衝液（ＰＨ４〜６）又はリン酸２ナトリウム−
リン酸１カリウム緩衝液（ＰＨ６〜８）を用い、０．５
％プルラン中で６０℃、１５分間反応させる。生成した
還元糖はＤＮＳ法で測定。
−酢酸緩衝液（ＰＨ４〜６）又はリン酸２ナトリウム−
リン酸１カリウム緩衝液（ＰＨ６〜８）を用い、０．５
％プルラン中で６０℃、１５分間反応させる。生成した
還元糖はＤＮＳ法で測定。
【００１５】三、作用最適ＰＨ 前記二の条件でおよそＰＨ６．０。
【００１６】四、作用温度 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ６．０）、０．５％プルラ
ン中で各種温度下１５分間反応させたところ、７５℃ま
で反応した。
ン中で各種温度下１５分間反応させたところ、７５℃ま
で反応した。
【００１７】五、作用最適温度 前記の条件下６０〜６５℃であった。
【００１８】六、熱安定性 ０．２Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ６．０）中で各種温度で６０
分間加熱し残存活性を測定したところ、６５℃において
６０％の活性が残存していた。更にこの系に１ｍＭ，Ｅ
ＤＴＡを加えると９０％以上活性は残存した。
分間加熱し残存活性を測定したところ、６５℃において
６０％の活性が残存していた。更にこの系に１ｍＭ，Ｅ
ＤＴＡを加えると９０％以上活性は残存した。
【００１９】七、ＰＨ安定性 ＰＨ５．５より９．０の間で安定（各種緩衝液を用いＰ
Ｈを調整し、６０℃・６０分放置後、ＰＨ７．０に調整
し残存活性を測定した）。
Ｈを調整し、６０℃・６０分放置後、ＰＨ７．０に調整
し残存活性を測定した）。
【００２０】八、精製方法 培養上澄液を硫安分画（３５〜６０％飽和）した後、沈
でん物を少量の水に溶解し透析後、ＰＨ８．０でＤＥＡ
Ｅ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅに吸着させた。ついで食塩濃度
を０．６Ｍまで漸次上昇させて酵素を溶出した。さらに
セフアデックスＧ−２００のカラムクロマトグラフィー
を２回繰返した後、α−サイクロデキストリンを結合し
たセフアロース６Ｂ（Sepharose 6B) カラムでアフイニ
テイクロマトグラフイを行った。
でん物を少量の水に溶解し透析後、ＰＨ８．０でＤＥＡ
Ｅ−ｃｅｌｌｕｌｏｓｅに吸着させた。ついで食塩濃度
を０．６Ｍまで漸次上昇させて酵素を溶出した。さらに
セフアデックスＧ−２００のカラムクロマトグラフィー
を２回繰返した後、α−サイクロデキストリンを結合し
たセフアロース６Ｂ（Sepharose 6B) カラムでアフイニ
テイクロマトグラフイを行った。
【００２１】溶出液の蛋白質の吸収は１個のピークを示
し、酵素活性のピークと完全に一致した。この活性区分
をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動を行うと単一バンド
を示した。
し、酵素活性のピークと完全に一致した。この活性区分
をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動を行うと単一バンド
を示した。
【００２２】九、分子量 ６２０００ｄａｌｔｏｎ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
【００２３】十、生産物 プルランからはパノースの他グルコース、マルトースを
与えた。また、でん粉からグルコース、マルトース、パ
ノース、ＩＭＭを与えた。
与えた。また、でん粉からグルコース、マルトース、パ
ノース、ＩＭＭを与えた。
【００２４】十一、力価測定方法 １％プルラン（０．２Ｍ酢酸緩衝液（ＰＨ６．０）に溶
解）０．２５ｍｌに酵素液０．２５ｍｌを加え、６０℃
・１５分間反応させ、生ずる還元力の増加をＤＮＳ法に
より定量した。上記反応で１分間当り１μｍｏｌの還元
糖を生ずる酵素力を１単位とした。
解）０．２５ｍｌに酵素液０．２５ｍｌを加え、６０℃
・１５分間反応させ、生ずる還元力の増加をＤＮＳ法に
より定量した。上記反応で１分間当り１μｍｏｌの還元
糖を生ずる酵素力を１単位とした。
【００２５】以上の理化学的性質から、本発明酵素はこ
れまでに報告されたことのない新規なプルラナーゼであ
るといえる。
れまでに報告されたことのない新規なプルラナーゼであ
るといえる。
【００２６】本発明では、かかる耐熱性のあるネオプル
ラナーゼの遺伝子をバチルス ステアロサーモフイル
ス、殊にバチルス ステアロサーモフイルスＴＲＳ４０
から調製し、制限酵素ヒンドIII を用いて切断する。ヒ
ンドIII を使用するのは、酵素の分子量の大きさ、生成
蛋白質の細胞外への分泌に必要なキヤリアー蛋白質に相
当する遺伝情報（シグナル配列）などを有効に保持した
遺伝子の断片が得られるためである。切断処理法は常法
による。
ラナーゼの遺伝子をバチルス ステアロサーモフイル
ス、殊にバチルス ステアロサーモフイルスＴＲＳ４０
から調製し、制限酵素ヒンドIII を用いて切断する。ヒ
ンドIII を使用するのは、酵素の分子量の大きさ、生成
蛋白質の細胞外への分泌に必要なキヤリアー蛋白質に相
当する遺伝情報（シグナル配列）などを有効に保持した
遺伝子の断片が得られるためである。切断処理法は常法
による。
【００２７】切断した断片をショットガン方式でペクタ
ープラスミド、たとえばｐＴＢ５２２（Journal of Gen
eral Microbiology 、第１３１巻、第１７５７頁、１９
８５年刊行に記載あり）に組換え、枯草菌を宿主として
複製維持できる組換えプラスミドを作成する。目的とす
るプラスミドは、分子量約２．２Ｍｄで制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩに対する切断箇所が２ケ所であり、ＥｃｏＲＩで処
理したときのＤＮＡ断片の分子量が０．８、０．４及び
１．０（Ｍｄ）で示されうるＤＮＡ断片を含む組換えプ
ラスミドである。さらに具体的には、該ＤＮＡ断片を前
記ｐＴＢ５２２に組込み、本発明者等によってｐＰＰ１
０と命名された組換えプラスミドは、遺伝子工学的一般
的な手法により目的物質生産を可能とするための所望性
質（コピー数、薬剤耐性の種類、各種制限酵素の切断箇
所など）を有する。このプラスミドｐＰＰ１０の制限酵
素地図は添付の図１に示す。
ープラスミド、たとえばｐＴＢ５２２（Journal of Gen
eral Microbiology 、第１３１巻、第１７５７頁、１９
８５年刊行に記載あり）に組換え、枯草菌を宿主として
複製維持できる組換えプラスミドを作成する。目的とす
るプラスミドは、分子量約２．２Ｍｄで制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩに対する切断箇所が２ケ所であり、ＥｃｏＲＩで処
理したときのＤＮＡ断片の分子量が０．８、０．４及び
１．０（Ｍｄ）で示されうるＤＮＡ断片を含む組換えプ
ラスミドである。さらに具体的には、該ＤＮＡ断片を前
記ｐＴＢ５２２に組込み、本発明者等によってｐＰＰ１
０と命名された組換えプラスミドは、遺伝子工学的一般
的な手法により目的物質生産を可能とするための所望性
質（コピー数、薬剤耐性の種類、各種制限酵素の切断箇
所など）を有する。このプラスミドｐＰＰ１０の制限酵
素地図は添付の図１に示す。
【００２８】前述の組換えプラスミドで形質転換せしめ
た宿主枯草菌はアミラーゼ生産能を失った枯草菌であれ
ば菌株の如何を問わず利用できる。かかる欠損株は常法
により容易に取得できる。
た宿主枯草菌はアミラーゼ生産能を失った枯草菌であれ
ば菌株の如何を問わず利用できる。かかる欠損株は常法
により容易に取得できる。
【００２９】本発明は枯草菌を使用したネオプルラナー
ゼの製造法に関するものである。即ち、組換えＤＮＡを
維持する菌が生育しうる栄養培地として、たとえば炭素
源としてでん粉、可溶性でん粉、デキストリン、酸処理
でん粉などの炭水化物を１〜１０％、窒素源として大豆
粕、大豆粕抽出物、乾燥酵母、ミルクカゼイン、ペプト
ン、肉エキス、コーンステイープリカー、ペプチド含有
物、アミノ酸類の単独ないし適宜の混和物を添加し、そ
の他必要に応じて少量の無機塩類を適量添加したものを
使い、これに菌体を接種し、ＰＨ６．５〜７．３、３７
℃で２４〜７２時間通気攪拌培養することにより、ネオ
プルラナーゼを生育蓄積せしめるのである。この培養物
からネオプルラナーゼを回収・精製するには、培養濾液
を硫安により分画・沈でん、アルコール沈でん、膜濃縮
法などの通常の手段によって行えばよい。
ゼの製造法に関するものである。即ち、組換えＤＮＡを
維持する菌が生育しうる栄養培地として、たとえば炭素
源としてでん粉、可溶性でん粉、デキストリン、酸処理
でん粉などの炭水化物を１〜１０％、窒素源として大豆
粕、大豆粕抽出物、乾燥酵母、ミルクカゼイン、ペプト
ン、肉エキス、コーンステイープリカー、ペプチド含有
物、アミノ酸類の単独ないし適宜の混和物を添加し、そ
の他必要に応じて少量の無機塩類を適量添加したものを
使い、これに菌体を接種し、ＰＨ６．５〜７．３、３７
℃で２４〜７２時間通気攪拌培養することにより、ネオ
プルラナーゼを生育蓄積せしめるのである。この培養物
からネオプルラナーゼを回収・精製するには、培養濾液
を硫安により分画・沈でん、アルコール沈でん、膜濃縮
法などの通常の手段によって行えばよい。
【００３０】
実施例１（組換えプラスミドの生成と形質転換された枯
草菌の培養） まずバチルス ステアロサーモフイルスＴＲＳ４０の染
色体ＤＮＡを以下により調製する。
草菌の培養） まずバチルス ステアロサーモフイルスＴＲＳ４０の染
色体ＤＮＡを以下により調製する。
【００３１】バチルス ステアロサーモフイルスＴＲＳ
４０を１００ｍｌＬ培地を含む５００ｍｌ容フラスコ中
で一夜、６０℃で培養した。これを遠心集菌し、２０ｍ
ｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭ・ＥＤＴＡ、
ＰＨ８．５）で洗浄し、３ｍｌの１５％しよ糖−５０ｍ
Ｍトリス（ＰＨ８．５）−５０Ｍ・ＥＤＴＡ−１ｍｇ／
ｍｌリゾチームに懸濁し、氷中で３０分間静置した。こ
れに３ｍｌの１％ザルコシル−５０ｍＭトリス（ＰＨ
８．５）−５０ｍＭ・ＥＤＴＡを添加し、混合した。つ
いで５．４ｇＣｓＣｌを加え０．３ｍｌのエチジウムブ
ロマイド液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、ＲＰ６５Ｔロー
ター（日立製作所製）で超遠心場で分離した。超遠心終
了後、ＤＮＡ区分を注射針で抜き取り、ｎ−ブタノール
で３回抽出を繰り返してエチジウムブロマイドを除去し
た。このＤＮＡ試料を１０ｍＭトリス（ＰＨ７．５）−
０．１ｍＭ・ＥＤＴＡ中で透析し４℃で保存した。
４０を１００ｍｌＬ培地を含む５００ｍｌ容フラスコ中
で一夜、６０℃で培養した。これを遠心集菌し、２０ｍ
ｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、１ｍＭ・ＥＤＴＡ、
ＰＨ８．５）で洗浄し、３ｍｌの１５％しよ糖−５０ｍ
Ｍトリス（ＰＨ８．５）−５０Ｍ・ＥＤＴＡ−１ｍｇ／
ｍｌリゾチームに懸濁し、氷中で３０分間静置した。こ
れに３ｍｌの１％ザルコシル−５０ｍＭトリス（ＰＨ
８．５）−５０ｍＭ・ＥＤＴＡを添加し、混合した。つ
いで５．４ｇＣｓＣｌを加え０．３ｍｌのエチジウムブ
ロマイド液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加え、ＲＰ６５Ｔロー
ター（日立製作所製）で超遠心場で分離した。超遠心終
了後、ＤＮＡ区分を注射針で抜き取り、ｎ−ブタノール
で３回抽出を繰り返してエチジウムブロマイドを除去し
た。このＤＮＡ試料を１０ｍＭトリス（ＰＨ７．５）−
０．１ｍＭ・ＥＤＴＡ中で透析し４℃で保存した。
【００３２】次いで以下の通りに制限酵素及びリガーゼ
で処理してベクタープラスミドを調製する。即ち、一方
では枯草菌を宿主として複製維持できるベクタープラス
ミドｐＴＢ５２２（テトラサイクリン耐性）を常法によ
り調製し、ついでバチルスステアロサーモフイルスＴＲ
Ｓ４０の染色体ＤＮＡ及びｐＴＢ５２２を制限酵素ヒン
ドIII で切断する。その反応条件は次の通りである。
で処理してベクタープラスミドを調製する。即ち、一方
では枯草菌を宿主として複製維持できるベクタープラス
ミドｐＴＢ５２２（テトラサイクリン耐性）を常法によ
り調製し、ついでバチルスステアロサーモフイルスＴＲ
Ｓ４０の染色体ＤＮＡ及びｐＴＢ５２２を制限酵素ヒン
ドIII で切断する。その反応条件は次の通りである。
【００３３】 ＴＲＳ４０ＤＮＡ ３０μｌ １０×Ｈｉｎｄ III緩衝液 １０μｌ （Ａ） 牛血清アルブミン（５ｍｇ／ｍｌ） ２μｌ 水 ５６μｌ Ｈｉｎｄ III溶液 ２μｌ
【００３４】ｐＴＢ５２２ １０
μｌ １０×Ｈｉｎｄ III緩衝液 １０μｌ （Ｂ） 牛血清アルブミン（５ｍｇ／ｍｌ） ２μｌ 水 ７６μｌ Ｈｉｎｄ III溶液 ２μｌ
μｌ １０×Ｈｉｎｄ III緩衝液 １０μｌ （Ｂ） 牛血清アルブミン（５ｍｇ／ｍｌ） ２μｌ 水 ７６μｌ Ｈｉｎｄ III溶液 ２μｌ
【００３５】表中、１０×Ｈｉｎｄ III緩衝液とは、１
００ｍＭトリス（ＰＨ７．４）、１００ｍＭＭｇＣ
ｌ2 、５００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭジチオスレイトー
ルを含む。
００ｍＭトリス（ＰＨ７．４）、１００ｍＭＭｇＣ
ｌ2 、５００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭジチオスレイトー
ルを含む。
【００３６】上記溶液で３７℃・１．５〜２時間反応さ
せる。上記で得られるＡ、Ｂ、２種類のＤＮＡを混合
し、３Ｍ酢酸カリウム２０μｌ加え、その後エタノール
０．４５ｍｌを加えて遠心し、上澄を除いた。沈でんは
エタノールで洗浄し、脱水・脱塩し、デシケーターで乾
燥した。この乾燥物に２×リガーゼ緩衝液（１３２ｍＭ
トリス（ＰＨ７．６）−１３．２Ｍ・Ｍｇｃｌ2 ）１０
０μｌ、１００ｍＭジチオスレイトール２０μｌ、５ｍ
Ｍ・ＡＴＰ２０μｌ、水６０μｌを加え混合した後、Ｄ
ＮＡリガーゼ１μｌを加え、８℃・１６時間保ち、ＤＮ
Ａ溶液とした。
せる。上記で得られるＡ、Ｂ、２種類のＤＮＡを混合
し、３Ｍ酢酸カリウム２０μｌ加え、その後エタノール
０．４５ｍｌを加えて遠心し、上澄を除いた。沈でんは
エタノールで洗浄し、脱水・脱塩し、デシケーターで乾
燥した。この乾燥物に２×リガーゼ緩衝液（１３２ｍＭ
トリス（ＰＨ７．６）−１３．２Ｍ・Ｍｇｃｌ2 ）１０
０μｌ、１００ｍＭジチオスレイトール２０μｌ、５ｍ
Ｍ・ＡＴＰ２０μｌ、水６０μｌを加え混合した後、Ｄ
ＮＡリガーゼ１μｌを加え、８℃・１６時間保ち、ＤＮ
Ａ溶液とした。
【００３７】第３段階としては、上述のベクターを枯草
菌に導入してクローニングする段階である。
菌に導入してクローニングする段階である。
【００３８】バチルス ズブチリスＮＡ１は、通常の変
異処理により得られるアミラーゼ欠損株の１つであるが
（日本農芸化学会昭和６１年度京都大会にて発表。講演
番号２Ａ−２２）、これをＬ培地で一夜培養した後、そ
の１ｍｌを１００ｍｌ容フラスコ内のＴＦＩ培地２０ｍ
ｌに植菌する。
異処理により得られるアミラーゼ欠損株の１つであるが
（日本農芸化学会昭和６１年度京都大会にて発表。講演
番号２Ａ−２２）、これをＬ培地で一夜培養した後、そ
の１ｍｌを１００ｍｌ容フラスコ内のＴＦＩ培地２０ｍ
ｌに植菌する。
【００３９】これを３７℃で培養し、対数増殖期を外れ
てから１時間後、５００ｍｌ容フラスコ内のＴＦII培地
３６ｍｌに４ｍｌ植菌し、１．５時間培養してコンピテ
ントセルを得る。
てから１時間後、５００ｍｌ容フラスコ内のＴＦII培地
３６ｍｌに４ｍｌ植菌し、１．５時間培養してコンピテ
ントセルを得る。
【００４０】ＴＦＩ、ＴＦII培地は夫々以下の通りであ
る。
る。
【００４１】このコンピテント セル１ｍｌに前述によ
り得られたＤＮＡ溶液を混合し、３７℃・３０分間激し
く振盪培養後、遠心集菌し、Ｌ培地１ｍｌを加えて３７
℃・１．５時間振盪培養する。その培養液を１００μｌ
づつテトラサイクリン２５μｇ／ｍｌを含む寒天平板に
塗抹し、３７℃１夜培養し、形質転換体を得た。
り得られたＤＮＡ溶液を混合し、３７℃・３０分間激し
く振盪培養後、遠心集菌し、Ｌ培地１ｍｌを加えて３７
℃・１．５時間振盪培養する。その培養液を１００μｌ
づつテトラサイクリン２５μｇ／ｍｌを含む寒天平板に
塗抹し、３７℃１夜培養し、形質転換体を得た。
【００４２】この形質変換体をＰＬＬ寒天平板（１％プ
ルラン、０．２％トリプトン、０．２％イーストエキ
ス、０．２％Ｎａｃｌ、１．５％寒天（ＰＨ７．３））
にレプリカし、３７℃１夜培養後、平板上にエタノール
を注ぎ数時間放置し、ハローを形成するコロニーを取得
した。このクローン株の保持する組換えプラスミドをｐ
ＰＰ１０と命名した。
ルラン、０．２％トリプトン、０．２％イーストエキ
ス、０．２％Ｎａｃｌ、１．５％寒天（ＰＨ７．３））
にレプリカし、３７℃１夜培養後、平板上にエタノール
を注ぎ数時間放置し、ハローを形成するコロニーを取得
した。このクローン株の保持する組換えプラスミドをｐ
ＰＰ１０と命名した。
【００４３】実施例２（ネオプルラナーゼの製造） 実施例１により得られたｐＰＰ１０を保持するバチルス
ズブチリスＮＡ１を２．５％可溶性でん粉を含むＬ培
地（２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有）にて３７
℃・２４時間培養した。培養液を遠心分離して上澄を採
り６０℃・１５分間加熱処理をした。この段階で培養上
澄液中の蛋白質は殆んど耐熱性のネオプルラナーゼのみ
であることが、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によ
り確認された。
ズブチリスＮＡ１を２．５％可溶性でん粉を含むＬ培
地（２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリン含有）にて３７
℃・２４時間培養した。培養液を遠心分離して上澄を採
り６０℃・１５分間加熱処理をした。この段階で培養上
澄液中の蛋白質は殆んど耐熱性のネオプルラナーゼのみ
であることが、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によ
り確認された。
【００４４】ネオプルラナーゼ活性測定法により関連菌
株を測定したところ、次のようであった。
株を測定したところ、次のようであった。
【００４５】組換えプラスミドｐＰＰ１０を保持するバ
チルス ズブチリスＮＡ１より得たネオプルラナーゼ
は、６０℃、６５℃で夫々６０分間熱処理したところ、
夫々９０％以上、６０％程度の酵素活性を維持してお
り、耐熱性に富むことが確認された。
チルス ズブチリスＮＡ１より得たネオプルラナーゼ
は、６０℃、６５℃で夫々６０分間熱処理したところ、
夫々９０％以上、６０％程度の酵素活性を維持してお
り、耐熱性に富むことが確認された。
【００４６】
【発明の効果】一般に好熱菌であるバチルス ステアロ
サーモフイルスは、枯草菌に較べ培養時の最終菌体濃度
が低く、菌体生産物を大量に取得するのが比較的困難で
ある。そこで本発明ではバチルス ステアロサーモフイ
ルス中の耐熱性酵素であるネオプルラナーゼの遺伝子を
枯草菌に組込むことにより、ネオプルラナーゼを大量に
取得することを可能としたものである。就中、バチルス
ステアロサーモフイルスＴＲＳ４０のＤＮＡをヒンド
III により処理して得られるＤＮＡ断片をｐＴＢ５２２
に組込んだバチルス ズブチリスＮＡ１は本願発明を効
果的に実現可能とするものである。しかして本発明によ
るときは、宿主菌にα−アミラーゼ及びプロテアーゼ欠
損の変異株であるバチルス ズブチリスＮＡ１を用いる
ので、培養濾液に含まれる菌体外分泌酵素は殆んど本菌
株にクローン化された耐熱性のネオプルラナーゼのみと
なり、その遺伝子が増幅されることにより、当該酵素の
生産性を顕著に向上せしめ得ることや、中温菌に好熱菌
の遺伝子がクローン化されたことにより、たとえば６０
℃・１５分間の加熱処理により培養濾液中の耐熱性のネ
オプルラナーゼ以外の蛋白質は殆んど変性沈でんしてし
まうことから、目的酵素の濃縮・精製はバチルス ステ
アロサーモフイルスＴＲＳ４０を培養しこれから本件酵
素を濃縮・精製するよりも遙かに簡便・効率的に行うこ
とができる。
サーモフイルスは、枯草菌に較べ培養時の最終菌体濃度
が低く、菌体生産物を大量に取得するのが比較的困難で
ある。そこで本発明ではバチルス ステアロサーモフイ
ルス中の耐熱性酵素であるネオプルラナーゼの遺伝子を
枯草菌に組込むことにより、ネオプルラナーゼを大量に
取得することを可能としたものである。就中、バチルス
ステアロサーモフイルスＴＲＳ４０のＤＮＡをヒンド
III により処理して得られるＤＮＡ断片をｐＴＢ５２２
に組込んだバチルス ズブチリスＮＡ１は本願発明を効
果的に実現可能とするものである。しかして本発明によ
るときは、宿主菌にα−アミラーゼ及びプロテアーゼ欠
損の変異株であるバチルス ズブチリスＮＡ１を用いる
ので、培養濾液に含まれる菌体外分泌酵素は殆んど本菌
株にクローン化された耐熱性のネオプルラナーゼのみと
なり、その遺伝子が増幅されることにより、当該酵素の
生産性を顕著に向上せしめ得ることや、中温菌に好熱菌
の遺伝子がクローン化されたことにより、たとえば６０
℃・１５分間の加熱処理により培養濾液中の耐熱性のネ
オプルラナーゼ以外の蛋白質は殆んど変性沈でんしてし
まうことから、目的酵素の濃縮・精製はバチルス ステ
アロサーモフイルスＴＲＳ４０を培養しこれから本件酵
素を濃縮・精製するよりも遙かに簡便・効率的に行うこ
とができる。
【００４７】
【図１】ベクタープラスミドｐＴＢ５２２を用いて調製
した組換えプラスミドｐＰＰ１０の制限酵素地図。図
中、太線で示した２．２ＭｄのヒンドIII 断片に相当す
る部分は、バチルス ステアロサーモフイルスＴＲＳ４
０由来の耐熱性ネオプルラナーゼ遺伝子である。ただ
し、円内の数字は分子サイズをＭｄで表わしたもの。
した組換えプラスミドｐＰＰ１０の制限酵素地図。図
中、太線で示した２．２ＭｄのヒンドIII 断片に相当す
る部分は、バチルス ステアロサーモフイルスＴＲＳ４
０由来の耐熱性ネオプルラナーゼ遺伝子である。ただ
し、円内の数字は分子サイズをＭｄで表わしたもの。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 15/56 Ｃ１２Ｒ 1:07）
Claims (1)
- 【請求項１】 バチルス ステアロサーモフイルス（Ba
cillus stearothermophilus)ＴＲＳ４０（微工研菌寄託
第９６０９号）の染色体ＤＮＡを制限酵素ヒンドIII
（Ｈｉｎｄ III）により処理して得られるネオプルラナ
ーゼをコードするＤＮＡ断片とヒンドIII で処理して得
られたベクター断片を結合させた分子量２．２Ｍｄの組
換えＤＮＡを複製維持した枯草菌を栄養培地で培養し、
その培養物からネオプルラナーゼを回収することを特徴
とする形質転換された枯草菌によるネオプルラナーゼの
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5085761A JPH0691818B2 (ja) | 1987-12-25 | 1993-03-18 | 形質転換された枯草菌によるネオプルラナーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33062587A JPH01171488A (ja) | 1987-12-25 | 1987-12-25 | 組換えプラスミド及びそれにより形質転換された枯草菌 |
| JP5085761A JPH0691818B2 (ja) | 1987-12-25 | 1993-03-18 | 形質転換された枯草菌によるネオプルラナーゼの製造法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33062587A Division JPH01171488A (ja) | 1987-12-25 | 1987-12-25 | 組換えプラスミド及びそれにより形質転換された枯草菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06121681A true JPH06121681A (ja) | 1994-05-06 |
| JPH0691818B2 JPH0691818B2 (ja) | 1994-11-16 |
Family
ID=26426766
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5085761A Expired - Fee Related JPH0691818B2 (ja) | 1987-12-25 | 1993-03-18 | 形質転換された枯草菌によるネオプルラナーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0691818B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014054221A (ja) * | 2012-09-13 | 2014-03-27 | Hayashibara Co Ltd | 新規α−グルカン転移酵素とそれらの製造方法並びに用途 |
-
1993
- 1993-03-18 JP JP5085761A patent/JPH0691818B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014054221A (ja) * | 2012-09-13 | 2014-03-27 | Hayashibara Co Ltd | 新規α−グルカン転移酵素とそれらの製造方法並びに用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0691818B2 (ja) | 1994-11-16 |
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