JPH06113843A - バチルス・メガテリウムの生産する新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法 - Google Patents
バチルス・メガテリウムの生産する新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法Info
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- JPH06113843A JPH06113843A JP4293802A JP29380292A JPH06113843A JP H06113843 A JPH06113843 A JP H06113843A JP 4293802 A JP4293802 A JP 4293802A JP 29380292 A JP29380292 A JP 29380292A JP H06113843 A JPH06113843 A JP H06113843A
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】新規サイクロデキストリン・グルカノトランス
フェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を使用して、γ−サイクロ
デキストリン（γ−ＣＤ）の工業的製造法を提供する。 【構成】バチルス・メガテリウムに属する微生物を培養
し、培養物中に主としてγ−ＣＤを生成する新規ＣＧＴ
ａｓｅを生産せしめ、これを採取する新規ＣＧＴａｓｅ
の製造法及び該ＣＧＴａｓｅを用いるγ−ＣＤの製造法
である。
フェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を使用して、γ−サイクロ
デキストリン（γ−ＣＤ）の工業的製造法を提供する。 【構成】バチルス・メガテリウムに属する微生物を培養
し、培養物中に主としてγ−ＣＤを生成する新規ＣＧＴ
ａｓｅを生産せしめ、これを採取する新規ＣＧＴａｓｅ
の製造法及び該ＣＧＴａｓｅを用いるγ−ＣＤの製造法
である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規サイクロデキスト
リン・グルカノトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.19、以
下CGTaseという）、その製造方法及びそれを用いるサイ
クロデキストリン（以下ＣＤという）の製造法に関す
る。更に詳しくは、CGTase生産能を有するバチルス・メ
ガテリウム（Bacillus megaterium）属に属する菌を培
養し、培養物中にCGTaseを産生せしめ、これを採取する
新規CGTaseの製造法及び該CGTaseを澱粉溶液に作用せし
めて、主としてγ−ＣＤを生成せしめるＣＤの製造法に
関する。
リン・グルカノトランスフェラーゼ（EC 2.4.1.19、以
下CGTaseという）、その製造方法及びそれを用いるサイ
クロデキストリン（以下ＣＤという）の製造法に関す
る。更に詳しくは、CGTase生産能を有するバチルス・メ
ガテリウム（Bacillus megaterium）属に属する菌を培
養し、培養物中にCGTaseを産生せしめ、これを採取する
新規CGTaseの製造法及び該CGTaseを澱粉溶液に作用せし
めて、主としてγ−ＣＤを生成せしめるＣＤの製造法に
関する。
【０００２】ＣＤは、６〜８個のグルコース分子がα−
1,4−グルコシド結合で環状に結合した非還元性のマル
トオリゴ糖であり、その分子空洞内に種々の物質を取り
込んで包接化合物を形成し、取り込まれた物質の物理、
化学的性質を変化させることができ、そのため、酸化し
やすい化合物や光分解し易い化合物の安定化、揮発性化
合物の不揮発化、難溶性化合物の可溶化、臭気性物質の
無臭化が可能であり、医薬品、化粧品、農薬及び食品へ
の広い分野で利用されている。
1,4−グルコシド結合で環状に結合した非還元性のマル
トオリゴ糖であり、その分子空洞内に種々の物質を取り
込んで包接化合物を形成し、取り込まれた物質の物理、
化学的性質を変化させることができ、そのため、酸化し
やすい化合物や光分解し易い化合物の安定化、揮発性化
合物の不揮発化、難溶性化合物の可溶化、臭気性物質の
無臭化が可能であり、医薬品、化粧品、農薬及び食品へ
の広い分野で利用されている。
【０００３】ＣＤには、グルコース分子数が６個からな
るα−ＣＤ、グルコース分子数が７個からなるβ−Ｃ
Ｄ、そしてグルコース分子数が８個からなるγ−ＣＤが
よく知られているが、このうちγ-ＣＤは、溶解度が大
きく、且つ包接能力にも優れているので、医薬品、化粧
品、農薬及び食品工業等への利用が、より有用視されて
いる。
るα−ＣＤ、グルコース分子数が７個からなるβ−Ｃ
Ｄ、そしてグルコース分子数が８個からなるγ−ＣＤが
よく知られているが、このうちγ-ＣＤは、溶解度が大
きく、且つ包接能力にも優れているので、医薬品、化粧
品、農薬及び食品工業等への利用が、より有用視されて
いる。
【０００４】
【従来の技術】これまで知られたCGTaseは、主としてα
−ＣＤ及びβ−ＣＤを生産するものであり、γ−ＣＤを
効果的に生産し得るCGTaseとしては、バチルス属の僅か
な菌株に知られているに過ぎない。例えば、バチルス・
エスピー（Bacillus sp.）AL６のCGTase（特開昭61-274
680：参考文献１）、バチルス・エスピー（Bacillus s
p.）No.313 のCGTase（特開昭62-25976：参考文献２）
及びバチルス・フィルムス（Bacillus firmus）290-3の
CGTase〔New trend in cyclodextrins and derivatives
25頁（1991年）、サンテ（Sante）社（フランス、パ
リ）出版：参考文献３〕が挙げられるに過ぎない。
−ＣＤ及びβ−ＣＤを生産するものであり、γ−ＣＤを
効果的に生産し得るCGTaseとしては、バチルス属の僅か
な菌株に知られているに過ぎない。例えば、バチルス・
エスピー（Bacillus sp.）AL６のCGTase（特開昭61-274
680：参考文献１）、バチルス・エスピー（Bacillus s
p.）No.313 のCGTase（特開昭62-25976：参考文献２）
及びバチルス・フィルムス（Bacillus firmus）290-3の
CGTase〔New trend in cyclodextrins and derivatives
25頁（1991年）、サンテ（Sante）社（フランス、パ
リ）出版：参考文献３〕が挙げられるに過ぎない。
【０００５】それ故、α−ＣＤ及びβ−ＣＤに関して
は、各種分野に利用されているが、γ−ＣＤに関して
は、ほとんど行われていない。
は、各種分野に利用されているが、γ−ＣＤに関して
は、ほとんど行われていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的とすると
ころは、γ−ＣＤを生産するCGTase生産能を有する微生
物を見いだし、該微生物を培養し、培養物中にCGTaseを
産生せしめ、これを採取すると共に、該酵素を使用する
γ−ＣＤの工業的製造法を提供することにある。
ころは、γ−ＣＤを生産するCGTase生産能を有する微生
物を見いだし、該微生物を培養し、培養物中にCGTaseを
産生せしめ、これを採取すると共に、該酵素を使用する
γ−ＣＤの工業的製造法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、γ
−ＣＤを高収率で生産するCGTase生産能を有する微生物
を広く自然界に求め、鋭意探索を試みた結果、バチルス
・メガテリウム（Bacillus megaterium）に属する菌株
が、本目的のCGTaseを生産することを見いだした。そし
て、該微生物を培養し、培養物中にCGTaseを産生せし
め、これを採取して、該酵素が新規酵素であることをも
知り、且つ該酵素を使用してγ−ＣＤの工業的製造法を
確立することにより、本発明を完成した。
−ＣＤを高収率で生産するCGTase生産能を有する微生物
を広く自然界に求め、鋭意探索を試みた結果、バチルス
・メガテリウム（Bacillus megaterium）に属する菌株
が、本目的のCGTaseを生産することを見いだした。そし
て、該微生物を培養し、培養物中にCGTaseを産生せし
め、これを採取して、該酵素が新規酵素であることをも
知り、且つ該酵素を使用してγ−ＣＤの工業的製造法を
確立することにより、本発明を完成した。
【０００８】本発明において使用される新たに土壌から
発見、分離された菌株の菌学的性質は下記の通りであ
る。
発見、分離された菌株の菌学的性質は下記の通りであ
る。
【０００９】（１）形態 細胞の形および大きさ：太い桿菌（菌端は膨張する） 1.1〜1.4×4.0〜6.0μ 運動性の有無：あり（周鞭毛） 胞子の有無：あり（細胞は膨張しない） グラム染色性：陽性 抗酸性：陰性
【００１０】（２）各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養：発育は良好、全縁不透明の光沢ある
コロニーで表面平滑（φ1.0〜1.5 mm） 肉汁寒天斜面培養：発育良好、直状、台状、白色、バタ
ー 肉汁液体培養：培地は全体に薄く白濁し、液面に微かに
菌蓋、底部に粘性の菌泥沈殿がみられる。 リトマスミルク培養：変化しない
コロニーで表面平滑（φ1.0〜1.5 mm） 肉汁寒天斜面培養：発育良好、直状、台状、白色、バタ
ー 肉汁液体培養：培地は全体に薄く白濁し、液面に微かに
菌蓋、底部に粘性の菌泥沈殿がみられる。 リトマスミルク培養：変化しない
【００１１】（３）生理学的性質 酸素に対する態度：偏性好気性 カタラーゼ：陽性 オキシダーゼ：陰性 ＯＦテスト：発酵、酸化共になし ブドウ糖からのガスの産生：陰性 インドールの生成：陰性 硝酸塩の還元：陽性（亜硝酸塩も還元） チロシンの加水分解：陽性 澱粉の加水分解：陽性 カゼインの加水分解：陰性 ゼラチンの加水分解：陽性 ジヒドロキシアセトン：陰性 フェニルアラニンデアミナーゼ：陰性 クエン酸の利用：陽性 エッグヨーク反応：陰性 0.001％リゾチーム生育：陰性 ウレアーゼ：陰性 ＴＳＩ寒天培地（斜面の酸）：黄／赤 硫化水素の生成：陰性 マッコンキー培地の生育：陰性 食塩に対する生育性：（0.5〜7.0％で陽性、10％で陰
性） 生育温度の範囲：12〜39℃（最適は31〜33℃） 生育pHの範囲：7.7〜11.6（最適は8.5） 糖類からの酸生成の有無： Ｌ−アラビノース − キシロース − グルコース ＋（ガス発生せず） マンニット ＋（ガス発生せず） サリシン ＋ 澱粉 ＋
性） 生育温度の範囲：12〜39℃（最適は31〜33℃） 生育pHの範囲：7.7〜11.6（最適は8.5） 糖類からの酸生成の有無： Ｌ−アラビノース − キシロース − グルコース ＋（ガス発生せず） マンニット ＋（ガス発生せず） サリシン ＋ 澱粉 ＋
【００１２】以上の菌学的性質について、Bergey' Manu
al of Determinative Bacteriology，第８版（1974）、
Bergey' Manual of Systematic Bacteriology，第２巻
（1986）及び『The Genus Bacillus』U.S.Department o
f Agriculture Handbook No.427 p-160 を参照し、その
性状を比較したところ、本菌はグラム陽性、周鞭毛、有
胞子であることから、バチルス（Bacillus）属に属する
菌であることがわかった。さらに、本菌は、上記の菌学
的諸性質からバチルス・メガテリウム（Bacillus megat
erium）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バ
チルス・フィムルス（Bacillus firmus）のいずれかに
属することが分かるが、しかし、バチルス・フィムルス
（Bacillus firmus）とは、菌幅とクエン酸利用で異な
り、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）とは、エ
ッグヨーク反応陰性、偏性好気性、菌幅が大きいこと、
及び食塩10％で生育しないこと等で異なる。そこで本菌
をバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）に
属するものと同定し、本菌株をバチルス・メガテリウム
（Bacillus megaterium）No.9604と命名した。
al of Determinative Bacteriology，第８版（1974）、
Bergey' Manual of Systematic Bacteriology，第２巻
（1986）及び『The Genus Bacillus』U.S.Department o
f Agriculture Handbook No.427 p-160 を参照し、その
性状を比較したところ、本菌はグラム陽性、周鞭毛、有
胞子であることから、バチルス（Bacillus）属に属する
菌であることがわかった。さらに、本菌は、上記の菌学
的諸性質からバチルス・メガテリウム（Bacillus megat
erium）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バ
チルス・フィムルス（Bacillus firmus）のいずれかに
属することが分かるが、しかし、バチルス・フィムルス
（Bacillus firmus）とは、菌幅とクエン酸利用で異な
り、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）とは、エ
ッグヨーク反応陰性、偏性好気性、菌幅が大きいこと、
及び食塩10％で生育しないこと等で異なる。そこで本菌
をバチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）に
属するものと同定し、本菌株をバチルス・メガテリウム
（Bacillus megaterium）No.9604と命名した。
【００１３】本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研菌寄第13142号（FERM P-13142）として寄託さ
れている。尚、バチルス・メガテリウム（Bacillus meg
aterium）に属する菌株において、主としてγ−ＣＤを
生産するCGTase生産能を有するという報告はなく、本菌
株が始めてである。
に微工研菌寄第13142号（FERM P-13142）として寄託さ
れている。尚、バチルス・メガテリウム（Bacillus meg
aterium）に属する菌株において、主としてγ−ＣＤを
生産するCGTase生産能を有するという報告はなく、本菌
株が始めてである。
【００１４】本菌株を利用して、CGTaseを製造するため
には、当該微生物が良好に生育し、酵素を順調に生産す
るために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源
等を含有する合成培地又は天然培地中でこれを培養す
る。炭素源としては、澱粉又はその組成画分、焙焼デキ
ストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα
−澱粉等の炭水化物が使用できる。具体例としては、可
溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、
デキストリン、アミロペクチン、アミロース等があげら
れる。
には、当該微生物が良好に生育し、酵素を順調に生産す
るために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源
等を含有する合成培地又は天然培地中でこれを培養す
る。炭素源としては、澱粉又はその組成画分、焙焼デキ
ストリン、加工澱粉、澱粉誘導体、物理処理澱粉及びα
−澱粉等の炭水化物が使用できる。具体例としては、可
溶性澱粉、トウモロコシ澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、
デキストリン、アミロペクチン、アミロース等があげら
れる。
【００１５】窒素源としては、ポリペプトン、カゼイ
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー或
いは大豆又は大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、
硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩窒素
化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられる。
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー或
いは大豆又は大豆粕などの抽出物等の有機窒素源物質、
硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機塩窒素
化合物、グルタミン酸等のアミノ酸類が挙げられる。
【００１６】そして無機塩類としては、リン酸１カリウ
ム、リン酸２カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム
等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム
塩、炭酸ナトリウム等のナトリウム塩等が用いられる。
ム、リン酸２カリウム等のリン酸塩、硫酸マグネシウム
等のマグネシウム塩、塩化カルシウム等のカルシウム
塩、炭酸ナトリウム等のナトリウム塩等が用いられる。
【００１７】培養は、振盪培養若しくは、通気攪拌培養
等の好気的条件下に於いて培地pH７〜11の範囲、好まし
くはｐＨ８〜10の範囲に調製し、温度10〜40℃の範囲、
好ましくは、25〜37℃で実施するのが望ましいが、この
条件以外であっても微生物が生育し、目的とする酵素を
生成する条件であれば特に制限されない。
等の好気的条件下に於いて培地pH７〜11の範囲、好まし
くはｐＨ８〜10の範囲に調製し、温度10〜40℃の範囲、
好ましくは、25〜37℃で実施するのが望ましいが、この
条件以外であっても微生物が生育し、目的とする酵素を
生成する条件であれば特に制限されない。
【００１８】このようにして培養を行うと、通常は培養
を開始して２〜７日間で培養液中にCGTaseが生産され
る。次いで、培養液から菌体を除去し、培養ろ液を得、
限外ろ過膜で脱塩、濃縮した後、硫安塩析又は有機溶媒
沈降等により酵素を回収する。こうして得られた粗製の
CGTaseは、そのままでもＣＤ生成反応に使用できるが、
必要に応じて、更にＤＥＡＥ−セファデックス（商品
名、ファルマシア社製）による吸着溶出、セファデック
ス（商品名、ファルマシア社製）による分画等により精
製して使用する。
を開始して２〜７日間で培養液中にCGTaseが生産され
る。次いで、培養液から菌体を除去し、培養ろ液を得、
限外ろ過膜で脱塩、濃縮した後、硫安塩析又は有機溶媒
沈降等により酵素を回収する。こうして得られた粗製の
CGTaseは、そのままでもＣＤ生成反応に使用できるが、
必要に応じて、更にＤＥＡＥ−セファデックス（商品
名、ファルマシア社製）による吸着溶出、セファデック
ス（商品名、ファルマシア社製）による分画等により精
製して使用する。
【００１９】得られた酵素CGTaseの酵素化学的性質を以
下に述べる。
下に述べる。
【００２０】作用及び基質特異性：２％可溶性澱粉
（pH7.0）に本酵素（５単位）を加えて、40℃で反応を
行い、経時的にＣＤ生成量を測定した。その結果を図１
に示す。図１に於いて黒四角はγ−ＣＤの生成量を示す
ものであり、黒三角は、β−ＣＤの生成量を示すもので
あり、黒丸はα−ＣＤの生成を示すものである。図１よ
り明かなように本酵素は澱粉に作用し、主としてγ−Ｃ
Ｄを生成し、β−ＣＤをも生成するが、α−ＣＤを生成
しない。
（pH7.0）に本酵素（５単位）を加えて、40℃で反応を
行い、経時的にＣＤ生成量を測定した。その結果を図１
に示す。図１に於いて黒四角はγ−ＣＤの生成量を示す
ものであり、黒三角は、β−ＣＤの生成量を示すもので
あり、黒丸はα−ＣＤの生成を示すものである。図１よ
り明かなように本酵素は澱粉に作用し、主としてγ−Ｃ
Ｄを生成し、β−ＣＤをも生成するが、α−ＣＤを生成
しない。
【００２１】至適ｐＨ：本酵素を1.5％可溶性澱粉溶
液に40℃にてpH３〜13のpH条件下で30分間作用させ、そ
れぞれの活性を測定した。その結果は、図２に示され
る。図２から明かなように本酵素の至適ｐＨは、10であ
る。
液に40℃にてpH３〜13のpH条件下で30分間作用させ、そ
れぞれの活性を測定した。その結果は、図２に示され
る。図２から明かなように本酵素の至適ｐＨは、10であ
る。
【００２２】至適温度：本酵素を1.5％可溶性澱粉溶
液に各種温度にてpH10.0のpH条件下で30分間作用させ、
それぞれの活性を測定した。その結果は、図３に示され
る。図３から明かなように本酵素の至適温度は、40〜45
℃である。
液に各種温度にてpH10.0のpH条件下で30分間作用させ、
それぞれの活性を測定した。その結果は、図３に示され
る。図３から明かなように本酵素の至適温度は、40〜45
℃である。
【００２３】安定pH：本酵素液をpH３〜13のpH条件下
で、40℃で30分間保持し、その残存活性を測定した。そ
の結果は、図４に示される。図４から明かなように安定
pH範囲は、ｐＨ８〜９である。
で、40℃で30分間保持し、その残存活性を測定した。そ
の結果は、図４に示される。図４から明かなように安定
pH範囲は、ｐＨ８〜９である。
【００２４】温度安定性：本酵素溶液を各種温度下
で、pH9.0（0.1M H3BO3,KCl-NaOH緩衝液）にて30分間放
置後、それぞれの残存活性を測定した。その結果は図５
の実線に示される。図５より明かなように本酵素は、40
℃で85％の残存活性を示した。尚、本酵素は、カルシウ
ム塩の添加により安定化され、10mMのカルシウム塩によ
り45℃の処理においても、図５の破線に示されるように
100％の残存活性を示した。
で、pH9.0（0.1M H3BO3,KCl-NaOH緩衝液）にて30分間放
置後、それぞれの残存活性を測定した。その結果は図５
の実線に示される。図５より明かなように本酵素は、40
℃で85％の残存活性を示した。尚、本酵素は、カルシウ
ム塩の添加により安定化され、10mMのカルシウム塩によ
り45℃の処理においても、図５の破線に示されるように
100％の残存活性を示した。
【００２５】活性測定法：基質〔1.5％可溶性澱粉、
0.1Ｍ アトキンス・パンチン（Atkins& Pantin）緩衝液
（pH10.0）〕0.5mlに酵素液0.05mlを添加し、40℃にて3
0分間反応した。その後、0.1Ｎ塩酸５mlを加え反応を停
止し、0.5mlを抜き取り、ヨウ素液５mlを加え。660nmで
の吸光度の減少を測定した。１単位は、本条件下、１分
間に660nmの吸光度を１％減少させる酵素量とした。
0.1Ｍ アトキンス・パンチン（Atkins& Pantin）緩衝液
（pH10.0）〕0.5mlに酵素液0.05mlを添加し、40℃にて3
0分間反応した。その後、0.1Ｎ塩酸５mlを加え反応を停
止し、0.5mlを抜き取り、ヨウ素液５mlを加え。660nmで
の吸光度の減少を測定した。１単位は、本条件下、１分
間に660nmの吸光度を１％減少させる酵素量とした。
【００２６】本酵素の酵素化学的性質を、既存のγ−Ｃ
Ｄを主として生成するCGTaseと比較し、表１に示す。
Ｄを主として生成するCGTaseと比較し、表１に示す。
【表１】 表１中の※は、10mMCaCl存在下での安定性を示す。表１
より明かなように本酵素は、既存のγ−ＣＤを主として
生成するCGTaseの何れとも異なる新規酵素である。
より明かなように本酵素は、既存のγ−ＣＤを主として
生成するCGTaseの何れとも異なる新規酵素である。
【００２７】本発明方法によりＣＤを製造するには、例
えば、先ず１〜30％の澱粉（澱粉又はその組成画分、加
工澱粉等を含む）を含有する水溶液に本酵素液（精製品
又は粗製品）を0.5〜20単位（乾燥澱粉１ｇ当たり）加
えてpH４〜10、温度20〜70℃にて、１〜50時間酵素反応
を行う。尚、この澱粉は、必要に応じて予め加熱し、液
化処理を施して用いる。
えば、先ず１〜30％の澱粉（澱粉又はその組成画分、加
工澱粉等を含む）を含有する水溶液に本酵素液（精製品
又は粗製品）を0.5〜20単位（乾燥澱粉１ｇ当たり）加
えてpH４〜10、温度20〜70℃にて、１〜50時間酵素反応
を行う。尚、この澱粉は、必要に応じて予め加熱し、液
化処理を施して用いる。
【００２８】以下に試験例及び実施例にて本発明を具体
的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるも
のではない。
的に説明するが、本発明はこれらによって限定されるも
のではない。
【００２９】試験例 ２％の馬鈴薯澱粉〔0.01M H3BO3,KCl-NaOH緩衝液（pH
8.0）〕に本酵素液（10mM CaCl2 を含む）を２．５及び
５単位（乾燥澱粉１ｇ当たり）それぞれ添加し、60℃に
て20〜44時間反応せしめた。その結果は、表２に示され
る。
8.0）〕に本酵素液（10mM CaCl2 を含む）を２．５及び
５単位（乾燥澱粉１ｇ当たり）それぞれ添加し、60℃に
て20〜44時間反応せしめた。その結果は、表２に示され
る。
【００３０】
【表２】
【００３１】表２中の u/g.Dsは、乾燥澱粉１ｇ当たり
の酵素単位を示し、又ＣＤ生成率は、基質に対する重量
比（％）で示す。表２より明かなように、本酵素は、何
れの反応条件に於いてもγ−ＣＤを高収率で生成するこ
とが分かる。
の酵素単位を示し、又ＣＤ生成率は、基質に対する重量
比（％）で示す。表２より明かなように、本酵素は、何
れの反応条件に於いてもγ−ＣＤを高収率で生成するこ
とが分かる。
【００３２】
実施例１ 可溶性澱粉 1.0％、ポリペプトン 0.5％、酵母エキス
0.25％、硫酸アンモニウム 0.1％、K2HPO4 0.05％、MgS
O4・7H2O 0.025％、CaCl2 0.01％、Na2CO3 1.0％（別殺
菌）からなる培地（pH10.0）100 mlを500 ml容坂口フラ
スコに入れ、常法により殺菌後バチルス・メガテリウム
（Bacillus megaterium）No.9604（FERM-P 13141）を接
種し、37℃で40時間振盪培養した。培養後、培養菌体を
遠心分離にて除去し、除菌液２Ｌを得た。この除菌液を
限外ろ過膜（モジュールＳＩＰ，旭化成社製）にかけ、
濃縮液30mlを得た。得られた濃縮液のCGTase活性は8.7
単位／mlであった。
0.25％、硫酸アンモニウム 0.1％、K2HPO4 0.05％、MgS
O4・7H2O 0.025％、CaCl2 0.01％、Na2CO3 1.0％（別殺
菌）からなる培地（pH10.0）100 mlを500 ml容坂口フラ
スコに入れ、常法により殺菌後バチルス・メガテリウム
（Bacillus megaterium）No.9604（FERM-P 13141）を接
種し、37℃で40時間振盪培養した。培養後、培養菌体を
遠心分離にて除去し、除菌液２Ｌを得た。この除菌液を
限外ろ過膜（モジュールＳＩＰ，旭化成社製）にかけ、
濃縮液30mlを得た。得られた濃縮液のCGTase活性は8.7
単位／mlであった。
【００３３】実施例２ ２％馬鈴薯澱粉溶液〔0.01Ｍ H3BO3,KCl-NaOH緩衝液（p
H8.0）〕10mlに本発明のCGTaseを5.0単位（固形澱粉１
ｇ当たり）を加え、60℃にて20時間反応させた。反応に
より得られたγ−ＣＤ及びβ−ＣＤの収率（基質に対す
る重量比で示す）は、それぞれ16.3％及び11.2％であ
り、α−ＣＤの生成は、認められなかった。この高速液
体クロマトグラフィーにより分析したクロマトグラフを
図６に示す。
H8.0）〕10mlに本発明のCGTaseを5.0単位（固形澱粉１
ｇ当たり）を加え、60℃にて20時間反応させた。反応に
より得られたγ−ＣＤ及びβ−ＣＤの収率（基質に対す
る重量比で示す）は、それぞれ16.3％及び11.2％であ
り、α−ＣＤの生成は、認められなかった。この高速液
体クロマトグラフィーにより分析したクロマトグラフを
図６に示す。
【００３４】
【発明の効果】本発明は、CGTase産生能を有するバチル
ス・メガテリウムに属する微生物を培養し、培養物中に
新規CGTaseを生産せしめ、これを採取する新規CGTaseの
製造法及び該新規CGTaseを用いるγ−Ｄの製造法であ
る。本願発明の方法により、γ−ＣＤが安価に製造さ
れ、γ−ＣＤの食品分野、飼料分野への用途がより大き
く開かれた。
ス・メガテリウムに属する微生物を培養し、培養物中に
新規CGTaseを生産せしめ、これを採取する新規CGTaseの
製造法及び該新規CGTaseを用いるγ−Ｄの製造法であ
る。本願発明の方法により、γ−ＣＤが安価に製造さ
れ、γ−ＣＤの食品分野、飼料分野への用途がより大き
く開かれた。
【図１】本発明のCGTaseを澱粉に作用させたときの反応
時間と各種サイクロデキストリンの生成量との関係を示
す。
時間と各種サイクロデキストリンの生成量との関係を示
す。
【図２】本発明のCGTaseの至適ｐＨ曲線を示す。図中で
黒丸はマッキルバイン（McIlvaine）緩衝液の、黒三角
はアトキンス・パンチン（Atkins & Pantin）緩衝液
の、黒四角は塩化カリ・水酸化ナトリウム（KCl-NaOH）
緩衝液のそれぞれの曲線を示すものである。
黒丸はマッキルバイン（McIlvaine）緩衝液の、黒三角
はアトキンス・パンチン（Atkins & Pantin）緩衝液
の、黒四角は塩化カリ・水酸化ナトリウム（KCl-NaOH）
緩衝液のそれぞれの曲線を示すものである。
【図３】本発明のCGTaseの至適温度曲線を示す。
【図４】本発明のCGTaseの安定ｐＨ曲線を示す。図中で
黒丸はマッキルバイン（McIlvaine）緩衝液の、黒三角
はアトキンス・パンチン（Atkins & Pantin）緩衝液
の、黒四角は塩化カリ・水酸化ナトリウム（KCl-NaOH）
緩衝液のそれぞれの曲線を示すものである。
黒丸はマッキルバイン（McIlvaine）緩衝液の、黒三角
はアトキンス・パンチン（Atkins & Pantin）緩衝液
の、黒四角は塩化カリ・水酸化ナトリウム（KCl-NaOH）
緩衝液のそれぞれの曲線を示すものである。
【図５】本発明のCGTaseの温度安定曲線を示す。図中で
実線はCGTaseのみの場合であり、破線は塩化カルシウム
20 mMを添加した場合である。
実線はCGTaseのみの場合であり、破線は塩化カルシウム
20 mMを添加した場合である。
【図６】本発明のCGTaseを澱粉に作用させたときに生成
する各種サイクロデキストリンの高速液体クロマトグラ
フィーにより分析したクロマトグラフを示す。図中は
γ−ＣＤのピークを示し、はβ−ＣＤのピークを示
す。
する各種サイクロデキストリンの高速液体クロマトグラ
フィーにより分析したクロマトグラフを示す。図中は
γ−ＣＤのピークを示し、はβ−ＣＤのピークを示
す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 19/18 Ｃ１２Ｒ 1:11）
Claims (4)
- 【請求項１】下記の酵素化学的性質を有するサイクロデ
キストリン・グルカノトランスフェラーゼ。 作用及び基質特異性：澱粉、デキストリン、アミロペ
クチン、アミロース等に作用して、主としてγ−サイク
ロデキストリンを生成し、β−サイクロデキストリンを
も生成するが、α−サイクロデキストリンを生成しな
い。 至適ｐＨ：10 至適温度：40〜45℃ 安定ｐＨ：８〜９ 温度安定性：40℃、30分処理で85％の残存活性を示
す。尚、10mMカルシウム塩の添加により、45℃、30分処
理でも100％の残存活性を示す。 - 【請求項２】バチルス・メガテリウム属に属するサイク
ロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ生産能を
有する微生物を培養し、培養物中にサイクロデキストリ
ン・グルカノトランスフェラーゼを産生せしめ、これを
採取することを特徴とするサイクロデキストリン・グル
カノトランスフェラーゼの製造法。 - 【請求項３】澱粉、デキストリン、アミロース、アミロ
ペクチン等の溶液にバチルス・メガテリウム属の産生す
るサイクロデキストリン・グリルカノトランスフェラー
ゼを反応させ、反応液中に主としてγ−サイクロデキス
トリンを生成せしめ、これを採取することを特徴とする
サイクロデキストリンの製造法。 - 【請求項４】サイクロデキストリン・グルカノトランス
フェラーゼ生産能を有するバチルス・メガテリウム（Ba
cillus megaterium）菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29380292A JP3250852B2 (ja) | 1992-10-06 | 1992-10-06 | バチルス・メガテリウムの生産する新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29380292A JP3250852B2 (ja) | 1992-10-06 | 1992-10-06 | バチルス・メガテリウムの生産する新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06113843A true JPH06113843A (ja) | 1994-04-26 |
| JP3250852B2 JP3250852B2 (ja) | 2002-01-28 |
Family
ID=17799345
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29380292A Expired - Fee Related JP3250852B2 (ja) | 1992-10-06 | 1992-10-06 | バチルス・メガテリウムの生産する新規サイクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ、その製造法及び該酵素を用いるサイクロデキストリンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3250852B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001090335A1 (fr) * | 2000-05-23 | 2001-11-29 | Nihon Shokuhin Kako Co., Ltd. | Nouvelle cyclodextrine glucanotransferase, procede de production de celle-ci et procede de production de cyclodextrine au moyen de cette enzyme |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100374555C (zh) * | 2006-01-19 | 2008-03-12 | 山东大学 | 一种利用酵母生产β-环糊精的方法 |
-
1992
- 1992-10-06 JP JP29380292A patent/JP3250852B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001090335A1 (fr) * | 2000-05-23 | 2001-11-29 | Nihon Shokuhin Kako Co., Ltd. | Nouvelle cyclodextrine glucanotransferase, procede de production de celle-ci et procede de production de cyclodextrine au moyen de cette enzyme |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3250852B2 (ja) | 2002-01-28 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |