JPH06109732A - 蛋白質の標識方法 - Google Patents
蛋白質の標識方法Info
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- JPH06109732A JPH06109732A JP4281139A JP28113992A JPH06109732A JP H06109732 A JPH06109732 A JP H06109732A JP 4281139 A JP4281139 A JP 4281139A JP 28113992 A JP28113992 A JP 28113992A JP H06109732 A JPH06109732 A JP H06109732A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】蛋白質の特異性および活性を低下させること無
く、蛋白質に標識を施す。 【構成】抗体に架橋剤Ｎ−サクシンイミジル ３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネ−トを結合させる際に、
硫酸アンモニウム共存下、結合反応を行う。
く、蛋白質に標識を施す。 【構成】抗体に架橋剤Ｎ−サクシンイミジル ３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネ−トを結合させる際に、
硫酸アンモニウム共存下、結合反応を行う。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、蛋白質を標識する方法
に関するものであり、さらに詳しくは、目的とする蛋白
質の特異性や活性を低下させることなく標識する方法に
関するものである。
に関するものであり、さらに詳しくは、目的とする蛋白
質の特異性や活性を低下させることなく標識する方法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】蛋白質に何らかの標識物を結合させ、そ
の物理化学的な性質を調べたり、または特定の物質を定
量したりすることは古くから行われている。特に抗体や
抗原に標識物を結合させ、抗原あるいは抗体を定量する
方法は、臨床的に重要な位置を占めている。しかしなが
らそのそれら方法は、蛋白質のアミノ基やカルボキシル
基、ＳＨ基などの官能基を標識物質と結合させるもので
あり、該蛋白質の特異性あるいは活性がそれら官能基を
必須とする場合は当然劣化を招くこととなる。従って、
蛋白質の性能を変えずに標識することが非常に望まれる
事である。
の物理化学的な性質を調べたり、または特定の物質を定
量したりすることは古くから行われている。特に抗体や
抗原に標識物を結合させ、抗原あるいは抗体を定量する
方法は、臨床的に重要な位置を占めている。しかしなが
らそのそれら方法は、蛋白質のアミノ基やカルボキシル
基、ＳＨ基などの官能基を標識物質と結合させるもので
あり、該蛋白質の特異性あるいは活性がそれら官能基を
必須とする場合は当然劣化を招くこととなる。従って、
蛋白質の性能を変えずに標識することが非常に望まれる
事である。
【０００３】抗体の標識方法については、１９３０年代
初めにはＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒらがアゾ色素を抗体
に結合させる方法で試験したが実用には至っていない。
現在では螢光物質、酵素などを標識する方法が一般に利
用されている。例えば螢光物質としてはフルオレセイン
イソチオシアネ−ト、テトラロ−ダミンイソチオシアネ
−トを用いて、抗体のリシン残基のε−アミノ基をチオ
カルバミド結合で標識する方法が知られる。
初めにはＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇｅｒらがアゾ色素を抗体
に結合させる方法で試験したが実用には至っていない。
現在では螢光物質、酵素などを標識する方法が一般に利
用されている。例えば螢光物質としてはフルオレセイン
イソチオシアネ−ト、テトラロ−ダミンイソチオシアネ
−トを用いて、抗体のリシン残基のε−アミノ基をチオ
カルバミド結合で標識する方法が知られる。
【０００４】酵素標識については、１９６０年代よりカ
ルボジイミド、ジアゾ化合物、チオシアン化合物などの
架橋剤を利用して抗体と酵素を標識する方法が開発され
てきた。しかしながらいずれも広く利用されるには至ら
なかった。１９７０年以降、グルタルアルデヒドをもち
いて抗体と西洋ワサビペルオキシダ−ゼを結合させる方
法が開発された。しかしこの方法も高重合体が形成され
たり、酵素活性や抗体活性が大きく損なわれたり、ある
いは収量が極端に低いなどの理由で汎用されるには至っ
ていない。
ルボジイミド、ジアゾ化合物、チオシアン化合物などの
架橋剤を利用して抗体と酵素を標識する方法が開発され
てきた。しかしながらいずれも広く利用されるには至ら
なかった。１９７０年以降、グルタルアルデヒドをもち
いて抗体と西洋ワサビペルオキシダ−ゼを結合させる方
法が開発された。しかしこの方法も高重合体が形成され
たり、酵素活性や抗体活性が大きく損なわれたり、ある
いは収量が極端に低いなどの理由で汎用されるには至っ
ていない。
【０００５】１９７４年には過ヨウ素酸が使われるよう
になった。その原理は、西洋ワサビペルオキシダ−ゼの
糖鎖にアルデヒド基を導入し、抗体のアミノ基と反応さ
せ生成したシッフ塩基を還元して標識させるものであ
る。しかし重合体の生成、抗体、酵素活性の劣化を完全
になくすことはできなかった。
になった。その原理は、西洋ワサビペルオキシダ−ゼの
糖鎖にアルデヒド基を導入し、抗体のアミノ基と反応さ
せ生成したシッフ塩基を還元して標識させるものであ
る。しかし重合体の生成、抗体、酵素活性の劣化を完全
になくすことはできなかった。
【０００６】１９７５年に石川らにより、ＩｇＧやＦ
（ａｂ´）２のヒンジ部のジスルフィド結合を還元して
生成するチオ−ル基と、酵素のアミノ基を利用して結合
させた架橋剤のマレイミド基を反応させて標識する方法
が開発された。この方法は、抗体活性の劣化がほとんど
なく非常に利用価値が高いとされている。しかし酵素へ
の架橋剤の結合は、アミノ基を用いるためやはり酵素活
性の劣化の可能性はなくすことができない。また抗体の
ジスルフィド結合を還元した際、生成する遊離のＳＨ基
は化学的に非常に不安定なので、毎回同一の性能をもつ
標識物質を得るには熟練が必要である。
（ａｂ´）２のヒンジ部のジスルフィド結合を還元して
生成するチオ−ル基と、酵素のアミノ基を利用して結合
させた架橋剤のマレイミド基を反応させて標識する方法
が開発された。この方法は、抗体活性の劣化がほとんど
なく非常に利用価値が高いとされている。しかし酵素へ
の架橋剤の結合は、アミノ基を用いるためやはり酵素活
性の劣化の可能性はなくすことができない。また抗体の
ジスルフィド結合を還元した際、生成する遊離のＳＨ基
は化学的に非常に不安定なので、毎回同一の性能をもつ
標識物質を得るには熟練が必要である。
【０００７】一般によく用いられる架橋剤としては、Ｎ
−サクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネ−ト（以下ＳＰＤＰと略）やその誘導体、ｍ−マ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルフォサクシン
イミドエステルやその誘導体などが挙げられる。
−サクシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネ−ト（以下ＳＰＤＰと略）やその誘導体、ｍ−マ
レイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルフォサクシン
イミドエステルやその誘導体などが挙げられる。
【０００８】標識反応の成否は、反応溶液のｐＨや架橋
剤の濃度にも強く起因するが、最適ｐＨをはずれたり、
濃度が低い場合は反応自体が進まず、未反応の蛋白質や
標識物が残ってしまい標識蛋白質の収率の低下などが考
えられる。また蛋白質ではその固有の等電点や活性に関
係するアミノ酸残基の等電点などの状態を制御しづら
く、蛋白質固有の条件が一般的な条件とはなりにくいこ
とは自明である。
剤の濃度にも強く起因するが、最適ｐＨをはずれたり、
濃度が低い場合は反応自体が進まず、未反応の蛋白質や
標識物が残ってしまい標識蛋白質の収率の低下などが考
えられる。また蛋白質ではその固有の等電点や活性に関
係するアミノ酸残基の等電点などの状態を制御しづら
く、蛋白質固有の条件が一般的な条件とはなりにくいこ
とは自明である。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】蛋白質への標識は今日
の生化学などの基礎分野から臨床検査などの応用分野ま
で多岐にわたり利用されている。特に抗体の標識は、利
用価値が高く広く応用されている。しかしながら、標識
により蛋白質特有の活性を失うこともあり、標識が大き
な障害となることも多い。以上のことに鑑み、蛋白質の
特異性や活性を低下させることなく、標識物質を効果的
に標識する方法を提供することを目的とするものであ
る。
の生化学などの基礎分野から臨床検査などの応用分野ま
で多岐にわたり利用されている。特に抗体の標識は、利
用価値が高く広く応用されている。しかしながら、標識
により蛋白質特有の活性を失うこともあり、標識が大き
な障害となることも多い。以上のことに鑑み、蛋白質の
特異性や活性を低下させることなく、標識物質を効果的
に標識する方法を提供することを目的とするものであ
る。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、蛋白質の
有効な標識法において、蛋白質の性能の劣化なしに標識
する方法について鋭意検討したところ、阻害剤を最適濃
度で共存させることで、これら課題を解決できることを
見出だし本発明を完成させた。
有効な標識法において、蛋白質の性能の劣化なしに標識
する方法について鋭意検討したところ、阻害剤を最適濃
度で共存させることで、これら課題を解決できることを
見出だし本発明を完成させた。
【００１１】即ち本発明は、蛋白質を標識物質にて標識
する際、蛋白質と標識物質との結合阻害剤を共存させて
標識することを特徴とする蛋白質の標識方法である。以
下、本発明をさらに詳細に説明する。
する際、蛋白質と標識物質との結合阻害剤を共存させて
標識することを特徴とする蛋白質の標識方法である。以
下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１２】本発明でいう蛋白質とは、例えば抗体、抗
原、レセプタ−、レクチン、酵素などを含み、その機能
によって限定されるものではなく、蛋白質であれば何等
限定されない。
原、レセプタ−、レクチン、酵素などを含み、その機能
によって限定されるものではなく、蛋白質であれば何等
限定されない。
【００１３】標識物質としては、酵素、蛍光物質、化学
物質または架橋剤などがあげられる。酵素としては例え
ばペルオキシダ−ゼ、β−Ｄガラクトシダ−ゼ、アルカ
リフォスファタ−ゼ、ウレア−ゼ、カタラ−ゼ、β−グ
ルクロニダ−ゼなどがあげられる。螢光物質としては例
えばフルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネ
−ト、テトラロ−ダミンイソチオシアネ−トなどがあげ
られる。化学物質としては例えばアビジン化合物、ビオ
チン化合物などがあげられる。さらに本発明では、蛋白
質に酵素、蛍光物質または化学物質などを導入する際に
使用する架橋剤も標識物質としてその範囲に含めて考え
られ、例えば、ＳＰＤＰやその誘導体、ｍ−マレイミド
ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルフォサクシンイミドエ
ステルやその誘導体、アジドベンゾイルヒドアザイド、
４，４´−ジイソチオシアノスチルベン−２，２´−ジ
スルホン酸ナトリウム塩などがあげられる。
物質または架橋剤などがあげられる。酵素としては例え
ばペルオキシダ−ゼ、β−Ｄガラクトシダ−ゼ、アルカ
リフォスファタ−ゼ、ウレア−ゼ、カタラ−ゼ、β−グ
ルクロニダ−ゼなどがあげられる。螢光物質としては例
えばフルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネ
−ト、テトラロ−ダミンイソチオシアネ−トなどがあげ
られる。化学物質としては例えばアビジン化合物、ビオ
チン化合物などがあげられる。さらに本発明では、蛋白
質に酵素、蛍光物質または化学物質などを導入する際に
使用する架橋剤も標識物質としてその範囲に含めて考え
られ、例えば、ＳＰＤＰやその誘導体、ｍ−マレイミド
ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルフォサクシンイミドエ
ステルやその誘導体、アジドベンゾイルヒドアザイド、
４，４´−ジイソチオシアノスチルベン−２，２´−ジ
スルホン酸ナトリウム塩などがあげられる。
【００１４】本発明で用いられる阻害剤は、標識物質を
結合させる蛋白質の部位によってその種類が異なり、ア
ミノ基の場合はアンモニウムイオンを持つ化合物例えば
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどが、カルボキ
シル基の場合は、カルボン酸をもつ化合物、例えば炭酸
などが、ＳＨ基の場合は、ジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）、メルカプトエタノ−ルなどが使用できるが、蛋白
質と標識物質との反応を阻害するものであれば、何等限
定されるものではない。例えば標識物質として架橋剤Ｓ
ＰＤＰを使用するときには、ＳＰＤＰは蛋白質のアミノ
基に結合するため、阻害剤としてアンモニウムイオンを
持つ化合物を使用することが好ましい。
結合させる蛋白質の部位によってその種類が異なり、ア
ミノ基の場合はアンモニウムイオンを持つ化合物例えば
硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムなどが、カルボキ
シル基の場合は、カルボン酸をもつ化合物、例えば炭酸
などが、ＳＨ基の場合は、ジチオスレイトール（ＤＴ
Ｔ）、メルカプトエタノ−ルなどが使用できるが、蛋白
質と標識物質との反応を阻害するものであれば、何等限
定されるものではない。例えば標識物質として架橋剤Ｓ
ＰＤＰを使用するときには、ＳＰＤＰは蛋白質のアミノ
基に結合するため、阻害剤としてアンモニウムイオンを
持つ化合物を使用することが好ましい。
【００１５】阻害剤の使用方法には特に限定はなく、標
識物質と蛋白質との結合反応が行われるときに共存させ
ておけばよい。例えば標識物質と蛋白質との結合反応の
際に、阻害剤を好ましくは１０μＭ〜５００ｍＭ、さら
に好ましくは１ｍＭ〜２００ｍＭとなるように添加し、
温度１０℃〜５５℃で、さらに好ましくは温度２５℃〜
４０℃で反応させればよい。反応時間は反応物質および
阻害剤の濃度や反応温度に依存するが、通常３０分〜４
時間で十分である。反応終了後、透析またはクロマトグ
ラフィーなどで精製し、未反応物質および阻害剤を除去
すればよい。
識物質と蛋白質との結合反応が行われるときに共存させ
ておけばよい。例えば標識物質と蛋白質との結合反応の
際に、阻害剤を好ましくは１０μＭ〜５００ｍＭ、さら
に好ましくは１ｍＭ〜２００ｍＭとなるように添加し、
温度１０℃〜５５℃で、さらに好ましくは温度２５℃〜
４０℃で反応させればよい。反応時間は反応物質および
阻害剤の濃度や反応温度に依存するが、通常３０分〜４
時間で十分である。反応終了後、透析またはクロマトグ
ラフィーなどで精製し、未反応物質および阻害剤を除去
すればよい。
【００１６】阻害剤を共存させることにより、蛋白質の
活性、特異性を低下させることなく標識物質と結合させ
ることができる理由は明らかではないが、次のように考
えられる。すなわち、蛋白質の活性および特異性を担う
重要な部位、例えば、抗体の抗原認識部位、レセプター
の結合部位などにも標識物質と結合する官能基が存在
し、阻害剤の非存在下ではその部分も標識物質との結合
が生じるため、蛋白質の活性および特異性が低下してし
まう。しかし阻害剤が共存すれば、標識物質の一部が阻
害剤にトラップされて、蛋白質の活性および特異性を担
う部位への標識物質の結合が起こりにくくなると考えら
れる。
活性、特異性を低下させることなく標識物質と結合させ
ることができる理由は明らかではないが、次のように考
えられる。すなわち、蛋白質の活性および特異性を担う
重要な部位、例えば、抗体の抗原認識部位、レセプター
の結合部位などにも標識物質と結合する官能基が存在
し、阻害剤の非存在下ではその部分も標識物質との結合
が生じるため、蛋白質の活性および特異性が低下してし
まう。しかし阻害剤が共存すれば、標識物質の一部が阻
害剤にトラップされて、蛋白質の活性および特異性を担
う部位への標識物質の結合が起こりにくくなると考えら
れる。
【００１７】
【発明の効果】本発明によれば、蛋白質の特異性および
活性の低下なしに標識物質を結合させることが可能であ
る。生化学などの基礎分野において、標識蛋白質を研究
に利用したいとする要望や、今日の臨床検査において非
常に有効な手段としての酵素免疫測定法で用いられてい
る標識抗体の劣化を防ぎ、測定感度を広げたい、測定項
目をふやしたいとする多くの要望を簡便に解決するもの
であり、その応用範囲は広く、その利用価値は高い。
活性の低下なしに標識物質を結合させることが可能であ
る。生化学などの基礎分野において、標識蛋白質を研究
に利用したいとする要望や、今日の臨床検査において非
常に有効な手段としての酵素免疫測定法で用いられてい
る標識抗体の劣化を防ぎ、測定感度を広げたい、測定項
目をふやしたいとする多くの要望を簡便に解決するもの
であり、その応用範囲は広く、その利用価値は高い。
【００１８】
【実施例】以下本発明を更に詳細に説明するために実施
例を示すが、本発明はこれら実施例になんら限定される
ものではない。
例を示すが、本発明はこれら実施例になんら限定される
ものではない。
【００１９】実施例１ （１）抗ヒトミオグロビン抗体へのＳＰＤＰの導入 マウス抗ヒトミオグロビン・モノクロ−ナル抗体ＫＭＭ
０７３（ＩｇＭ）２ｍｇを、１ｍｇ／ｍＬになるように
リン酸緩衝化生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ含有０．
０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７．４：以下ＰＢＳ）で調製
し、ＰＢＳにて４時間透析した。透析後、ＳＰＤＰの阻
害剤として硫酸アンモニウムを０ｍＭ，１００ｍＭ，１
５０ｍＭ，２００ｍＭ，または２５０ｍＭ濃度になるよ
うに添加し、さらにエタノ−ルで１０ｍｇ／ｍＬに溶解
したＳＰＤＰを１００μＬ添加し、２時間反応させた。
それぞれの反応生成物をＰＢＳで１２時間透析して硫酸
アンモニウムおよび未反応物を除去し、ピリジルジチオ
プロピオネート（ＰＤＰ）導入抗ヒトミオグロビン抗体
を５ロット得た。 （２）Ｓ−アセチル無水コハク酸を用いたアルカリフォ
スファタ−ゼへのＳＨ基の導入 ウシ小腸アルカリフォスファタ−ゼをＰＢＳで５ｍｇ／
ｍＬに調製した溶液３ｍＬに、１０ｍｇ／ｍＬに調製し
たＳ−アセチル無水コハク酸５０μＬ添加した。３７℃
で２時間反応後、ＰＢＳで透析し、ＳＨ基導入アルカリ
フォスファタ−ゼを得た。 （３）抗体ＫＭＭ０７３へのアルカリフォスファタ−ゼ
標識 （１）で得られた５ロットのＰＤＰ導入抗体ＫＭＭ０７
３と（２）で調製したＳＨ基導入アルカリフォスファタ
−ゼを１：１でよく混和し、結合反応開始剤として５０
ｍＭのＤＴＴを添加した。３日間４℃で反応し、ＴＳＫ
ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ（東ソ−社製）を用いたゲ
ル濾過クロマトグラフィ−にて精製し、５ロットのアル
カリフォスファタ−ゼ標識抗体ＫＭＭ０７３を得た。な
お、クロマトグラフィ−精製において、未反応の抗体と
遊離のフォスファタ−ゼとは検出されなかった。 （４）アルカリフォスファタ−ゼ標識抗体ＫＭＭ０７３
を用いたミオグロビン測定 抗ヒトミオグロビンポリクロ−ナル抗体（ＤＡＫＯ社
製）を１０μｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳで希釈
し、Ｍａｘｉ Ｓｏｒｐプレート（ヌンク社製）に、１
００μＬ／ウエルずつ入れて固相化した。固相化時間
は、３７℃で１．５時間とした。次にＰＢＳｔｗｅｅｎ
で３回洗浄し、０．２％のウシ血清アルブミンを溶解し
たＰＢＳで各３００μＬ／ウエルでブロッキングした。
０７３（ＩｇＭ）２ｍｇを、１ｍｇ／ｍＬになるように
リン酸緩衝化生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ含有０．
０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７．４：以下ＰＢＳ）で調製
し、ＰＢＳにて４時間透析した。透析後、ＳＰＤＰの阻
害剤として硫酸アンモニウムを０ｍＭ，１００ｍＭ，１
５０ｍＭ，２００ｍＭ，または２５０ｍＭ濃度になるよ
うに添加し、さらにエタノ−ルで１０ｍｇ／ｍＬに溶解
したＳＰＤＰを１００μＬ添加し、２時間反応させた。
それぞれの反応生成物をＰＢＳで１２時間透析して硫酸
アンモニウムおよび未反応物を除去し、ピリジルジチオ
プロピオネート（ＰＤＰ）導入抗ヒトミオグロビン抗体
を５ロット得た。 （２）Ｓ−アセチル無水コハク酸を用いたアルカリフォ
スファタ−ゼへのＳＨ基の導入 ウシ小腸アルカリフォスファタ−ゼをＰＢＳで５ｍｇ／
ｍＬに調製した溶液３ｍＬに、１０ｍｇ／ｍＬに調製し
たＳ−アセチル無水コハク酸５０μＬ添加した。３７℃
で２時間反応後、ＰＢＳで透析し、ＳＨ基導入アルカリ
フォスファタ−ゼを得た。 （３）抗体ＫＭＭ０７３へのアルカリフォスファタ−ゼ
標識 （１）で得られた５ロットのＰＤＰ導入抗体ＫＭＭ０７
３と（２）で調製したＳＨ基導入アルカリフォスファタ
−ゼを１：１でよく混和し、結合反応開始剤として５０
ｍＭのＤＴＴを添加した。３日間４℃で反応し、ＴＳＫ
ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ（東ソ−社製）を用いたゲ
ル濾過クロマトグラフィ−にて精製し、５ロットのアル
カリフォスファタ−ゼ標識抗体ＫＭＭ０７３を得た。な
お、クロマトグラフィ−精製において、未反応の抗体と
遊離のフォスファタ−ゼとは検出されなかった。 （４）アルカリフォスファタ−ゼ標識抗体ＫＭＭ０７３
を用いたミオグロビン測定 抗ヒトミオグロビンポリクロ−ナル抗体（ＤＡＫＯ社
製）を１０μｇ／ｍＬの濃度になるようにＰＢＳで希釈
し、Ｍａｘｉ Ｓｏｒｐプレート（ヌンク社製）に、１
００μＬ／ウエルずつ入れて固相化した。固相化時間
は、３７℃で１．５時間とした。次にＰＢＳｔｗｅｅｎ
で３回洗浄し、０．２％のウシ血清アルブミンを溶解し
たＰＢＳで各３００μＬ／ウエルでブロッキングした。
【００２０】３７℃で１．５時間インキュベ−ト後洗浄
し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで、５００，２５０，
１２５，６２．５，３１．３，または０ｎｇ／ｍＬに調
製したヒトミオグロビンを５０μＬ／ウエルずつ加え、
（３）で得た５ロットの標識抗体を２８０ｎｍの吸光度
で０．００４になるようにそれぞれ０．５％ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳで希釈し各ウエルに１００μＬずつ加えた。３７℃
で１．５時間反応後、溶液を除去した。
し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで、５００，２５０，
１２５，６２．５，３１．３，または０ｎｇ／ｍＬに調
製したヒトミオグロビンを５０μＬ／ウエルずつ加え、
（３）で得た５ロットの標識抗体を２８０ｎｍの吸光度
で０．００４になるようにそれぞれ０．５％ＢＳＡ−Ｐ
ＢＳで希釈し各ウエルに１００μＬずつ加えた。３７℃
で１．５時間反応後、溶液を除去した。
【００２１】次にＰＢＳで３回洗浄後、各ウェルに３ｍ
ｇ／ｍＬのパラニトロフェニルフォスフェ−トを溶解し
た１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．５）からなる基質溶液を１００μＬ／ウエル
ずつ分注した。室温で３０分インキュベ−ト後、１Ｎ水
酸化ナトリウム溶液を１００μＬ加え酵素反応を停止さ
せた。上記マイクロタイタ−プレ−トを各ウエルについ
て、波長４０５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光度を自
動マイクロタイタ−プレ−トリ−ダ−（東ソ−株式会社
製、ＭＰＲ−Ａ４，商品名）で測定した。
ｇ／ｍＬのパラニトロフェニルフォスフェ−トを溶解し
た１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．５）からなる基質溶液を１００μＬ／ウエル
ずつ分注した。室温で３０分インキュベ−ト後、１Ｎ水
酸化ナトリウム溶液を１００μＬ加え酵素反応を停止さ
せた。上記マイクロタイタ−プレ−トを各ウエルについ
て、波長４０５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光度を自
動マイクロタイタ−プレ−トリ−ダ−（東ソ−株式会社
製、ＭＰＲ−Ａ４，商品名）で測定した。
【００２２】抗体へＳＰＤＰを導入する際に、阻害剤と
して各種濃度の硫酸アンモニウムを用いて作製した標識
化抗体によるミオグロビンの検出結果を表１に示す。表
から明らかなように、阻害剤として硫酸アンモニウムを
添加して標識化を行うと、無添加の場合と比較して明ら
かに検出感度が良くなり、すなわち、抗体の活性および
特異性が損なわれていないことが示された。 （５）抗ヒトミオグロビン抗体への低濃度ＳＰＤＰの導
入 （１）で使用したマウス抗ヒトミオグロビン・モノクロ
−ナル抗体ＫＭＭ０７３（ＩｇＭ）１ｍｇ／ｍＬに、エ
タノ−ルで１０ｍｇ／ｍＬに溶解したＳＰＤＰを１０μ
Ｌ添加し、阻害剤を添加せずに２時間反応させた。反応
物をＰＢＳで１２時間透析し、ＰＤＰ導入抗ヒトミオグ
ロビン抗体を得た。 （６）（５）で得られた反応物と（２）で調製したアル
カリフォスファタ−ゼを（３）と同じ工程で処理し、低
濃度のＳＰＤＰを用いて作製したアルカリフォスファタ
−ゼ標識抗体ＫＭＭ０７３を得た。このとき明らかに未
反応のＫＭＭ０７３と遊離のアルカリフォスファタ−ゼ
がゲル濾過クロマトグラフィ−から検出された。この標
識抗体を用いて（４）と同様の工程にてミオグロビンを
測定した。その結果を表２に示す。表から明らかなよう
に、阻害剤を添加しないと、使用するＳＰＤＰを１／１
０量にしても検出感度が低下し、すなわち阻害剤の非共
存下では標識剤を少量しか使わなくても抗体の活性およ
び特異性が低下することが明らかである。
して各種濃度の硫酸アンモニウムを用いて作製した標識
化抗体によるミオグロビンの検出結果を表１に示す。表
から明らかなように、阻害剤として硫酸アンモニウムを
添加して標識化を行うと、無添加の場合と比較して明ら
かに検出感度が良くなり、すなわち、抗体の活性および
特異性が損なわれていないことが示された。 （５）抗ヒトミオグロビン抗体への低濃度ＳＰＤＰの導
入 （１）で使用したマウス抗ヒトミオグロビン・モノクロ
−ナル抗体ＫＭＭ０７３（ＩｇＭ）１ｍｇ／ｍＬに、エ
タノ−ルで１０ｍｇ／ｍＬに溶解したＳＰＤＰを１０μ
Ｌ添加し、阻害剤を添加せずに２時間反応させた。反応
物をＰＢＳで１２時間透析し、ＰＤＰ導入抗ヒトミオグ
ロビン抗体を得た。 （６）（５）で得られた反応物と（２）で調製したアル
カリフォスファタ−ゼを（３）と同じ工程で処理し、低
濃度のＳＰＤＰを用いて作製したアルカリフォスファタ
−ゼ標識抗体ＫＭＭ０７３を得た。このとき明らかに未
反応のＫＭＭ０７３と遊離のアルカリフォスファタ−ゼ
がゲル濾過クロマトグラフィ−から検出された。この標
識抗体を用いて（４）と同様の工程にてミオグロビンを
測定した。その結果を表２に示す。表から明らかなよう
に、阻害剤を添加しないと、使用するＳＰＤＰを１／１
０量にしても検出感度が低下し、すなわち阻害剤の非共
存下では標識剤を少量しか使わなくても抗体の活性およ
び特異性が低下することが明らかである。
【００２３】 表１ ミオグロビン 硫酸アンモニウム濃度 ｍＭ 濃度ｎｇ／ｍＬ ０ １００ １５０ ２００ ２５０ ―――――― ―――――――――――――――――――――――――――― ０ ０．０ ０．０ ０．０ ０．０ ０．０ ３１．３ ０．００ ０．１０ ０．０ ０．０ ０．０ ６２．５ ０．０ ０．０６８ ０．０１２ ０．００４ ０．００６ １２５ ０．００１ ０．２６０ ０．０５２ ０．０４６ ０．０５１ ２５０ ０．００３ ０．６７６ ０．２６８ ０．２２４ ０．２３１ ５００ ０．０２３ １．１７４ ０．７３９ ０．６８７ ０．６９４
Claims (2)
- 【請求項１】蛋白質を標識物質にて標識する際、蛋白質
と標識物質との結合阻害剤を共存させて標識することを
特徴とする蛋白質の標識方法。 - 【請求項２】標識物質が酵素、螢光物質、化学標識また
は架橋剤である請求項１に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4281139A JPH06109732A (ja) | 1992-09-28 | 1992-09-28 | 蛋白質の標識方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4281139A JPH06109732A (ja) | 1992-09-28 | 1992-09-28 | 蛋白質の標識方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06109732A true JPH06109732A (ja) | 1994-04-22 |
Family
ID=17634912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4281139A Pending JPH06109732A (ja) | 1992-09-28 | 1992-09-28 | 蛋白質の標識方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06109732A (ja) |
-
1992
- 1992-09-28 JP JP4281139A patent/JPH06109732A/ja active Pending
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