JPH059200A - ヒト尿性トリプシンインヒビターの製造方法 - Google Patents
ヒト尿性トリプシンインヒビターの製造方法Info
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- JPH059200A JPH059200A JP3161828A JP16182891A JPH059200A JP H059200 A JPH059200 A JP H059200A JP 3161828 A JP3161828 A JP 3161828A JP 16182891 A JP16182891 A JP 16182891A JP H059200 A JPH059200 A JP H059200A
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- phosphate buffer
- fraction
- human urinary
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明の目的は、ＨＵＴＩを高度に精製でき
るＨＵＴＩの製造方法を提供することにある。 【構成】 本発明は、ヒト尿性トリプシンインヒビター
含有水溶液を金属キレート樹脂で処理および／または疎
水性担体で処理することを特徴とするヒト尿性トリプシ
ンインヒビターの製造方法である。
るＨＵＴＩの製造方法を提供することにある。 【構成】 本発明は、ヒト尿性トリプシンインヒビター
含有水溶液を金属キレート樹脂で処理および／または疎
水性担体で処理することを特徴とするヒト尿性トリプシ
ンインヒビターの製造方法である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト尿性トリプシンイン
ヒビターの製造方法に関する。
ヒビターの製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】ヒト尿性トリプシンインヒビター（ヒト尿
由来トリプシンインヒビター、以下ＨＵＴＩ）は、Ｐｏ
ｒｋｓｃｈらによりヒト尿より初めてｉｎｔａｃｔな形
で分離・精製された（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅ
ｄ．，７９，４９１，（１９７２））。同分子はシアル
酸及び中性ヘキソースを数十％含む、分子量約６７ｋｄ
（ゲル濾過分析）、等電点２〜３．５の糖タンパク質で
ある（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，７９，４９
１，（１９７２）、日泌尿会誌、７４，１６２７，（１
９８３）、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｓ，１２，３８９，（１９８６）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０９，１２
４７，（１９８２））。
由来トリプシンインヒビター、以下ＨＵＴＩ）は、Ｐｏ
ｒｋｓｃｈらによりヒト尿より初めてｉｎｔａｃｔな形
で分離・精製された（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅ
ｄ．，７９，４９１，（１９７２））。同分子はシアル
酸及び中性ヘキソースを数十％含む、分子量約６７ｋｄ
（ゲル濾過分析）、等電点２〜３．５の糖タンパク質で
ある（Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，７９，４９
１，（１９７２）、日泌尿会誌、７４，１６２７，（１
９８３）、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｓ，１２，３８９，（１９８６）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１０９，１２
４７，（１９８２））。
【０００３】このＨＵＴＩは、膵酵素のトリプシン及び
キモトリプシンを特に強く阻害するが、ＡＴ−III やＦ
ＯＹと異なり凝固・線溶系の酵素を全く或は弱くしか阻
害しない（日薬理会誌、８１，２３５，（１９８
３））。また、ライソゾーム膜の安定化効果を持つこと
から同酵素の産生を抑制したり、心筋抑制因子の産生抑
制作用を有すると言われている（麻酔、３３，１３７，
（１９８４））。
キモトリプシンを特に強く阻害するが、ＡＴ−III やＦ
ＯＹと異なり凝固・線溶系の酵素を全く或は弱くしか阻
害しない（日薬理会誌、８１，２３５，（１９８
３））。また、ライソゾーム膜の安定化効果を持つこと
から同酵素の産生を抑制したり、心筋抑制因子の産生抑
制作用を有すると言われている（麻酔、３３，１３７，
（１９８４））。
【０００４】以上の活性・作用を有することから、急性
膵炎や急性循環不全への有用性が期待され、持田製薬
（株）により初めて製剤化され、１９８５年に商品名ミ
ラクリッドとして発売されるに到った（持田製薬
（株）、ミラクリッド添付文書（１９８５）） 本製剤は、臨床的に急性膵炎及び手術時やエンドトキシ
ンショック時に対処する重篤な副作用の見られない製剤
として使われており、近年の売上は１００億円に達して
いる。
膵炎や急性循環不全への有用性が期待され、持田製薬
（株）により初めて製剤化され、１９８５年に商品名ミ
ラクリッドとして発売されるに到った（持田製薬
（株）、ミラクリッド添付文書（１９８５）） 本製剤は、臨床的に急性膵炎及び手術時やエンドトキシ
ンショック時に対処する重篤な副作用の見られない製剤
として使われており、近年の売上は１００億円に達して
いる。
【０００５】ＨＵＴＩの精製法としては陰イオン交換体
処理、限外濾過、ゲル濾過、アフィニティクロマト、無
機吸着剤処理、塩析、等電点沈殿法、キトサン処理、不
溶性トリプシン処理等が知られている（特開昭５１−５
１５７９、同５１−１１８８１０、同５１−１２３８１
０、同５５−１６０７２４、同５６−９９４２７、同５
７−１４０７２８、同６０−２６０５１８、同６１−３
７７３６等）。
処理、限外濾過、ゲル濾過、アフィニティクロマト、無
機吸着剤処理、塩析、等電点沈殿法、キトサン処理、不
溶性トリプシン処理等が知られている（特開昭５１−５
１５７９、同５１−１１８８１０、同５１−１２３８１
０、同５５−１６０７２４、同５６−９９４２７、同５
７−１４０７２８、同６０−２６０５１８、同６１−３
７７３６等）。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＨＵ
ＴＩを高度に精製できるＨＵＴＩの製造方法を提供する
ことにある。
ＴＩを高度に精製できるＨＵＴＩの製造方法を提供する
ことにある。
【０００７】
【問題を解決するための手段】本発明者らは上記の事情
に鑑み、各種検討を行った結果、ＨＵＴＩ含有水溶液を
金属キレート樹脂または疎水性担体で処理することによ
りＨＵＴＩを効率よく精製できることを見出した。さら
に、これらの方法を従来から公知の方法と組合わせるこ
とにより、高度に精製されたＨＵＴＩを製造できること
を見出して本発明を完成した。
に鑑み、各種検討を行った結果、ＨＵＴＩ含有水溶液を
金属キレート樹脂または疎水性担体で処理することによ
りＨＵＴＩを効率よく精製できることを見出した。さら
に、これらの方法を従来から公知の方法と組合わせるこ
とにより、高度に精製されたＨＵＴＩを製造できること
を見出して本発明を完成した。
【０００８】即ち、本発明は、ヒト尿性トリプシンイン
ヒビター含有水溶液を金属キレート樹脂で処理および／
または疎水性担体で処理することを特徴とするヒト尿性
トリプシンインヒビターの製造方法である。
ヒビター含有水溶液を金属キレート樹脂で処理および／
または疎水性担体で処理することを特徴とするヒト尿性
トリプシンインヒビターの製造方法である。
【０００９】本発明のＨＵＴＩ含有水溶液は、尿由来、
細胞培養液由来、遺伝子組換え由来のいずれであっても
よい。また、原液そのもの、部分精製、高度精製のいず
れの段階にあってもよい。
細胞培養液由来、遺伝子組換え由来のいずれであっても
よい。また、原液そのもの、部分精製、高度精製のいず
れの段階にあってもよい。
【００１０】ＨＵＴＩ含有水溶液を金属キレート樹脂で
処理し、その非吸着画分を回収することにより、精製し
たＨＵＴＩを得ることができる。金属キレート樹脂はキ
レート化合物を不溶性担体に化学結合させたものに、金
属イオンをキレート結合させたものである。金属イオン
としては銅イオン（Ｃｕ2+）、亜鉛イオン（Ｚｎ2+）等
が例示される。キレート化合物としてはＥＤＴＡ等が例
示される。不溶性担体としてはアガロース型（商品名セ
ファロース等）、デキストラン型（商品名セファデック
ス等）、セルロース型（商品名セルロファイン等）が例
示される。また、このようなキレート樹脂として、キレ
ート・セファロース６Ｂ、同ＦＦ（ファルマシア社）、
キレート・セルロファイン（生化学工業）等が市販され
ている。
処理し、その非吸着画分を回収することにより、精製し
たＨＵＴＩを得ることができる。金属キレート樹脂はキ
レート化合物を不溶性担体に化学結合させたものに、金
属イオンをキレート結合させたものである。金属イオン
としては銅イオン（Ｃｕ2+）、亜鉛イオン（Ｚｎ2+）等
が例示される。キレート化合物としてはＥＤＴＡ等が例
示される。不溶性担体としてはアガロース型（商品名セ
ファロース等）、デキストラン型（商品名セファデック
ス等）、セルロース型（商品名セルロファイン等）が例
示される。また、このようなキレート樹脂として、キレ
ート・セファロース６Ｂ、同ＦＦ（ファルマシア社）、
キレート・セルロファイン（生化学工業）等が市販され
ている。
【００１１】金属キレート樹脂の製法として具体的には
以下の方法が用いられる。亜鉛をキレート化する場合は
塩化亜鉛ＺｎＣｌ2 を１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度でキレ
ート樹脂と接触させ、ｐＨ３〜４で処理する。銅をキレ
ート化する場合は硫酸銅、例えば、ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2
Ｏを１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度でキレート樹脂を接触さ
せ、ｐＨ５〜７で処理する。
以下の方法が用いられる。亜鉛をキレート化する場合は
塩化亜鉛ＺｎＣｌ2 を１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度でキレ
ート樹脂と接触させ、ｐＨ３〜４で処理する。銅をキレ
ート化する場合は硫酸銅、例えば、ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2
Ｏを１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度でキレート樹脂を接触さ
せ、ｐＨ５〜７で処理する。
【００１２】ＨＵＴＩ含有水溶液と金属キレート樹脂の
接触条件はｐＨ７〜９．０程度、塩濃度０．１〜１Ｍ程
度が例示される。具体的には０．１〜１Ｍ塩化ナトリウ
ム加０．０１〜０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７〜９．
０）等を用いる。
接触条件はｐＨ７〜９．０程度、塩濃度０．１〜１Ｍ程
度が例示される。具体的には０．１〜１Ｍ塩化ナトリウ
ム加０．０１〜０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７〜９．
０）等を用いる。
【００１３】また、ＨＵＴＩ含有水溶液を疎水性担体で
処理し、その非吸着画分を回収することにより、精製し
たＨＵＴＩを得ることができる。疎水性担体は不溶性担
体に疎水性基を結合させたものである。疎水性基として
はアルキル基（好ましくは炭素数１〜１０のもの：例え
ば、ブチル基、オクチル基等）、フェニル基、フェニル
アラニル基等が例示される。不溶性担体としてはアガロ
ース型（商品名セファロース等）、デキストラン型（商
品名セファデックス等）、セルロース型（商品名セルロ
ファイン等）が例示される。また、このような疎水性担
体としてオクチル・セファロースＣＬ−６Ｂ、ブチル・
セファロース４Ｂ、フェニルセファロースＣＬ−６Ｂ
（全てファルマシア）等が市販されている。。
処理し、その非吸着画分を回収することにより、精製し
たＨＵＴＩを得ることができる。疎水性担体は不溶性担
体に疎水性基を結合させたものである。疎水性基として
はアルキル基（好ましくは炭素数１〜１０のもの：例え
ば、ブチル基、オクチル基等）、フェニル基、フェニル
アラニル基等が例示される。不溶性担体としてはアガロ
ース型（商品名セファロース等）、デキストラン型（商
品名セファデックス等）、セルロース型（商品名セルロ
ファイン等）が例示される。また、このような疎水性担
体としてオクチル・セファロースＣＬ−６Ｂ、ブチル・
セファロース４Ｂ、フェニルセファロースＣＬ−６Ｂ
（全てファルマシア）等が市販されている。。
【００１４】ＨＵＴＩ含有水溶液を疎水性担体で処理す
る際の接触条件としてはｐＨ５〜７程度、塩濃度０．５
〜３Ｍ程度が例示される。具体的には、０．７〜１Ｍ硫
酸アンモニウム、０．７〜１Ｍ硫酸アンモニウム加１〜
１０ｍＭリン酸緩衝液等が例示される。
る際の接触条件としてはｐＨ５〜７程度、塩濃度０．５
〜３Ｍ程度が例示される。具体的には、０．７〜１Ｍ硫
酸アンモニウム、０．７〜１Ｍ硫酸アンモニウム加１〜
１０ｍＭリン酸緩衝液等が例示される。
【００１５】本発明の方法はお互いを組合せることによ
って、または、従来から公知の方法と組合せることによ
って、ＨＵＴＩをさらに高度に精製することができる。
具体的には以下のような方法が挙げられる。 （１）陰イオン交換体処理 ＨＵＴＩ含有水溶液を陰イオン交換体で処理し、吸着画
分を回収する。
って、または、従来から公知の方法と組合せることによ
って、ＨＵＴＩをさらに高度に精製することができる。
具体的には以下のような方法が挙げられる。 （１）陰イオン交換体処理 ＨＵＴＩ含有水溶液を陰イオン交換体で処理し、吸着画
分を回収する。
【００１６】陰イオン交換体は陰イオン交換基を不溶性
担体に結合したものである。陰イオン交換基としてはＤ
ＥＡＥ系、ＱＡＥ系等が例示される。不溶性担体として
はアガロース型（商品名セファロース等）、デキストラ
ン型（商品名セファデックス等）、セルロース型（商品
名セルロファイン等）が例示される。
担体に結合したものである。陰イオン交換基としてはＤ
ＥＡＥ系、ＱＡＥ系等が例示される。不溶性担体として
はアガロース型（商品名セファロース等）、デキストラ
ン型（商品名セファデックス等）、セルロース型（商品
名セルロファイン等）が例示される。
【００１７】吸着条件としてはｐＨ３〜１０程度、塩濃
度０．０１〜０．２Ｍ程度が例示される。具体的には
０．０１〜０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５〜７．５）等
を用いる。
度０．０１〜０．２Ｍ程度が例示される。具体的には
０．０１〜０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５〜７．５）等
を用いる。
【００１８】溶出条件としてはｐＨ５〜７．５程度、塩
濃度０．４、０．１〜１．２Ｍ程度が例示される。具体
的には０．１〜１Ｍ塩化ナトリウム加０．０１〜０．２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５〜７．５）等を用いる。 （２）金属キレート樹脂処理 （１）の吸着画分を金属キレート樹脂で処理し、非吸着
画分を回収する。 （３）疎水性担体処理 （２）の非吸着画分を疎水性担体で処理し、非吸着画分
を回収する。 （４）限外濾過 （３）の非吸着画分を限外濾過膜に通し、低分子量画分
または高分子量画分をカットする。
濃度０．４、０．１〜１．２Ｍ程度が例示される。具体
的には０．１〜１Ｍ塩化ナトリウム加０．０１〜０．２
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ５〜７．５）等を用いる。 （２）金属キレート樹脂処理 （１）の吸着画分を金属キレート樹脂で処理し、非吸着
画分を回収する。 （３）疎水性担体処理 （２）の非吸着画分を疎水性担体で処理し、非吸着画分
を回収する。 （４）限外濾過 （３）の非吸着画分を限外濾過膜に通し、低分子量画分
または高分子量画分をカットする。
【００１９】低分子量側のカット値としては分子量１万
程度、高分子量側のカット値としては分子量１００万程
度が例示される。 （５）ゲル濾過 （４）の濃縮画分をゲル濾過処理し、その溶出画分中か
らＨＵＴＩ含有画分を回収する。
程度、高分子量側のカット値としては分子量１００万程
度が例示される。 （５）ゲル濾過 （４）の濃縮画分をゲル濾過処理し、その溶出画分中か
らＨＵＴＩ含有画分を回収する。
【００２０】ゲル濾過用担体としてはアガロース型（商
品名セファロース）、デキストラン型（商品名セファデ
ックス）、ポリアクリルアミド型（商品名セファクリ
ル）が例示される。
品名セファロース）、デキストラン型（商品名セファデ
ックス）、ポリアクリルアミド型（商品名セファクリ
ル）が例示される。
【００２１】処理条件としてはｐＨ５〜７程度、塩濃度
０．１〜１Ｍ程度が例示される。具体的には０．１〜１
Ｍ塩化ナトリウム加０．０１〜０．２Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ５〜７）が用いられる。
０．１〜１Ｍ程度が例示される。具体的には０．１〜１
Ｍ塩化ナトリウム加０．０１〜０．２Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ５〜７）が用いられる。
【００２２】本発明は公知の他の精製方法と組合せるこ
とができる。また、加熱処理等を施してもよい。この
際、安定化剤としてＥＤＴＡ１〜１００ｍＭ、ゼラチン
等が例示される。
とができる。また、加熱処理等を施してもよい。この
際、安定化剤としてＥＤＴＡ１〜１００ｍＭ、ゼラチン
等が例示される。
【００２３】本発明の製法により得られるＨＵＴＩは分
子量６〜７万程度（好ましくは６万７千）、等電点は２
〜３．５程度、比活性は２０００〜３０００単位／ｍｇ
蛋白程度、純度はほぼ１００％である。また、不純物は
ほとんど認められず、金属イオン、ＥＤＴＡ等も検出限
界以外である。着色物質も充分に除去される。
子量６〜７万程度（好ましくは６万７千）、等電点は２
〜３．５程度、比活性は２０００〜３０００単位／ｍｇ
蛋白程度、純度はほぼ１００％である。また、不純物は
ほとんど認められず、金属イオン、ＥＤＴＡ等も検出限
界以外である。着色物質も充分に除去される。
【００２４】
【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例お
よび実験例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限
定されるものではない。 実施例１ 人尿を特開昭６２−９３２３８の方法に準じて調製した
ものを本発明の出発原料とした。
よび実験例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限
定されるものではない。 実施例１ 人尿を特開昭６２−９３２３８の方法に準じて調製した
ものを本発明の出発原料とした。
【００２５】出発原料４２０ｍｌをｐＨ６．４に調整
後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）で平衡化した
ＱＡＥ−アガロースゲル（商品名Ｑ−セファロース フ
ァストフロー、 ファルマシア社、１００ｃｍ2 ×６．
５ｃｍ）にアプライした。その後、０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム加０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）で溶出しＨ
ＵＴＩ含有画分を回収した。
後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）で平衡化した
ＱＡＥ−アガロースゲル（商品名Ｑ−セファロース フ
ァストフロー、 ファルマシア社、１００ｃｍ2 ×６．
５ｃｍ）にアプライした。その後、０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム加０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）で溶出しＨ
ＵＴＩ含有画分を回収した。
【００２６】溶出画分４００ｍｌをｐＨ７．９に調整
後、０．５Ｍ塩化ナトリウム加０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．９）で平衡化したＣｕ2+キレートアガロース
ゲル（商品名キレートセファロース ファスト フロ
ー、 ファルマシア社、参考例参照）にアプライし、非
吸着画分を回収した。
後、０．５Ｍ塩化ナトリウム加０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．９）で平衡化したＣｕ2+キレートアガロース
ゲル（商品名キレートセファロース ファスト フロ
ー、 ファルマシア社、参考例参照）にアプライし、非
吸着画分を回収した。
【００２７】非吸着画分８４０ｍｌに２Ｍ硫酸アンモニ
ウムを添加して濃度０．８Ｍに調整後、０．８Ｍ硫酸ア
ンモニウム加６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）で平衡化し
たフェニル−アガロースゲル（商品名フェニル セファ
ロース４Ｂ、ファルマシア社、３．３×７．３ｃｍ）に
アプライし、非吸着画分を回収した。
ウムを添加して濃度０．８Ｍに調整後、０．８Ｍ硫酸ア
ンモニウム加６ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）で平衡化し
たフェニル−アガロースゲル（商品名フェニル セファ
ロース４Ｂ、ファルマシア社、３．３×７．３ｃｍ）に
アプライし、非吸着画分を回収した。
【００２８】非吸着画分１５２０ｍｌにＥＤＴＡを１ｍ
Ｍとなるように添加後に限外濾過膜（商品名ＵＦメンブ
ラン、フィルトロン社、分子量１万以下の画分をカット
で処理し、濃縮画分を回収した。
Ｍとなるように添加後に限外濾過膜（商品名ＵＦメンブ
ラン、フィルトロン社、分子量１万以下の画分をカット
で処理し、濃縮画分を回収した。
【００２９】濃縮画分３６ｍｌを０．３Ｍ塩化ナトリウ
ム加０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）で平衡化した
ポリアクリルアミドゲル（商品名セファクリルＳ−２０
０ＨＰ、ファルマシア社、７．６×１２０ｃｍ）にアプ
ライし、同緩衝液で溶出しＨＵＴＩ画分を回収した。
ム加０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）で平衡化した
ポリアクリルアミドゲル（商品名セファクリルＳ−２０
０ＨＰ、ファルマシア社、７．６×１２０ｃｍ）にアプ
ライし、同緩衝液で溶出しＨＵＴＩ画分を回収した。
【００３０】得られたＨＵＴＩは以下のような性質を有
していた 分子量６万７千 比活性４９２２単位／ＯＤ280 Ｃｕ2+イオンおよびカリクレインは認められなかった。
また着色物質は充分に除去されていた。下記ゲル濾過分
析および逆相クロマト分析を行った結果、両者とも単一
ピークを示した。
していた 分子量６万７千 比活性４９２２単位／ＯＤ280 Ｃｕ2+イオンおよびカリクレインは認められなかった。
また着色物質は充分に除去されていた。下記ゲル濾過分
析および逆相クロマト分析を行った結果、両者とも単一
ピークを示した。
【００３１】ゲル濾過分析 カラム：Ｇ３０００ＳＷXL（トーソー社）、 溶出溶媒：０．３Ｍ塩化ナトリウム加０．１Ｍ酢酸緩衝
液（pH６．８） 逆相クロマト分析 カラム：２１４ＴＰ５４（ＶＹＤＡＣ社、０．４６×２
５ｃｍ） 溶出溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ Ｂ：０．１％ＴＦＡ＋２５％メタノール＋７４．９％イ
ソプロパノール 勾配度 Ａ対Ｂを９０：１０から４０：６０まで 各精製工程での蛋白質と活性の回収の度合を表１に示し
た。また、上記実験を繰り返して、吸光度を測定し、着
色物質の挙動を調べ、その結果を表２に示した。
液（pH６．８） 逆相クロマト分析 カラム：２１４ＴＰ５４（ＶＹＤＡＣ社、０．４６×２
５ｃｍ） 溶出溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ Ｂ：０．１％ＴＦＡ＋２５％メタノール＋７４．９％イ
ソプロパノール 勾配度 Ａ対Ｂを９０：１０から４０：６０まで 各精製工程での蛋白質と活性の回収の度合を表１に示し
た。また、上記実験を繰り返して、吸光度を測定し、着
色物質の挙動を調べ、その結果を表２に示した。
【００３２】
【表１】
【００３３】
【表２】
【００３４】実施例２ 人尿を特開昭６２−９３２３８の方法に準じて調製した
ものを本発明の出発原料とした。
ものを本発明の出発原料とした。
【００３５】出発原料４２０ｍｌをｐＨ６．４に調整
後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）で平衡化した
ＱＡＥ−アガロースゲル（商品名Ｑ−セファロース フ
ァストフロー、ファルマシア社）にアプライした。その
後、０．５Ｍ塩化ナトリウム加０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６．４）で溶出しＨＵＴＩ含有画分を回収した。
後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）で平衡化した
ＱＡＥ−アガロースゲル（商品名Ｑ−セファロース フ
ァストフロー、ファルマシア社）にアプライした。その
後、０．５Ｍ塩化ナトリウム加０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ６．４）で溶出しＨＵＴＩ含有画分を回収した。
【００３６】溶出画分８００ｍｌをｐＨ８に調整後、
０．５Ｍ塩化ナトリウム加０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８）で平衡化したＣｕ2+キレートアガロースゲル（商品
名キレートセファロース ファスト フロー、 ファル
マシア社、参考例参照）にアプライし、非吸着画分を回
収した。
０．５Ｍ塩化ナトリウム加０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
８）で平衡化したＣｕ2+キレートアガロースゲル（商品
名キレートセファロース ファスト フロー、 ファル
マシア社、参考例参照）にアプライし、非吸着画分を回
収した。
【００３７】非吸着画分２６０ｍｌに酢酸緩衝液（ｐＨ
５）を加えて、最終５０ｍＭに調整し、６０℃、１０時
間加熱処理した。さらに２Ｍ硫酸アンモニウムを添加し
て濃度０．８Ｍに調整後、０．８Ｍ硫酸アンモニウムで
平衡化したフェニル−アガロースゲル（商品名フェニル
セファロース４Ｂ、ファルマシア社）にアプライし、
非吸着画分を回収した。
５）を加えて、最終５０ｍＭに調整し、６０℃、１０時
間加熱処理した。さらに２Ｍ硫酸アンモニウムを添加し
て濃度０．８Ｍに調整後、０．８Ｍ硫酸アンモニウムで
平衡化したフェニル−アガロースゲル（商品名フェニル
セファロース４Ｂ、ファルマシア社）にアプライし、
非吸着画分を回収した。
【００３８】非吸着画分６１０ｍｌにＥＤＴＡを１ｍＭ
となるように添加後に限外濾過膜（商品名ＵＦメンブラ
ン、フィルトロン社、分子量１万以下の画分をカット）
で処理し、濃縮画分を回収した。
となるように添加後に限外濾過膜（商品名ＵＦメンブラ
ン、フィルトロン社、分子量１万以下の画分をカット）
で処理し、濃縮画分を回収した。
【００３９】濃縮画分２８ｍｌを０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウム加５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．２）で平衡化した
ポリアクリルアミドゲル（商品名セファクリルＳ−２０
０ＨＰ、ファルマシア社、７．６×１２０ｃｍ）にアプ
ライし、同緩衝液で溶出しＨＵＴＩ画分を回収した。
ウム加５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．２）で平衡化した
ポリアクリルアミドゲル（商品名セファクリルＳ−２０
０ＨＰ、ファルマシア社、７．６×１２０ｃｍ）にアプ
ライし、同緩衝液で溶出しＨＵＴＩ画分を回収した。
【００４０】得られたＨＵＴＩは実施例１と同様の性質
を有していた。各精製工程での蛋白質と活性の回収の度
合いを表３に示した。
を有していた。各精製工程での蛋白質と活性の回収の度
合いを表３に示した。
【００４１】
【表３】
【００４２】また、リムラス試験によるエンドトキシン
量の測定結果を表４にゲル濾過による分子量分布の測定
結果を表５に示した。
量の測定結果を表４にゲル濾過による分子量分布の測定
結果を表５に示した。
【００４３】
【表４】
【００４４】
【表５】
【００４５】参考例 キレート樹脂（商品名キレート セファロース ファス
ト フロー、ファルマシア社に５ｍｇ／ｍｌの硫酸銅Ｃ
ｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏを添加し、室温で３０分間インキュ
ベーションした。蒸留水で洗浄した後に０．５Ｍ塩化ナ
トリウム加０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．９）で平衡
化する。
ト フロー、ファルマシア社に５ｍｇ／ｍｌの硫酸銅Ｃ
ｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏを添加し、室温で３０分間インキュ
ベーションした。蒸留水で洗浄した後に０．５Ｍ塩化ナ
トリウム加０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．９）で平衡
化する。
【００４６】
【発明の効果】本発明により高度に精製されたＨＵＴＩ
を調整することができる。従って、本発明は医療用医薬
品として極めて有用なＨＵＴＩを提供することができ
る。
を調整することができる。従って、本発明は医療用医薬
品として極めて有用なＨＵＴＩを提供することができ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 武智 和男 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 西槙 秀男 大阪府枚方市招提大谷２丁目1180番地の１ 株式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 成田 修策 京都府福知山市長田野町２丁目11番地 株 式会社ミドリ十字オサダノ工場内 (72)発明者 石川 昭一 京都府福知山市長田野町２丁目11番地 株 式会社ミドリ十字オサダノ工場内
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 【請求項１】 ヒト尿性トリプシンインヒビター含有水
溶液を金属キレート樹脂で処理および／または疎水性担
体で処理することを特徴とするヒト尿性トリプシンイン
ヒビターの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3161828A JP2722140B2 (ja) | 1991-07-02 | 1991-07-02 | ヒト尿性トリプシンインヒビターの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3161828A JP2722140B2 (ja) | 1991-07-02 | 1991-07-02 | ヒト尿性トリプシンインヒビターの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH059200A true JPH059200A (ja) | 1993-01-19 |
| JP2722140B2 JP2722140B2 (ja) | 1998-03-04 |
Family
ID=15742691
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3161828A Expired - Fee Related JP2722140B2 (ja) | 1991-07-02 | 1991-07-02 | ヒト尿性トリプシンインヒビターの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2722140B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR970020116A (ko) * | 1995-09-19 | 1997-05-28 | 노보루 아까사까 | 인간 뇨 트립신 억제제 제제 및 그의 제조방법 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03176499A (ja) * | 1989-12-04 | 1991-07-31 | Denki Kagaku Kogyo Kk | 人尿トリプシンインヒビターの精製方法 |
| JPH04193894A (ja) * | 1990-11-27 | 1992-07-13 | Denki Kagaku Kogyo Kk | 入尿トリプシンインヒビターの精製方法 |
-
1991
- 1991-07-02 JP JP3161828A patent/JP2722140B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03176499A (ja) * | 1989-12-04 | 1991-07-31 | Denki Kagaku Kogyo Kk | 人尿トリプシンインヒビターの精製方法 |
| JPH04193894A (ja) * | 1990-11-27 | 1992-07-13 | Denki Kagaku Kogyo Kk | 入尿トリプシンインヒビターの精製方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR970020116A (ko) * | 1995-09-19 | 1997-05-28 | 노보루 아까사까 | 인간 뇨 트립신 억제제 제제 및 그의 제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2722140B2 (ja) | 1998-03-04 |
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|---|---|---|---|
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