JPH0552185B2 - - Google Patents
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- JPH0552185B2 JPH0552185B2 JP62236411A JP23641187A JPH0552185B2 JP H0552185 B2 JPH0552185 B2 JP H0552185B2 JP 62236411 A JP62236411 A JP 62236411A JP 23641187 A JP23641187 A JP 23641187A JP H0552185 B2 JPH0552185 B2 JP H0552185B2
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Classifications
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は氷核活性（ice nucleating activity）
を有する微生物の製造方法に関する。 従来の技術 米国特許第4200228号には雪を製造する方法が
開示されており、この方法によれば微生物が空気
中に噴霧される小滴中に含まれている。使用され
ている微生物は氷核生成を促進することが知られ
ている種類のものである。その結果、通常の温度
より可成り高い温度で雪を製造することができ
る。このプロセスに有用な代表的な微生物はシユ
ードモナス（Pseudomonas）、更に詳しくはシユ
ードモナス シリンゲ（Pseudomonas
syringae）である。 このプロセスをいかなる規模でも使用しようと
すると、多量の微生物を必要することは明白であ
る。更に、微生物は、その貯蔵、取扱及び運搬輸
送を容易にするために、乾燥形態で得るのが好ま
しい。 氷核活性を有する微生物の生長条件は既に知ら
れている。例えばMaki及びWilloughbyの
Bacteria as Biogenic Sources of Freezing
Nuclei，J.Applied Mateorogy17，1049〜1053
頁には、シユードモナス シリンゲのような微生
物を20℃より低い温度、即ち５℃でKoserクエン
酸液体培地（citrate broth）で生長させること
が記載されている。この培地は良く知られたもの
であり、そのPHは約6.7である。この文献にはPH
コントロールについては何も記載されていない。
更に、この文献には、培養物を20℃より高い温度
で生長させた場合には極めて少量の凍結核が生成
されるに過ぎないと述べられている。 回収プロセスについては、前記文献はホルマリ
ン処理した濃縮培養地を凍結乾燥することが開示
されているのみで、詳細な記載はない。 別の文献、即ちKoxloff，Schofield及びLute
のIce Nucleating Activity of Pseudomonas
syringae and Erwiuia Herhicola，J.Bacter.
153，222〜231頁（1983）には微生物をPHが約7.0
のトリプロン−酵母エキス−グリセルール培地で
成長させている。この文献では微生物は乾燥状態
では回収されておらず、懸濁液の状態で直接活性
のテストをしている。この氷核活性は懸濁液中で
安定でなく、一夜で活性が低下することが認めら
れている。 発明が解決すべき問題点 前記微生物の大量生産に前記した公知の方法を
用いた場合には所望の氷核活性のものは得られな
い。最初の懸濁液の氷核活性が所望の活性より低
くなるばかりでなく、活性の大半が大量の微生物
を凍結乾燥する間に失なわれてしまう。この結果
は、前記方法が商業的な量の微生物を妥当なコス
トで製造することのできないプロセスであること
を示している。本発明はかかる問題を解決せんと
するものである。 問題点を解決するための手段 本発明によれば、氷核活性を有する微生物を醗
酵培地で醗酵させる工程と当該微生物を回収する
工程とを含む氷核活性を有する微生物の改良製造
方法が提供され、この方法は培地のPHが約6.7に
近づいた時に培地に酸を添加し、そして培地のPH
が約5.5に近づいた時に培地に塩基を添加するこ
とによつて特徴づけられている。 発明の実施態様 従来の一般的な醗酵プロセスにおいては、醗酵
培地のPHは放置状態で変動させているか、出来る
だけ固定したPH値に保持しているかのいずれかで
ある。前記の引用文献においては、PH制御につい
ては何も触れられていないからPHは自然に変動さ
せていると思われる。これらの醗酵は中性付近、
即ち7.0に近いPHで開始するのが一般である。こ
れらの一般的な醗酵方法では、PHは広範囲に変動
する。即ち、典型的には醗酵される生物によつて
酸が生成するので最初にPHが低下し、次に醗酵の
継続に従つてPHが上昇する。典型的にはPHは、PH
制御をしない場合には、5.0程度の低いPHから8.0
程度の高いPHまで変動する。 氷核形成微生物の場合には、醗酵培地のPHを変
動はさせるが約6.7と5.5との間、好ましくは6.6と
5.6との間で変動させた場合には微生物の氷核活
性（INA）が実質的に改善される。PHを前記範
囲の中間点、即ちPH6.1又は別の点、例えば6.8に
保持した場合には、INAは低くなる。同様に、
醗酵PHを前記範囲を超えて広い範囲で変化させた
場合にもINAは低下する。かかる現象の理由は
不詳である。 本発明に従つてPHを制御する方法は当業者の常
識の範囲内である。PHが6.7に近づいたらPHが実
質的に6.7を超えるのを防止するに十分な速度で
酸を加えることができる。例えば典型的な例とし
ては、1500リツトルの醗酵器の場合には、PHが
6.7に到達した時点で１分間培地１リツトル当り
約１mlの速度で酸を添加し始めれば十分である。
塩基も同様にして添加することができる。このPH
コントロールは当業界でよく知られているより手
動又は自動で行なうことができる。例えば水酸化
ナトリウム及び硫酸を好適に使用することができ
る。 本発明に従えば、INAの改良は任意の醗酵温
度で認められるが、本発明者らは温度もINAの
最適収率を得るために重要であることを見出し
た。本発明者らは、最適温度が19℃と23℃との間
であり、特に好ましくは21℃である。このこと
は、前記したように、Maki及びWilloughbyは５
℃を使用し、そして20℃又はそれより高い温度で
生長させた培地は極く僅かの凍結核を生産するに
過ぎないと述べていることを考慮すれば驚くべき
ことである。 本発明は任意の醗酵を用いて前記改良を与える
が、本発明者らは更に改良をもたらす特定の培地
を見出した。この好ましい培地は、炭素源として
グリセロール又はマンニトールもしくはソルビト
ールのような糖アルコールを含む。窒素源として
は酵母エキスのような複合源が好ましい。本発明
の好ましい培地は、炭素源としてのマンニトー
ル、酵母エキス及び硫酸マグネシウムを含むもの
である。本発明者らは、また、最適な結果を得る
ためには、これらの成分の初期濃度が予想される
濃度よりも高いことを見出した。現在好ましいと
思れる培地は下記第表に掲げるものである。 【表】 本発明によれば、氷核活性を有する任意の微生
物を製造することができる。適当な微生物として
は、P.シリンゲ（syringae）及びP.フルオールセ
ンズ（fluorscens），P.コロナフアシエンズ
（coronafaciens）及びP.ピシ（pisi）などのシユ
ードモナス（Pseudomonas）属の微生物を例示
することができる。本発明において使用するのに
有用な他の微生物としては、例えばエルウイナ
（Erwina），ヘルビコーラ（herbicola）をあげる
ことができる。現時点では特に好ましい微生物は
P.シリンゲ（syringae）ATCCNo.53543〔ブタペス
ト条約に従つて米国メリーランド州のロツクビル
のATCC（American Type Culture Collection）
に1986年９月23日に寄託〕である。 前記醗酵プロセスで製造される微生物は種々の
方法で乾燥させることができる。典型的な例は、
スプレー乾燥及び凍結乾燥である。いずれの乾燥
方法もINAを或る程度低下させる。好ましい方
法では、培地を冷却し、濃縮し、そして超低温液
体中に流してペレツトを形成し、そしてこれらの
ペレツトを次に比較的低温で凍結乾燥した。 以下の例においてはINAは慣用技術を用いて
計算した。INAは複数個の微生物を含む水滴
（10μ）をパラフイン被覆アルミ箔上に置き、
これを−５℃の恒温浴中に入れることによつて求
めた。この方法の詳細は、例えば文献Vali，
Quantitative Evaluation of Experimental
Results on the Heterogenous Freeziug of
Supercooled Liquids，J.Atoms Sci.，28，402
〜409頁（1971年）に記載されている。本発明の
目的に対して、乾燥することなく醗酵器から直接
サンプリングしたサンプルを用いて測定した。従
つて、これを「醗酵器INA」と称する。その単
位は、乾燥微生物１ｇ当りの核の数である。 実施例 例 １ マンニトール、酵母エキス及び硫酸マグネシウ
ムを含む栄養培地を含んだアガープレート上に、
シユードモナス シリンゲATCCNo.5343を線状又
はしま状にうえた。温度26℃で36時間経過後、プ
レートの半分を同様に培地を含む500mlフラスコ
中に接種するのに用いた。 温度26℃で14時間経過後、前記液状接種物を８
リツトルの醗酵培地を600nmで測定して約0.75〜
1.0の光学濃度単位の光学濃度に接種するのに用
いた。この培地の組成は、0.1ｇ／の植物ベー
スの発泡抑制剤ストラクトール（Struktol）
（Struktol Corp米国より市販）を更に含む以外
は、前記した第表に記載したのと同じである。 醗酵温度は21℃にコントロールした。醗酵の
間、系のPHを4N硫酸及び2N水酸化ナトリウムで
コントロールした。即ち、PHが6.6に近づいたら
硫酸を添加し、PHが5.6に近づいたら水酸化ナト
リウムを添加した。溶解酸素は30％飽和より上に
維持し、前記発泡抑制剤は発泡をコントロールす
るのに必要な場合に添加した。 36時間経過後、細胞塊は１リツトル当り18ｇ
（乾燥細胞）に到達し、醗酵器INAは5.0×1011で
あつた。 例 ２ 本例は比較例である。 醗酵の間PHをコントロールしなかつた以外は例
１を繰り返した。得られた醗酵器PHは1.66×1011
であつた。 例 ３ 本例は醗酵培地の成分の濃度を例１の半分にし
た以外は例１を繰り返した。この醗酵の醗酵器PH
は2.30×1011であつた。 例 ４ 本例は比較例である。 この例ではPHが7.0及び6.7に近づいた時点で例
１のようにしてPHを制御した以外は例１を繰り返
した。醗酵器PHは1.40×1011であつた。 以上の各例の結果を第表に示す。 【表】
を有する微生物の製造方法に関する。 従来の技術 米国特許第4200228号には雪を製造する方法が
開示されており、この方法によれば微生物が空気
中に噴霧される小滴中に含まれている。使用され
ている微生物は氷核生成を促進することが知られ
ている種類のものである。その結果、通常の温度
より可成り高い温度で雪を製造することができ
る。このプロセスに有用な代表的な微生物はシユ
ードモナス（Pseudomonas）、更に詳しくはシユ
ードモナス シリンゲ（Pseudomonas
syringae）である。 このプロセスをいかなる規模でも使用しようと
すると、多量の微生物を必要することは明白であ
る。更に、微生物は、その貯蔵、取扱及び運搬輸
送を容易にするために、乾燥形態で得るのが好ま
しい。 氷核活性を有する微生物の生長条件は既に知ら
れている。例えばMaki及びWilloughbyの
Bacteria as Biogenic Sources of Freezing
Nuclei，J.Applied Mateorogy17，1049〜1053
頁には、シユードモナス シリンゲのような微生
物を20℃より低い温度、即ち５℃でKoserクエン
酸液体培地（citrate broth）で生長させること
が記載されている。この培地は良く知られたもの
であり、そのPHは約6.7である。この文献にはPH
コントロールについては何も記載されていない。
更に、この文献には、培養物を20℃より高い温度
で生長させた場合には極めて少量の凍結核が生成
されるに過ぎないと述べられている。 回収プロセスについては、前記文献はホルマリ
ン処理した濃縮培養地を凍結乾燥することが開示
されているのみで、詳細な記載はない。 別の文献、即ちKoxloff，Schofield及びLute
のIce Nucleating Activity of Pseudomonas
syringae and Erwiuia Herhicola，J.Bacter.
153，222〜231頁（1983）には微生物をPHが約7.0
のトリプロン−酵母エキス−グリセルール培地で
成長させている。この文献では微生物は乾燥状態
では回収されておらず、懸濁液の状態で直接活性
のテストをしている。この氷核活性は懸濁液中で
安定でなく、一夜で活性が低下することが認めら
れている。 発明が解決すべき問題点 前記微生物の大量生産に前記した公知の方法を
用いた場合には所望の氷核活性のものは得られな
い。最初の懸濁液の氷核活性が所望の活性より低
くなるばかりでなく、活性の大半が大量の微生物
を凍結乾燥する間に失なわれてしまう。この結果
は、前記方法が商業的な量の微生物を妥当なコス
トで製造することのできないプロセスであること
を示している。本発明はかかる問題を解決せんと
するものである。 問題点を解決するための手段 本発明によれば、氷核活性を有する微生物を醗
酵培地で醗酵させる工程と当該微生物を回収する
工程とを含む氷核活性を有する微生物の改良製造
方法が提供され、この方法は培地のPHが約6.7に
近づいた時に培地に酸を添加し、そして培地のPH
が約5.5に近づいた時に培地に塩基を添加するこ
とによつて特徴づけられている。 発明の実施態様 従来の一般的な醗酵プロセスにおいては、醗酵
培地のPHは放置状態で変動させているか、出来る
だけ固定したPH値に保持しているかのいずれかで
ある。前記の引用文献においては、PH制御につい
ては何も触れられていないからPHは自然に変動さ
せていると思われる。これらの醗酵は中性付近、
即ち7.0に近いPHで開始するのが一般である。こ
れらの一般的な醗酵方法では、PHは広範囲に変動
する。即ち、典型的には醗酵される生物によつて
酸が生成するので最初にPHが低下し、次に醗酵の
継続に従つてPHが上昇する。典型的にはPHは、PH
制御をしない場合には、5.0程度の低いPHから8.0
程度の高いPHまで変動する。 氷核形成微生物の場合には、醗酵培地のPHを変
動はさせるが約6.7と5.5との間、好ましくは6.6と
5.6との間で変動させた場合には微生物の氷核活
性（INA）が実質的に改善される。PHを前記範
囲の中間点、即ちPH6.1又は別の点、例えば6.8に
保持した場合には、INAは低くなる。同様に、
醗酵PHを前記範囲を超えて広い範囲で変化させた
場合にもINAは低下する。かかる現象の理由は
不詳である。 本発明に従つてPHを制御する方法は当業者の常
識の範囲内である。PHが6.7に近づいたらPHが実
質的に6.7を超えるのを防止するに十分な速度で
酸を加えることができる。例えば典型的な例とし
ては、1500リツトルの醗酵器の場合には、PHが
6.7に到達した時点で１分間培地１リツトル当り
約１mlの速度で酸を添加し始めれば十分である。
塩基も同様にして添加することができる。このPH
コントロールは当業界でよく知られているより手
動又は自動で行なうことができる。例えば水酸化
ナトリウム及び硫酸を好適に使用することができ
る。 本発明に従えば、INAの改良は任意の醗酵温
度で認められるが、本発明者らは温度もINAの
最適収率を得るために重要であることを見出し
た。本発明者らは、最適温度が19℃と23℃との間
であり、特に好ましくは21℃である。このこと
は、前記したように、Maki及びWilloughbyは５
℃を使用し、そして20℃又はそれより高い温度で
生長させた培地は極く僅かの凍結核を生産するに
過ぎないと述べていることを考慮すれば驚くべき
ことである。 本発明は任意の醗酵を用いて前記改良を与える
が、本発明者らは更に改良をもたらす特定の培地
を見出した。この好ましい培地は、炭素源として
グリセロール又はマンニトールもしくはソルビト
ールのような糖アルコールを含む。窒素源として
は酵母エキスのような複合源が好ましい。本発明
の好ましい培地は、炭素源としてのマンニトー
ル、酵母エキス及び硫酸マグネシウムを含むもの
である。本発明者らは、また、最適な結果を得る
ためには、これらの成分の初期濃度が予想される
濃度よりも高いことを見出した。現在好ましいと
思れる培地は下記第表に掲げるものである。 【表】 本発明によれば、氷核活性を有する任意の微生
物を製造することができる。適当な微生物として
は、P.シリンゲ（syringae）及びP.フルオールセ
ンズ（fluorscens），P.コロナフアシエンズ
（coronafaciens）及びP.ピシ（pisi）などのシユ
ードモナス（Pseudomonas）属の微生物を例示
することができる。本発明において使用するのに
有用な他の微生物としては、例えばエルウイナ
（Erwina），ヘルビコーラ（herbicola）をあげる
ことができる。現時点では特に好ましい微生物は
P.シリンゲ（syringae）ATCCNo.53543〔ブタペス
ト条約に従つて米国メリーランド州のロツクビル
のATCC（American Type Culture Collection）
に1986年９月23日に寄託〕である。 前記醗酵プロセスで製造される微生物は種々の
方法で乾燥させることができる。典型的な例は、
スプレー乾燥及び凍結乾燥である。いずれの乾燥
方法もINAを或る程度低下させる。好ましい方
法では、培地を冷却し、濃縮し、そして超低温液
体中に流してペレツトを形成し、そしてこれらの
ペレツトを次に比較的低温で凍結乾燥した。 以下の例においてはINAは慣用技術を用いて
計算した。INAは複数個の微生物を含む水滴
（10μ）をパラフイン被覆アルミ箔上に置き、
これを−５℃の恒温浴中に入れることによつて求
めた。この方法の詳細は、例えば文献Vali，
Quantitative Evaluation of Experimental
Results on the Heterogenous Freeziug of
Supercooled Liquids，J.Atoms Sci.，28，402
〜409頁（1971年）に記載されている。本発明の
目的に対して、乾燥することなく醗酵器から直接
サンプリングしたサンプルを用いて測定した。従
つて、これを「醗酵器INA」と称する。その単
位は、乾燥微生物１ｇ当りの核の数である。 実施例 例 １ マンニトール、酵母エキス及び硫酸マグネシウ
ムを含む栄養培地を含んだアガープレート上に、
シユードモナス シリンゲATCCNo.5343を線状又
はしま状にうえた。温度26℃で36時間経過後、プ
レートの半分を同様に培地を含む500mlフラスコ
中に接種するのに用いた。 温度26℃で14時間経過後、前記液状接種物を８
リツトルの醗酵培地を600nmで測定して約0.75〜
1.0の光学濃度単位の光学濃度に接種するのに用
いた。この培地の組成は、0.1ｇ／の植物ベー
スの発泡抑制剤ストラクトール（Struktol）
（Struktol Corp米国より市販）を更に含む以外
は、前記した第表に記載したのと同じである。 醗酵温度は21℃にコントロールした。醗酵の
間、系のPHを4N硫酸及び2N水酸化ナトリウムで
コントロールした。即ち、PHが6.6に近づいたら
硫酸を添加し、PHが5.6に近づいたら水酸化ナト
リウムを添加した。溶解酸素は30％飽和より上に
維持し、前記発泡抑制剤は発泡をコントロールす
るのに必要な場合に添加した。 36時間経過後、細胞塊は１リツトル当り18ｇ
（乾燥細胞）に到達し、醗酵器INAは5.0×1011で
あつた。 例 ２ 本例は比較例である。 醗酵の間PHをコントロールしなかつた以外は例
１を繰り返した。得られた醗酵器PHは1.66×1011
であつた。 例 ３ 本例は醗酵培地の成分の濃度を例１の半分にし
た以外は例１を繰り返した。この醗酵の醗酵器PH
は2.30×1011であつた。 例 ４ 本例は比較例である。 この例ではPHが7.0及び6.7に近づいた時点で例
１のようにしてPHを制御した以外は例１を繰り返
した。醗酵器PHは1.40×1011であつた。 以上の各例の結果を第表に示す。 【表】
Claims (1)
- １ 氷核活性を有する微生物を醗酵培地において
醗酵させる工程と、当該微生物を回収する工程と
を含む、氷核活性を有する微生物の製造方法にお
いて、系のPHが約6.7に近づいた時に前記培地に
酸を添加し、そして系のPHが約5.5に近づいた時
に前記培地に塩基を添加することを特徴とする氷
核活性を有する微生物の製造方法。
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| US910600 | 1986-09-23 |
Publications (2)
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