JPH05507402A - 酸化安定性洗剤用酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 酸化安定性洗剤用酵素 技術分野 本発明は、酸化安定性洗剤用酵素の分野に関する。更に詳しくは、本発明は新規 な化学的に変化させた洗剤用酵素に関し、ここにおいて一種又はそれ以上のメチ オニンがシスティンに改変されており、該システィンは酸化剤に対して酵素の改 良された安定性を付与するため、引き続き化学的に修正されている０本発明は又 、酸化に対して洗剤用酵素を安定化させる新規方法にも間する。更に、本発明は これらの酸化安定性洗剤用酵素を含んでなる洗剤組成物に関する。

背景技術 一般に低酸化安定性に関する問題は、洗剤用酵素の安定性に対する周知の主な障 害である。漂白剤の活性成分の存在のため、洗剤用酵素は、活性の損失を伴い、 酸化雰囲気中でそれらの酵素活性を発現させねばならない。

この問題に対し、種々の解決法が提案されているが、今日まで酸化安定性洗剤用 酵素は入手できていない。

今日、用いられている洗剤用酵素は、天然からの酵素を単離し次いで洗剤配合物 においてそれらを試験することにより見出されている。幾つかの洗剤用酵素が、 化学的および酵素的性質を改変した新規洗剤用酵素を得るため、それらの分子内 のアミノ酸を欠失又は置換することにより人工的に改変されてきている。ランダ ムおよび部位特異的変異誘発としての知識が、酵素の物理的および化学的性質の 知識から適用されてきており、従って、これらの技術は大部分、プロテアーゼに 適用されている。特に、ズブチリン遺伝子の部位特異的変異誘発は、多くの注意 を引きつけており、多くの変異が特許公報（例えば、ＥＰ１３０．７５６．　Ｅ Ｐ２１４，４３５；　ＥＰ３０３．７６１；　ＥＰ２６０，１０５；１０８７１ ０４４．６１　；　ＷＯ３７１０５０５０参照）に記載されている。

ズブチリシンは、グラム陽性細菌又は真蘭により産生されたセリンプロテアーゼ である。多様のズブチリンが同定されており、幾つかの場合、アミノ酸配列が決 定されている（　Ｗ　Ｏ８９１０６２７９およびデンマーク特許出Ｉｔ！１３１ ６９／８９）　、　２２２位において、これらの野生のズブチリシンはメチオニ ン残基を存しており、このメチオニン残基が酸化剤に対する酵素の不安定さの原 因として同定されている。

Ｄ、Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｃｖ、２４４．５３３３〜５３３Ｂ（１９６９））　。

２２２位の残基を１９個の必須アミノ酸残基以外のもので置換することが行われ ており、得られた突然変異体は相対的活性に関して研究されている（Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、２６０，６５１８〜６５２１（１９８５））　、　Ｃｙ　ｓ−変 異体のみが、野生型の強さの相対的活性を示すが（５６％）しかし、野生型に以 ているこのＣｙｓ−特異体は酸化剤に対し不安定であり、そしてＩＭＨ２０２中 １２分の中卒２期」が見出された（野生型ズブチリシンは、システィン残基を有 しない）。最も酸化安定性の高い変異体の内、Ａｌａ−変異体は最高の酵素活性 を示しており（１１％）、そして該変異体はｘＭＨｔｏ、中、１５分後にその活 性を失っていなかった。

科学的使用に対し、以下の内容が実証された。すなわち、部位特異的変異誘発は 変った性質を有する酵素誘導体を達成するため化学的修飾と組合せることができ る。従って、カルボキシ−ペプチダーゼ−ｙの結合部位中に導入されたシスティ ン残基の化学修飾は、ペプチドアミドの脱アミド化およびペプチド合成において それぞれより有効である酵素誘導体を与えることが判明した（Ｂｅｃｈ＝Ｌ、Ｍ 、アンドＢｒｅｄｄａｍ、に、　；　Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ　Ｒｅｓ、Ｃｏａ＋ｓ ｕｎ、、５３，３８９−３９３（１９８８）　）。

従って、本発明の目的は改良された酸化安定性を示しかつ同時にそれらの洗濯特 性に関しそれらの蛋白質分解活性を実質的に保持する、化学的に変化された新規 な洗剤用酵素を提供することにある。

更に、本発明の目的は、酸化に対し洗剤用酵素を安定化させる新規方法を確立す ることにある。

発明の詳細な説明 洗剤用酵素の変異体を化学的に改変することにより、酸化剤に対して付与された 安定性を有する、化学的に改変された新規な活性は洗剤用酵素の調製が、今や驚 （べきことに成功した。

従って、第一の面によれば、本発明は、新規な酸化安定性の化学的に改変された 洗剤用酵素を提供するものであり、この酵素において、１個又はそれ以上のメチ オニンがシスティンに変異されており、更にシスティンはＨＳ基の水素を一般式 Ｒ’Ｓ−（ここで、Ｒ’　はＣ１−６アルキルである）の基に置き代えるため引 き続き化学的に改変されている。

第二の面によれば、本発明は酸化に対し洗剤用酵素を安定化させる新規方法を提 供するものであり、これにより洗剤用酵素の変異体（ここにおいて、１種又はそ れ以上の変異体はシスティンに変異化されている）は、一般式Ｒ’　ＳＳＯ□Ｒ ”　（ここで、Ｒ’　はＣＩ−ｂアルキルであり、ＲｚはＣｌ−４アルキルであ る）の化合物との反応によりシスティンのＨＳ−基の水素を一般式Ｒ’Ｓ−（こ こで％Ｒ’はＣ１−６アルキルである）の基に、置き代えることにより化学的に 改変され、そして該反応はｐｉ（５〜１１のｐＨ値で行なわれる。

第三の面によれば、本発明は洗剤用添加剤、好ましくは無粉塵性粒質物又は安定 化液体の形態で与えられる、１種又はそれ以上の酸化安定性洗剤用酵素を含んで なる。

図面の簡単な説明 本発明は、次の図面を参照しながら、より詳しく説明されるであろう： 図１は、本発明の化学的に改変される反応を一般的に、図式的に示したものであ り、 図２ａ−ｄは、洗剤用酵素のペプチド骨格に結合した種々の基の構造の比較を示 す。

図２ａは、メチオニン側鎖を有する「野生型」酵素を示す。

図２ｂは、酵素変異体を示し、ここにおいてメチオニンはシスティンに改変され ている（Ｍ−Ｃ）。

図２ｃは、本発明の化学的に改変された酵素変異体を示す。

図２ｄは、酸化された「野生型」酵素を示す。

図３〜５は、野生型酵素（Ｓ、３０９）、メチオニン置換酵素（Ｒ２２Ｃ）、お よび本発明に従って化学的に改変された酵素（ｍ−Ｒ２２２Ｃ）に対する、三種 の異なる洗剤組成物中の洗濯特性と酵素濃度の関係を示す。

発明の詳細 な説明に従った化学的改変方法により、洗剤用酵素（ここにおいて、１種又はそ れ以上のメチオニンはシスティンに改変されている）は、システィンのＲ３−基 の水素を一般式Ｒ’　Ｓの基に置き代えるため（図１参照）、一般式Ｒ’　５Ｓ Ｏｚ　Ｒ”　（ここで、Ｒ１およびＲ２は以下に定義された意味である）で表わ される試剤を用いて処理される。この方法により、システィンは元々存在するメ チオニンに立体的に以ているが、酸化剤に対しはるかにより安定である（図２参 照）アミノ酸に変換され、次いで本発明の酸化安定性洗剤用酵素が得られる。

叉肛里鼠塞 洗剤産業において、酵素は２０年以上、洗剤配合物中に付与されてきている。洗 剤用酵素は、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼおよびプロテアーゼ並びに他の 酵素又はそれらの混合物を含んでなる。

商業的に最も重要な洗剤用酵素は、ズブチリシンを含むプロテア一本発明の酸化 に対する洗剤用酵素を安定化する方法により、洗剤用酵素の変異体（ここにおい て、１種又はそれ以上のメチオニンがシスティンに変異されている）は、一般式 ＲＩ　５ＳＯｚ　Ｒ１（ここにおいて、Ｒ１はＣ１−、アルキルであり、更にＲ ２はＣ１−４アルキルである）で表わされる化合物との反応によって、システィ ンのＲ５−基を一般式Ｒ’５Ｓ−（ここでＲ’　はＣＩ−６アルキルである）に 置き代えることにより化学的に改変される。

盗光止金立 本発明の酸化に対する洗剤用酵素を安定化させる方法において、出発化合物は洗 剤用酵素の変異体であり、ここにおいて１種又はそれ以上のメチオニンがシステ ィンに変異されている。

出発化合物は、例えば部位特異的変異誘発により得ることができる。クローン化 の手順およびインビトロ変異誘発は、国際公開公報ＷＯ３９１０６２７９におい て記載される如く本質的に行うことができる。

好ましい出発化合物は、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又はプロテアーゼで ある。より好ましい出発化合物はズブチリシンである。

種々のズブチリンブロテアーゼのアミノ酸配列の概要は、デンマーり特許出１！ １３１６９／８９に示されている。これらのズブチリンのいずれもシスティン残 基を有しておらず、一方それらは１種以上のメチオニン残基を有している。従っ て、２２２位において、かつ活性セリンに隣接してズブチリシンプロテアーゼは 、メチオニン残基を保持しそしてすでに言及したように、この残基は酸化剤に対 し酵素の不安定さに対する原因として同定されている。比較のため、種々のズブ チリンブロテアーゼに対する選択された部分アミノ酸配列を表１に示す。明らか にするため、活性セリンの近くの領域内の残基のみを掲げる。

表１ 種々のズブチリンブロテアーゼに対するアミノ酸配列の比較Ｎｏ：　２１０　２ ２０ ａ）Ｐ−Ｇ−Ｖ−３−１−Ｑ−３−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｎ−＊−に−傘−Ｙ−Ｇ− Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−τ−３−Ｍ−Ａ−３−Ｐ−Ｈ−ｂ）Ｐ−Ｇ−Ｖ−５−１−Ｑ− ３−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｇ一本−Ｔ一本−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−３−Ｍ− Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｈ−ｃ）Ｐ−Ｇ−Ｖ−５−１−Ｑ−Ｓ−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−Ｊｌ −Ｔ−傘−Ｙ−Ｇ−Ａ−Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−５−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｐ−）！−ｄ）　Ｐ −Ｇ−Ｖ−５−Ｉ−Ｑ　−５−Ｔ−Ｌ−Ｐ−Ｇ−Ｇ−＊−Ｔ−＊−Ｙ−Ｇ−Ａ　 −Ｙ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−Ｓ−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｈ−ｅ）Ｐ−Ｇ−Ｖ−５−シーＹ−５ −Ｔ−Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｎ一本−Ｔ−率−Ｙ−Ｔ−３−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−３−Ｍ−＾ −５−Ｐ−Ｈ−ｆ）Ｐ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｖ−Ｙ−３−Ｔ−Ｙ−Ｐ−Ｔ−Ｎ−＊−Ｔ −率−Ｙ−Ａ−Ｔ−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−３−Ｍ−Ａ−３−Ｐ−Ｈ−ｇ）Ｐ−Ｇ−Ａ −Ｇ−Ｖ−Ｙ−３−Ｔ−Ｙ−Ｐ−Ｔ−３−阜−Ｔ一本−Ｙ−Ａ−Ｔ−Ｌ−Ｎ−Ｇ −Ｔ−３−Ｍ−Ａ−５−Ｐ−Ｈ−ｈ）Ｐ−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｖ−Ｑ−５−Ｔ−Ｙ−Ｐ −Ｇ−５一本−Ｔ−＊−Ｙ−Ａ−３−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−Ｓ−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｈ −４）　Ｐ−Ｇ−Ｖ　−Ｎ　−Ｖ−Ｎ−５−Ｔ−Ｙ−Ｔ−Ｇ−Ｎ−＊−Ｒ−傘− Ｙ−Ｖ−Ｓ−Ｌ−Ｓ−Ｇ−Ｔ−３−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｈ−ｊ）Ｐ−Ｇ−５−Ｗ− Ｉ−Ｙ−５−Ｔ−Ｙ−Ｐ−Ｔ−５−＊−Ｔ一本−Ｙ−Ａ−５−Ｌ−３−Ｇ−Ｔ− Ｓ−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｈ−ｋ）Ｐ−Ｇ−Ｔ−Ｓ−Ｉ−Ｌ−３−Ｔ−Ｗ−Ｉ−Ｇ− Ｇ一本−８一本−Ｔ−１１−５４−５−Ｇ−Ｔ−３−トＡ−Ｔ−Ｐ−Ｈ−１）　 Ｐ−Ｇ−Ａ−３−Ｉ　−Ｐ−３−Ａ−Ｗ−Ｙ　−Ｔ　−５−Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｑ −Ｔ−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−Ｓ−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｈ−＊）Ｐ−Ｇ−Ｖ−Ｎ−Ｖ−Ｑ −５−Ｔ−Ｙ−Ｐ−Ｇ−５一本−Ｔ−率−Ｙ−Ａ−３−Ｌ−Ｎ−Ｇ−Ｔ−３−Ｍ −Ａ−Ｔ−Ｐ−トｎ）　Ｐ−Ｇ−Ｔ−Ｄ−１−に−５−Ｔ−Ｗ−Ｎ−Ｄ−Ｇ−Ｒ −Ｔ−に−１−１−Ｓ−傘−傘−Ｇ−Ｔ−５−Ｍ−Ａ−５−Ｐ−Ｈ−ｏ）Ｐ−Ｇ −Ｔ−Ｄ−ｒ−Ｌ−５−Ｔ−Ｗ−１−Ｇ−Ｇ−５−Ｔ−Ｒ−５−Ｉ−５４１−Ｇ −Ｔ−５−Ｍ−Ａ−Ｔ−Ｐ−Ｈ−表１、続き・・ ａ＝ズブチリシンＢＰＮ’　（ウェルズ等、１９８３、同上）ｂ−ズブチリシン アミロサラカリチフス（クリハラ等、１９７２、同上） Ｃ−ズブチリシン１６８（スタールおよびフエラリー、１９８４、同上） ｄ＝ズブチリシンメセンテリコベブチダーゼ（スペントセン等、１９８６、同上 ） ｅ＝ズブチリシンＤＹ（ネドコフ等、１９８５、同上）ｆ＝ズブチリシンカルス ベルク（スミス等、１９６８、同上）ｇ＝ズブチリシンカルスベルク（ヤコブス 等、１９８５、同上）ｈ＝ズブチリシン３０９（国際特許出ＩＩＩ　ＰＣＴ／Ｄ Ｋ８８１００００２）ｉ＝ズブチリシン１４７（国際特許出ＩＩＩ　ＰＣＴ／Ｄ Ｋ８８１００００２）ｊ＝テルミターゼ（メロラン等、１９８５、同上）ｋ＝プ ロテナーゼＫ（ベトゼル等、１９８８、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｕｃｈｅｓ＋、１７８ ：１５５〜）およびガンケル等、１９８９、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｕｃｈｅ＋ｗ、１ ７９：１Ｂ５〜） Ｉ＝アクアリシン（クオン等、１９８８、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｕｃｈｅａ、　１７ ３：４９１〜） ｍ＝バシラスＦＢ９２プロテアーゼ（ヨーロッパ特許出１ａｉ０２８３０７５） ｎ＝プロテアーゼＴＷ７　（）リチラチウムアルブム）（国際特許出願ＰＣＴ／ ＵＳ８８１０１０４０） ０＝プロテアーゼＴＷ３（）リチラチウムアルブム）（国際特許出ＨＰＣＴ／Ｕ Ｓ８８１０１０４０） ＊−割り当てられた欠失 ズブチリシン変異体（ここにおいて、Ｒ２２２はシスティンで置換されている） の内、好ましいものは、ズブチリン−３０９−Ｉ２２２　ｅ、ズブチリシン−１ ４７−Ｉ２２２ｅ、ズブチリシン−ＢＰＮ’−Ｉ２２２Ｃ，ズブチリシンカルス ベルクーＭ２２２　ｅおよびプロテアーゼに−Ｍ２２２Ｃである。最も好ましい ものは、ズブチリシン−３０９−Ｉ２２２Ｃである。

■１五改変 一般式Ｒ’　ＳＳＯ□Ｒｚの改変用化学的試剤は、商業的に入手可能であるが、 又は伝統的な有機化学的方法（ｒＭａｔｅｒｉａｌｓ　ａｎｄ　ｍｅｔｈａｄｓ 　Ｊ参照）により調製できる。

立体的理由のため、置換基Ｒ’およびＲ２は制限された大きさを有するべきであ る。従って、好ましいＲ１置換基はＣ１−、アルキルであり、最も好ましい置換 基はメチル、エチル又はプロピル／イソプロピルである。好ましいＲ１−置換基 はＣ１−ｎアルキルであり、最も好ましい置換基はメチル又はエチルである。

一般式ＲＩ　ＳＳＯ，Ｒ”の好ましい試剤は、メタンーメチルーチオスルホネー ）　（ＭＭＴＳ）、エタン−メチル−チオスルホネート（ＥＭＴＳ）　、および ブロバンーメチルーチオスルホネー）　（ＰＭＴＳ）　（ｒＭａｔｅｒｉａｌｓ 　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）である。

ｐｏは、５〜１１の範囲内にあるべきであり、最も好ましくは８〜１０の範囲内 である。

１益 本発明の新規な酸化安定性の化学的に改変された洗剤用酵素は、酵素中の１個又 はそれ以上のメチオニンがシスティンに変異されており、次いでＨＳ−基の水素 を一般式Ｒ’Ｓ−（ここで、Ｒ１はＣｌ−６アルキルである）の基に置き代える ため、システィンは化学的に改変されているような洗剤用酵素である。本発明の 好ましい酸化安定性洗剤用酵素は、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又はプロ テアーゼであり、ここにおいて１種以上のメチオニンはＩ３−基の水素を一般式 ＲＩＳ−（ここでＲ’はＣＩ４アルキルである）の基に置換するため、システィ ンに改質されている。

本発明のより好ましい酸化安定性の洗剤用酵素は、ズブチリシンである。

最も好ましい、酸化安定性洗剤用酵素は、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又 はプロテアーゼであり、ここにおいて１種以上のメチオニンはＩ３−基の水素を 一般式Ｒ’Ｓ−（ここでＲ１はＣｌ−３アルキルである）の基に置換するため、 システィンに変異されている。

本発明の他の態様において、好ましい酸化安定性洗剤用酵素は、化学的に改変さ れたズブチリシンであり、ここにおいて活性セリンに隣接した２２２位のメチオ ニンは、システィンに改変されており、次いで、システィンのＩ３−基の水素を 一般式Ｒ’Ｓ−（ここで、Ｒ′はＣＩ−６アルキルである）の基に置き代えるた め、化学的改変に委ねられる。

酸化安定性の化学的に改変されたズプチリンが、より好ましく、ここでズブチリ シンはズブチリシン−３０９、ズブチリシン−１４７、ズブチリシンＢＰＮ’、 ズブチリシンカルスベル７又はプロテアーゼにである。

酸化安定性の化学的に改変されたズブチリシン（これはズブチリシン−３０９で ある）が、最も好ましい。

本出願に関連して、本発明の化学的に改変された洗剤用酵素の化学記号法が用い られる。この化学記号法によれば、ズブチリシン−３０９の変異体（ズブチリシ ン−３０９−Ｉ２２２Ｃ）（これは、その後Ｒ’　ＳＳＯ□Ｒｚとの反応により 化学的に改変される）は、ズブチリシン−３０９−Ｉ２２２Ｃ−３Ｒ’　と命名 される。もしも試剤がＭＭＴＳである場合、表記はズブチリシン−３０９−Ｉ２ ２２Ｃ−３Ｅであろう。もしも試剤がＰＭＴＳである場合、表記はズブチリシン −３０９−Ｉ２２２Ｃ−３Ｐ等であろう。

本発明によれば、いかなる洗剤用酵素も改良された酸化安定性を得るため化学的 に改変できる。本発明に係る、好ましい酸化安定性の化学的に改変された洗剤用 酵素は、ズブチリシン−３０９−Ｉ２２２Ｃ−ＳＭおよびズブチリシン−３０９ −Ｉ２２２　Ｃ−３Ｐである。

実施例からの比較結果を次の表２に示す。

表から明らかなように、Ｋ７は全ての酵素に対しほぼ定数であり、一方ｋ　ｃａ ｔは相当に変化する。「野生型」酵素は、最高の特異活性を有するが、明らかに 、ズブチリシン−３０９−Ｍ２２２Ｃ−５Ｍ酵素は、相当に高い酵素活性と共に 酸化雰囲気に対し最高の安定性を有している。

非改変ズブチリシン−３０９−Ｍ２２２Ｃ変異体は、劣った酵素活性と同様に劣 った安定性を有している。

迭五凪底宜 本発明の洗剤組成物は、一種以上の界面活性剤を含んでいてもよく、この界面活 性剤はアニオン性、非イオン性、カチオン性、両性もしくは双性タイプ又はこれ らの混合物であってよい、アニオン性界面活性剤の典型的例は、直鎖アルキルベ ンゼンスルホネート（ＬＡＳ）；アルキルスルホネート（ＡＳ）ｉα−オレフィ ンスルホネート（ＡＯ３）；アルコールエトキシスルフェート（ＡＥＳ）および 天然脂肪酸のアルカリ金属塩である。非イオン界面活性剤の例は、アルキルポリ エチレングリコールエーテル；ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテ ル；スクロースおよびグルコースの脂肪酸エステル；およびポリエトキシル化ア ルキルグルコシドのエステルである。

本発明の洗剤組成物は又、当業者に公知の他の洗剤用成分、例えばビルダー、漂 白剤、漂白活性化剤、耐蝕剤、香料、酵素および漂白剤用の安定化剤、製剤化助 剤、蛍光増白側、フオームブースター、キレート化剤、フィラー、布帛柔軟剤等 を含有し得る。本発明の洗剤用組成物は、Ｊ、ファルベ（Ｆａｌｂｅ、Ｊ、；５ ｕｒｆａｃｔａｎｔ　ｉｎ　Ｃｏｎｓｕｍｅｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｔｈｅｏｒ ｙ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｍ；スペリンゲルフェ ルラーク１９８７、特に’Ｆｒａｍｅ　ｆｏｒｍｕｌａｔｊｗ＋ｓ　ｆｏｒ　１ ｉｆｕｉｄ／ｐｏｗｄｅｒｈｅａｕｙ−ｄｕｔｙ　ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ」の章 を参照）に記載と実質的に同一の方法で製剤化できる。

現在、今の内容が意図されている。すなわち、本発明の洗剤組成物は、洗浄液１ １！当たり蛋白分解酵素０．０００５〜０．　５ＣＰＩＩに相当する量の酵素調 製品を含有し得る。

本発明の洗剤組成物は、好都合の形態、例えば粉末、液体等に製剤化できる。

本発明の洗剤組成物は、好都合には１種又はそれ以上の他の酵素、例えばリパー ゼ；アミラーゼ；セルラーゼ；および／又はペルオキシダーゼを、好都合には洗 剤組成物中に含んで含有し得る。

本発明のプロテアーゼは、洗剤用プロテアーゼを含有する添加剤を別個に添加す ることにより、又は異なる洗剤用酵素を含んでなる組合わせた添加剤を添加する ことにより洗剤用組成物中に含ましめることができる。

本発明の添加剤は、例えば粒質物、液体、スラリー等として製剤化できる。好ま しい洗剤用組成物の製剤は無粉塵性粒質物又は安定化液体である。無粉塵性粒質 物は、例えば英国特許１，３６２，３６５又は米国特許４，１０６，９９１に従 い製造でき、更に所望により当業者に公知方法でコートできる。液体酵素調製品 は、確立された方法に従い例えば、ポリオール、例えばポリエチレングリコール ；糖もしくは糖アルコール；乳酸もしくはホウ酸を添加することにより安定化で きる。他の酵素安定化剤は、当業者に周知である。保護された酵素は、ヨーロッ パ特許２３８，２１６に開示された方法に従って調製できる。

有用な態様において、本発明のプロテアーゼは、例えば、ヨーロッパ特許（ＥＰ ）３４２，１７７；　ＥＰ３６８，５７５；　ＥＰ３７８，２６１；およびＥＰ ３７Ｂ、２６２に従った洗剤配合物中に含ましめることができる。

洗濯特性における研究から、本発明に従った化学的に改変されたズブチリシン変 異体は、「野生型」ズブチリシンおよび非改質Ｍ２２２Ｃ−変異体の洗濯適性と 少なくとも同程度の強さの洗濯適性を有する。

洗濯特性を例３〜５において試験し、結果を図３〜５に示す。

本発明に係る新規化学的改変方法により、新規ズブチリシン変異体を得ることが 可能となる。本発明に係る新規な化学的に改変されたズブチリシン変異体は、酸 化剤に対する秀れた安定性および比較的に高い酵素活定性を有する。更に、それ らの洗濯特性はそれらの親酵素に対する比較において保持されている。

凰料並走丈１抹 一般式Ｒ’　ＳＳＯ□Ｒ２で表わされる改変用化学試剤は、商業的に入手可能で あるか、又はシェークト等（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、■、４１５６−、［６ ６（１９８０）によって記載される如く、塩化メタンスルホニルおよび硫化ナト リウムとの反応によって得られる、通常の前駆体である、ナトリウムメタンチオ スルホネートから伝統的な有機化学的方法により調製できる。次いで、ＭＭＴＳ 、ＥＭＴＳおよびＰＭＴＳ等をナトリウムメタンチオスルホネートと、ブロモメ タン、ブロモエタンおよびブロモプロパンと、それぞれ反応させることにより合 成する。

改変用の化学反応の程度は、変度されるズブチリシン変異体に適用される、例え ばニレマンの反応により監視できる。この反応は、実施例で記載される如く行な われる。

蛋白質分解活性は、２５゛Ｃで分光光度計で監視でき、次いでペプチド基質 ５ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ　（Ｓｕｅ−スクシニル、お よびｐＮＡ＝ｐ−ニトロ−アニリド）又はＤＭＣ（ジメチル−カゼイン）の分解 およびその後動力学的パラメーターｋ　ｃａｔおよびに８の計算が行なわれる。

蛋白質分解活性は、又ノボノルディスク社（デンマーク国）から要求により入手 可能な出版物ＡＰＩＯＩ／４−ｇｂ　（又はその後の出版物）（これは、参考の ため発明細書で加入されている）に記載・されたジメチルーセゼイン（ＤＭＣ） 法によっても決定できる。

ｔｌ／□は酵素の半減期であり、そして蛋白質分解活性の減少により約２５℃で ０．１ＭのＨ２Ｃ，中（ｐＨ６，５）で測定される。

次の実施例により、更に本発明を説明する。本発明の幾つかの特定の態様を示す 実施例は、本明細書および実施例と共に添付の請求の範囲により規定されるべき 本発明の範囲を制限するものとして解釈してはならない。

実施例エ ズブチリシン−３０９−Ｍ２２２Ｃ−−の　・ズブチリシン−３０９−Ｍ２２２ Ｃ変異体を、国際特許出１ｉＷＯ８９１０６２７９（これは、本明細書中、参考 のため導入されている）で示される如く生産し、次いで１０ｍＭのＭＥＳ　（２ −（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）、２００ａ＋Ｈのホウ酸、２ｍＭのＣ ａＣＬ、および０．１Ｍ未満のＮａＣｌから成る緩衝液（ｐＨ６，５）中で保持 した。５ｓＭのＭＥＳおよび２１１ＭのＣａＣ１，で平衡化されたＰ４ゲル濾過 カラム（バイオラボ社製）を用い、ｐＨ６，５で脱塩した。

エタノールに溶解した６、２ｄのＭ２２２　Ｃ，Ａｂ　５ｉｎｏ　＝９゜７．０ ．５５ｄのＩＭのＣＨＥＳ　（２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ］−エタンスル ホン酸）、ｐＨ９，５（シグマ社製）および０．２５ｍの９４３１のメタン−メ チル−チオスルホネート（ＭＭＴ　Ｓ　）（アルドリッチ−ケミ−社製）を添加 することにより、改変を行った。この混合物を室温で６０分間放置した。次いで 、ｐＨ６，５を有し、５＋ｗＭのＭＥＳおよび２鋼りのＣａＣＩｚで平衡化され た、４８ｄのＰ４カラムで脱塩した。最高の吸光度を有するカラムからの分画を 集めた、１０ｄｌ、　Ａｂ　Ｓｔｅｍ　＝５．　７９．９５％収率。

システィンが反応したことを確保するため、ニレマンの反応を改変される酵素に ついて行った。この反応中、ニレマンの試剤、２６２−ジニトロ−５，５ジチオ ジ安息香酸は、遊１１ＳＨ−基と反応し、次いでニトロ−メルカプト−安息香酸 が放出される。この放出は、４１２０−で監視できる（ここで、Δε−１３６０ ０Ｍ−’ｃｍ−９゜塩酸に関して溶液を０．１Ｍにすることにより酵素を変性し 、次いで凍結乾燥し更にｐＨ８，５を有し、５０＋Ｍのビシン（Ｎ、Ｎ−ビス〔 ２−ヒドロキシエチルクーグリシン）、２１１ＰＩのＣａＣｌオおよび０．ＩＭ のＫＣＩから成る、緩衝溶液中に溶解する。９００μ２のこの溶液をキュベツト にピペットで移し、次いで９００μｉの緩衝溶液を対照として使用した。゛酵素 の濃度を測定するためＡｂｅｔｓ。

を用いた。メタノール中の１０１ニレマンの試薬１０μ！を、双方のキュベツト に添加した。４１２ｒｎでの吸光度の変化は、遊離ＳＨ−基の数に関係する０反 応生成物、ズブチリシン−３０９−Ｍ２２２Ｃ−３Ｍにおいて、遊ｗｉＳＨ−基 は存在せず、このことはズブチリシン−３０９−Ｍ２２２Ｃ中に導入されたシス ティンは改変されたことを意味する。対照として用いたズブチリシン２０９−Ｍ ２２２Ｃにおいて、導入されたシスティンは、遊ｌ５Ｈ−基とニレマンの試薬と の反応によって回収された（９０％）、このことは、システィンは、反応生成物 、ズブチリシン−３０９−Ｍ２２２Ｃ−３Ｍにおいて改変されていたことを実証 する。

別の対照として、酵素をフェニル−Ｈｇ−ＣＩで滴定した。ズブチリシン−３０ ９−Ｍ２２２Ｃをフェニル−Ｈｇ−ＣＩで改変した場合、活性が減少する。フェ ニル−Ｈｇ−Ｃ１，／ＷＴの比が１を超える場合、活性は非変性酵素の活性のｌ Ｏ％常に保持され、これは酵素当たり１つの基が改変されたことに相当する。生 成物ズブチリシン−３０９−Ｍ２２２Ｃ−３Ｍとフェニル−Ｈｇ−ＣＩとの同様 の反応において、ズブチリシン−３０９−Ｍ２２２　Ｃ−３Ｍに対しフェニル− Ｈｇ−Ｃ１が２．５を超える場合、活性変化は認められない、このことは、ズブ チリシン−３０９−Ｍ２２２Ｃ中の遊離システィンが生成物ズブチリシン−Ｍ２ ２２Ｃ−８Ｍ中で改変されたことを実証する。

例２ １１邊ユ 動力学的特性に対し、サビナーゼ酵素を次の溶液中で分析した＝５０μ！の酵素 溶液 ９００μｊｌ！の５０ｍＭのビシン、２ｍＭのＣａ　Ｃｌｘ　、Ｏ，ＬＭのＨＣ Ｉ、ｐＨ８，５， ５０ｉｔｉｌのＸ＠ＭＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ　（Ｄ ＭＦ中）、 ここでＰｈｅとｐＮＡ（Ｐ−ニトロアニリド）間の基質の分解を、４１Ｑｎｍ、 Δｔ　＝　８５００　Ｍ−’Ｃ１１−’で分光光学的に監視する。

アミノ酸組成から測定したΔε１８６　（Δε１．。＝２３２１７Ｍ−’１−１ ）を用い、２８０ｎｍでの吸収から酵素濃度を測定する。

ミバエリスメンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ　Ｍｅｎｔｅｎ）の式に対する、基質 の７種の濃度での初期速度の直接適合性から動力学的パラメーターｋ　ｃｍ％お よびに、を決定する。

酵素濃度、Ｘは４から１３１１に変化し、その結果、分析中の基質の濃度は０． ２から６．５ｍＭに変化する。従って、酵素のＫ。値付近が選ばれる。

野生型および突然変異体酵素の活性に対する０、１ＭのＨオ０□の効果に対する 時間の経過を、５ｍＭのＭＥＳ、２ｗＭのＣａ　Ｃ１ｍ中（ｐＨ６，５）の酵素 約０．５μＭとＨ，Ｏ□　（３０％の保存液より、メルク社）とインキュベーシ ョンすることにより調べる。規則的な間隔時間において、分析中の酵素の適当量 を、０．３５ｓ＋Ｍの５ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ、５０ ｗＭのビシン、２−ＨのＣａＣＩｚ、Ｏ，ＩＭのＫＣＩ　（ｐＨ８，５）で、希 釈中で希釈し次いで４１０ｎｓでの吸光度の変化を監視することにより停止する 。

残存活性を、非処理酵素対照の活性％として決定する。残存活性の５０％に対応 する半減期、ｔ、Ｉ／□を活性度曲線から決定する。

特性結果を既に示した表２に掲げる。

例３ 叉１立血 洗濯特性試験を、草汁で汚した綿布について２０℃で、１０分間等温的に行った 。

改変したズブチリシン−３０９−Ｍ２２２Ｃ−３Ｍ　（ｍ−Ｍ２２２Ｃ）変異体 を野生型酵素（Ｓ、３０９）および非改変ズブチリシン−３０９−Ｍ２２Ｃ変異 体（Ｍ２２２Ｃ）と比較した。洗剤は、本発明のプロテアーゼの添加前には何ら 酵素を含有していなかった。

試験Ａにおいて、過ホウ酸および活性化剤を有する商業上のヨーロッパタイプの 粉末洗剤５．０ｇ／Ｊ！を用いた。洗剤を約９°ｄｉ（（ドイツ硬度）水に溶解 し、次いでｐＩ（を１０．２に調整した。０゜００８から０．４■蛋白質／１で 酵素を用いた（図３参照）。

試験Ｂにおいて、過ホウ酸および活性化剤を有する商業上のヨーロッパタイプの 粉末洗剤（Ｂ）５．０ｇ／ｊ２を用いた。洗剤を約９゜ｄ）Ｉ　（ドイツ硬度） 水に溶解し、次いでｐＨを９．５に調整した。０゜００８から０．０８■蛋白質 ／ｌで酵素を用いた（図４参照）。

試験Ｃにおいて、過ホウ酸および活性化剤を有する商業上の米国タイプの粉末洗 剤（Ｃ）１．１ｇ＃２を用いた。洗剤を約６°ｄ）Ｉ（ドイツ硬度）水に溶解し 、次いでｐｉ（を１０．２に調整した。０゜０Ｏ８から０．０８■蛋白質／ｉ！ 、で酵素を用いた（図５参照）。

洗濯に続いて、布をバケツ内で２５分間水道流水でフラ・ンシュした。次いで布 を一夜風乾しく日光に対し保護）、次いで４６０ｎ−での規約反射率（％Ｒ）を 測定した。

洗濯特性として、示差規約反射率、ΔＲを用いたが、これは添加した酵素を用い た洗濯後の規約反射率から酵素を添加しないでの洗濯後の規約反射率に等しい。

図面より、３種の酵素は蛋白質基準で同等に良好に作用していることが分かる。

ＦＩＧ、１ デルタＲ 要約書 新規な化学的に改変された洗剤用酵素が提供され、ここにおいて一種又はそれ以 上のメチオニンがシスティンに改変されており、該システィンは引き続き化学的 に改変され酸化に対して安定性が改善された酵素が与えられる。また、洗剤用酵 素を安定化するための新規方法も提供される。更に、これらの新規酸化安定性洗 剤用酵素を含んでなる洗剤組成物が提供される。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年ＩＯ月１ｌＩＬ日

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．１個又はそれ以上のメチオニンがシステインに改変されている酸化安定性の 化学的に改変された洗剤用酵素であって、システインがＨＳ基の水素を一般式Ｒ １Ｓ−（ここで、Ｒ１はＣ１−６アルキルである）の基に置き代えるため引き続 き化学的に改変されていることを特徴とする、前記洗剤用酵素。
2. ２．洗剤用酵素が、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又はプロテアーゼである ことを特徴とする、請求の範囲第１項記載の酸化安定性の化学的に改変された洗 剤用酵素。
3. ３．洗剤用酵素がズブチリシンであることを特徴とする、請求の範囲第１項記載 の酸化安定性の化学的に改変された洗剤用酵素。
4. ４．Ｒ１がＣ１−３アルキルであることを特徴とする、請求の範囲第１〜３項の いずれかに記載の酸化安定性の化学的に改変された洗剤用酵素。
5. ５．活性セリンに隣接した２２２位のメチオニンが、システインに改変されてい る、酸化安定性の化学的に改変されたズブチリシンであって、システインがＨＳ −基の水素を一段式Ｒ１Ｓ−（ここで、Ｒ１はＣ１−６アルキルである）の基に 置き代えるため、化学的改変に委ねられていることを特徴とする、前記ズブチリ シン。
6. ６．ズブチリシンが、ズブチリシン−３０９、ズブチリシン−１４７、ズブチリ ンＢＰＮ′、ズブチリシン　カルスベルク、又はプロテアーゼであることを特徴 とする、請求の範囲第５項記載の酸化安定性の化学的に改変されたズブチリシン 。
7. ７．ズブチリシンが、ズブチリシン−３０９であることを特徴とする、請求の範 囲第５項記載の酸化安定性の化学的に改変されたズブチリシン。
8. ８．Ｒ１がＣ１−３アルキルであることを特徴とする、請求の範囲第５〜７項の いずれかに記載の酸化安定性の化学的に改変されたズブチリシン。
9. ９．酸化安定性の化学的に改変されたズブチリシン、ズブチリシン−３０９−Ｍ ２２２Ｃ−ＳＭ。
10. １０．酸化安定性の化学的に改変されたズブチリシン、ズブチリシン−３０９− Ｍ２２２Ｃ−ＳＰ。
11. １１．酸化に対する洗剤用酵素の安定化方法であって、洗剤用酵素の変異体（こ こにおいて、１種又はそれ以上のメチオニンはシステインに改変されている）を 、一般式Ｒ１　ＳＳＯ２　Ｒ２（ここで、Ｒ１はＣ１−６アルキルであり、Ｒ２ はＣ１−４アルキルである）の化合物との反応により、システインのＨＳ−基の 水素を一般式Ｒ１　Ｓ−（ここで、Ｒ１はＣ１−６アルキルである）の基に、置 き代えることにより化学的改変し、該反応をｐＨ５〜１１のｐＨ値で行なうこと を特徴とする、前記方法。
12. １２．洗剤用酵素が、アミラーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又はプロテアーゼであ ることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の酸化に対する洗剤用酵素の安定化 方法。
13. １３．酸化に対するズブチリシンの安定化方法であって、ズブチリシン変異体（ ここにおいて、１種又はそれ以上のメチオニンは、システインに改変されている ）を、一般式Ｒ１　ＳＳＯ２　Ｒ２（ここで、Ｒ１はＣ１−６アルキルであり、 Ｒ２はＣ１−４アルキルである）の化合物との反応により、システインのＨＳ− 基の水素を一般式Ｒ１　Ｓ−（ここで、Ｒ１はＣ１−６アルキルである）の基に 、置き代えることにより化学的改変し、該反応をｐＨ５〜１１のｐＨ値で行なう ことを特徴とする、前記方法。
14. １４．反応をｐＨ８〜１０のｐＨ値で行うことを特赦とする請求の範囲第１３項 記載の方法。
15. １５．Ｒ１がＣ１−６アルキルであり、Ｒ２がＣ１−２アルキルであることを特 徴とする、請求の範囲第１３項又は１４項記載の方法。
16. １６．Ｒ１がＣ１−６アルキルであり、Ｒ２がＣ１−２アルキルであることを特 徴とする、請求の範囲第１３項又、１４項記載の方法。
17. １７．請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の酸化安定性洗剤用酵素を含ん でなる、洗剤組成物。
18. １８．更に、一種以上の他の酵素、特にアミラーゼ；リパーゼ；セルラーゼ；又 はペルオキシダーゼを含んでなる、請求の範囲第１７項記載の洗剤用組成物。
19. １９．洗剤用添加剤、好ましくは無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラ リー又は保護された酵素の形態で与えられる、請求の範囲第１〜１０項のいずれ かに記載の酸化安定性洗剤を含んでなる、洗剤組成物。