JPH05505404A - ＴＧＦ―βとの共同的組合せによる骨修復のための骨形成タンパク質の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、骨成形術に関する。特に本発明は、骨の成長を誘導するタンパク質の 組合せ、この組合せを含む薬学的組成物、このような組成物を使用する骨成長を 促進する方法、骨髄前駆細胞を刺激し、骨髄細胞へ分裂および分化させる方法、 ならびに骨粗しよう症のような、骨の生成および／または骨の再吸収の機能障害 ／機能不全に関連する疾病の治療方法に関する。

隨五！見 骨が、生体系（ｌｉｖｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍｓ）と接触することによって新しい 骨の形成を刺激し得る物質を含んでいることが立証されている。（Ｕｒｉｓｔ、 　Ｍ、Ｒ，、■劫」工」並（１９６ｇ）　５６：３７；　５ｃｉｅｎｃｅ　（１ ９５５）　１５０：８９３；　Ｒｅｄｄｉ、　Ａ、ｔ（、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ ｌ　Ａｃａｄ　ＳｃＬ」注■（１９７２）　６９：１６０１）。この活性の原図 となる因子を精製する試みがなされてきた。Ｕｒｉｓｔの米国特許第４．２９４ ．７５３号および第４．４５５．２５６号によれば、尿素または塩酸グアニジン を使用して、脱塩した骨から「骨形成タンパク質Ｊ　（ＢＭＰ）が抽出され、そ して再沈降された。次いで、Ｌｌｒｉｓｔは、この粗製タンパク質混合物のイオ ン交換精製により、ｐＨ４，８で、活性がカルボキンメチルセルロース樹脂（Ｃ ＭＣ）に吸着しないことを報告した（ＩＪｒｉｓｔ、　Ｍ、Ｒ，、Ｃ１１ｎ　０ ｒｔｈｏ　ＲｅｌＲｅ５　（１９８２）１６２：２１９）　、　５ｃｉｅｎｃｅ 　（１９８３）　２２０：６８０−６８５および江匹」ａｔｌ　Ａｃａｄ　５ｃ ｉｅｎｃｅ　（ＬＩＳＡ）（１９８４）　８１：３７１−３７５にお（するＬｌ ｒｉｓｔの報告は、１７．５００およびｉｌｌ、　５００ダルトンの分子量を有 するＢＭＰを記載している。ｔｌｒｉｓｔの公開特許、ＥＩ’Ａ公開第０２１２ ４７４号４家、Ｂ　Ｍ　Ｐの限定タフバク質分解によって得られた４、　ＱＱＧ 力）ら１．ＣＪＯＯダルトンのＢＭＰフラグメントをｊ己載して（する。

米国特許第４．６０８．１９９号は、３０．０００から３２．０００ダルトンの 骨由来タンパク質を記載している。このタン、＜り質Ｃよ、水溶性であり、フン カナバリンＡ　（ＣｏｎＡ）ｌこ対して親和性を宵していないことが記載されて いる。

Ｎｏ　８８１００２０５は、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２クラスｌ　（”　ＢＭＰ− ２″）、ＢＭＰ−３およびＢＭＰ−２クラスＩＩ（”ＢＭＰ−４”）と命名され る４つのタン／＜り質を報告しており、これらは、骨形成活性を有していること が記載されて０る。

これらのＢＭＰが、それ自体で骨形成活性を有してｔＸるの力）、または他の因 子との組合せを必要として（＼るのか（よ知られていない。

Ｊ、Ｍ、Ｗｏｚｎｅｙは、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｖ ｏｌ−ユ（１９１１９）、ｐｌ）、　２６７−２８０において、ＢＭＰ−２ｉこ 密接（こ関連したざらに３つのＢＭＰタンパク質を記載しており、それらＩｔ、 ＢＭＦ’−５、ＢＭＦ’−６およびＢＭＦ’−７と命名されて０る。

ｗｏ　３９１０９Ｔ１１７および８９１０９７１１Ｂは、ｒＯＦ’−１」と呼＋ ｆれる、現在ではＢＭＰ−７として知られるタンノでり質を記載して（する。Ｂ ！ＪＰ−７のクローン化は、Ｅ、　０ｚｋａｙｎａｋら、ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａ ｌ　（１９９０）主：２０８５−２０９３に記載されており、ＢＭＰ−７の精製 は、Ｔ、に、　５ａｉｐａｔｈら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅ＋ｓ　（１９９０）　 ２６５＋１３１９８−１３２０５に記載されている。

５ｅｙｅｄｉｎおよびＴｈｏｍａｓの米国特許第４．４３４．０９４号は、カオ トエピ、り剤を用いた抽出、アニオンおよびカチオン交換カラムを用いた分画、 およびｐＨ４，８におけるＣＭＣへ吸着した画分からの活性の回収による骨生成 を刺激する骨由来タンパク質の部分的生成を報告した。この新しいタンパク質画 分は、「骨形成因子Ｊ　（ＯＦ）と名付けられ、約３０．０００ダルトン未満の 分子量を有するものとして特徴づけられた。

本譲受人が所有する米国特許第４．７７４．３３２号は、カオトロピック剤を用 いた抽出およびイオン交換カラム分画によって均一に精製された、２つの骨由来 のタンパク質を記載している。

これら２つのタンパク質は、初めは、軟骨誘導因子（ＣＩＦ）Ａおよび（ＩＦ　 Ｂと呼ばれた。次いで、ＣＩＦ　Ａは、腫瘍増殖因子β（ＴＧＦ−β）と呼ばれ る、以前に同定されたタンパク質と同一であることが見い出された。ＣＩＦ　Ｂ は、ＴＧＦ−βの新規の形管であることが見い出され、現在はＴＧＦ−β２とし て知られ、ＣＩＦ　Ａは、ＴＧＦ−β１として知られている。

その他のＴＧＦについてもまた記載されている。Ｄｅｒｙｎｃｋらの米国特許第 ４．８８６．７４７号は、ＴＧＦ−β３の同定およびそのヌクレオチド配列を記 載しており、組換え細胞培養物からのＴＧＦ−β３の回収方法を開示している。

Ｓ、Ｂ、　Ｊａｋｏｖｌｅｗら、靭士＝ｃ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　（１９８１ １１）　ｉ：１１８６−１１９５は、ＴＧＦ−β４、およびｃＤＮＡ特徴付けに よって同定されるそのヌクレオチド配列を記載しているｏ　Ａ、Ｂ、　Ｒｏｂｅ ｒｔｓら、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ、　’／。

Ｌユ（１９９０）、　Ｉ）ｐ、１３５−１４７は、猛二！ｕで調整した培地から のＴＧＦ−β５の精製を記載している。

異なる場所での？誘導活性をその精製に使用して、骨誘導因子（ＯＩ　Ｆ）と命 名されたウシの骨由来の新規な糖タンパク質もまた、報告されている（Ｂｅｎｔ ｚ、　Ｈ，ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ−（１９ｇ９）　２６４：２０８０ ５−２０８１０）　ｏ最初、これらのｒｏ　Ｉ　Ｆｍ製物」の骨誘導活性は、Ｔ ＧＦ−β１または２のいずれかによって実質的に同上され得ると考えられた（　 Ｂｅｎｔｚ、　Ｈ，ら、二Ｂｉｏ１．　Ｃｈｅ＋ｍ、（１９８９）　２６４：２ ０８０５−２０８１０；　Ｂｅｎｔｚ、Ｈ，ら、Ｄｅｖｅｌ。

＋ｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｏｆ　Ｃａｒｔｉｌａ　ｅ　ａｎｄ　 Ｂｏｎｅ　Ｍａｔｒｉｘ　（Ａ、　ＳｓｎおよびＴ、　Ｔｈｏｒｎｈｉｌ１編） 　ｐｐ、１３７−１４７．　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｉｎｃ、（１９８７）　 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。しかし、後に、ＯＩＦ活性を有すると思われていた因子は 、実は、その活性を有していないことが見い出された。

単離された調製物中の骨誘導活性が、単一タンパク質によるものか、または複数 のタンパク質が共同で作用したものかは知られていない。骨誘導活性に関与する タンパク質の同定は、骨から抽出されるタンパク質の膨大な数（数百と推定され る）と、骨誘導活性の決定的なインビトロアッセイがないことにより複雑になっ ている。

ｌ１旦１且 本発明は、予想しなかった２つの発見から生じたものである。その１つは、ウシ の骨由来の部分的に精製されたｒＯＩＦ調製物」中の骨形成刺激活性が、明らか に、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７を含む、調製物中の ＢＭＰの存在に起因することである。もう１つは、ＴＧＦ−βが、ＢＭＰ−２、 ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７を含むＢＭＰと共に投与されると、骨 形成活性において共同の効果が得られるという、細胞増殖効果を有することであ る。

従って、本発明の第１の目的は、軟骨および／または骨の欠陥を治療するための 、ＢＭＰおよびＴＧＦ−βを含む組成物を提供することである。

本発明の他の目的は、生きた哺乳類における所定の部位の骨の欠陥を、インビボ で治療する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、生きた哺乳類における骨髄細胞生産を誘導する方法を提供 することである。

本発明のその他の目的、利点および新規な特徴は、以下本明細書に一部説明し、 以下の試験を行うことによって、または本発明の実施によって、その一部が当業 者に明白となるであろう。

本発明の１つの局面では、軟骨および／または骨の欠陥をインビボで治療するた めの組成物であって、（ａ）組織成長誘導に有効な量の骨形成タン、ｆり質（Ｂ ＭＰ）および、腫瘍増殖因子β（ＴＧＦ−β）とを、（ｂ）薬学的に受容可能な キャリヤーと共に含む組成物が提供される。

本発明の他の局面では、インビボで所望の部位で軟骨および／または骨の欠陥の 治療方法であって、上記の組成物を哺乳類の前記の部位に移植する工程を含む方 法が提供される。

本発明のさらに他の局面では、生きた哺乳類での骨髄細胞の生産の誘導方法であ って、組織成長誘導に有効な量の上記組成物を哺乳類に組織的に投与する工程を 含む方法が提供される。

盟」■と４！！　’Ａ　ａ丸五 図１は、骨誘導因子を含む国分のＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー分画を示す 。

図２は、図１の工程において得られたい（つかの画分の５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果 を示す。

図３は、図１の第１ピークからの物質のＲＰ−ＨＰＬＣ分画を示す。

図４は、ピークｌタンパク質のペプチド配列と、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−３配 列とを比較している。

図５は、ＴＧＦ−β（・）を有する、およびＴＧＦ−β（Ｏ）を有さないＢＭＰ −２＋３移植片の骨誘導特性を示す。

移植片のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰａ　ｓ　ｅ）活性をアッセイし、０− ５（最高）のスケールで、骨（Ｂ）および軟骨（Ｃ）を組織学的に評価した。

１１旦１皿呈笠里 り豆： 明細書の用語「骨形成タンパク質Ｊ　（ＢＭＰ）は、インビボでのネズミの骨形 成アッセイでの活性により測定される、骨の形成を誘起し得る骨由来の１つのク ラスのタンパク質ヲ指す。ＢＭＰは、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、Ｂ ＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７、ならびに、天然のＢＭＰ の生物学的特徴を保持する、そのフラグメント、欠失体、付加体、置換体、変異 体および改変体を含む。ＢＭＰは、ヒト、ウシまたは池の種の起源であり得る。

明細書の用語［腫瘍増殖因子βＪ　（ＴＧＦ−β）は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ− β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４およびＴＧＦ−β５を含む、細胞増殖を誘起 し得るポリペプチドのファミリー、ならびに天然のＴＧＦ−βの生物学的特徴を 保持する、そのフラグメント、欠失体、付加体、置換体、変異体および改変体を 指す。ＴＧＦ−βは、ヒト、ウシまたは他の橿の起源であり得る。

タンパク質の「変異」は、それをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列の変化に よる、（通常存在するタンパク質に対する）その−次構造の変異である。これら の変異には、遺伝子的に操作された変異体および対立変異体が含まれる。「改変 された」タンパク質は、グリコリル化パターンまたはリピ２ド化パターン、ある いは、タンパク質の一次構造、二次構造または三次構造を変化させる翻訳後の事 象の結果、通常存在するタンパク質とは異なる。タンパク質の一次構造の変化は また、欠失、付加または置換から生じ得る。「欠失体」は、１つまたはそれ以上 の内部アミノ酸残基が存在しないポリペプチドと定義される。「付加体」は、野 生型と比較して、１つまたはそれ以上の付加された内部アミノ酸残基を有するポ リペプチドと定義される。「置換体」は、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の 他の残基による置換から生じる。タンパク質「フラグメント」は、該ポリペプチ ドが関連するタンパク質の一次配列の一部と同一の一部アミノ酸配列からなるポ リペプチドである。

好ましい「ｌｉｉ換体」は、保存性、すなわち、残基は、同じ遺伝型の他の残基 と置換される、置換である。十分理解されているように、天然に存在するアミノ 酸は、酸性、塩基性、中性極性、または中性非極性に細分類される。さらに、天 然に存在する３つのアミノ酸は、芳香族である。天然のＢＭＰおよびＴＧＦ−β と異なるコードされたペプチドが、置換されたアミノ酸と同一のグループのアミ ノ酸の置換されたコドンを含んでいるのが一般に好ましい。従って、一般に、塩 基性アミノ酸Ｌｙｓ、　ＡｒｇおよびＨｉｓは、互換可能である；酸性アミノ酸 アスパラギン酸およびグルタミン酸は、互換可能である；中性極性アミノ酸５ｅ ｒＳＴｈｒ、　Ｃｙｓ、　ＧｉｎおよびＡｓｎは、互換可能である；非極性脂肪 酸ＧｌｙＳＡｌａ、　Ｖａｔ、ｌｉｅおよびＬｅｕは、互いに保存性であるくし かし、サイズにより、ＧｌｙとＡｌａとはより密接に関連し、Ｙａｋ　ｌｉｅお よびＬｅｕはより密接に関連している）、そして、芳香族アミノ酸Ｐｈｅ、　Ｔ ｒｐおよびＴｈｒは、互換可能である。プロリンは、非極性中性アミノ酸である が、コンホメーンコンへの影響により問題を引き起こすため、同一のまたは同様 のフンホメーシコンが得られ得る場合以外は、プロリンによる置換またはプロリ ンの置換は好ましくない。保存性の変化を示す極性アミノ酸は、Ｓｅｒ、　Ｔｈ ｒ、　Ｇｉｎ、　Ａｓｎを含む：そして、より少ない程度保存性を示す極性アミ ノ酸にはＭｅｔを含む。さらに、異なるカテゴリーに分類されるが、Ａｌａ、Ｇ ｌｙおよびＳｅｒは、互換可能なようであり、Ｃｙｓは、付加的にこのグループ に適合し、あるいは、極性中性アミノ酸として分類し得る。

ＢＭＰまたはＴＧＦ−βまたはその両方を合成する場合には、天然の遺伝子にコ ードされていないアミノ酸による置換もまた行ない得る。例えば、代替残基には 、式Ｈ２Ｎ＜ＣＦｉ２）、、Ｃ００Ｈ１ここでｎは２−６、のω−アミノ酸が含 まれる。これらは、サルコシン、ｔ−ブチルアラニン、ｔ−ブチルグリシン、Ｎ −メチル−イソロイシンおよびノルロイシンのような、中性、非極性アミノ酸で ある。例えば、フェニルグリシンのような他のアミノ酸で、芳香族中性アミノ酸 としてのＴｒｐ％ＴｙｒまたはＰｈｅ８１換し得る。シトルリンおよびメチオニ ンスルホキシドは中性極性、シクロヘキ／ルアラニンは中性非極性、システィン 酸は酸性、そしてオルニチンは塩基性である。もし、これらの１つまたはそれ以 上がヒドロキシプロリンと置換されるならば、置換されたプロリン残基のコンホ メーション寄与特性は、保持され得る。

タンパク質の生物学的「特徴」という用語は、タンパク質が天然に存在する微生 物の通常の生物学的工程中での、タンパク質の構造的または生化学的機能を指す 。ＢＭＰの生物学的特徴の例に、その特異的な抗原性または免疫原性、および／ またはその骨誘起活性が挙げられる。ＴＧＦ−βの生物学的特徴には、その特異 的な抗原性または免疫原性、および／または、インビボでの炎症応答および化学 走化性応答を媒介する能力が含まれる。

本明細書の用語「宵効な量」は、徹者に投与した時に、毒性のような、耐え難い 副作用を引き起こすことなしに、所望のまたは目的とする有益な効果を提供する ために必要な治療薬剤の童を指す。

柾ユニ： 本発明の組成物には、２つの活性成分がある。ＢＭＰタンパク質とＴＧＦ−βタ ンパク質である。これらの成分は、組成物の骨形成能力に関して共同的に作用す る。

好ましくは、ＢＭＰ成分は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７ またはその混合物を含む。最も好ましくは、ＢＭＰ成分は、ＢＭＰ−２およびＢ ＭＰ−３の混合物である。好ましくは、ＴＩＧＦ−β成分は、ＴＧＦ−β１また はＴＧＦ−β２またはその両方を含み、最も好ましくはＴＧＦ−β２を含む。

２つの成分は、以下の３通りの方法の１つによって調製され得る：　（１）天然 の産物の単離および精製による調製方法；　（２）合成による方法；および（３ ）組換えによる方法。

且聚立座　ＢＭＰ−１，ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３およびＢＭＰ−４の単離および 精製は、本明細書では参考文献として援用する米国特許第４．８７７、８６４号 に記載されている。ＢＭＰ−７の単離および精製は、Ｔ、に、　Ｓａｍｐａｔｈ ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９９０）■５：１３１９８−１３２０５に記 載されている。

ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２の単離および精製は、本明細書では参考文献と して援用する米国特許第４．７７４．３３２号に記載されている。ＴＧＦ−β５ の単離および精製は、Ａ、Ｂ、　Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏ ｒｓ、Ｖｏｌ、２　（１９９０）、ｐｐ、１３５−１４７に記載されている。

１腹二圭工亙ま　本発明のＢＭＰおよびＴＧＦ−βは、例えば、固相ペプチド合 成のような当該技術分野で公知の手段によって、化学的に合成し得る。それらの アミノ酸配列１よ公知である、または、それらの当該技術分野に公知のヌクレオ チド配列から推定される。合成は、α−アミノを保護したアミノ酸を使用し、ペ プチドのカルボキシ末端から開始される。

他の保護基も適切であるが、ｔ−プチルオキシ力ルボニル（Ｂｏａ）保護基を、 すべてのアミン基に使用し得る。例えば、Ｂｏａ−Ｌｙｓ−ＯＨまたはＢｏａ− Ａｒｇ−ＯＨ（すなわち、ＢＭＰ様カルボ牛ン末端アミノ酸）を、クロロメチル 化ポリスチレン樹脂支持体にエステル化し得る。ポリスチレン樹脂支持体は、ポ リスチレンポリマーを特定の有機溶媒に対して完全に不溶とする架橋剤として、 約０．　５から２％のジビニルベンゼンを有するスチレンのコポリマーであるこ とが好ましい。５ｔａｖａｒｔら、５ｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅ　ｔｉｄｅ　 Ｓ　ｎｔｈｅｓｉｓ　（１９６９）、　Ｖｌ、Ｆｉ、Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ。

、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｊ、　Ａｍ 、　Ｃｈｅｔ　Ｓａｃ、（１９６３）　８５・２１４９−２１５４を参照。ペプ チドを合成するための種々の方法は、米国特許第３．８６２．９２５号、第３． ８４２．０５７号、第３，９７２．８５９号および第４．１０５．６０２号にも 例示されている。

合成は、用手法を用い、または例えばＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅ＋５ｓ ４３０Ａ型ペプチド合成装置（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｒ＋ ｉａ）またはＢｉｏｓｅａｒｃｈ　ＳＡＭ　Ｉｆ型自動ペプチド合成装置（旧ｏ ｓａａｒｃｈ、Ｉｎｃ。

、　Ｓａｎ　Ｒａｆａｅｌ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）を製造者による手順書の 指示に従い自動で使用し得る。

自動合成では配列の制御も可能なため、この合成方法の使用で、アミノ酸配列の 付加、置換および欠失も当然可能になる。さらに、置換されたアミノ酸が遺伝子 によってコードされている必要もない。故に、Ｄ形あるいはβ−またはω−アミ ノ酸で、天然に存在するアミノ酸を置換し得る。

監１土三圭玉亙広　本発明のＢＭＰおよびＴＧＦ−βはまた、それらの同定およ び単離されたヌクレオチド配列を使用し、そして、当該技術分野内の分子生物学 、微生物学、組換えＤＮＡ技術および免疫学といった従来の技術を使用して製造 し得る。このような技術は、文献に完全に説明されている。

例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、　粒ム 」シ圧工ｍｎ１ｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ　（１９＋！２ ン：　Ｌ≧ＮＡ　Ｃ！≦トコーシ１１−１４」ツー１盃、、Ｖｏｌｕｍ■■ ＩおよびＩｆ　（Ｄ、Ｎ、　Ｇｌｏｖｅｒ編１９８５）：　Ｏｌｉ　ｏｎｕｃｌ ｅｏｔ山ＬユＬ止虫」」しｓ　＜Ｍ、Ｊ、　ＧａｉｔｌＭ　１９８４）：　Ｎｕ ｃｌｅｉｃｌ−Δ３ＬＬ」＝一旦シｄΣ工」二ｄｉｚａｔｉｏｎ　（Ｂ、Ｄ、　 ＨａｍｅｓおよびＳ、Ｊ、　Ｈｉｇｇｉｎｓ編１９８４）；　Ｔｒａｎｓｃｒｉ 　ｔｉｏｎ　ａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　（Ｂ、Ｄ、　ＨａｍｅｓおよびＳ 、Ｊ、　ｌｌｌｇｇｌｎｓ編１９８４）；　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１１　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅ　（１？、［、Ｆｒｅｓｈｎｅｙｍ　１９８６）：　Ｉｉｍｏｂｉｌｉｚ ｅｄＣｅ　Ｉｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚ　ｍｅｓ　（ＩＲＬ　ｐｒｅｓｓ　１９８６） ；　Ｐｅｒｂａｌ、Ｂ、、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　（１９８４）；　Ｇｅｎｅ　ＴｒａｎｓｆｅｒＶ ｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　％ｌａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ　（Ｊ、Ｈ，Ｍｉｌ ｌｅｒおよびＭ、Ｐ、　Ｃａｌｏｓ編、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８７）；　ｔｈｅ　５ｅｒｉｅｓ、　Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　（Ｓ、　ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ、　Ｋａｐ ｌａｎ！ｓ。

Ａｃａｄｅ＋＋＋ｉｅ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、）、およびＨａｎｄｂｏｏｋ　 ｏｆ　Ｅｘ　ｅｒｉｍｅｎｔａ１７、Ｖｏｌｕ＋ａｅｓ　１−ＩＶ　（Ｄ、Ｍ、 　ＷｅｉｒおよびＣ，Ｃ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌｍ、１９８６．　Ｂｌａｃｋｖｅ ｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を参照。

組換えによって生産される改変型ＢＭＰまたはＴＧＦ−βは、ＢＭＰまたはＴＧ Ｆ−βをコードする配列の突然変異誘発、例えば、部位特異的突然変異誘発、お よび配列の欠失または挿入によって得られ得る。変異を引き起こす技術は、当業 者に公知である。例えば、Ｍａｎ　ｉａｔ　ｉｓら、前出、Ｐｅｒｂａｌ、　Ｂ 。

前出、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｖｍｏｌｏ　、前出、およびＧｅｎｅ　Ｔ ｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ、 前出を参照。

本発明のＢＭＰおよびＴＧＦ−βポリペプチドを得るための上記の方法は、限定 を意図しておらず、本発明の成分は、従来の任意の方法で調製し得る。

ヒト、サル、つ７およびネズミ材料由来の骨誘起タンパク質が、外来移植片で軟 骨内骨を産生ずる能力では、非種特異的であることを考慮すると（Ｓａｍｐａｔ ｈ、　Ｔ、Ｋ　ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃニュ旺旦（１９８３） 　８０：５５９１）　、本明細書に記載＋７）ＢＭＰおよびＴＧＦ−βは、哺乳 類の種間で高度に保存されていると思われる。すなわち、異なる哺乳類橿からの 対応する骨誘起タンパク質（本明細書では、「種アナログ」と呼ぶ）は、実質的 に相同なアミノ酸配列を有している。このアミノ酸配列は、仮に変化があるとし ても、例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換、お よび／または、該分子が骨形成を誘起する非種特異的能カに影響を与えない、実 質的に同様のグリコジル化パターンが、ウシのタンパク質と異なるに過ぎない。

この観点から、用語「実質的に同等な」および「実質的に相同な」は、種または 調製の方法にかかわらず、実施例に記載のウシの骨形成タンパク質と同一のアミ ノ酸配列を有するタンパク質、および同様のタンパク質であるが、その違いが非 覆特異的軟骨内骨誘起活性に悪影響を与えない、異なるアミノ酸配列を有する、 タンパク質を指す。

このような「実質的に相同な」タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書に記載の ランタンパフ質に対して、通常、少な（とも５０％相同、さらに一般的には少な くとも８０％相同、そして、好ましくは少なくとも９０％相同である。従って、 このようなタンパク質は、異なった哺乳類起源の骨から得られるか、または組換 えＤＮＡ手法を用いて合成され得る。

本発明のＭＢＰおよびＴＧＦ−βタンパク質は、懸濁または溶液中にあるとき、 あるいは個体の形態で結晶化または沈澱されるときにはその周囲のｐＨに依存す るが、薬学的に受容可能な塩または中性の形態であり得る。このタンパク質の遊 離アミン基は、例えば、塩酸、リン酸または硫酸等の無機酸：あるいは、例えば 、酢酸、グリコール酸、コハク酸またはマンデル酸等の有機酸、と酸付加塩を形 成し得る。遊離カルボキシル基は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまはた水 酸化カルシウム等を含む無機塩基、およびピペリジン、グルコサミン、トリメチ ルアミン、コリンおよびカフェイン等の有機塩基、と塩を形成し得る。さらに、 このタンパク質は、脂質および糖等の他の生物学的物質との組合せによる改変、 あるいはアミ７基のアセチル化、ヒドロキシル側鎖またはリン酸化、または、チ オール基の酸化によって改変し得る。これらの改変は全て、本発明の定義の範囲 内に含まれる。

ｌに一豊： 本発明の骨形成組成物は、骨が通常形成されない環境に、新たな骨形成を誘起す るために使用し得る。従って、この組成物は、骨の様々な欠陥を治療するために 使用し得る：組成物は、予防的に、骨折の可能性の減少、人工関節の固定の改善 、先天的なまたは外傷によって誘起された骨の欠陥を修復するため、または美容 成形手術に使用し得る。この組成物はまた、骨が通常形成される場合に、骨の形 成を促進させるために使用し得る。例えば、骨折の修復、外科的に除去された骨 の置き換え、宏周病により損傷した骨の修復、あるいは他の歯または顎提修復術 に使用し得る。このような使用では、組成物を、骨形成の所望の部位に移植等に よって局部的に投与し得る。

この組成物はまた、不十分な骨の形成、関連した兆候および／または、局部的な 、領域的なまたは全身的な骨粗しよう症のような、望ましくないレベルの骨の再 吸収を治療するため、または、慢性および急性の骨髄性白血病および造血系の他 の癌のような造血系の機能不全または機能障害の治療で骨髄前駆細胞を刺激する ため、または、照射治療後に、骨髄幹細胞を刺激して分裂および分化を行わせる ために、静脈注射等により、全身に投与し得る。

本発明の骨形成組成物は、通常、薬学的に受容可能な固体または液体キャリヤー と共に、骨形成に有効な量で処方され、活性が所望される部位に局部注射または 移植により、あるいは従来の非経口経路により全身投与される。局部投与用処方 は、活性が所望される部位にタンパク質を提供でき、骨および軟骨を発達するた めの構造を提供できるマトリックス物質を含むのが好ましい。可能なマトリック スは、生物分解性または非生物分解性であり得、化学的または生物学的に定義さ れ得る。このような物質の例は、硫酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、リン 酸トリカルシウム、ポリオルジエステル類、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合 体、コラーゲン、生体ガラス等である。全身投与用処方は、タンパク質の治療薬 の非経口投与に通常使用される液体媒体が含まれる。

本発明の骨形成組成物は、その水溶性を高めるため、半減期を高めるため、また は骨への結合能力を向上させるために、他の分子と結合し得る。例えば、タンパ ク質は、ポリエチレングリコールと結合されてその水溶性を高め得る。あるいは ビスホスフォネート（例えば、１−ヒドロ半シエチリデンー１，１−ビスーホス フォン酸、ジクロロメチレンビスホスフオン酸、および３−アミノ−１−ヒドロ キシブロピリデジー１．１−ビスホスフォン酸）のような骨と結合する分子およ び蛍光色素（例えば、テトラサイクリン類、カルセインブルー、キシレノールオ レンジ、カルセイングリーンおよびアリザリンコンブレクソンレノド）と結合し 、骨の部位へ標的付は得る。分子をタンノくり質に結合するための様々な試薬は 、当該技術分野で公知であり、アルデヒド類、カルボジイミド類および他の二宮 能官能基が含まれる。

投与される骨形成組成物の量は、使用するキャリヤー、患者（年齢、性別、病歴 、人種）および治療される部位と状態により変化し得る。局部移植の場合、処方 中のキャリヤーに対するＢＭＰおよびＴＧＦ−βの重量比は、通常、約１：５， ０００から１・ｓｏ、　ｏｏｏの範囲内である。組成物中のＴＧＦ−βに対する ＢＭＰの重量比は、通常、１０．１から１．１０である。移植片は、移植または 注入等の従来の外科技術によって、患者の所定の部位に配置し得る。

全身投与の場合、ＢＭＰおよびＴＧＦ−βの総量は、通常、体重１　ｋｇ当り２ ０μｇと２　ｍｇとの間の範囲である。さらに、骨粗しよう症の場合、ＢＭＰお よびＴＧＦ−βタンパク質と、フッ化物、カル／トニン、ビタミン０代謝産物お よび副甲状腺ホルモン等の他の治療薬とを組み合わせることが望ましい。

組成物は、その活性が非種特異的であるため、スポーツ用、ペット用、農場用の 動物およびヒトを含む哺乳類全般の治療に使用し得る。

以下の実施例は、本発明を例示することを目的とし、本発明を限定するものでは ない。

１皿皿 Ａ、ＯＴ　Ｆｍ　”ＩＡからのＢＭＰのＰ５回のクロマトグラフィ一工程を連続 的に適用することによって、脱塩したウシの骨の４Ｍグアニジン−ＨＣｌからＯ Ｉ　Ｆ調製物を得た。このクロマトグラフィーの最後の工程は、アセトニトリル 勾配を用いるＲＰ−ＨＰＬＣからなる（　Ｂｅｎｔｚ、　Ｈ。

ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９８９）２６４：２０８０５−２０８１ ０を７照のこと）。

ＯＩＦｇ製物をさらに精製するために、ＯＩＦの塊を含む画分をプールし、２容 積の０．１％ＴＦＡで希釈し、ｎ−プロパツール勾配を使用する同一のカラム上 で再びクロマトグラフィーにかけた。溶媒Ａは０１％のＴＦＡであり、溶媒Ｂは 溶媒Ａ中の９０％のｎ−プロパツールであった。タンパク質を、直接勾配、毎分 ０．４％の溶媒Ａ中の２０−４５％の溶媒Ｂ、および毎分１．２ｍｌの流量で、 カラムから溶出させた。

図１に示されるように、２つの主要なピークが得られた。

タンパク質の濃度は、ＢＣＡ　ピアスアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ　ａｓｓａｙ）（ Ｓｍ１ｔｈ、Ｐ、　Ｋ、ら、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、（１９８５）　１５０ ：　７６−８６１３）、およびピーク領域（２３０ｒ＋ｎ＋の吸光度）をランの 血清アルブミンの標準サンプルのピーク領域と比較することによって決定した。

Ｆ、Ｗ、　５ｔｕｄｉｅｒ　（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（１９７３）　７９ ：２３７−２４８）によって改変されたように、Ｕ、に、　Ｌａｅｓ＋ｓｌｉ　 （Ｎａｔｕｒｅ　（１９７０）　２２７：６１１０−６８５）の方法を用いて、 １５％のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動することによって、タンパク質を 分析した。ゲルを銀染色し、ＯＩＦに特異的なモノクローナル抗体を使用して、 ウェスタンプロット分析を行った（Ｄａｓｃｈ、　Ｊ、Ｒ，ら、止、　Ｂｏｎｅ Ｍｉｎ、　Ｒｅｓ。（１９８９）　４：５２８６　（要約））。

ゲル電気泳動特性および免疫化学標識による特徴付けられるように、後に溶出さ れたピーク（ピーク２）は、ＯＩＦを含んでいた（Ｂｅｎｔｚ、　Ｋら、Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　（１９８９）　２６４＋　２０８０５−２０８１０） 。ピーク１は、ピーク面積によって測定されたところによると、様々なサンプル 中の全タンパク質の１０−４０％を示した。

図１の断片４０−４９　（図２に示されるレーンｌ−１０）を５ＤＳ−ＰＡＧＥ で分析すると、ピーク１の物質（レーン２−４）は、２８−３４　ｋＤＡの質量 範囲で拡散するいくつかの成分を含んでいるのが発見された。これらの成分は、 還元されると、相対量の１．３および４のそれぞれにおいて、３０．１８および １６　ｋＤａの成分に変換された。この挙動は、Ｗａｎｇら（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８８）　８５：９４８４−９４８８） およびＬｕｙｔｅｎら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９８９）　２６４＋　 １３３７７−１３３８０）によって報告されるように、ＢＭＰ調製物に特徴的で ある。

この同定を確認し、ＢＭＰ種を決定するために、ピーク１タンパク質をペプチド 分析にかけた。還元、エンドプロティナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ 　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いたＳ−ピリジルエチル化開裂およびペプチド精製を 、実賀的に、Ｈ，Ｂｅｎｔｚら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９９０）　 ２６５：５０２４−５０２９に記載されているように行った。ピーク１タンパク 質のタンパク質開裂から生じるペプチド混合物を、Ｖｙｄａｋ　Ｃ１８カラム、 ２−１　ｘ　１５０　ｔＩ＋＋を用いるＲＰ−ｉｌＰＬｃによって分画した（図 ３）。溶媒Ａは０．１％のＴＦＡであり、溶媒Ｃは、溶媒Ａ中の９０％のアセト ニトリルであった。カラムを、溶媒Ａ中の０−２０％の溶媒Ｃの毎分１％の直線 勾配、次いで、２０−５４％の同一溶媒の毎分０．４％の直線勾配、および毎分 ０゜２５１１の流量で溶出した。

次いで、この調製物から選択された画分の配列決定をした。

モデル１２０Ａミクロボア（１ｉ（ｒｏｂｏｒｅ）オンラインフェニルチオヒダ ントイン誘導体分析器（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えた、モ デル４７５Ａミクロタンパク質ンークエンサーでの日動エドマン分解によって、 ペプチドを配列決定した。この配列（図４に示されるＬｌからＬＩＯ）を、ＢＭ Ｐ−１−４の知られている配列（Ｎ。

ｚｎｅｙ、Ｊ、Ｍ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８ｇ）　２４２：　１５２８− １５３４：　Ｗｏｚｎｅｙ、Ｊ、Ｍ、ら、Ｐｒｏ　、　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔ ｏｒ　Ｒｅｓ、（１９９０）　Ｌ：　２５７−２８０）と比較した。いくつかの 部位およびいくつかの残基における、マツチしない二次的な残基帰属によって示 されるように、ペプチドは純粋ではなかったが、ペプチドがＢＭＰ−２およびＢ ＭＰ−３の混合物のみからのものであることが明白である。

Ｂ、ピーク１タンパク　の　およびＴＧＦ−の釆スし艮 ピークｌ物質によって示されるような、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−３（共にｒＢ ＭＰ−２士３」）の骨誘導活性、ならびにピーク２物質によって示されるような 、ＯＩＦ骨誘導活性を、以下のラットの皮下組織モデルにおいて測定した。

ピーク１または２物質を、多孔性粒子状のヒドロキシアノｆタイト／トリカルシ ウムホスフェート（Ｚｉｍｍｅｒ、　Ｗａｒｓａｖ、ＩＮ）およびウシの皮膚コ ラーゲ７　（Ｖｉｔｒｏｇｅｎ、　ＣｏｌＣｏ１１ａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔ　１ｏ ｎ）と混合し、凍結乾燥し、リン酸緩衝生理食塩水で水和し、重量がそれぞれ約 ５０１１Ｉｇ（乾燥型ｊｌ）のペレットに成形した。べＬ／　ソトは、Ｉ　Ｂ当 り１２０　ｎｇのピーク１または２物質を含んでいた。ペレットの中には、ｌ　 ｍｇ当り１４０ｎｇ（７）ＴＧＦ　−β２を含んでいるものもあった。前に記載 したように、３４から４０ＦＥ齢の雄のＳ　ｐｒａｇｕｅ−Ｄａｙ　ｌｅｙう１ トの皮下組織に、ペレ。

トを、通常１グループ当り４つずつ移植した（Ｂｅｎｔｚ、　Ｈ，ら、Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、（１９８９）２６４；　２０８０５−２０８１０）。１４ 日後、ペレットを外植し、アルカリホスファターゼ活性をアッセイすることによ って無機物の付加を、そして前述したような組織的方法で骨および軟骨を評価し た（　Ｂｅｎｔｚ、　’ｄ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｔ　（１９８９＞　 ２６４：２０８０５−２０８１０）。前述したように、ＴＧＦ−β１および２を つ７の骨から単離した（Ｓｅｙｅｄｉｎ、　Ｓ、Ｍ、ら、旦ｒｏｅ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８５）　８２：　２２６７−２２７ １；　５ｅｙｅｄｉｎ、Ｓ、Ｍ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、（１９８６）　 ２６１：　５６９３−５６９５；　５ｅｙｅｄｉｎ、Ｓ、Ｍ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、（１９８７）　２６ユ：　１９４６−１９４９）。

表１に示されるように、１４日回心、ＢＭＰ−２÷３（ピーク１物質）は、大量 の骨形成を誘導し、この実験におし１てはＴＧＦ−β２を有する場合と有さない 場合の両方において、アルカリホスファターゼ活性が増加した。一方、ＢＭＰ− ２↑３による軟骨の誘導は、ＴＧＦ−β２によって８しく刺激された。ＴＧＦ− β２を有さない０ＩＦ（ピーク２物１ｉｔ）は、完全に不活性であった。ＴＧＦ −β２を用いたとき、ＯＩＦ外植片は、表１に示されるように、時折、軟骨およ び骨の両方を示した。この発見は、いくつかのＢＭＰコンタミネーションが、い くつかのＯＩＦサンプル中に残存して（Ｘることを示唆している。ＢＭＰ−２＋ ３に付加されたＯＩＦは、ＴＧＦ−β２を有していても、または有していなくて も、回答効果を与えなかった。

（以下余白） 艮土　・ ＢＭＰ−２＋３およびＯＩＦのインビボにおける　活性ＢＭＰ−２＋３　微量　 ４．　Ｏ１５，４０１Ｆ　０　０　２．３ ＢＭＰ−２＋３１０ＩＦ　微量　３．２５　１１．８仁鉦≦し ＢＭＰ−２＋３　３．２５　４．ｓ　１２．５０１Ｆ　０．７５Ｃ０，７ＳＣ４ ，６Ｃ３ＭＰ−２＋３１０ＩＦ　３．０　４．７５　１０．７”ｏ−ｓ　（最高 ）のスケールで評価したｂμｍｏｌｅｓ　Ｉ）−エトロフェノール／分／ｇ湿重 量として表現した０４つのサンプルのうちの１つにおける活性を示した。

ＢＭＰ−２＋３の骨誘導活性の調節に対する、ＴＧＦ−β２の効果をさらに十分 に示すために、ＢＭＰ−２＋３の応答曲線をＴＧＦ−β２を有する場合と有さな い場合とで、１４日回心再び決定した。図５に示されるように、軟骨および骨の 形成を強化するＴＧＦ−β２の効果は、明臼である。ＴＧＦ−β２を有さない場 合、ＢＭＰ−２＋３は、ｌ　ｍｇ移植片当り２５　ｎｇまでのレベルで、実質的 に不活性であり、軟骨はすべてのレベルで存在しなかった。ＴＧＦ−β２を有す る場合、１　ｍｇ移植片当り１２．５ｎｇ以上のＢＭＰ−２＋３のレベルで、確 実に強化され、軟骨は、ｌａｇ移植片当り２５　ｎｇ以上で存在していた。

ＢＭＰ−２＋３によって誘導された軟骨内性骨形成における、上記の２つの実験 によって示される、ある一定時間でのデータは、ＴＧＦ−β２が初期の軟骨形成 を増加させ、軟骨退化および骨による置換の開始を遅らせていることを示唆して いる。ＴＧＦ−β１は、他の実験でも、同様の結果を示している。

ＦＩＧ、ｉ １７％５ＤＳ−ＰＡＧＥ ４３に− 一一番４５ １４．４Ｋ　− ユ吐久、へ４２９５−３９６ ＳＣＫＲＩ−ＩＰＬＹＶＤＦＳＤＶＧＷＮＤＶ／ＩＶＡＰＰＧＹＨＡＦＹＣＨＧ ＥＣＰＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴＮＨＡ　工ＶＬ９　：　ＨＰＬＹＶＤＦＳＤＶＧＬ ＮＤ−工ＶＡＰ−ＶＴＬ ＯＴＬＶＮＳＶＮＳに工ＰＫＡＣＣＶ装置ＳＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＷＬにＮ ＹＯＤＭＷＥＣ；ＣＧＣＦ！Ｌ６：　Ａ−ＮＶＰ置ＳＡＩＳＭＬＹＬＤＥ　Ｌ２ ：　ＮＹＱＤＭＷＥＧ−ＧＥＮＤＰＡ　ＤＱＰ　Ｌ　ＡＮ ヱド、残基　３６３−４７２ ０ＷＩＥＰＲＮＣＡＲＲＹＬ？ＣＶＤＦＡＤＩＧＷＳＥＷＩ　工ＳＰＫＳＦＤＡ ＹＹＣＳＧＡＣＯＦＰＭＰＫＳＬＫＰＳＮＨＡＬ３：　−ＩＥＰＲＮ−ＡＴＲＹ ＬＫ−ＤＰ−Ｇ−Ｄ　Ｌ４：　５ＦＤＡＹ−５ＧＡ−ＯＦ−ＯＰＡＤＥＬＦＥＩ ＴＩＯＳ工ＶＲＡＶＧＷＰＧＩＦ　ＥＰＣＣＶＰＥＫＭＳＳＬＳ　Ｉ　ＬＦＦＤ ＥＮＫＮＷＬＫＶＹＰＮＭＴＶＥＳＣＡＣＲＬ７：　ＭＳ−ＬＳＩＬＦＦＤＥＮ ＫＬＤＰＰＴＬ ＢＭＰ−２＋３．　ｎｇ／ｍｇ　Ｊ７ｙｇｔｔ）炙ヱＬ艷 骨形成タンパク質（ＢＭＰ　Ｓ）は、ＴＧＦ−βと相乗作用をして、向上した骨 形成活性を有する組成物が提供される。

これらの組成物を使用して、骨の欠陥を治療する方法、骨の成長を誘導する方法 および骨髄細胞の生産を増加する方法もまた開示される。

国際調査報告

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．軟骨および／または骨の欠陥を治療するための組成物であって、少なくとも １つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）および、少なくとも１つの腫瘍増殖因子（Ｔ ＧＦ）とを、共に組織成長を誘導する量含み、そして薬学上受け入れられるキャ リヤーまたは賦形剤を含む、組成物。
2. ２．前記ＢＭＰがＢＭＰ−２を含む、請求項１に記載の組成物。
3. ３．前記ＢＭＰがＢＭＰ−３を含む、請求項１に記載の組成物。
4. ４．前記ＢＭＰがＢＭＰ−２およびＢＭＰ−３を含む、請求項１に記載の組成物 。
5. ５．前記ＢＭＰがＢＭＰ−４を含む、請求項１に記載の組成物。
6. ６．前記ＢＭＰがＢＭＰ−７を含む、請求項１に記載の組成物。
7. ７．前記ＴＧＦがＴＧＦ−β１を含む、請求項１に記載の組成物。
8. ８．前記ＴＧＦがＴＧＦ−β２を含む、請求項１に記載の組成物。
9. ９．前記ＴＧＦがＴＧＦ−β２を含む、請求項４に記載の組成物。
10. １０．骨の成長を誘導するための骨形成組成物であって、少なくとも１つの骨形 成タンパク質（ＢＭＰ）および、少なくとも１つの腫瘍増殖因子（ＴＧＦ）とを 、共に骨成長を誘導する量含み、そして薬学上受け入れられるキャリヤーまたは 賦形剤を含む、組成物。
11. １１．前記ＢＭＰがＢＭＰ−２を含む、請求項１０に記載の組成物。
12. １２．前記ＢＭＰがＢＭＰ−３を含む、請求項１０に記載の組成物。
13. １３．前記ＢＭＰがＢＭＰ−２およびＢＭＰ−３を含む、請求項１０に記載の組 成物。
14. １４．前記ＢＭＰがＢＭＰ−４を含む、請求項１０に記載の組成物。
15. １５．前記ＢＭＰがＢＭＰ−７を含む、請求項１０に記載の組成物。
16. １６．前記ＴＧＦがＴＧＦ−β１を含む、請求項１０に記載の組成物。
17. １７．前記ＴＧＦがＴＧＦ−β２を含む、請求項１０に記載の組成物。
18. １８．前記ＴＧＦがＴＧＦ−β２を含む、請求項１３に記載の組成物。
19. １９．軟骨または骨の欠陥を有する個体を治療するための方法であって、 少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）および、少なくとも１つの腫瘍増 殖因子（ＴＧＦ）とを、共に組織成長を誘導する量含み、そして薬学上受け入れ られるキヤリヤーまたは賦形剤を含む組成物を、個体に投与する工程を包含する 、方法。
20. ２０．前記ＢＭＰがＢＭＰ−２を含む、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．前記ＢＭＰがＢＭＰ−３を含む、請求項１９に記載の方法。
22. ２２．前記ＢＭＰがＢＭＰ−２およびＢＭＰ−３を含む、請求項１９に記載の方 法。
23. ２３．前記ＢＭＰがＢＭＰ−４を含む、請求項１９に記載の方法。
24. ２４．前記ＢＭＰがＢＭＰ−７を含む、請求項１９に記載の方法。
25. ２５．前記ＴＧＦがＴＧＦ−β１を含む、請求項１９に記載の方法。
26. ２６．前記ＴＧＦがＴＧＦ−β２を含む、請求項１９に記載の方法。
27. ２７．前記ＴＧＦがＴＧＦ−β２を含む、請求項２２に記載の方法。
28. ２８．個体において骨髄細胞の生産を誘導するための方法であって、 少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）および、少なくとも１つの腫瘍増 殖因子（ＴＧＦ）とを、共に骨髄細胞成長を誘導する量含み、そして薬学上受け 入れられるキャリヤーまたは賦形剤を含む組成物を、個体に投与する工程を包含 する、方法。
29. ２９．前記ＢＭＰがＢＭＰ−２を含む、請求項２８に記載の方法。
30. ３０．前記ＢＭＰがＢＭＰ−３を含む、請求項２８に記載の方法。
31. ３１．前記ＢＭＰがＢＭＰ−２およびＢＭＰ−３を含む、請求項２８に記載の方 法。
32. ３２．前記ＢＭＰがＢＭＰ−４を含む、請求項２８に記載の方法。
33. ３３．前記ＢＭＰがＢＭＰ−７を含む、請求項２８に記載の方法。
34. ３４．前記ＴＧＦがＴＧＦ−β１を含む、請求項２８に記載の方法。
35. ３５．前記ＴＧＦがＴＧＦ−β２を含む、請求項２８に記載の方法。
36. ３６．前記ＴＧＦがＴＧＦ−β２を含む、請求項３１に記載の方法。