KR20040053137A - 자가 성장 인자 칵테일 조성물, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

자가 성장 인자 칵테일 조성물, 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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KR20040053137A
KR20040053137A KR10-2004-7004248A KR20047004248A KR20040053137A KR 20040053137 A KR20040053137 A KR 20040053137A KR 20047004248 A KR20047004248 A KR 20047004248A KR 20040053137 A KR20040053137 A KR 20040053137A
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밍 하오 젱
사무엘 에스. 아스쿨라이
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베리겐 아게
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Abstract

본 발명은, 성장 인자가 배양된 연골세포로부터 수득됨을 특징으로 하는, 골형성, 건형성 또는 연골형성의 치료를 위해 적합한 하나 이상의 성장인자를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

Description

자가 성장 인자 칵테일 조성물, 이의 제조 방법 및 용도 {AUTOLOGOUS GROWTH FACTOR COCKTAIL COMPOSITION, METHOD OF PRODUCTION AND USE}
대부분의 세포와 같이, 연골세포는 성숙 단계 및 분화 단계를 포함하는 생활 주기를 갖고 있다. 연골 세포는, 증식 동안에 전구연골모세포가 되는 중간엽 줄기 세포로서 생활을 시작할 수 있다. 이들 전구연골모세포는 분화/매트릭스 생성동안에 연골모세포가 된다. 이어서 연결모세포는 비대 또는 성숙 과정을 거쳐 연골세포가 된다.
발명의 요약
본 발명은, 골형성, 건형성 및/또는 연골형성의 치료용으로 적합한 하나 이상의 성장 인자를 함유하지만 이에 제한되지 않는 조성물에 관한 것이고 여기서, 성장 인자는 배양된 연골세포로부터 수득됨을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 대상체 기원의 연골세포를 배양하는 단계 및 연골세포의 배양액으로부터 하나 이상의 성장 인자를 농축시키는 단계를 포함하는, 성장 인자 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은, 조직 또는 결손체를 하나 이상의 성장 인자와 접촉시키는 단계를 포함하여, 골, 건 또는 연골 또는 이의 결손체를 치료하는 방법에 관한 것이고 여기서, 성장 인자는 배양된 연골세포로부터 수득됨을 특징으로 한다.
도 1은 자가 연골세포 이식을 사용한 연골 복구의 분자 대조표를 나타낸다.
도 2는 연골세포에서 성장 인자 및 전사 인자의 유전자 발현을 나타낸다.
도 3은 연골세포에서 성장 인자, 매트릭스 단백질 및 전사 인자의 유전자 발현을 나타낸다.
도 4는 연골세포에서 성장 인자, 매트릭스 단백질 및 전사 인자의 유전자 발현을 나타낸다.
도 5는 연골세포에서 RANKL 및 이의 수용체의 유전자 발현을 나타낸다.
도 6은 연골세포에서 스테로이드 호르몬 수용체의 유전자 발현을 나타낸다.
도 7은 농축되지 않은 대조군 샘플과 농축된 샘플간의 성장 인자들을 웨스턴 블롯으로 비교한 것이다.
도 8은 농축되지 않은 샘플과 농축된 샘플간의 성장 인자의 농도를 비교한 것이다.
도 9는 본 발명의 성장 인자를 사람 연골세포 배양물에 적용한 후의 연골 세포 배양물을 나타낸 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"이란 명시된 수치의 ±10%의 범위를 언급한다. 예를 들어, "약 20"은 20의 ±10%인 18 내지 22를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적인" 또는 "실질적으로"는 상당한 범위 또는 정도로 근접해있음을 의미한다.
연골세포는 다수의 기술을 사용하여 배양되어 왔다. 연골세포용 단층 배양, 연골세포용 콜라겐 겔 배양, 연골세포용 알기네이트 겔 배양 및 연골세포용 아가로스 겔 배양이 각각 보고되었다. 이들 세포는 아가로스 겔에서 배양동안에 세포외 단백질을 생산하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 한 양태에서, 배양물은 75cm2당 약 100만 세포의 평판(plating) 밀도를 가질 수 있다. 연골세포는 아스코르브산이 첨가된 10% 내지 20%의 자가 용액중에서 성장시킬 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 용도를 위한 연골세포에 적합한 성장 조건은, 참조문헌으로서 전반적인 내용이 본원에 인용되는 WO 제00/09179호 및 미국 특허 제5,989,269호에 제시되어 있다. 본 발명에 사용하기 위해 전형적인 세포 배양 방법을 제시하는 실시예 6 내지 10을 참조한다.
연골세포가 당해 배양 시스템내에서 세포의 형태학적 외관으로부터 생산하는 세포외 단백질 또는 성장 인자가 어떠한 유형인지를 결정하기란 어렵다. 따라서, 연골세포의 세포외 매트릭스 단백질 및 성장 인자의 생산을 촉진시키는 기술 및 방법을 개발할 필요가 있다. 추가로, 연골형성, 건형성 및 골형성의 유도와 연관된 특정 세포 집단에 의해 생산되는 성장 인자의 프로필을 동정할 필요가 있다.
많은 생물학적 화합물은 연골세포의 발육을 조절한다. 이들 화합물은 연골세포 및 특히, 연골세포의 단층 배양물로부터 추출되고/되거나 농축되어 연골, 건 및/또는 골 조직 및 결손체의 치료에 치료학적으로 사용될 수 있는 소위 성장 인자 "칵테일"이라는 성장 인자 조성물을 형성할 수 있다. 예를 들어, 한 양태에서, 본발명은, 정형외과 수술에서, 본 발명의 조성물로부터 수득되는, 추출되고/되거나 농축된 성장 인자의 용도를 포함한다.
추가로, 본 발명의 성장 인자 조성물은 척추, 둔부, 무릎, 어깨, 손목, 발목 및 손가락 뿐만 아니라 골절 고정 및 유착 불능 골절의 치료 및 골 시멘트, 인산칼슘, 황산칼슘, 하이드록시애퍼타이트 및 이의 배합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 시멘트 및 기타 자가 성장 인자와 같은 기타 제품에 사용하기 위한 과정 및 장치를 포함하는, 복원 과정 및 장치에 치료학적 가치를 가질 수 있다.
1. 성장 인자
연골세포 및 특히, 단층 배양된 연골세포는, 형질전환 성장 인자(TGF-β3), 골 형성 단백질(BMP-2), PTHrP, 오스테오프로테그린(OPG), 인디언 고슴도치, RANKL, 및 인슐린 유사 성장 인자(IgF1)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다수의 성장 인자의 생산 능력을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다.
한 양태에서, 기타 다른 것 뿐만 아니라 본 발명에 따른 성장 인자 조성물은 연골세포의 단층 배양물로부터 추출되어 하기에 기재된 바와 같이 치료학적 목적을 위해 사용될 수 있는 본 발명의 조성물을 구성할 수 있다. 추가로, 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 성장 인자 조성물은, 하기에 보다 상세하게 기재된 바와 같이, 치료 목적을 위해 사용될 수 있는 하나 이상의 실질적으로 집적되고/되거나 농축된 성장 인자를 함유하는 조성물을 구성하는데 적합한 성장 인자를 포함하는 조성물로부터 추출될 수 있다.
A) 성장 인자의 유도
한 양태에서, 본 발명의 성장 인자 조성물은, 자가 연골세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포로부터 유래한다. 당해 방식으로, 자가 연골세포로부터 유래하는 성장 인자의 프로필은 대상체의 성장 인자의 천연 프로필과 실질적으로 일치한다.
또 다른 양태에서, 대상체 성장 인자의 조성물의 특징은 처음에, PCT 출원 번호 PCT/IB02/02752(이의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다)에 기재된 기술 및 특히, 당해 PCT 출원의 실시예 1, 2 및 3에 기재되고 본원의 실시예 2, 3 및 4에서 반복된 기술을 사용하여 밝힌다. 또 다른 적당한 기술은 웨스턴 블롯 분석 및 대상체 성장 인자 프로필의 면역형광 특징 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일단 대상체 성장 인자 프로필의 특징이 적절하게 밝혀진 경우, 당해 프로필을 또 다른 시험 프로필과 비교하여, 치료될 세포 또는 조직에 대한 대상체 성장 인자 프로필과 실질적으로 일치하는 프로필을 갖는 적합한 성장 인자 조성물을 모색할 수 있다. 한 양태에서, 시험 프로필은, a) 비-자가 세포, b) 상이한 시점에서 대상체로부터 제거된 자가 세포 및/또는 c) 대상체 연골세포와는 상이한 형태를 갖는 자가 세포 기원의 성장 인자의 특징을 분석하여 유도될 수 있다. 또한, 프로필은, 재조합 DNA 기술, 즉, 성장 인자 단백질을 생산하는 미생물을 사용하고 이어서 당해 단백질을 혼합하여, 치료될 세포 또는 조직에 대한 대상체 성장 인자 프로필과 실실적으로 일치하는 프로필을 갖는 단백질 혼합물을 제조하여 합성될 수 있다.
또 다른 양태에서, 성장 인자 조성물은 하나 이상의 성장 인자 단백질을 첨가하거나 제거하여 변형시킴으로써 통상적인 프로필, 또는 대상체 프로필 또는 또 다른 목적하는 프로필과 실질적으로 일치할 수 있는 프로필을 갖는 조성물을 제조할 수 있다.
B) 성장 인자의 기능
상기된 성장 인자는 연골, 건 및 골 재생에 중요하다. 초기에, 배양된 연골세포의 세포 증식동안에, TGF-β3, BMP-2, PTHrP, 인디언 고슴도치, OPG, RANKL 및 IGF1이 존재한다. 기타 다른 것 뿐만 아니라 이들 인자들은 연골세포, 건세포 및 골모세포의 증식 및 분화 정도를 조절함으로써 연골형성, 건형성 및 골형성 프로그램에 영향을 미칠 수 있는 것으로 사료된다. 따라서, 본원에 기재된 성장 인자를 손상된 대상체에 적절히 투여하여, 연골세포, 건세포 및 골모세포가 관여해야만 하는 임의의 치유가 증대됨에 따라서 손상 또는 질환으로부터의 회복을 증진시킬 수 있다.
매트릭스 생성동안에, II형 콜라겐 및/또는 아그레칸 및 기타 매트릭스 물질은 매트릭스 생산 범위를 조절할 수 있다. 당해 조절은 세포 피드백에 의해 유지될 수 있는 것으로 사료된다. 특히, 성장 인자 및 사이토킨은 전사 인자를 조절하고 이어서 이것은 II형, IX 형 및 XI형 콜라겐, 아그레칸, CEP-68 및 GP 39와 같은 세포외 매트릭스 단백질의 생산을 조절하고 이어서 이것은, 예를 들어, 성장 인자 및 사이토킨의 세포외 농도를 감소시킴에 의해 성장 인자 및 사이토킨의 존재를 조절할 수 있다.
도 1은, 자가 연골세포 이식 후, 연골 복구에 대한 연골세포 계열의 특징 분석 및 분자 대조표를 나타낸다. 시험관내 증식 단계에서, 연골세포는 TGF-β3, BMP-2, PTHrP, 인디언 고슴도치, OPG 및 RANKL을 포함하지만 이에 제한되지 않는 성장 인자 및 사이토킨을 생산한다. 대상체에게 이식된 후, 연골세포가 매트릭스를 생성하기에 앞서, SOX-9, II형 콜라겐, 아그레칸 및 기타 세포외 매트릭스 단백질이 또한 생성된다. 매트릭스 생성 후, 비타민 D3를 포함하는 많은 인자가 연골세포 매트릭스의 성숙 또는 변형을 조절할 수 있다.
도 2는 단층 배양된 연골세포로부터의 성장 인자 및 전사 인자의 발현을 보여준다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 성장 인자 TGF-β3 및 BMP-2는 연골세포에서 발현된다. 또한, 전사 인자 SOX-9이 발현된다.
도 3은, SOX-9이 발현됨으로써, 매트릭스 단백질 CEP-68이 또한 발현됨을 보여주고 이것은 조사된 연골세포가 매트릭스 및 성장 인자를 생성할 수 있음을 암시한다.
도 4는 성장 인자 TGF-β3가 발현됨으로써 매트릭스 단백질 아그레칸 및 II형 콜라겐이 또한 연골세포에 의해 발현됨을 보여준다.
도 5는, 역전사 효소 PCR을 사용한 30회의 유전자 증폭 시점에서 RANKL 발현이 검출되지 않음을 보여준다. 그러나, 34회 시점에서 RANKL mRNA가 발견될 수 있고 이것은 RANKL이 발현될 수 있음을 지적한다. 추가로, 도 5는, RANKL의 세포 수용체, 즉 GADPH(글리세럴알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제) 및 OPG가 또한 연골세포에서 발현됨을 보여준다. 이들 데이타는 RANKL이 연골세포 성장을 위해 중요할 수 있음을 시사한다.
도 6은 스테로이드 호르몬 수용체 GADPH, GRα, GRβ및 VDR이 연골세포에서 발현됨을 보여준다. 이들 데이타는 하나 이상의 스테로이드 호르몬에 대한 연골세포의 반응이 연골세포의 성장인자 생성의 조절에 대한 경로를 제공할 수 있음을 시사한다. 가능한 적합한 스테로이드 호르몬은 비타민 D3 및 글루코코르티코이드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
따라서, 한 양태에서, 단층 배양물중의 연골세포는, 형질전환 성장 인자, 골 형성 단백질, PTHrP, 오스테오프로테그린, RANKL 및 인디언 고슴도치를 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 성장 인자를 생성할 수 있다. 이들 인자는, 본 발명의 방법에 의해 추출될 수 있고 이어서 대상체에 전달될 수 있는 성장 인자 "칵테일"을 형성한다. 본원에 기재된 바와 같이, 이들 성장 인자는 대상체 자신의 자가 연골세포로부터 수득할 수 있고 골, 건 및 연골 결손을 포함하지만 이에 제한되지 않는 조직의 치료를 위해 사용될 수 있다.
예를 들어, 연골 결손 치료용 자가 연골세포 이식 기술을 사용하여 연골세포는 시험관내에서 증식하고 성장 인자를 생산한다. 대상체에 이식 후, 연골세포는 매트릭스 생성 단계동안에 세포외 매트릭스 단백질의 생산을 개시할 수 있다. 연골세포에 의한 연골형성 과정은 전사 인자 SOX-9이 존재함을 특징으로 할 수 있다.
따라서, 상기된 정보로부터, 골, 건 및 연골 조직 및 결손체의 재생 및/또는 치유를 위해 적합한 매트릭스 단백질의 발현 및 생산을 유도하는 성장 인자의 발현 및/또는 존재 및 전사 인자의 발현간에는 뜻밖의 관계가 있음이 밝혀졌다.
2. 연골세포로부터 성장 인자의 분리
본 발명에서, 기타 다른 것 뿐만 아니라 본원에 기재된 하나 이상의 성장 인자는 배양된 연골세포의 배지로부터 추출되고/되거나 정제되어 치료 목적으로 사용될 수 있는 본 발명의 조성물을 구성할 수 있다. 추가로, 또 다른 양태에서, 상기된 성장인자는 배양된 연골세포로부터 농축되어 또한 치료 목적으로 사용될 수 있는 본 발명의 조성물을 구성할 수 있다.
한 양태에서, 본 발명에 따른 성장 인자는 혈청 및 기타 생물학적 유체로부터 소분자량의 분자를 제거하는데 사용될 수 있는 투석 여과에 의해 추출 정제 및/또는 농축될 수 있다. 본 발명에서, 투석 여과 또는 보다 일반적으로 "한외여과"는 농도 구배대신 수압을 사용하여, 연골세포 배양물, 바람직하게는 사람 연골세포 배양물의 상등액으로부터 상기된 바와 같은 성장 인자를 추출하고 농축하고/하거나 정제한다. 한 양태에서, 성장 인자 함유 상등액은, 먼저 제조원[Millipore/Amicon]에 의해 제조된 원심분리 여과 장치인 센트리플러스(Centriplus)?와 같은 원심분리 여과 장치에 세포 배양물을 로딩하여 세포 배양 물질이, 전형적으로 액체 및 고형상과 같은 상으로 분리되도록 함에 의해 수득된다.
세포 파쇄물(전형적으로 고형상)의 제거 후, 배양 상등액은 공극 크기가 바람직하게 약 5 내지 70kDa이고, 보다 바람직하게는 약 10 내지 30kDa인 하나 이상의 낮은 흡착성, 소수성 YMT 막[제조원(Millipore/Amicon)으로부터 시판됨] 또는분자체를 통과하도록 원심분리할 수 있다. 당해 상등액은 먼저, 전형적으로 약 70 내지 30kDa인 대형 여과기를 통과할 수 있다. 따라서, 거대 여과기로부터의 유출액은 전형적으로 약 5 내지 10kDa인 소형 여과기를 통과할 수 있다. 본 발명의 성장 인자는 전형적으로 대형 여과기(70 내지 30kDa)를 통과하고 전형적으로 소형(5 내지 10kDa) 여과기에 의해 보유되며 따라서 본 발명의 조성물은 크기가 약 70 내지 30kDa 및 약 5 내지 10kDa의 사이이고 바람직하게는, 약 30kDa 내지 약 10kDa 사이인 분자를 포함할 수 있다.
본 발명의 몇몇 성장 인자는 서로 결합함으로써 대형 분자를 형성할 수 있음을 주지해야만 한다. 따라서, 대형 여과기의 유출액 및 이어서 소형 여과기의 잔류물로부터 수득되는 본 발명의 조성물은 크기가 대형 여과기의 공극 크기보다 큰 분자를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 하나 이상의 성장 인자를 함유하는 상등액을 상기된 여과기를 통해 여과한 후, 본 발명의 조성물은, 크기가 약 50kDa 내지 약 5kDa이고, 몇몇 양태에서 약 70kDa 내지 5kDa인 분자를 포함할 수 있다.
소형 공극 크기 여과기에 의해 보유되는 용질은, 본 발명의 성장 인자를 포함하는 농축된 단백질로서 추가로 사용하기 위해 수거될 수 있다. 당해 방법에 의해, 크기가 12kDa인 성장 인자, 예를 들어, TGF-β3의 농도는 도 7의 웨스턴 블롯의 결과에 의해 나타난 바와 같이 대조군(농축되지 않은 상등액)과 비교하여 증가한다. 도 7에서, 상등액을 여과하는데 사용되는 2개의 여과기의 공극 크기는 10kDa(YK10) 및 30kDa(YK30)이다.
전형적으로, 추출 및/또는 농축을 위한 원심분리는, 약 2000 x g 초과, 바람직하게는 약 3,000 x g 의 원심분리 속도에서 약 15℃ 미만, 바람직하게는 약 4℃에서 약 2 내지 8시간, 바람직하게는 약 4시간동안 수행할 수 있다.
또 다른 양태에서, 시판되는 생물 반응기를 사용하여 배양 배지를 수거하고 성장인자를 추출하고/하거나 농축시켜 본 발명의 조성물을 형성할 수 있다. 당해 생물 반응기는 2002년 8월 27일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제60/406224호[발명의 명칭: "Bioreactor with Expandable Surface Area for Culturing Cells"]에 기재되어 있고 당해 문헌의 내용은 본원에 참조로서 인용된다. 한 양태에서, 생물 반응기는 용기, 용기내 담체, 유입기, 유출기 및 진탕기를 포함한다. 담체는 세포가 배양되는 즉시 팽창가능한 표면적을 포함할 수 있다.
생물 반응기의 한 양태에서, 담체의 표면적은 가역적으로 팽창가능하고 즉, 당해 표면적은 팽창하고 나서 본래의 표면적으로 다시 감소한다.
생물 반응기의 한 측면에서, 가역적으로 팽창가능한 담체는, 임의로 집중 경계선인 다수의 제거가능한 경계선을 갖고 있는 조직 배양 플레이트이고 이의 표면적은, 세포 증식으로 인해 표면적이 최적이하가 됨에 따라 경계선을 제거함으로써 증가된다. 경계선의 형태는 규칙적이거나 불규칙한 형태일 수 있고, 예를 들어, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 원형, 선형 또는 비선형일 수 있다.
상기된 방식 또는 또 다른 적합한 방식으로 추출되고/되거나 농축된 당해 조성물은 하나 이상의 하기 성장 인자를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다: TGF-β3, BMP-2, PTHrP, OPG, 인디언 고슴도치, IgF1 및 RANKL. 성장 인자는 임의의 치료학적 유효 농도로 농축될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "치료학적유효량"이란 목적하는 조직을 성장시키는데 효과적인 양을 언급하고 이것은 조직내 결손을 복구시키고/시키거나 본원에 기재된 질환의 증상 및 특정 조직 또는 결손과 연관된 증상을 감소시키거나 제거하거나 치료하거나 예방하거나 조절하는 양이다.
한 양태에서, 예를 들어, TGF-β3와 같은 하나 이상의 성장 인자는 농축된 상등액중에 약 5ng/ml의 초과, 보다 바람직하게는 약 15ng/ml 초과하는 양으로 존재할 수 있다. 몇몇 양태에서, 성장 인자는 약 1ng/ml 내지 15ng/ml, 보다 바람직하게는 약 5ng/ml 내지 15ng/ml로 존재할 수 있다. 비교 목적을 위해, 농축 전 상등액중의 성장인자의 농도는 도 8에 나타낸 바와 같이 약 1ng/ml이하일 수 있다.
3. 치료학적 적용
한 양태에서, 본 발명의 성장 인자 조성물의 사용은, 본 발명의 성장 인자 조성물을 손상된 신체 기관, 조직 또는 구조물과 접촉시키는 단계 및 특히, 본 발명의 조성물을 골, 건 또는 연골을 포함하지만 이에 제한되지 않는 조직과 접촉시키는 단게를 포함한다.
또 다른 양태에서, 성장 인자 치료법은 본 발명의 조성물을 , 골, 건 또는 연골을 포함하지만 이에 제한되지 않는 조직내 결손과 접촉시키는 단계를 포함한다. 결손은 손상 또는 기타 외상뿐만 아니라 노화로 인한 퇴화로부터 비롯된 것일 수 있다. 본 발명을 적용함으로써, 당해 결손에 대한 치유 효과는 결손 부위에서 연골형성, 건형성 및/또는 골형성 속도의 증가를 유도하여 증진될 수 있다. 추가로, 시험관내에서, "칵테일" 농축된 성장 인자의 사람 연골세포 배양물로의 적용은 도 9에 나타낸 바와 같이 연골세포 증식을 증가시킴을 보여준다. 특히, 1:50의 잔류 희석액이, YK10 및 YK30 여과기 둘다에 있어서, 약 48시간 후 효과적인 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 성장 인자 조성물은 다양한 정형 외과 증상에서 복원 장치, 골 대체, 골절 고정 및 골, 건 및 연골 재생의 유도와 함께 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명의 성장 인자 조성물은 척추, 둔부, 무릎, 어깨, 손목, 발목 및 손가락에 사용하기 위한 복원 장치 및 과정, 골절 고정 및 유착 불능 골절, 및 기타 골, 건 및 연골 결손의 치료에서 치료학적 가치를 가질 수 있다.
하나 이상의 골연골 결손을 치료하기 위해, 본 발명의 자가 성장 인자 "칵테일"은, "골 지지체" 물질, 인산칼슘 비계, 하이드록시애퍼타이트, 황산칼슘 또는 콜라겐 혼성물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비계 담체와 부분적으로 또는 완전히 혼합될 수 있다. 성장 인자 "칵테일"은, 연골하골상의 연골 결손을 복구할 수 있는, 제조원[Verigen Transplantation Services International, of Leverkusen, Germany]으로부터 시판되는 매트릭스 유도 자가 연골세포 이식(MACITM)과 같은 기타 통상적인 치료법과 비교하여, 연골하 구역내에서 골 형성을 유도할 수 있다.
골 결손을 치료하기 위해, 성장 인자 "칵테일"은 상기된 바와 같이 비계에 로딩될 수 있고 결손이 척추상에 또는 그 근방에 위치하는 경우, 풍선 기술을 포함하지만 이에 제한되지 않는 기술을 사용하여 결손 부위로 이식될 수 있다.
추가로, 본 발명은 관절 연골 또는 회전근 개 건 복구를 포함하지만 이에 제한되지 않는 연골, 골 또는 건 복구를 위한 콜라겐 비계와 조합하여 사용될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명의 성장 인자 조성물은 미국 특허원 제10/121,449호(2002년 4월 12일자로 출원됨)(이의 내용은 참조로서 본원에 인용된다)에 기술된 바와 같이, 콘드로-가이드(Geistlich, Switzerland), 소장 점막하(SIS) 막(DePuy Orthopaedics)과 같은 생체재료 비계와 함께 사용될 수 있다.
골 시멘트를 포함하지만 이에 제한되지 않는 시멘트 및 기타 자가 성장 인자와 같은, 본 발명의 조성물을 포함하는 기타 제품은 또한 본 발명의 범주내에 있다. 당해 조성물은 골형성, 건형성 및 연골형성을 증진시키기 위한 특정 용도에 사용될 수 있다.
4. 투여량
치료에 요구되는 본 발명에 다른 성장 인자 조성물의 양은 투여 수단, 표적 부위, 대상체의 생리학적 상태 및 투여될 기타 성장 인자 및 약물을 포함하는 많은 상이한 인자에 따라 다양하다. 따라서, 치료 투여량은 안정성 및 효능을 최적화하도록 적정되어야만 한다. 전형적으로, 시험관내 사용되는 투여량은 당해 시약의 동일계 투여용으로 유용한 양에 대한 유용한 지침을 제공할 수 있다. 특정 장애의 치료를 위한 유효량에 대한 동물 시험을 통해 사람 투여량을 추가로 가늠해볼 수 있다. 전반적인 내용이 본원에 참조로서 인용되는, 문헌[참조: Gilman, et al.(eds), Goodman and Gilman's: The pharmacological Basis of Therapeutics,8th ed., Pergamon Press(1990); and Remington's Pharmaceutical Science, 7th Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. (1985)]에 기재된 사항을 다양하게 고려한다.
본 발명의 성장 인자 조성물은 하루 체중 kg당 약 0.001mg 내지 약 10mg/kg의 투여 범위로 투여되는 것이 유용하다. 또한, 몇몇 경우에, 0.0001mg/kg 내지 약 10mg/kg이 또한 투여될 수 있다. 사용되는 특정 용량은 치료될 특정 조직 조건, 투여 경로 및/또는 증상의 중증도, 연령 및 대상체의 일반적인 상태등과 같은 인자에 따라 담당의사의 판단하에 조절된다.
5. 대상체 및 징후
본원에 사용된 바와 같이, 대상체는, 골, 연골 및/또는 건 손상 또는 결손을 포함하지만 이에 제한되지 않는 정형 외과 증상을 앓고 있는 모든 개인이다.
하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된다. 그러나, 본 발명은 이들 실시예에 기재된 특정 조건 또는 세부사항으로 제한되지 말아야 하는 것으로 이해되어야 한다. 명세서 전반에 걸쳐, 미국 특허를 포함하지만 이에 제한되지 않는 대중에게 공개된 문헌에 대한 모든 참조문헌은 특이적으로 참조로서 인용된다.
실시예 1 - 본 발명의 성장 인자 조성물과 배합된 골 대용물
본 발명의 유효량의 농축된 성장 인자는, 물질 및 성장 인자를 대상체에게 투여하기 전에, 물질에 적절한 유형의 믹서로 기재된 물질과 배합할 수 있다.
제1 골 대용 물질은 제조원[Biomet Merk with the address Fruiteniersstrasst 23, Postbus 1138, 3330 CC Zwijndrecht, The Netherlands]에서 제조된 엔도본(Endobon)?, 특히, 골 이식 대용물로서 사용하기에 적합한 하이드록시애퍼타이트 세라믹(HA 세라믹)을 포함한다. 당해 물질은 생물 기원이고 골전도성이다. 이식 즉시, 세라믹의 상호 연결 공극 시스템으로 인해 새로운 골이 세라믹으로 직접 성장할 수 있다. 엔도본?은 골절, 골낭, 관절 고정 및 골 종양의 골 결손을 밀봉하는데 사용될 수 있다.
제2 대용 물질은 또한 제조원[Biomet Merk]으로부터 제조되는 바이오본(Biobon)?및 체온에서 흡열적으로 경화되는, 재흡수성인 합성 미세결정 인산칼슘 시멘트를 포함한다. 골 결손의 충전 또는 복원을 위해 사용될 수 있다. 인산칼슘 분말 및 식염수를 적당히 혼합한 후에, 수득한 호상제를 대상체에 적용할 수 있고 바이오본?은 골 결손 형태로 경화될 수 있다. 셋팅 후, 이의 화학적 조성물 및 결정 구조는 천연 골의 인산칼슘 성분과 필수적으로 동일한 것으로 나타날 수 있다.
실시예 2 - RT-PCR을 사용한 연골세포의 특성 분석
연골세포 분화에 따른 여러 마커에 대해 RT-PCR을 수행하고 콜라겐 I(진뱅크 승인 번호 제XM 012651호), 콜라겐 II(진뱅크 승인 번호 제L 10347호), 아그레칸(진뱅크 승인 번호 제XM 083921호), SOX-9(진뱅크 승인 번호 제XM 039094호), BMP-2(진뱅크 승인 번호 제NM 001200호), TGF-베타-3(진뱅크 승인 번호 제NM 003239호), Cbfa-1, PTHrP(진뱅크 승인 번호 제M 57293호, 제M 32740호), 알칼린포스파타제(진뱅크 승인 번호 제XM 001826호) 및 인디언 고슴도치를 포함하는 이들 마커의 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 PCR 프라이머를 제조한다. 프라이머 및 PCR 조건은 각각 표 1 및 표 2에 나타낸다.
총 RNA는 제조업자의 지침(Ambion Inc., Austin, TX)에 따라 RNA졸 용액을 사용하여 연골세포 배양물로부터 분리한다. RT-PCR을 위해, 일본쇄 cDNA는 올리고-dT 프라이머와 함께 역전사 효소(Promega, Sydney Australia)를 사용하여 총 2㎍의 RNA로부터 제조한다. 각각의 cDNA 2㎍은, 1 x PCR 완충액중의 프라이머 0.4mM/L, dNTP 125μM/L 및 총 25㎕의 용적의 물과 함께 1.0 유니트의 Taq 폴리머라제(Promega, Sydney Australia)를 사용하여 30회의 PCR에 적용한다(표 2 참조). DNA 열 순환기(모델 2400; 퍼킨-엘머)에서 증폭시킨다.
특정 프라이머 서열은 대상 유전자의 분리된 엑손으로부터 선별하여 게놈 DNA 시그날의 오염을 방지한다. 소프트웨어 프로그램(인터넷 주소: http://genzi.virus.kyoto-u.ac.jp/cgi-bin/primer3.cgi)을 사용하여 프라이머가 디자인되었고 겐셋 올리고스[Genset Oligos(Australia)](인터넷 주소: http://www.gensetoligos.com/australia)에 의해 합성되었다(표 1 참조). 내부 대조군으로서, 글리세럴알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)를 암호화하는 관리 유전자(housekeeping gene)의 특정 프라이머를 사용하여 일본쇄 cDNA를 25회 동안 PCR 증폭시킨다. PCR 생성물은 아가로스 겔 1.5%상에서 전기영동하고 에티디움 브로마이드로 염색한다.
0프라이머 서열 어닐링 온도 단편 길이
COL1FCOL1R GGTGCTAAAGGCGAACCTGG (서열 1)ACCAGCAGGACCAGTCTCAC (서열 2) 60℃ 750bp
COL2FCOL2R GTCATTTCCTTGTGCTCTCC (서열 3)ATGGGCAGCAGTGTTTCTCC (서열 4) 58℃ 384bp
AGGFAGGR GCATTCTGGATTTCTGGACC (서열 5)AGGTTAGCTTCGTGGAATGC (서열 6) 58℃ 492bp
Sox9FSox9R GAGCGAGGAGGACAAGTTCC (서열 7)GGTGGTCCTTCTTGTGCTGC (서열 8) 58℃ 320bp
BMP2FBMP2R AACGGACATTCGGTCCTTGC (서열 9)GGTGATAAACTCCTCCGTGG (서열 10) 57℃ 557bp
TGF3FTGF3R ACCGAGTCGGAATACTATGC (서열 11)GTCGGAAGTCAATGTAGAGG (서열 12) 58℃ 691bp
CBFFCBFR GACTGTGGTTACTGTCATGG (서열 13)GGTGGCAGTGTCATCATCTG (서열 14) 52℃ 958bp
PTFPTR CCTCCCATTTGCTAAGGTGC (서열 15)CAATCCTGCTGGTAGGGTTC (서열 16) 58℃ 1597bp
APFAPR GAAGCTCAACACCAACGTGG (서열 17)TCTTCCAGGTGTCAACGAGG (서열 18) 55℃ 641bp
IHFIHR TGCATTGCTCCGTCAAGTCC (서열 19)AGTACAGCAGTTCCAGGAGG (서열 20) 55℃ 657bp
프로토콜, 1X 반응 혼합물
10 x PCR 완충액 2.5㎕
dNTP(5mM) 2.0㎕
센스 프라이머(∼15 내지 25μM) 0.5㎕(최종 농도 0.3 내지 0.5μM)
안티센스 프라이머(∼15 내지 25μM) 0.5㎕
ddH2O 17.0㎕
DNA 폴리머라제 0.5㎕
cDNA 2.0㎕
총계 25.0㎕
사용되는 사이클 조건:
94℃ 3분
94℃어닐링72℃ 1분1분35회1분
72℃ 7분
4℃ 정지
실시예 3 - 웨스턴 블롯 분석을 사용한 연골세포의 특징 분석
II형 콜라겐, 아그레칸 및 S-100 단백질, 및 기타 단백질을 포함하는 연골세포에 대한 몇몇 마커를 사용하여 웨스턴 블롯 분석을 통해 배양된 연골세포의 특징을 밝힐 수 있다. 당해 마커에 대한 항체는 예를 들어, 제조원[Sigma(St. Louis, MO),Dako(Austrailia) and R&D Systems(Minneapolis, MN)]으로부터 시판되고 있다.
연골세포의 웨스턴 블롯 분석을 위한 재료 및 방법은 지금 상세하게 기재한다.
약 103내지 104의 배양된 연골세포를 수거하고 이들을 펠렛으로 원심분리하여 세포를 용해한다. 상등액을 축출하고 펠렛을 NET-겔 용해 완충액(Quagen GmbH, Germany) 250㎕중에 재현탁시키고 빙상에서 20분동안 항온처리한다. 피펫을 사용하여 세포 파쇄물 및 용해 완충액을 1.5ml 에펜도르프TM튜브에 이동시키고 4℃에서 2분동안 12000g에서 원심분리한다. 상등액을 새로운 튜브로 이동시키고 SDS-PAGE 겔을 상등액에 적용한다. 30V(40mA)에서 하루밤동안 미니 트랜스-블롯 전기영동 이동 셀(Bio-Rad, California, USA)을 사용하여 하이본드 TMC 0.45㎛ 니트로셀룰로스 막(Amersham, Piscataway, NJ)에 겔을 이동시킨다. 2ℓ의 물중의 글라이신 7.57g, 트리스 369g 및 메탄올 400ml을 함유하는 이동 완충액의 존재하에 이동시킨다[문헌참조: Sambrook et al. 1989, In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York]. 웨스턴 블롯에 대한 표준 프로토콜은 예를 들어, 본원에 참조로서 인용되는 문헌[Sambrook et al.(1989, In: Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) and Ausubel et al.(1997, In: Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York)]에 기재되어 있다.
변성 및 재생 단계
구아니딘-HCl(G-HCl)의 농도가 6M, 3M, 1M 및 0.1M인 4개의 용액을 제조한다. 표 3은 본 단계에 사용되는 G-HCl 용액을 제조하기 위한 세부사항을 제공한다.
G-HCl 용액을 제조하는 경우, 모든 성분은 새롭게 제조해야만 한다. 밀크 분말을 기타 성분에 첨가하기전에 물에 용해시켜 G-HCl 용액중에 최종 농도가 2% 밀크가 되도록 한다. 실온에서 6M G-HCl, 3M G-HCl, 1M G-HCl 및 0.1M G-HCl로 각각 1회씩 세척당 30분동안 4회 막을 세척한다. 이어서 막을 4℃에서 밤새, 친화성 크로마토그래피(AC) 완충액 및 2% 밀크 분말로 세척한다.
AC 완충액은 하기와 같이 제조한다:
50mL의 글리세롤(최종 10% 글리세롤),
10mL의 5M NaCl(최종 100mM NaCl),
10mL의 1M 트리스, pH 7.6(최종 20mM 트리스),
1mL의 0.5M EDTA(최종 0.5mM의 EDTA) 및
5mL의 10% 트윈-20(최종 0.1% 트윈-20)을 빙상에서 첨가한다.
6M 3M 1M 0.1M 2% 밀크 분말
글리세롤 2.5mL 2.5mL 2.5mL 2.5mL 2.5mL
5M NaCl 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL
1M 트리스(pH 7.5) 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL 0.5mL
0.5M EDTA 0.05mL 0.05mL 0.05mL 0.05mL 0.05mL
10% 트윈-20 0.25mL 0.25mL 0.25mL 0.25mL 0.25mL
8M 구아니딘 18.75mL 9.30mL 3.13mL 0.31mL ---
밀크 분말 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g 0.5g
DdH20 2.45mL 12.82mL 18.07mL 20.89mL 21.20mL
1M DTT(최종) 25㎕ 25㎕ 25㎕ 25㎕ 25㎕
총 용적 25mL 25mL 25mL 25mL 25mL
세척 및 차단 단계
이어서 막을 5분동안 1X TBS-트윈으로 5분동안 2회 세척함에 이어서 5분동안 AC 완충액으로 1회 세척한다. 이어서, 2% 탈지유 및 1X TBS-트윈으로 제조된 차단 용액과 실온에서 1시간동안 막을 항온처리함에 이어서 1X TBS-트윈으로 5분동안 2회 세척한다.
대상 단백질에 대한 탐침
탐침 반응 혼합물(단백질 프로브 50㎕ 및 1M DTT 20㎕를 갖는 20 1x TBS-트윈중의 2% 탈지유)를 막에 첨가하고 4℃에서 4시간동안 항온처리하고 이어서 4℃에서 각각 5분동안 1X TBS 트윈으로 2회 세척한다. 단백질 프로브는 대상 단백질에 대한 항체이다. 이 경우에, 단백질 프로브는 TGF-베타-3에 대한 항체이다. 이어서 막을 4℃에서 15분동안 1X TBS 트윈중에 2% 탈지유 10ml로 다시 세척하고 이어서 4℃에서 20분동안 1X TBS 트윈으로 2번째 세척한다.
제1 항체의 첨가
막을, 진탕기를 사용하여 1X TBS-트윈 완충액중에서 각각 5분동안 2회 이상 세척한다.
1X TBS-트윈 및 1% 탈지유(0.2g)를 함유하는 20mL의 튜브를 제조하고 제1 및 제2 항체를 위해 2개의 10ml의 튜브에 적정한다. 항 V5 항체 1㎕를 제1 항체에 피펫 첨가하여 최종 희석 비율이 1/10000이 되게 하고 약하게 혼합한다. 제1 항체 용액을 막에 붓고 실온에서 2시간동안 진탕기상에서 항온처리한다. 또한, 항체 용액을 4℃에서 밤새 항온처리할 수 있다.
제2 항체의 첨가
항온처리 후, 각각 5분동안 1 x TBS-트윈으로 3회 세척한다.
5㎕의 제2 항체(항 마우스 IgG-Fab)를 제2 항체의 최종 희석비가 1/2000이 되도록 제2 항체 용액에 피펫 첨가하고 약하게 혼합한다. 제2 항체 용액을 막에 붓고 진탕기상에서 실온에서 45분동안 항온처리한다.
검출 용액의 첨가
제2 항체 용액과 항온처리한 후, 진탕기상에서 각각 5분동안 1xTBS-트윈으로 2회 세척한다. 진탕기상에서 1X TBS으로만 각각 5분동안 2회 이상 세척한다.
루미겐 검출 용액 A 2ml과 루미겐 검출 용액 B(ECL plus, Sydney, Austrailia) 50㎕를 혼합하여 검출 용액을 제조하고 막이 검출용액으로 균일하게 확실히 피복되도록하면서 막에 첨가한다. 과량의 검출 용액을 버리고 랩이 확실히 주름지지 않도록 하면서 막을 플라스틱 랩에 밀봉한다. 막을 필름 프레임내 필름 조각상에 위치시키고 약 30분동안(노출시간은 다양하다) 노출시키고 이어서 현상한다.
상기된 방법을 사용한 결과는 배양된 연골세포에 TGF-베타-3이 검출됨을 입증한다.
실시예 4- 면역조직화학 분석 및 면역형광 분석
웨스턴 블롯 분석과 유사하게, II형 콜라겐, 아그레칸 및 S-100 단백질을 포함하는 연골세포에 대한 여러 마커를 사용하여 면역조직화학 및 면역형광에 의해 배양된 연골세포의 특징을 밝힐 수 있다. 이들 방법은 MACI?(매트릭스 유도된 자가 연골세포 이식)의 연골세포에 직접 사용할 수 있다.
당해 재료 및 방법은 지금 기재한다.
MACI?막상의 연골세포는 5% 파라포름알데하이드 용액으로 고정하고 직접 면역형광시킨다. 또한, 연골세포는 고정후 파라핀 봉입할 수 있다. 이어서 연골세포는 0.2M 트리스-완충 식염수(TBS)중에서 세척하고 35% 과산화수소(H2O2)중에서 항온처리하여 내인성 퍼옥시다제에 대해 차단된다. 이어서, 세포는 20%의 정상 말 혈청으로 전처리하고 제1 항체와 항온처리한다. 세포를 TBS로 세척하고 제2 항체(접합될 수 있는)와 항온처리한다. 스트렙트아비딘과 접합된 퍼옥시다제를 검출하기 위한 3'3'-디아미노벤즈이딘과 같은 색 반응 검출 시스템을 사용하여 연골세포 마커를 검출한다.
상기된 방법을 사용하여, 면역형광에 의해 검출된 바와 같이 콜라겐 막상에서 배양된 연골세포내에 TGF-베타-3이 발현됨을 입증한다.
실시예 5
자가 이식된 연골 또는 연골세포로의 혈관 형성을 막기 위해수르지셀(Surgicel)?이 본 발명에 따라 사용될 수 있도록 하기 위해, 수르지셀?은 먼저 글루타릭 알데하이드와 같은 고정제로 처리한다. 간략하게, 수르지셀?은 1분동안 글루타릭 알데하이드 0.6%로 처리하고 이어서 수회 세척하여 조직에 독성일 수 있는 글루타릭 알데하이드 잔기를 제거한다. 또한, 수르지셀?은 실시예 2에 기재된 바와 같이 글루타릭 알데하이드로 처리하기 전에 티셀(Tisseel)?로서 불리우는 피브린 접착제로 처리한다. 예를 들어, 글루타릭 알데하이드와 같은 고정화제로 처리되고 멸균 생리 식염수(0.9%)로 세척되며 냉장고에 보관된 수르지셀?은 1 내지 2개월동안 용해되지 않는 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 수르지셀?은 7일 내지 14일의 기간동안 재흡착된다. 이식된 연골세포가 고형 연골층으로 성장하기 전에, 골 구조로부터 이식된 연골로의 혈관의 발육 또는 혈관 형성을 예방하는데 오랜 시간이 요구되기 때문에 당해 시간은 너무 짧다. 다른 말로, 혈관 형성을 충분히 억제하기 위해서는 예를 들어, 1개월정도의 긴 시간을 요구한다. 따라서, 생성물은 그 시간전에 상당히 흡착되지 말아야 한다. 한편, 재흡착이 궁극적으로 요구된다. 따라서, 억제 차단벽으로서 사용되는 유기 물질은 이들 능력을 갖고 있고 당해 방식으로 처리된 수르지셀?이 당해 기능을 제공한다.
실시예 6
수르지셀?은 또한 유기 아교로 피복한다. 본 실시예에서, 사용되는 아교는티셀?이지만 기타 다른 것이 또한 사용될 수 있다. 수르지셀?과 함께 당해 생성물은 본 발명의 특정 목적을 위해 사용가능한 차단벽을 생성한다. 임의의 기타 지혈제 또는 혈관 억제 차단벽이 사용될 수 있다. 티셀?은 하기에 기재된 바와 같이 혼합된다. 이어서 수르지셀?은 티셀?을, 적셔질때까지 수르지셀?물질상에 양 측면에서 분무하여 티셀?로 피복한다. 티셀?(피브린 아교)는 이어서 실온에서 경화되도록 방치한다. 완전히 경화되기 전에 즉시, 피복된 수르지셀?을 1분동안 0.6%의 글루타릭 알데하이드중에 첨가하고 이어서 멸균 생리(0.9%) 식염수로 세척한다. 이어서 pH를 PBS 및/또는 NaOH로 조정하여 pH가 7.2 내지 7.4로 안정하게 유지되도록 한다. 이후에, 처리된 수르지셀?은 이어서 15mM 헤페스 완충액을 함유한 최소 필수 배지/F12와 같은 조직 배양 배지로 세척한다.
당해 실시예에 언급된 바와 같이, 본 발명자는 피브린 접착제로서 티셀?을 사용하여 수르지셀?을 피복시켰다. 추가로, 피브린 접착제 또는 아교는 또한 골 방향의 병변 기저상에 직접 적용할 수 있고 이의 위에 수르지셀?이 접착된다. 생체내 시험과 연계하여 사용되는 시험관내 시스템은 세포 연구용 눈클론(NUNCLON)TM델타 6-웰 멸균 1회용 플레이트[NUNC, InterMed,Roskilde, Denmark]로 이루어진다. 각각의 웰은 직경이 약 4cm이다.
본 발명에서, 피브린 접착제는 사람에게 허용될 수 있는, 피브린 성분과 함께, 아교를 생성하는 임의의 접착제일 수 있다[문헌참조: Ihara, N, et al., Burns Incl. Therm. Inj., 1984, 19,, 396]. 본 발명은 또한, 피브린 접착제와 연계하여 사용될 수 있는 임의의 기타 아교 성분을 고려한다. 본 발명에서, 본 발명자는 티셀?또는 티수콜(Tissucol)?(Immuno AG, Vienna, Austria)을 사용한다. 티셀?키트는 하기의 성분으로 이루어진다:
티셀?, 응고성 단백질인 피브리노겐, 혈장 피브로넥틴(CIG) 및 인자 XIII 및 플라스미노겐을 함유하는 동결건조된 바이러스 불활성화된 밀봉제,
아프로티닌 용액(소),
트롬빈 4(소),
트롬빈 500(소),
염화칼슘 용액.
티셀?키트는 두플로젝트(DUPLOJECT)?응용 시스템을 포함한다. 티셀?키트를 사용한 피브린 접착제 또는 2개의 성분 밀봉제는 면역 AG 생성물 삽입 쉬트에 따른 하기의 방식으로 조합된다.
실시예 7
연골세포는 37℃에서 CO2배양기로 HAM F12 및 15mM 헤페스 완충액 및 5 내지 7.5% 자가 혈청을 함유한 최소 필수 배양 배지에서 성장시키고 기관[VerigenEurope A/S, Symbion Science Park, Copenhagen, Denmark]의 클래스 100 연구소에서 취급한다. 배양 배지의 또 다른 조성물이 연골세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 세포는 5 내지 10분동안 트립신 EDTA를 사용하여 트립신 처리하고 버커-터크(Burker-Turk) 챔버에서 트립판 블루 생존력 염색을 사용하여 계수한다. 세포수는 ml당 7.5 x 105의 세포로 조정한다. 하나의 눈클론TM플레이트를 클래스 100 연구소에서 개봉한다.
수르지셀?지혈 차단벽을 적합한 크기로 절단하여 눈클론TM조직 배양 트레이에 웰의 기저에 맞도록 한다. 당해 경우에, 대략 직경이 4cm인 환을 무균 조건하에 절단하고 세포 연구(NUNC, InterMed, Roskilde, Denmark)용 눈클론TM델타 6-웰 멸균 1회용 플레이트내 웰의 기저상에 위치시킨다. 웰의 기저상에 위치한 지혈 차단벽은 실시예 1에 기재된 바와 같이 전처리한다. 당해 처리는 수르지셀?의 흡착을 상당히 지연시킨다. 이러한 지혈 차단벽은, 미반응된 글루타르알데하이드가 세척 방출될때까지 증류수에서 수회 세척한다. 혈청을 함유하는 소량의 세포 배양 배지는 지혈 차단벽에 흡수되어 지혈 차단벽이 웰의 기저에서 습윤되어 있도록 적용한다.
1ml의 배양 배지에 약 106세포를 지혈 차단벽 상부에 직접 위치시키고 상기된 바와 같이 0.4% 글루타르알데하이드로 전처리된 지혈 차단벽 표면에 분산시킨다. 이어서 플레이트를 37℃에서 60분동안 CO2배양기에서 배양한다. 5 내지 7.5%의 혈청을 함유하는 2 내지 5ml의 조직 배양 배지를, 세포를 함유하는 웰에 주의깊게 첨가하여 배지를 축출할때 웰의 측면에 피펫 말단이 접하도록 유지하여 세포가 튀지않도록 한다. 배지의 pH는 매우 낮은(pH 약 6.8) 것으로 나타난다. 이어서, pH는 7.4 내지 7.5로 조정한다. 다음날, 몇몇 연골세포가 지혈 차단벽상에서 성장하기 시작하여 클러스터로 배열된다. 몇몇 세포는 pH 조정전에 낮은 pH에 노출되어 죽는다. 당해 플레이트는 3일째에 배지를 교환하여 3 내지 7일동안 배양한다.
배양 시기 말에, 배지를 버리고 디메틸아르신산의 0.1M 나트륨 염(또한, 나트륨 카코딜레이트로 명명됨, pH는 HCl로 7.4로 조정함)을 함유하는 냉장된 2.5% 글루타르알데하이드를 고정제로서 첨가하여 전자 현미경을 위한 셀 및 지지체(지혈 차단벽)를 제조한다.
실시예 8
연골세포는 37℃에서 CO2배양기로 HAM F12 및 15mM 헤페스 완충액 및 5 내지 7.5% 자가 혈청을 함유한 최소 필수 배양 배지에서 성장시키고 기관[Verigen Europe A/S, Symbion Science Park, Copenhagen, Denmark]의 클래스 100 연구소에서 취급한다. 배양 배지의 또 다른 조성물이 연골세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 세포는 5 내지 10분동안 트립신 EDTA를 사용하여 트립신 처리하고 버커-터크(Burker-Turk) 챔버에서 트립판 블루 생존력 염색을 사용하여 계수한다. 세포수는 ml당 7.5 x 105의 세포로 조정한다. 하나의 눈클론TM플레이트를 클래스 100 연구소에서 개봉한다.
수르지셀?(지혈 차단벽으로서 사용)은 실시예 1에 기재된 바와 같이 1분동안 0.6% 글루타릭 알데하이드로 처리하고 0.9%의 멸균 염화나트륨 용액 또는 바람직하게 PBS 완충액과 같은 완충액 또는 MEM/F12와 같은 배양 배지로 처리하고 글루타릭 알데하이드 처리 후 pH는 6.8이고 바람직하게는 7.0 내지 7.5이어야만 한다. 티셀?을, 두플로젝트?시스템을 사용하여 수르지셀?의 양측면상에 적용하여 피브린 접착제와 함께 사용될 패치인 수르지셀?의 양 측면을 피복한다. 아교를 3 내지 5분 이상동안 무균 조건하에 건조시켜 방치한다. "피복된" 지혈 차단벽은 연구용 눈클론TM델타 6-웰 멸균 1회용 플레이트내 웰의 기저상에 위치시킨다. 혈청을 함유하는 소량의 조직 배양 배지를 적용하여 지혈 차단벽에 흡수시킨다. 혈청을 함유하는 1ml의 조직 배양 배지내에 약 106의 세포를 지혈제 상부에 직접 위치시키고 지혈 차단벽의 표면상에 분산시킨다. 이어서 플레이트를 60분동안 37℃에서 CO2배양기에서 배양한다. 5 내지 7.5%의 혈청을 함유하는 조직 배양 배지 2 내지 5ml을 세포를 함유하는 웰에 주의깊게 첨가하여 배지를 축출할때 웰의 측면에 피펫 말단이 접하도록 유지하여 세포가 튀지않도록 한다. 3 내지 6일 후, 현미경 조사는 세포가 만족스러운 방식으로 수르지셀?에 부착되어 성장함을 보여주고 이것은 수르지셀?이 연골세포에 독성을 나타내지 않고 연골세포가 만족스러운 방식으로 수르지셀?으로 성장함을 시사한다.
당해 플레이트는 3일째에 배지를 교환하여 3 내지 7일동안 배양한다.
배양 시기 말에, 배지를 버리고 또한, 나트륨 카코딜레이트로 명명되는 디메틸아르신산의 0.1M 나트륨 염(pH는 HCl로 7.4로 조정함)을 함유하는 냉장된 2.5% 글루타르알데하이드를 고정제로서 첨가하여 전자 현미경을 위한 셀 및 지지체(지혈 차단벽)를 제조한다.
실시예 9
연골세포는 37℃에서 CO2배양기로 HAM F12 및 15mM 헤페스 완충액 및 5 내지 7.5% 자가 혈청을 함유한 최소 필수 배양 배지에서 성장시키고 기관[Verigen Europe A/S, Symbion Science Park, Copenhagen, Denmark]의 클래스 100 연구소에서 취급한다. 세포는 5 내지 10분동안 트립신 EDTA를 사용하여 트립신 처리하고 버커-터크(Burker-Turk) 챔버에서 트립판 블루 생존력 염색을 사용하여 계수한다. 세포수는 ml당 7.5 x 105내지 2 x 106의 세포로 조정한다. 하나의 눈클론TM플레이트를 클래스 100 연구소에서 개봉한다.
바이오-가이드(Bio-Gide)?가, 배양된 연골세포가 이식될 관절의 결손 영역을포함하는 패치 또는 밴드로서 뿐만 아니라 지혈 차단벽으로 사용되는 재흡수 가능한 이층 막으로서 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 바이오-가이드?는 표준화된 조절된 제조 방법[문헌참조: E.D.Geistlich Sohne AG, CH-6110 Wolhusen]에 의해 수득되는 순수한 콜라겐 막이다. 콜라겐은 수의사 보증 돼지로부터 추출하고 항원 반응을 피하도록 주의깊게 정제하며 김마 조사에 의해 이중 발포제로 멸균한다. 이층 막은 다공성 표면 및 밀집 표면을 갖는다. 막은 추가의 가교 결합 또는 화학적 처리 없이 콜라겐 I형 및 III형으로 이루어진다. 콜라겐은 24주내에 재흡수된다. 막은 심지어 습윤화되어도 이의 구조적 위상을 유지하고 봉합선 또는 못에 의해 고정화될 수 있다. 막은 또한 봉합선 대신 또는 봉합선과 함께 티셀?과 같은 피브린 접착제를 사용하여 인접한 연골 또는 조직으로 접착될 수 있다.
바이오-가이드?는 클래스 100 연구소에서 개봉하고 무균 조건하에 세포 연구용 눈클론TM델타 6-웰 멸균 1회용 플레이트내 웰의 기저상에 위치시키는데 이때, 이층 막의 다공성 표면이 위를 향하거나 밀집 표면이 위를 향해 있다. 혈청을 함유하는 1ml 조직 배양 배지에서 약 106의 세포는 바이오-가이드?의 상부상에 직접 위치시키고 바이오-가이드?의 다공성 표면 또는 밀집 표면상에 분산시킨다. 이어서 플레이트를 60분동안 37℃에서 CO2배양기에서 배양한다. 5 내지 7.5%의 혈청을 함유하는 조직 배양 배지 2 내지 5ml을 세포를 함유하는 웰에 주의깊게 첨가하여 배지를 축출할때 웰의 측면에 피펫 말단이 접하도록 유지하여 세포가 튀지않도록 한다.
연골세포가 바이오-가이드?를 함유하는 웰에 위치한지 2일째에 세포를니콘(Nikon) 반전 현미경으로 조사한다. 몇몇 연골세포가 바이오-가이드?상에 부착되어 있음을 알 수 있다. 물론, 당해 현미경을 사용하여 바이오 가이드?자체를 투시하여 관찰할 수는 없다.
당해 플레이트는 3일째에 배지를 교환하여 3 내지 7일동안 배양한다. 배양 시기 말에, 배지를 버리고 디메틸아르신산의 0.1M 나트륨 염(또한, 나트륨 카코딜레이트로 명명됨, pH는 HCl로 7.4로 조정함)을 함유하는 냉장된 2.5% 글루타르알데하이드를 고정제로서 첨가하여 세포가 다공성 표면 또는 밀집 표면상에 배양되는 셀 및 바이오-가이드?지지체를 제조한다. 이어서 바이오-가이드?패치는 전자현미경을 위해, 기관[Department of Pathology, Herlev Hospital, Denmark]에 보내진다.
전자 현미경은 바이오-가이드?의 밀집 표면상에 배양된 연골 세포가 바이오-가이드?의 콜라겐 구조내로 성장하지 않은 반면에 다공성 표면상에 배양된 세포는 실질적으로 콜라겐 구조내로 성장함을 보여주고 추가로, 프로테오글리캔이 존재함을 보여주고 섬유아세포 구조에 대한 징조는 없다. 이러한 결과는, 예를 들어, 바이오-가이드?패치로서의 콜라겐 패치가 연골 결손체를 덮는 패치로서 봉합되는 경우, 다공성 표면이, 배양된 연골세포가 주입되어야만 하는 결손체쪽으로 아래를 향하고 있음을 보여준다. 이들은 이어서 콜라겐을 침투할 수 있고 온전한 표면과 병행하여 연한 연골 표면을 형성하고 당해 영역에서, 프로테오글리갠의 연한 층이 생성된다. 반면, 콜라겐의 밀집 표면이 결손체쪽으로 아래를 향하는 경우, 이식될 연골세포는 콜라겐과 통합하지 않고 세포는 상기된 바와 같은 동일한 연한 표면을 형성하지 않는다.
실시예 10
연골세포는 37℃에서 CO2배양기로 HAM F12 및 15mM 헤페스 완충액 및 5 내지 7.5% 자가 혈청을 함유한 최소 필수 배양 배지에서 성장시키고 기관[Verigen Europe A/S, Symbion Science Park, Copenhagen, Denmark]의 클래스 100 연구소에서 취급한다. 배양 배지의 또 다른 조성물이 연골세포를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 세포는 5 내지 10분동안 트립신 EDTA를 사용하여 트립신 처리하고 버커-터크(Burker-Turk) 챔버에서 트립판 블루 생존력 염색을 사용하여 계수한다. 세포수는 ml당 7.5 x 105내지 2 x 106의 세포로 조정한다. 하나의 눈클론TM플레이트를 클래스 100 연구소에서 개봉한다.
재흡수 가능한 이층 막으로서 사용되는 바이오-가이드?는 또한 생성물 삽입체로서 기재된 바와 같은, 티셀?에서 정상적으로 발견되는 것 보다 아프로티닌의 함량이 추가로 상당히 높은 티셀?과 같은 유기 아교와 함께 사용될 수 있다. 아프로티닌의 함량이 약 25,000 KIU/ml로 증가되어 물질의 재흡착은 정상적인 기간 보다 수주간 지연된다.
시험관내에서 당해 특징을 시험하기 위해, 티셀?을 눈클론TM플레이트 웰의 기저에 적용하고 즉시 경화되도록 방치한다. 이어서 바이오-가이드?과 같은 콜라겐 패치를 티셀?상에 적용하고 웰의 기저상에 접착시킨다. 이러한 바이오-가이드?및 티셀?의 배합은 연골 이식 영역으로의 혈관의 형성 또는 침투를 억제하거나 예방하는 지혈 차단벽이 되도록 디자인된다. 이러한 혼성 콜라겐 패치는 현재 병변(치료될 표면과 가장 인접한) 기저에서 지혈 차단벽 및 연골 형성을 위한 지지체 둘다로서 사용될 수 있는데 이것은 원거리 표면이 콜라겐 패치의 다공성 측면일 수 있고 따라서 연골세포 및 연골 매트릭스의 침투를 고무시키기 때문이다. 따라서, 이러한 혼성 콜라겐 패치는 또한 콜라겐 다공성 표면이 이식된 연골세포쪽 아래를 향하고 상부에 차단벽이 형성된 이식체의 상부를 덮는데 사용될 수 있다. 상승된 아프로티닌 성분을 갖는 혼성 콜라겐 패치는 또한 티셀?과 같은 임의의 유기 아교없이 사용될 수 있고 자연적인 힘에 의해 접착하여 결손체내에 직접 위치된다. 따라서, 콜라겐 패취는 지혈 차단벽 및 복구/이식 부위의 무세포 보호 덮개 둘다로서 사용될 수 있고 여기서, 패치의 다공성 표면이 이식된 연골세포/연골쪽으로 배향된다. 또 다른 변법은 콜라겐 II형으로 이루어진 콜라겐 패치[제조원(Geistlich Sohne AG, CH-6110 Wolhusen)으로부터 시판됨)를 사용한다.
따라서, 본 발명은, 유기 매트릭스 아교와 연합된 아프로티닌 성분이 바람직하게 약 25,000의 KIU/ml의 농도로 상승된 콜라겐 매트릭스이고, 콜라겐 성분이 바이오-가이드?재흡수 가능한 이층 물질 또는 II형 콜라겐과 유사하고 유기 아교가 티셀?물질과 유사한 혼성 콜라겐 패치를 제공한다. 또 다른 양태에서, 혼성 콜라겐 패치는 복구 부위에 접착시키기 위해 임의의 유기 아교를 사용하지 않는다.
본 발명의 특정 양태만이 상세하게 상기 기재되었지만 본 발명이, 본 발명의 취지 및 의도된 범주를 벗어나지 않고 변경되고 변화될 수 있음을 인지할 것이다.

Claims (14)

  1. 골형성, 건형성, 연골형성 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 치료에 적합한 하나 이상의 추출된 성장 인자를 포함하는 조성물로서, 성장 인자가 배양된 연골세포로부터 수득되고, 이의 크기가 약 70kDa 내지 10kDa이고, 성장 인자의 농도가 약 5ng/ml 내지 15ng/ml임을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 성장 인자가 TGF-β, BMP, PTHrP, RANKL, IgF1 및 OPG로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자임을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 성장 인자가 연골세포의 단층 배양물로부터 수득됨을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 성장 인자가 치료학적 유효 농도로 존재함을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 골 시멘트, 인산칼슘, 황산칼슘, 하이드록시애퍼타이트(hydroxyapatites) 및 기타 자가 성장 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  6. 연골세포의 단층 배양물을 제공하는 단계 및
    연골세포의 단층 배양물로부터 하나 이상의 성장 인자를 추출하는 단계를 포함하여, 성장 인자 조성물을 제조하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 성장 인자를 농축시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 성장 인자가 TGF-β, BMP, PTHrP, RANKL, IgF1 및 OPG로 이루어진 성장 인자의 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 연골세포를 배양하는 단계가 단층내 자가 연골세포를 배양하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 성장 인자가 치료학적 유효 농도로 농축됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제6항에 있어서, 골 시멘트, 인산칼슘, 황산칼슘, 하이드록시애퍼타이트 및 기타 자가 성장 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 물질과 농축된 성장인자를 배합하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  12. 골, 건 또는 연골 결손체를 치료하는 방법으로서, 골, 건 또는 연골 결손체를, 배양된 연골세포로부터 수득되는 하나 이상의 성장 인자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 성장 인자가 TGF-β, BMP, PTHrP, RANKL, IgF1 및 OPG로 이루어진 성장 인자 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 성장 인자가, 골 시멘트, 인산칼슘, 황산칼슘, 하이드록시애퍼타이트 및 기타 자가 성장 인자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 물질과 배합됨을 특징으로 하는 방법.
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