MXPA04002716A - Composicion combinada de factor de crecimiento autologo, metodo de produccion y uso. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a una composicion que incluye uno o mas factores de crecimiento adecuados para el tratamiento de la osteogenesis, tenogenesis o condrogenesis, en donde los factores de crecimiento se obtienen a partir de condrocitos cultivados.

Description

COMPOSICIÓN COMBINADA DE FACTOR DE CRECIMIENTO AUTÓLOGO, MÉTODO DE PRODUCCIÓN Y USO Antecedentes de la Invención Como la mayoría de las células, los condrocitos tienen un ciclo de vida que incluye etapas de maduración y diferenciación. Los condrocitos pueden empezar su vida como células madre mesenquimales , las cuales durante la proliferación se convierten en precondroblastos . Estos precondroblastos se transforman en condroblastos durante la diferenciación/producción de matriz. Los condroblastos, entonces, pueden sufrir una hipertrofia o maduración para convertirse en condrocitos. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una composición que incluye, pero que no se limita a cuando menos un factor de crecimiento adecuado ara el tratamiento de la osteogénesis , tenogénesis y/o condrogénesis , en donde el factor de crecimiento se obtiene a partir de condrocitos cultivados. La presente invención también se refiere a un método para preparar una composición de factor de crecimiento que incluye los pasos de cultivar condrocitos provenientes de un sujeto y concentrar cuando menos un factor de crecimiento proveniente del cultivo de condrocitos. REF. : 154838 Adicionalmente , la presente invención se refiere a un método de tratamiento de huesos, tendones o cartílagos, o un defecto en los mismos, que incluye el paso de poner en contacto el tejido o defecto con cuando menos un factor de crecimiento, en donde el factor de crecimiento se obtiene a partir de condrocitos cultivados. Breve Descripción De Las Figuras La Fig. 1 representa el control molecular de la reparación de cartílago utilizando un implante de condrocitos autólogos (ICA) . La Fig. 2 representa la expresión génica de los factores de crecimiento y factores de transcripción en condrocitos . La Fig. 3 representa la expresión génica de factores de crecimiento, proteínas de matriz y factores de transcripción en condrocitos. La Fig. 4 representa la expresión génica de factores de crecimiento, proteínas de matriz y factores de transcripción en condrocitos. La Fig. 5 representa la expresión génica de ANKL y sus receptores en condrocitos. La Fig. 6 representa la expresión génica de receptores de hormonas esteroides en condrocitos. La Fig. 7 representa una comparación por inmunoelectrotransferencia tipo Western de los factores de crecimiento entre una muestra control no concentrada y una muestra concentrada. La concentración de TGFb3 se incrementa después de un procedimiento de concentración a través de filtros que tienen valores de corte de 10 y 30 kDa (YK10, YK30) . La Fig. 8 representa una comparación de la concentración de factores de crecimiento entre una muestra control no concentrada y una muestra concentrada. Se presenta la cantidad de TGFb 1 en medio concentrado (ELISA) . La Fig. 9 representa un cultivo celular de condrocitos después de la aplicación de los factores de crecimiento de la presente invención a cultivos de condrocitos humanos. Proliferación celular después de la aplicación de sobrenadante concentrado en un cultivo de condrocitos humanos. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Tal como se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" se refiere a un rango de valores ± 10% del valor especificado. Por ejemplo, la expresión "aproximadamente 20" incluye ± 10% de 20, o de 18 a 22, inclusive . Tal como se utiliza en la presente, el término "sustancial" o "sustancialmente" significa que se aproxima en gran medida o en un alto grado. Se han cultivado condrocitos utilizando un número de técnicas. Se han descrito técnicas para un cultivo en monocapa de condrocitos, un cultivo en gel de colágena para condrocitos, un cultivo en gel de alginato para condrocitos y un cultivo en gel de agarosa para condrocitos. Estas células se encontró que producían proteínas extracelulares durante el cultivo en gel de agarosa. En una modalidad de la presente invención, los cultivos pueden tener una densidad de aproximadamente 1 millón de células por 75 cm2. Los condrocitos se pueden hacer crecer en una solución autóloga al 10 a 20% con ácido ascórbico. En una modalidad, las condiciones de crecimiento adecuadas para los condrocitos útiles en la presente invención se establecen en la Publicación Internacional de Patente WO 00/09179 y en la Patente Norteamericana US 5,989,269, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia. Véanse los Ejemplos 6 a 10, los cuales muestran métodos típicos de cultivo celular para utilizarse en la presente invención. Es difícil determinar qué tipo de proteína extracelular o factor de crecimiento, si los hay, va a producir un condrocito únicamente por el aspecto morfológico de la célula en estos cultivos celulares. Así pues, existe la necesidad de desarrollar técnicas y métodos para promover la producción condrocítica de proteínas de matriz extracelular y factores de crecimiento. Además, es necesario identificar el perfil de factores de crecimiento producidos por una población de células, los cuales estén asociados con la inducción de condrogénesis, tenogenesis y osteogénesis. Muchos compuestos biológicos controlan el desarrollo condrocítico . Estos compuestos se pueden extraer y/o concentrar a partir de condrocitos y en particular en condrocitos cultivados en monocapa, para formar una composición de factores de crecimiento, denominada composición "combinada" de factores de crecimiento, la cual se puede utilizar terapéuticamente en el tratamiento de tejido y defectos de cartílago, tendones y/o huesos. Por ejemplo, en una modalidad, la presente invención incluye el uso de factores de crecimiento extraídos y/o concentrados obtenidos a partir de una composición de la presente invención en cirugía ortopédica. Además, las composiciones de factores de crecimiento de la presente invención pueden tener un valor terapéutico en procedimientos reconstructivos y aparatos, incluyendo procedimientos y aparatos para utilizarse en la columna vertebral, caderas, rodillas, hombros, muñecas, tobillos y dedos, así como la fijación de fracturas y el tratamiento de una fractura que no tiene unión, y en otros productos tales como cementos, incluyendo pero no limitándose a cementos óseos, fosfatos de calcio, sulfatos de calcio, hidroxiapatitas y combinaciones de los mismos, y otros factores de crecimiento autólogos. A continuación se describen la composición de la presente invención y los métodos de uso. 1. Factores de Crecimiento Se ha encontrado que los condrocitos, y en particular los condrocitos cultivados en monocapa, tienen la capacidad de producir un número de factores de crecimiento, incluyendo pero no limitándose al factor de crecimiento transformante (TGF-P3) , proteina morfogénica ósea (BMP-2) , PTHrP, osteoprotegrina (OPG) , Factor Indian Hedgehog, RANKL y factor de crecimiento similar a la insulina (IgFl) . En una modalidad, las composiciones de factor de crecimiento de conformidad con la presente invención, asi como otras, se pueden extraer de un cultivo en monocapa de condrocitos, para formar las composiciones de la presente invención que se pueden utilizar para propósitos terapéuticos, tal como se describió anteriormente. De manera adicional, en otra modalidad, las composiciones de factor de crecimiento de conformidad con la presente invención, se pueden extraer de composiciones que incluyen factores de crecimiento adecuados para formar composiciones que contienen uno o más factores de crecimiento enriquecidos y/o concentrados que se pueden utilizar para propósitos terapéuticos, tal como se describirá más detalladamente a continuación.

A) Derivación de Factores de Crecimiento En una modalidad, las composiciones de factores de crecimiento de la presente invención se derivan de células que incluyen, pero no se limitan a condrocitos autólogos. De esta manera, el perfil de factores de crecimiento derivados de los condrocitos autólogos puede conformar sustancialmente el perfil de factores de crecimiento natural del sujeto. En otra modalidad, la composición de los factores de crecimiento de un sujeto inicialmente se caracteriza utilizando las técnicas descritas en la Solicitud de Patente PCT No. PCT/IB02/02752, cuyo contenido se incorpora en la presente en su totalidad como referencia y en particular utilizando las técnicas descritas en los Ejemplos 1, 2 y 3 de la Solicitud PCT, y se reiteran en la presente como Ejemplos 2, 3 y 4. Otras técnicas apropiadas incluyen, pero no se limitan a análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Western y caracterización inmuno luorescente del perfil de factores de crecimiento de un sujeto. Una vez que el perfil de factores de crecimiento del sujeto es caracterizado apropiadamente, el perfil se puede comparar con otros perfiles de prueba para encontrar una composición de factores de crecimiento adecuada que tenga un perfil que concuerde sustancialmente con el perfil de factores de crecimiento del sujeto para las células o tejidos por ser tratados. En una modalidad, el perfil de prueba se puede derivar de la caracterización de factores de crecimiento de a) células no autólogas, b) células autólogas removidas del sujeto en un momento diferente y/o c) células autólogas que tienen una diferente morfología que las células condrociticas del sujeto. Alternativamente, el perfil se puede generar utilizando técnicas de ADN recombinante, i.e. utilizando microbios para producir proteínas de factor de crecimiento y después mezclar las proteínas para producir una mezcla de proteínas que tenga un perfil que coincida sustancialmente con el perfil de factores de crecimiento del sujeto para las células o tejidos por ser tratados. En todavía otra modalidad, una composición de factores de crecimiento se puede modificar mediante la adición o remoción de una o más proteínas factores de crecimiento para crear una composición que tenga un perfil a la medida o un perfil que pueda coincidir sustancialmente con el perfil del sujeto u otro perfil deseado. B) Función de los Factores de Crecimiento Los factores de crecimiento anteriormente descritos son importantes en la regeneración de cartílagos, tendones y huesos. Inicialmente , durante la proliferación celular de los condrocitos cultivados, están presentes el TGF-p3, BMP-2, PTHrP, Factor Indian Hedgehog, OPG, RANKL así como IGF1. Se piensa que estos factores, así como otros, pueden controlar le grado de proliferación y diferenciación de los condrocitos, tenocitos y osteoblastos , y de esta manera influenciar los programas de condrogénesis , tenogénesis y osteogénesis . De conformidad con lo anterior, al administrar apropiadamente los factores de crecimiento descritos en la presente a un sujeto lesionado, cualquier sanación que requiera la participación de condrocitos, tenocitos y osteoblastos se puede aumentar, mejorando de esta manera la recuperación de una lesión o enfermedad. Durante la producción de la matriz, la colágena tipo II y/o aggrecan y otros materiales de la matriz, pueden controlar el grado de producción de matriz. Se piensa que tal control se puede mantener por retroalimentación celular. Específicamente, los factores de crecimiento y citocinas regulan los factores de transcripción, los cuales, a su vez, regulan la producción de proteínas de matriz extracelular, tales como la colágena tipo II, IX y XI, aggrecan, CEP-68 y GP 39, los cuales, a su vez, pueden regular la presencia de factores de crecimiento y citocinas, e.g., al reducir la concentración extracelular de factores de crecimiento y citocinas. La Fig. 1 muestra una caracterización de la línea condrocítica y controles moleculares de la reparación de cartílagos después de la implantación de condrocitos autólogos. En la etapa de proliferación in vi tro, los condrocitos producen factores de crecimiento y citocinas, incluyendo pero no limitándose a TGF~P3, BMP-2, PTHrP, Factor Indian Hedgehog, OPG, RANKL. Después de la implantación a un sujeto, los condrocitos proceden a la producción de matriz. Las proteínas SOX-9, colágena tipo II, aggrecan y otras proteínas de la matriz extracelular , también se producen. Después de la producción de la matriz, muchos factores, incluyendo la vitamina D3, pueden regular la maduración o modificación de la matriz condrocítica . La Fig. 2 muestra la expresión de factores de crecimiento y factores de transcripción provenientes de condrocitos cultivados en monocapa. Como se muestra en la Fig. 2, los factores de crecimiento TGF-p3 y BMP-2 se expresan en condrocitos. También se expresa el factor de transcripción SOX-9. La Fig. 3 muestra que a medida que se expresa SOX- 9, la proteína de matriz CEP-68 también se expresa, indicando que los condrocitos examinados son capaces de producir matriz y factores de crecimiento. La Fig. 4 muestra que a medida que se expresa el factor de crecimiento TGF-P3, las proteínas de matriz aggrecan y colágena tipo II también son expresadas por los condrocitos . Utilizando la reacción de polimerización en cadena (RPC) catalizada con transcriptasa reversa a 30 ciclos de amplificación génica, la Fig. 5 muestra que la expresión de RANKL no se detecta. Sin embargo, a 34 ciclos se puede encontrar ARNm de RANKL, indicando de esta manera que puede ocurrir la expresión de RANKL. Además, la Fig. 5 muestra que los receptores celulares de RANKL, es decir GADPH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) y OPG también se expresan en condrocitos. Estos datos sugieren que la proteína RANKL puede ser importante para el crecimiento de condrocitos . La Fig. 6 muestra que los receptores de hormonas esteroides GADPH, GRa, GR(¾ y VDR se expresan en condrocitos.

Estos datos sugieren que la respuesta condrocítica a una o más hormonas esteroides puede presentar una ruta hacia la regulación de la producción condrocítica de factores de crecimiento. Las posibles hormonas esteroides adecuadas incluyen, pero no se limitan a la vitamina D3 y glucocorticoide . Así pues, en una modalidad, los condrocitos en un cultivo en monocapa pueden producir muchos factores de crecimiento, incluyendo pero no limitándose a factores de crecimiento transformantes, proteínas morfogénicas óseas, PTHrP, osteoprotegrina, RANKL y Factor Indian Hedgehog. Estos factores forman el "combinado" de factores de crecimiento, los cuales se pueden extraer por el método de la presente invención y subsecuentemente administrar a sujetos. Tal como se describe en la presente, estos factores de crecimiento se pueden obtener de los condrocitos autólogos propios del sujeto y utilizarse para el tratamiento de tejidos, incluyendo pero no limitándose a defectos óseos, de tendones y de cartílagos. Por ejemplo, al utilizar las técnicas de implante de condrocitos autólogos para el tratamiento de defectos de cartílago, los condrocitos proliferan in vitro y producen factores de crecimiento. Después del implante en el sujeto, los condrocitos pueden comenzar a generar proteínas de matriz extracelular durante la etapa de producción de matriz. El proceso de condrogénesis por los condrocitos se puede caracterizar por la presencia del factor de transcripción SOX-9. De conformidad con la información anteriormente descrita, se puede encontrar que existe una relación casual entre la expresión y/o presencia de factores de crecimiento y la expresión de factores de transcripción que causa la expresión y generación de proteínas de matriz adecuadas para la generación y/o sanación de tejidos y defectos de huesos, tendones y cartílagos. 2. Separación de los Factores de Crecimiento de Condrocitos En la presente invención, uno o más de los factores de crecimiento aquí descritos, así como otros, se pueden extraer y/o purificar a partir de medios de condrocitos cultivados, para formar composiciones de la presente invención que se pueden utilizar para propósitos terapéuticos. Adicionalmente, en otra modalidad, los factores de crecimiento anteriormente descritos se pueden concentrar a partir de un medio de condrocitos cultivados para formar composiciones de la presente invención que también se pueden utilizar para propósitos terapéuticos. En una modalidad, la purificación por extracción y/o concentración de los factores de crecimiento de conformidad con la presente invención, se puede llevar a cabo por filtración por diálisis, que se puede utilizar para remover moléculas de peso molecular pequeño del suero y otros fluidos biológicos. En la presente invención, la filtración por diálisis o más comúnmente conocida como "ultrafiltración" , utiliza la presión hidrostática en vez de gradientes de concentración para extraer, concentrar y/o purificar los factores de crecimiento anteriormente descritos provenientes del sobrenadante de un cultivo de condrocitos, de preferencia un cultivo de condrocitos humanos. En una modalidad, un sobrenadante que contiene factores de crecimiento se obtiene primero cargando un cultivo celular en un aparato de filtración centrifuga, tal como un aparato Centriplus® Centrifugal Filter Device, fabricado por Millipore/Amicon, para provocar que los materiales del cultivo celular se separen en fases, típicamente en una fase liquida y una sólida. Después de la remoción de los restos celulares (típicamente la fase sólida) , el sobrenadante del cultivo se puede centrifugar nuevamente a través de una o más membranas YMT hidrofílicas de baja adsorción (disponibles en Millipore/Amicon) o a través de tamices moleculares, los cuales de preferencia tienen un tamaño de poro de entre aproximadamente 5 y 70 kDa, más preferiblemente de aproximadamente 10 a 30 kDa. El sobrenadante primero se puede hacer pasar a través de un filtro grande, típicamente de aproximadamente 70 a 30 kDa. De conformidad con lo anterior, el flujo de salida del filtro grande se puede hacer pasar a través de un filtro más pequeño, típicamente de aproximadamente 5 a 10 kDa. Los factores de crecimiento de la presente invención típicamente pasan a través del filtro grande (de 70 a 30 kDa) y típicamente son retenidos por el filtro más pequeño (de 5 a 10 kDa) y, por lo tanto, las composiciones de la presente invención pueden incluir moléculas que tengan un tamaño entre aproximadamente 70 a 30 kDa y aproximadamente 5 a 10 kDa, de preferencia entre aproximadamente 30 y aproximadamente 10 kDa. Debe observarse que algunos factores de crecimiento de la presente invención se pueden unir unos con otros y formar de esta manera moléculas más grandes. Así pues, las composiciones de la presente invención que se obtienen del flujo de salida de un filtro grande y se retienen en un filtro subsecuente más pequeño, pueden incluir moléculas que tengan un tamaño más grande que el tamaño de poro del filtro grande. En particular, después de la filtración de un sobrenadante que contiene uno o más factores de crecimiento de la presente invención a través de los filtros anteriormente descritos, las composiciones de la presente invención pueden incluir moléculas que tengan un tamaño entre aproximadamente 50 y 5 kDa, en algunas modalidades entre aproximadamente 70 y 5 kDa. El soluto retenido por el filtro de tamaño de poro más pequeño se puede juntar para su uso posterior como concentrado de proteínas, incluyendo factores de crecimiento de la presente invención. Por este método, la concentración de factores de crecimiento, e.g. TGF- 3, que tiene un tamaño de 12 kDa, se incrementa cuando se compara con un control (sobrenadantes no concentrados) , tal como se muestra por os resultados de una inmunoelectrotransferencia tipo Western que se muestra en la Figura 7. En la Fig. 7, los dos filtros utilizados para filtrar el sobrenadante tenían un tamaño de poro de 10 kDa (YK10) y 30 kDa (YK30) . Típicamente, la centrifugación para la extracción y/o concentración se puede llevar a cabo por aproximadamente dos a ocho horas, de preferencia aproximadamente cuatro horas, a aproximadamente menos de 15 °C, de preferencia aproximadamente a 4°C, a velocidades de centrifuga mayores de aproximadamente 2,000xg, de preferencia aproximadamente 3, OOOxg. En una modalidad alternativa, se puede utilizar un biorreactor comercial para cosechar el medio de cultivo, extraer y/o concentrar los factores de crecimiento, para formar una composición de la presente invención. Tal biorreactor se ha descrito en una Solicitud de Patente Provisional intitulada "Biorreactor con Área de Superficie Expansible para Cultivar Células", que tiene el número de serie 50/406224, presentada el 27 de agosto del 2002, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia. En una modalidad, el biorreactor incluye un recipiente, un vehículo dentro del recipiente, un flujo de entrada, un flujo de salida y un mecanismo de agitación. El vehículo puede incluir un área de superficie expansible sobre la cual se cultivan las células. En una modalidad del biorreactor, el área de superficie del vehículo es expansible de manera reversible, es ; decir, el área de superficie se expande y después se contrae hasta el tamaño de superficie original. En un aspecto del biorreactor, el vehículo expansible de manera reversible es una placa de cultivo de tejidos que tiene una pluralidad de límites removibles, los cuales opcionalmente so concéntricos, de tal manera que el área de superficie de la placa de cultivo tisular se incremente al remover los limites a medida que el área de superficie se vuelve subóptima para la proliferación celular. La forma de los limites puede tener cualquier forma regular o irregular, por ejemplo puede ser cuadrada, rectangular, triangular, circular, lineal o no lineal. Una vez extraída y/o concentrada de la manera anteriormente descrita o por cualquier otro método apropiado, la composición puede incluir, pero no limitarse a uno o más de los siguientes factores de crecimiento: TGF- 3, BMP-2, PTHrP, OPG, Factor Indian Hedgehog, IgFl y RANKL. Los factores de crecimiento se pueden concentrar hasta cualquier concentración terapéuticamente efectiva. Tal como se utiliza en la presente, el término "terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que es efectiva para hacer crecer el tejido deseado, para reparar un defecto en el tejido y/o para reducir, eliminar, tratar, prevenir o controlar los síntomas de las enfermedades y trastornos aquí descritos, asociados con el tejido o defecto particular. En una modalidad, uno o más factores de crecimiento; e.g., TGF-p3, se pueden presentar en cantidades mayores de aproximadamente 5 ng/mL, más preferiblemente mayores que aproximadamente 15 ng/mL en el sobrenadante concentrado. En algunas modalidades, los factores de crecimiento pueden estar presentes entre aproximadamente 1 y ng/mL, más preferiblemente entre aproximadamente 5 y 15 ng/mL. Para propósitos comparativos, la concentración de los factores de crecimiento en el sobrenadante antes de llevar a cabo la concentración, puede ser de aproximadamente 1 ng/mL o menor, tal como se muestra en la Figura 8. 3. Aplicación Terapéutica En una modalidad, el uso de las composiciones de factores de crecimiento de la presente invención incluye poner en contacto una composición de factores de crecimiento de la presente invención con un órgano, tejido o estructura del cuerpo lesionado, y en particular poner en contacto una composición de la presente invención con un tejido que incluye, pero no se limita a tejido óseo, tendón o cartílago. En otra modalidad, la terapia con el factor de crecimiento incluye poner en contacto una composición de la presente invención, con un defecto en un tejido que incluye, pero no se limita a tejido óseo, de tendón o de cartílago. El defecto puede ser el resultado de una lesión u otro trauma, así como puede ser el resultado de degeneración causada por la edad. Mediante la aplicación de la presente invención, el índice de sanación del defecto se puede mejorar al inducir un mayor índice de condrogénesis , tenogénesis y/u osteogénesis en el sitio del defecto. Además, in vitro, la aplicación de los factores de crecimiento concentrados "combinados" a cultivos de condrocitos humanos, se demostró que incrementaba la proliferación de las células condrociticas , tal como se muestra en la Figura 9. En particular, la dilución 1:50 del retenido se encontró que era particularmente efectiva después de aproximadamente 48 horas, con respecto a los retenidos de las membranas de filtración YKl'O y YK30. El uso de composiciones de factor de crecimiento de la presente invención, puede ser con aparatos reconstructivos, sustitutos de hueso, fijaciones de fracturas y la inducción de regeneración de hueso, tendón y cartílago, en varios trastornos ortopédicos. Además, las composiciones de factor de crecimiento de la presente invención pueden tener un valor terapéutico en aparatos reconstructivos y procedimientos para utilizarse en la columna vertebral, caderas, rodillas, hombros, muñecas, tobillos y dedos, en la fijación de fracturas y en el tratamiento de fracturas que no tienen unión, y en otros defectos de huesos, tendones y cartílagos . Para el tratamiento de uno o más defectos osteocondrales , un "combinado" de factores de crecimiento autólogos de la presente invención, se puede mezclar parcial o completamente con un armazón de sostén, incluyendo pero no limitándose a materiales de "soporte óseo", armazones de sostén de fosfato de calcio, hidroxiapatita, sulfato de calcio o colágena compuesta. El "combinado" de factores de crecimiento puede inducir la formación de hueso en el compartimento subcondral, en comparación con otros tratamientos convencionales tales como el Trasplante de Condrocitos Autólogos Inducidos para Producir Matriz (Matrix Induced Autologous Chondrocyte Transplantation, MACI™) disponible en Verigen Transplantation Services International, de Leverkusen, Alemania, que puede restaurar un defecto de cartílago por arriba del hueso subcondral. Para el tratamiento de defectos óseos, el "combinado" de factores de crecimiento se puede colocar en un armazón de sostén, de la manera anteriormente descrita, e implantarse en el sitio del defecto utilizando tecnología que incluye, pero no se limita a tecnología de globo en el caso de un defecto localizado en o cerca de la columna vertebral. Además, la presente invención se puede utilizar en combinación con un armazón de sostén de colágena para la reparación de cartílago, hueso o tendón, incluyendo pero no limitándose a cartílago articular o reparación del tendón de rotación del codo. En una modalidad, las composiciones de factores de crecimiento de la presente invención se pueden utilizar con armazones de sostén biomédicos tales como Chondro-Gide (Geistlich, Suiza) Membranas de Submucosa de Intestino Delgado (SIS) (DePuy Orthopaedics) , tal como se describe en la Solicitud de Patente Norteamericana No. de Serie /121,449 (presentada el 12 de abril del 2002), cuyo contenido se incorpora en la presente en su totalidad como referencia . Otros productos que incluyen una composición de la presente invención, tales como cementos, incluyendo pero no limitándose a cementos óseos, y otros factores de crecimiento autólogos, también están dentro de los alcances de la presente invención. Tales composiciones pueden encontrar un uso particular en mejorar la osteogénesis , tenogénesis y condrogénesis . 4. Dosi cación Las cantidades de composición de factor de crecimiento de conformidad con la presente invención necesarias para el tratamiento, dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo la vía de administración, el sitio blanco, el estado fisiológico del sujeto y otros factores de crecimiento y/o medicamentos administrados. Asi pues, las dosis de tratamiento se deberán calcular para optimizar la seguridad y eficacia. Típicamente, las dosis utilizadas in vitro pueden proporcionar una linea útil para investigar las cantidades útiles en la administración in situ de estos compuestos. Las pruebas en animales de dosis efectivas para el tratamiento de trastornos particulares, proporcionarán indicaciones predictivas adicionales para la dosificación en seres humanos. Se describen varias consideraciones por ejemplo en Gilman et al. (editores), Goodamn y Gilman: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press (1990 (; y en Remington's Pharmaceutical Sciences, 7th Ed. Mack Publishing Co., Easton, P . (1985); cuyo contenido se incorpora en la presente en su totalidad como referencia. Las composiciones de factor de crecimiento de la presente invención son útiles cuando se administran en un rango de dosis de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, por día. Alternativamente, en algunos casos también se pueden administrar de 0.0001 a aproximadamente 10 mg/kg. La dosis especifica empleada es regulada por el trastorno tisular particular que se está tratando, la via de administración y/o por el juicio del médico en cuestión, dependiendo de factores tales como la gravedad del trastorno, la edad y condición general del paciente, y similares. 5. Sujetos e Indicaciones Tal como se utiliza en la presente, el término "sujeto" es cualquier persona que sufra de un trastorno ortopédico, incluyendo pero no limitándose a lesiones o defectos en huesos, cartílagos y/o tendones. Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la presente invención. Sin embargo, debe entenderse que la invención no está limitada a las condiciones o detalles específicos que se describen en estos ejemplos.

Durante la descripción, cualquiera y todas las referencias a un documento disponible al público, incluyendo pero no limitándose a Patentes Norteamericanas, se incorporan específicamente como referencia. Ejemplo 1 - Sustituciones de Hueso en Combinación con Composiciones de Factor de Crecimiento de la Presente Invención Una cantidad efectiva de un factor de crecimiento concentrado de la presente invención, se puede combinar con un material que se describe a continuación, mezclando en una mezcladora apropiada para los materiales, antes de la administración de los materiales y factores de crecimiento a un sujeto. Un primer material sustituto de hueso incluye Endobon®, fabricado por Biomet Merck con dirección en Fruiteniersstraat 23, Pstbus 1138, 3330 CC Zwijndrecht, Los Países Bajos, una hidroxiapatita cerámica (HA cerámica) que es particularmente adecuada para utilizarse como sustituto de injerto en huesos. El material es de origen biológico y osteoconductivo . Después del implante, crece hueso nuevo directamente en el material cerámico debido al sistema de poros interconectados del material cerámico. El Endobon® se puede utilizar para encerrar defectos óseos de fracturas, quistes óseos, artrodesis y tumores óseos. Un segundo material sustituto incluye Biobon®, también fabricado por Biomet Merck, que es un cemento de fosfato de calcio microcristalino sintético, que es reabsorbible y que se endurece endotérmicamente a temperatura corporal. Se puede utilizar para rellenar o reconstruir defectos óseos. Después de mezclar apropiadamente el polvo de fosfato de calcio con solución salina, la pasta resultante se puede aplicar al sujeto y Biobon® puede endurecerse con la forma del defecto óseo. Después del endurecimiento, su composición química y estructura cristalina pueden tener un aspecto esencialmente idéntico al componente fosfato de calcio del hueso natural. Ejemplo 2 - Caracterización de Condroeitos por RPC- TR Se llevó a cabo una Reacción de polimerización en cadena catalizada con transcriptasa reversa (RPC-TR) para varios marcadores para la diferenciación condrocítica, y se desarrollaron cebadores de RPC utilizando las secuencias de nucléotidos de estos marcadores, incluyendo la colágena I (GenBank No. de acceso XM 012651), colágena II (GenBank No. de acceso L 10347), aggrecan (GenBank No. de acceso XM 083921), ???-9 (GenBank No. de acceso XM 039094), BMP-2 (GenBank No. de acceso NM 001200), TGF-beta-3 (GenBank No. de acceso NM 003239), Cbfa-1, PTHrP (GenBank Nos. de acceso M 57293, M 32740), fosfatasa alcalina (GenBank No. de acceso XM 001826) y Factor Indian Hedgehog. Los cebadores y condiciones de PCR se muestran en las Tablas 1 y 2, respectivamente . Se aisló ARN total de cultivos de condrocitos utilizando la solución RNAzol de conformidad con las instrucciones del fabricante (Ambion Inc., Austin, TX, EUA) . Para la RPC-TR, se preparó ADNc de una sola cadena a partir de 2 g de ARN total utilizando la transcriptasa reversa (Promega, Sidney, Australia) con un cebador oligo-dT. Dos ]i de cada ADNc se sometieron a 30 ciclos de PCR utilizando 1.0 unidades de polimerasa Taq (Proegam, Sidney, Australia) con 0.4 mMol/L de cebadores, 125 µ???/L de dNTP en solución reguladora lx PCR y agua hasta un volumen total de 25 pL (véase la Tabla 2) . La amplificación se llevó a cabo en un DNA thermal cycler (Modelo 2400; Perkin-Elme ) . Se seleccionaron secuencias de cebadores específicos de exones separados de los genes de interés, para evitar contaminación con señales de ADN genómico. Los cebadores se diseñaron utilizando el programa de software de http : //genzi . virus . kyoto-u . ac . jp/egi-bin/primer3. cgi y sintetizados por Genset Oligos (Australia) en http : / /www . gensetoligos . com/australia (véase la Tabla 1) . Como control interno, el ADNc de una sola cadena se amplificó por PCR durante 25 ciclos utilizando cebadores específicos de un gen doméstico de la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) . Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1.5% y se tiñeron con bromuro de etidio. TABLA 1 TABLA 2 Protocolo, mezcla de reacción solución reguladora 10X PCR 2.5 L dNTP (5 mM) 2.0 µ? cebador de sentido (-15-25 µ?) 0.5 µ?? (concentración final de 0.3 a 0.5 µ?) cebador antisentido (~15-25 µ?) 0.5 pL ddHzO 17.0 uL ADN Pol. 0.5 L ADNc 2.0 ]i TOTAL 25.0 Las condiciones de los ciclos fueron: Ejemplo 3 - Caracterización de Condrocitos por Análisis de Inmunoelectrotransferencia tipo Western Se pueden utilizar varios marcadores para condrocitos, incluyendo colágena tipo II, aggrecan y proteína S-100, y otras proteínas, para caracterizar condrocitos cultivados mediante el análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Western. Los anticuerpos contra tales marcadores están disponibles en el comercio, por ejemplo en Sigma (St. Louis, MO), Dako (AUSTRALIA) y R&D Systems (Minneapolis , MN) . Los materiales y métodos para el análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Western de los condrocitos, se describen a continuación en detalle.

Se cosecharon de 103 a 104 condrocitos cultivados y las células se rompieron por centrifugación, formando una pella. El sobrenadante se eliminó y la pella se resuspendió en 250 microlitros de solución reguladora de lisis NET-gel (Quagen GmbH, Alemania) y se incubó durante 20 minutos en hielo. Con una pipeta los restos celulares y la solución reguladora de lisis se transfirieron a un tubo de Eppendorf™ de 1.5 mililitros y se centrifugó a 12000 g durante 2 minutos a 4°C. El sobrenadante se pasó a un nuevo tubo y se le realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) . El gel fue transferido a una membrana de nitrocelulosa Hybond T -C de 0.45 µp\ (Amersham, Piscataway, NJ) , utilizando un equipo de transferencia electroforética Mini Trans-blot (Bio-Rad, California, EUA) a 30 V (40 mA) durante una noche. La transferencia se llevó a cabo en presencia de solución reguladora de transferencia que contenia 7.57 gramos de glicina, 369 gramos de Tris y 400 mililitros de metanol, en 2 litros de agua (Sambrook et al., 1989, en: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) . Los protocolos estándar para la inmunoelectrotransferencia tipo Western están disponibles, por ejemplo, en Sambrook et al. (1989, en: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) y en Ausubel et al. (1997, en: Current Protocols in Molecular Biology, Green & iley, Nueva York) , los cuales se incorporan en la presente como referencia. Etapa de Desnaturalización y Renaturalización Se prepararon cuatro soluciones de guanidina-HCl (G-HC1) , a concentraciones 6M, 3M, 1M y 0.1M. La Tabla 3 proporciona detalles para la preparación de las soluciones G-HC1 utilizadas en esta etapa. Cuando se preparan las soluciones G-HC1, todos los ingredientes deberán ser recién preparados. Se disolvió leche en polvo en agua antes de agregarla a los demás ingredientes para crear una concentración final en la solución de G-HC1 de 2% de leche. La membrana se lavó cuatro veces, durante 30 minutos por lavado, una vez con cada una de las siguientes soluciones: G-HC1 6M, G-HC1 3M, G-HC1 1M y G-HC1 0.1M, a temperatura ambiente. Después la membrana se lavó con solución reguladora de cromatografía de afinidad (CA) más solución de leche en polvo al 2% durante una noche a 4°C. La solución reguladora de CA se preparó de la siguiente manera: 50 mL de glicerol (final 10% de glicerol) 10 mL de NaCl 5M (final NaCl 100 m ) 10 mL de Tris 1M, pH 7.6 (final Tris 20 mM) 1 mL de AEDT 0.5M (final AEDT 0.5 mM) 5 mL de Tween-20 al 10% (final Tween-20 al 0.1%) y se colocó en hielo.

Tabla 3 : Soluciones de Guanidina-HCl para la Etapa de Desnaturalización/Renaturalización Etapa de Lavado y Blogueo Posteriormente, la membrana se lavó dos veces con IX TBS-Tween durante 5 minutos, seguido por un lavado con solución reguladora CA durante 5 minutos. Luego la membrana se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con solución bloqueadora preparada con leche descremada al 2% y IX TBS-Tween, seguido por dos lavados de 5 minutos con IX TBS-Tween. Sondeo para la Proteina de Interés La Mezcla de Reacción de Sondeo (leche descremada al 2% en 20 IX TBS-Tween con 50 pL de Sonda de Proteina y 20 pL de DTT 1M) se agregó a la membrana y se incubó durante 2 horas a 4°C, seguido por dos lavados con IX TBS-Tween durante 5 minutos cada uno, a 4°C. La Sonda de Proteina es el anticuerpo contra la proteina de interés. En este caso, la Sonda de Proteina fue un anticuerpo contra TGF-beta-3. Después la membrana se lavó nuevamente con 10 mL de leche descremada al 2% en IX TBS-Tween durante 15 minutos, a 4°C, seguido por un segundo lavado con IX TBS-Tween durante 20 minutos a 4°C. Adición del Anticuerpo Primario La membrana se lavó dos veces más, durante 5 minutos cada una con IX solución reguladora TBS-Tween utilizando un aparato de rotación. Se preparó un tubo de ensayo de 20 mL que contenia IX TBS-Tween y leche descremada al 1% (0.2 gramos) y se dividió en dos tubos de 10 mL para el anticuerpo primario y el secundario. Se tomó con pipeta 1 pL de anticuerpo anti-V5 en el tubo del anticuerpo primario hasta una dilución final del anticuerpo de 1/10000 y se mezcló suavemente. La solución de anticuerpo primario se vació en la membrana y se incubó en un aparato de rotación durante 2 horas a temperatura ambiente. Alternativamente, la solución de anticuerpo se puede incubar durante una noche a 4°C. Adición del Anticuerpo Secundario Después de la incubación, se llevaron a cabo tres lavados con IX TBS-Tween, de 5 minutos cada uno. Se tomaron con pipeta 5 pL del anticuerpo secundario (IgG-Fab antimurino) y se vaciaron en la solución del anticuerpo secundario hasta una dilución final del anticuerpo secundario de 1/2000 y se mezcló suavemente. La solución de anticuerpo secundario se vació en la membrana y se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente, en un aparato de rotación. Adición de la Solución de Detección Después de incubar con la solución de anticuerpo secundario, se llevaron a cabo dos lavados con IX TBS-Tween de 5 minutos cada uno, en un aparato de rotación. Se realizaron dos lavados más, cada uno de 5 minutos, con IX TBS ÚNICAMENTE, en el aparato de rotación. La solución de detección se preparó mezclando 2 mL de Solución A de Detección Lumigen y 50 pL de Solución B de Detección Lumigen (ECL plus, Sydney, Australia) y se agregaron a la membrana, asegurándose que la membrana fuera cubierta de manera pareja por la solución de detección. El exceso de solución de detección se sacudió y la membrana se selló en una envoltura de plástico, asegurándose de que no hubiera arrugas en la envoltura. La membrana se colocó sobre un pedazo de película en un marco de película y se expuso durante aproximadamente 30 minutos (el tiempo de exposición varía), y después se reveló. Utilizando el método anteriormente descrito, los resultados demostraron la detección de TGF-beta-3 en los condrocitos cultivados. Ejemplo 4 - Inmunohistoquímica y Análisis Inmunofluorescente De manera similar al análisis de inmunoelectrotransferencia tipo Western, se pueden utilizar varios marcadores de condrocitos incluyendo colágena tipo II, aggrecan y proteína S-100 para caracterizar los condrocitos cultivados, mediante inmunohistoquímica e inmunofluorescencia . Estos métodos se pueden utilizar directamente sobre los condrocitos de MACI® (matrix induced autologous chondrocyte implantation, Trasplante de Condrocitos Autólogos Inducidos para Producir Matriz) . A continuación se describirán los materiales y métodos . Los condrocitos en una membrana MACI® se fijaron con una solución de paraformaldehido al 5% y se sometieron a una inmunofluorescencia directa. Alternativamente, los condrocitos se pueden impregnar con parafina después de la fijación. Posteriormente, los condrocitos se lavaron con Tris 0.2M-solución salina reguladora (TBS) y se bloquearon para peroxidasa endógena incubando en peróxido de hidrógeno al 35% (H202) . Después, las células fueron preincubadas con suero normal de caballo al 20% y se incubaron con un primer anticuerpo. Las células se lavaron con TBS y se incubaron con un segundo anticuerpo (el cual puede estar conjugado) . Un sistema de detección de reacción colorida, tal como 3'3'-diaminobenzidina para la detección de peroxidasa conjugada con estreptavidina, se utilizó para detectar las marcas condrociticas . Utilizando el método anteriormente descrito, se demuestra la expresión de TFG-beta-3 en condrocitos cultivados en una membrana de colágena, lo cual fue detectado por inmunofluorescencia . Ejemplo 5 Con el fin de utilizar el Surgicel® de conformidad con la presente invención para prevenir el desarrollo de vasos sanguíneos en cartílago autólogo implantado o en condrocitos, el Surgicel® primero se trató con un fijador, tal como aldehido glutá ico. Brevemente, el Surgicel® se trató con aldehido glutárico al 0.6% durante 1 minuto, seguido por varios lavados para eliminar los residuos de aldehido glutárico que pudieran ser tóxicos para el tejido.

Alternativamente, el Surgicel® se trató con el adhesivo de fibrina denominado Tisseel® antes del tratamiento con aldehido glutárico, de la manera que se describe en el Ejemplo 2. Se encontró que el Surgicel® fijado con, por ejemplo, un fijador tal como aldehido glutárico, lavado con solución fisiológica estéril (0.9%) y almacenado en un refrigerador, no se disolvía durante 1 a 2 meses. Generalmente, el Surgicel® se reabsorbía en un periodo entre 7 y 14 días. Este tiempo era demasiado corto, debido a que se necesita más tiempo para prevenir el desarrollo de vasos sanguíneos o vascularización de la estructura ósea en el cartílago implantado antes de que los condrocitos implantados hayan crecido para formar una capa sólida de cartílago. En otras palabras, se necesita una suficiente inhibición de la vascularización durante un tiempo más prolongado, por ejemplo, durante un mes. Por lo tanto, el producto no debe ser absorbido significativamente antes de ese tiempo. Por otro lado, la reabsorción es necesaria eventualmente . Así pues, el material orgánico utilizado como barrera inhibidora deberá tener estas capacidades y se ha encontrado que el Surgicel® tratado de esta manera, proporciona tal función. Ejemplo 6 El Surgicel® también se cubrió con un pegamento orgánico. En este ejemplo, el pegamento utilizado fue Tisseel®, pero también se pueden utilizar otros. Este producto, junto con el Surgicel®, produce una barrera útil para los propósitos particulares de la invención. Se puede utilizar cualquier otra barrera hemostática o inhibidora vascular. El Tisseel® se mezcló de la manera previamente descrita. Después, el Surgicel® se revestió con Tisseel® rociándolo sobre el material de Surgicel® por ambos lados hasta que se empapara. El Tisseel® (pegamento de fibrina) se dejó solidificar a temperatura ambiente. Inmediatamente antes de concluida la solidificación, el Surgicel® revestido se colocó en aldehido glutárico al 0.6% durante 1 minuto y después se lavó con solución salina fisiológica estéril (0.9%. Después el pH se ajustó con PBS y/o con NaOH, hasta que tuviera un valor estable de 7.2 a 7.4. Posteriormente, el Surgicel® tratado de esta manera se lavó con medio de cultivo tisular tal como medio esencial minimo/F12, con solución reguladora Hepes 15 mM. Como se mencionó en este ejemplo, se utilizó Tisseel® como adhesivo de fibrina para revestir al Surgicel®. Además, el adhesivo o pegamento de fibrina también se puede aplicar directamente en el fondo de la lesión en el hueso sobre el cual se va a pegar el Surgicel®. El sistema in vitro utilizado en vez de una prueba in vivo, consistió de una placa de 6 pozos estéril, desechable, NUNCLON™ Delta para trabajos de investigación celular (NUNC, InterMed, Roskilde, Dinamarca) . Cada pozo mide aproximadamente 4 cm de diámetro.

En la presente invención, el adhesivo d fibrina puede ser cualquier adhesivo que, junto con el componente fibrina, produzca un pegamento que pueda ser tolerado en seres humanos (Ihara, N, et al., Burns Ind. Therm. Inj . , 1984, 10, 396). La presente invención también anticipa cualquier otro componente de pegamento que se pueda utilizar en vez del adhesivo de fibrina. En la presente invención se utilizó Tesseel® o Tissucol® (Immuno, AG, Vienna, Austria) . El paquete de Tisseel® consiste de los siguientes componentes: Tisseel®, que es un sellador inactivado con virus liofilizado, que contiene las siguientes proteínas coagulables: fibrinógeno, fibronectina plasmática (CIG) y Factor XIII, y Plasminógeno . Solución de aprotinina (bovina) Trombina 4 (bovina) Trombina 500 (bovina) Solución de cloruro de calcio. El paquete de Tisseel® contiene un Sistema de Aplicación DUPLOJECT®. El adhesivo de fibrina o el sellador de dos componentes que utiliza el paquete Tisseel®, se combina de la siguiente manera según la hoja de instructivo de Immuno AG : Ejemplo 7 Se hicieron crecer condrocitos en un medio de cultivo esencial mínimo que contenía HAM F12 y solución reguladora Hepes 15 mM y de 5 a 7.5% de suero autólogo, en una incubadora de C02 a 37 °C y se manipuló en una laboratorio Clase 100 en Verigen Europe ?/?, Symbion Science Park, Copenhague, Dinamarca. Se pueden utilizar otras composiciones de medio de cultivo para cultivar los condrocitos. Las células se tripsinizaron utilizando AEDT-tripsina durante 5 a 10 minutos y las células viables se contaron por tinción vital con Azul de Tripano en una cámara de Burker-Turk. La cuenta celular se ajustó a 7.5xl05 células por mililitro. A una placa NUNCLON™ se le quitó el revestimiento en el laboratorio Clase 100. La barrera hemostática Surgicel® se cortó a un tamaño adecuado que ajustara en el fondo del pozo de la placa de cultivo tisular NUNCLON™. En este caso fue un círculo de aproximadamente 4 cm de diámetro (pero puede ser de cualquier tamaño posible) , cortado en condiciones asépticas y colocado en el fondo de un pozo de una placa desechable estéril NUNCLON™ Delta de 6 pozos para trabajo de investigación celular (NUNC, InterMed, Roskilde, Dinamarca) . La barrera hemostática a ser colocada en el fondo del pozo fue tratada previamente de la manera descrita en el Ejemplo 1. Este tratamiento retrasa significativamente la absorción del Surgicel®. Esta barrera hemostática, posteriormente, se lavó varias veces con agua destilada hasta que se eliminara el glutaraldehido que no reaccionó. Se aplicó una pequeña cantidad de medio de cultivo celular conteniendo suero, para que fuera absorbida en la barrera hemostática, para mantener la barrera hemostática húmeda en el fondo del pozo. Aproximadamente 106 células en 1 mL de medio de cultivo se colocaron directamente en la barrera hemostática, se dispersaron sobre la superficie de la barrera hemostática previamente tratada con glutaraldehido al 0.4% de la manera anteriormente descrita. Después, la placa se incubó en una incubadora de C02 a 37 °C durante 60 minutos. Se adicionó cuidadosamente una cantidad de 2 a 5 mL de medio de cultivo tisular conteniendo de 5 a 7.5% de suero al pozo que contenia las células, evitando salpicar las células al mantener la punta de la pipeta tangencial con respecto a la pared del pozo cuando se adicionó el medio. Pareció que el pH del medio era demasiado bajo (pH de aproximadamente 6.8). Entonces, el pH se ajustó a 7.4-7.5. Al día siguiente comenzaron a crecer algunos condrocitos en la barrera hemostática, acomodándose en grupos. Algunas de las células murieron a causa de la exposición al pH bajo antes del ajuste del pH. La placa se incubó durante 3 a 7 días cambiando el medio en el día 3. Al final del periodo de incubación, el medio se decantó y se agregaron glutaraldehido al 2.5% refrigerado que contenia sal sódica del ácido dimetilarsinico 0.1M (también denominado cacodilato de sodio, ajustando el pH con HC1 a 7.4), como fijador para preparar las células y el soporte (barrera hemostática) para la microscopía electrónica. Ejemplo 8 Se hicieron crecer condrocitos en medio de cultivo esencial mínimo que contenía HAM F12 y solución reguladora Hepes 15 mM y de 5 a 7.5% de suero autólogo en una incubadora de C02 a 3 °C y se manipuló en un laboratorio Clase 100 en Verigen Europe ?/?, Symbion Science Park, Copenhague, Dinamarca. Se pueden utilizar otras composiciones de medio de cultivo para cultivar los condrocitos. Las células se tripsinizaron utilizando AEDT-tripsina durante 5 a 10 minutos y las células se contaron por tinción vital con Azul de Tripano en una cámara de Burker-Turk. La cuenta de células se ajustó a 7.5xl05 células por mililitro. A una placa de NUNCLON™ se le quitó el revestimiento en el laboratorio Clase 100. El Surgicel® (para utilizarse como barrera hemostática) se trató con aldehido glutárico al 0.6% durante un minuto de la manera descrita en el Ejemplo 1 y se lavó con solución de cloruro de sodio estéril al 0.9% o, de preferencia, con una solución reguladora tal como solución reguladora PBS, o con un medio de cultivo tal como MEM/F12, ya que el pH después del tratamiento con aldehido glutárico es de 6.8 y de preferencia debería ser de 7.0 a 7.5. El Tisseel® fue aplicado a ambos lados del Surgicel®, utilizando el sistema DUPLOJECT®, revistiendo de esta manera ambos lados del Surgicel®, que era el parche que se iba a utilizar con adhesivo de fibrina. El pegamento se dejó secar en condiciones asépticas durante cuando menos 3 a 5 minutos. La barrera hemostática "revestida" se colocó en el fondo de un pozo en una placa desechable estéril NUNCLON™ Delta de 6 pozos para trabajo de investigación celular. Se aplicó una pequeña cantidad de medio de cultivo tisular conteniendo suero para que se absorbiera en la barrera hemostática. Se colocaron aproximadamente 106 células en 1 mL de medio de cultivo tisular conteniendo suero directamente en la parte superior del Hemostat, dispersándolas por la superficie de la barrera hemostática. Después la placa se incubó en una incubadora de C02 a 37 °C durante 60 minutos. Se agregó cuidadosamente una cantidad de 2 a 5 mL de medio de cultivo tisular conteniendo de 5 a 7.5% de suero al pozo que contenía las células, evitando salpicar las células al mantener la punta de la pipeta tangencial con respecto a la pared del pozo cuando se estaba aplicando el medio. Después de 3 a 6 días, el examen microscópico reveló que las células se estaban adhiriendo y crecían en el Surgicel® de una manera satisfactoria, lo cual sugiere que el Surgicel® no mostró ninguna toxicidad para los condrocitos y que los condrocitos crecieron de manera satisfactoria en el Surgicel®.

La placa se incubó durante 3 a 7 días cambiando el medio de cultivo en el día 3. Al final del periodo de incubación, el medio se desechó y se agregaron glutaraldehido al 2.5% refrigerado que contenia sal sódica del ácido dimetilarsinico 0.1M, también denominado cacodilato de sodio, a ustando el pH con HC1 a 7.4, como fijador para preparar las células y el soporte (barrera hemostática) para la microscopía electrónica. Ejemplo 9 Se hicieron crecer condrocitos en medio de cultivo esencial mínimo que contenía HAM F12 y se agregaron solución reguladora Hepes 15 mM y de 5 a 7.5% de suero autólogo en una incubadora de CO2 a 37 °C y se manipularon en un laboratorio Clase 100 en Verigen Europe A/S, Symbion Science Park, Copenhague, Dinamarca. Las células se tripsinizaron utilizando AEDT-tripsina durante 5 a 10 minutos y las células se contaron por tinción vital con Azul de Tripano en una cámara de Burker-Turk. La cuenta de células se ajustó a un valor de 7.5xl05 a 2xl06 células por mililitro. A una placa de NUNCLON"1™ se le quitó el revestimiento en el laboratorio Clase 100. Se ha encontrado que la Bio-Gide® se puede utilizar como membrana bicap reabsorbible, que será utilizada como parche o vendaje que cubre el área defectuosa de la articulación en la cual los condrocitos cultivados se van a trasplantar, así como también puede usarse como barrera hemostática. La Bio-Gide® es una membrana de colágena pura obtenida por procesos de fabricación estandarizados y controlados (por E.D. Geistlich Sohne AG, CH-6110 Wolhusen) . La colágena se extrae de cerdos veterinariamente certificados y se purifican cuidadosamente para evitar reacciones antigénicas, y se esteriliza en empaques tipo ampolla por radiación gamma. Las membranas bicapa tienen una superficie porosa y una superficie densa. La membrana está hecha de colágena tipo I y tipo III sin mayor reticulación o tratamiento químico. La colágena es reabsorbida en un periodo de 24 semanas. La membrana retiene su integridad estructural incluso cuando está húmeda y se puede fijar con suturas o grapas. Las membranas también se pueden "pegar" utilizando adhesivo de fibrina, tal como Tisseel® al cartílago vecino o al tejido vecino, en vez de usar suturas o en conjunto con suturas. La Bio-Gide® fue abierta en el laboratorio Clase 100 y colocada bajo condiciones asépticas en el fondo de los pozos de una placa desechable estéril NUNCLON™ Delta de 6 pozos para trabajo de investigación celular, ya sea con la superficie porosa de la membrana bicapa hacia arriba, o bien, con la superficie densa hacia arriba. Se colocaron aproximadamente 106 células en 1 mL de medio de cultivo tisular directamente sobre la Bio-Gide®, se dispersaron por la superficie porosa o densa de la Bio-Gide®. Después la placa se incubó en una incubadora de C02 a 37 °C durante 60 minutos. Se agregó cuidadosamente una cantidad de 2 a 5 mL de medio de cultivo tisular que contenia de 5 a 7.5% de suero al pozo que contenia las células, evitando salpicar las células al mantener la punta de la pipeta en posición tangencial con respecto a la pared del pozo cuando se estaba aplicando el medio. En el dia 2 después de que los condrocitos fueron colocados en el pozo que contenia la Bio-Gide®, las células se examinaron en un microscopio invertido Nikon. Se observó que algunos condrocitos se habían adherido al borde de la Bio-Gide®. Por supuesto no era posible ver a través de la Bio-Gide® misma utilizando este microscopio. La placa se incubó durante 3 a 7 días cambiando el medio en el día 3. Al final del periodo de incubación, el medio se decantó y se agregó sal sódica del ácido dimetilarsínico 0.1M que contenía glutaraldehído al 2.5% refrigerado (también denominado cacodilato de sodio, ajustando el pH con HC1 a 7.4) como fijador para preparar las células y el soporte Bio-Gide® con las células cultivadas en la superficie porosa o en la superficie densa. Los parches Bio-Gide®, posteriormente, fueron enviados para realizar una microscopía electrónica al Departamento de Patología del Hospital Herlev, Dinamarca.

La microscopía electrónica demostró que los condrocitos cultivados en la superficie densa de la Bio-Gide® no crecieron en la estructura de colágena de la Bio-Gide®, mientras que las células cultivadas en la superficie porosa, sí crecieron en la estructura de colágena y además mostraron la presencia de proteoglicanos y no mostraron signos de estructuras fibroblásticas . Este resultado muestra que cuando el parche de colágena, por ejemplo un parche de Bio-Gide®r se cose para cubrir un defecto en un cartílago, la superficie porosa de dicho parche deberá estar en contacto con el defecto en el cual se van a inyectar los condrocitos cultivados. Éstos entonces serán capaces de penetrar la colágena y producir una superficie cartilaginosa lisa alineada con la superficie intacta y en esta área se construirá una capa lisa de proteoglicanos. Por otro lado, si la superficie densa de la colágena está en contacto con el defecto, los condrocitos por ser implantados no se integrarán con la colágena y las células no producirán la misma superficie lisa anteriormente descrita. Ejemplo 10 Se hicieron crecer condrocitos en medio de cultivo esencial mínimo que contenía HAM F12 y se agregaron solución reguladora Hepes 15 mM y de 5 a 7.5% de suero autólogo en una incubadora de C02 a 37 °C y se manipularon en un laboratorio Clase 100 en Verigen Europe ?/?, Symbion Science Park, Copenhague, Dinamarca. Las células se tripsinizaron utilizando AEDT-tripsina durante 5 a 10 minutos y se contaron por tinción vital con Azul de Tripano en una cámara de Burker-Turk. La cuenta de células se ajustó a un valor de 7.5xl05 a 2xl06 células por mililitro. A una placa de NUNCLON™ se le quitó el revestimiento en el laboratorio Clase 100. La Bio-Gide® utilizada como membrana bicapa reabsorbible , también se puede usar junto con un pegamento orgánico tal como Tisseel® con un contenido significativamente más alto de Aprotinina que el normalmente encontrado en Tisseel®, tal como se describe en el instructivo del producto. Al incrementar el contenido de Aprotinina a aproximadamente 25,000 UI/mL, la reabsorción del material se retrasará por semanas, en vez del lapso normal de días. Para probar esta característica in vitro, el Tisseel® se aplicó al fondo de un pozo de una placa NUNCLON™ y se dejó solidificar de manera incompleta. Después se aplicó un parche de colágena tal como Bio-Gide® sobre el Tisseel® y se pegó al fondo del pozo. Esta combinación de Bio-Gide® y Tisseel® está diseñada para ser una barrera hemostática que inhibirá o prevendrá el desarrollo de infiltración de vasos sanguíneos en el área de trasplante de condrocitos. Este parche de colágena híbrido ahora se puede utilizar como barrera hemostática en el fondo de la lesión (más próximo a la superficie por ser reparada) y como soporte para la formación de cartílago, debido a que la superficie distal puede ser el lado poroso del parche de colágena y de esta manera inducir la infiltración de los condrocitos y la matriz cartilaginosa. Así pues, este parche de colágena híbrido se puede utilizar para cubrir la parte superior del implante con la superficie porosa de colágena dirigida hacia los condrocitos implantados y formándose la barrera encima. El parche de colágena híbrido con un elevado contenido de Aprotinina también se puede utilizar sin ningún pegamento orgánico tal como Tisseel® y colocarse directamente en el defecto, adhiriéndose por fuerzas naturales. Así pues, el parche de colágena se puede utilizar tanto como barrera hemostática, como también en forma de una cobertura libre de células en el sitio de reparación/trasplante, con la superficie porosa del parche orientada hacia los condrocitos/cartílago trasplantados. Otra variante utilizaría un parche de colágena que consiste de colágena tipo II (i.e. de Geistlich Sohne AG, CH-6110, Wolhusen) . Así pues, la presente invención proporciona un parche de colágena híbrido en donde el parche es una matriz de colágena con elevados de niveles del componente Aprotinina, de preferencia aproximadamente 25,000 KUI/mL, en asociación con un pegamento de matriz orgánico, en donde el componente colágena es similar al material de bicapa reabsorbible Bio-Gide® o a la colágena tipo II, y el pegamento orgánico es similar al material Tisseel®. En otra modalidad, el parche de colágena híbrido no utiliza ningún pegamento orgánico para adherirse al sitio de reparación. Aunque sólo se describen específicamente modalidades particulares de la invención, deberá observarse que es posible realizar modificaciones y variaciones de la invención sin apartarse del espíritu y los alcances de la misma . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecedente, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición que comprende cuando menos un factor de crecimiento extraído adecuado para el tratamiento de trastornos que se seleccionan del grupo que consiste de osteogénesis , tenogénesis, condrogénesis y combinaciones de los mismos, caracterizada porque el factor de crecimiento se obtiene de condrocitos cultivados y tiene un tamaño entre 70 y 10 kDa y la concentración del factor de crecimiento está entre aproximadamente 5 y 15 ng/mL.
2. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el factor de crecimiento es uno o más factores de crecimiento que se seleccionan del grupo que consiste de TGF-ß, BMP, PTHrP, RANKL, IgFl y OPG.
3. 3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el factor de crecimiento se obtiene de un cultivo de condrocitos en monocapa .
4. 4. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el factor de crecimiento está presente en una concentración terapéuticamente efectiva.
5. 5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque además comprende uno o más materiales que se seleccionan del grupo que consiste de cementos óseos, fosfatos de calcio, sulfatos de calcio, hidroxiapatitas y otros factores de crecimiento autologos.
6. 6. Un método para preparar una composición de factores de crecimiento, caracterizado porque comprende los pasos de: proporcionar un cultivo de condrocitos en monocapa; y extraer cuando menos un factor de crecimiento del cultivo de condrocitos en monocapa.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque además comprende el paso de concentrar el factor de crecimiento.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el factor de crecimiento es uno o más factores de crecimiento que se seleccionan del grupo que consiste de TGF-ß, BMP, PHTrP, RANKL, IgFl y OPG.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el paso de cultivar los condrocitos comprende cultivar condrocitos autologos en una monocapa.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque los factores de crecimiento se concentran hasta alcanzar una concentración terapéuticamente efectiva .
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque además comprende el paso de combinar el factor de crecimiento concentrado con uno o más materiales que se seleccionan del grupo que consiste de cementos óseos, fosfatos de calcio, sulfatos de calcio, hidroxiapatitas y otros factores de crecimiento autólogos.
12. 12. Un método para el tratamiento de un defecto en un hueso, tendón o cartílago, caracterizado porque comprende el paso de poner en contacto un defecto de un hueso, tendón o cartílago con cuando menos un factor de crecimiento, en donde el factor de crecimiento se obtiene a partir de condrocitos cultivados .
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el factor de crecimiento es uno o más factores de crecimiento que se seleccionan del grupo que consiste de TGF-ß, BMP, PTHrP, RANKL, IgFl y OPG.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el factor de crecimiento se combina con uno o más materiales que se seleccionan del grupo que consiste de cementos óseos, fosfatos de calcio, sulfatos de calcio, hidroxiapatitas y otros factores de crecimiento autólogos .