CN107708712B - 用于修复软骨缺陷的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于修复软骨缺陷的组合物。所述组合物包含骨髓浓缩物、软骨碎片或粉末以及滑液膜。同时本发明还公开了一种用于在个体中治疗软骨缺陷的方法。所述方法包含施加本发明的组合物至所述软骨缺陷中，以及施加一纤维蛋白胶至所述组合物上以覆盖所述软骨缺陷。

Description

用于修复软骨缺陷的组合物
技术领域
本发明涉及一种用于修复软骨缺陷的组合物。
背景技术
运用自体软骨细胞的组织工程已逐渐成为一种前景看好的软骨再生方法。然而，仍存在许多关于运用自体软骨细胞的担忧，例如于采获位置处造成伤害以及它们在单层扩张期间会有失去表现型的固有倾向。间质干细胞(Mesenchymal stem cells；MSCs)是经考虑的选择细胞类型，因为它们具有可以以单一步骤程序分化成软骨细胞的能力，而无须一生检/培养期及分阶再植入手术(Fang HW,Biomed Eng21:149–155(2009))。由MSCs进行软骨再生要成功的一个关键是正确调制细胞，使其分化至成软骨路径中并表现正常软骨胞外基质(ECM)。此外，ECM经认定会显著参与引导MSCs分化程序(Quesenberry PJ et al.,1Stem Cells 16(Suppl 1):33–35(1998)；Philp D et al.,Stem Cells 23:288–296(2005))。
最近，与自体软骨细胞植入(Autologous chondrocyte implantation；ACI)相关的软骨修复产品已经积极推销至许多国家，以创造更多的商业价值。他们在优良组织操作(Good Tissue Practice；GTP)实验室提供由一小软骨生检组织培养及扩张软骨细胞的商业服务。然而，却需要两次手术且仍具有某些限制(Buda R et al.,IntOrthop.2015May；39(5):893-900；Pestka JM et al.,Am J Sports Med.2014Jan；42(1):208-15)。
另一方面，若干已知以细胞为基础的组合物需要一有效载体或封闭剂以固定至缺陷位置上。为求软骨修复成功，移植物具备充足的初始机械稳定度是非常重要的(Efe T etal.,Knee Surg Sports TraumatolArthrosc.2012Feb；20(2):210-5)。移植物必须在早期术后阶段期间能承受得住关节活动期间活体内的力。必须有合适的固定以使移植物保持在缺陷区域并达到最佳的关节表面一致性。一般来说，在软骨缺陷上会缝合一骨膜补片或胶原蛋白纤维网以避免细胞或载体/封闭剂的损失(Slynarski K et al.,TransplantProc.2006Jan-Feb；38(1):318-9；Stone KR et al.,Arthroscopy.2006 Mar；22(3):291-9；以及Christoph Erggeletet al.,Arch Orthop Trauma Surg,DOI 10.1007/s00402-009-0957-y(2009))。这也许会增加外科医师的负担并造成若干问题，如骨膜肥大(Kreuzetal.,Osteoarthritis Cartilage.2007Dec；15(12):1339-47；Henderson I et al.,Arthroscopy.2006Dec；22(12):1318-1324)。
鉴于上述，仍然需要改善用于修复软骨缺陷的组合物。
发明内容
本发明发明人非预期性地发现，一种包含骨髓浓缩物、软骨碎片以及滑液膜的组合物在修复软骨缺陷上展现极佳的特性。此外，非预期性地发现，施加在本发明的组合物上的纤维蛋白胶表现极佳的黏合性且不会如通常用于软骨缺陷位置上随时间而消散或损失，如此便不需要通过缝合骨膜或合成膜来覆盖，填充有用于修复的以细胞为基础的组合物的软骨缺陷，此惯常的步骤。
因此，在一方面，本发明提供一种用于修复软骨缺陷的组合物，其包含骨髓浓缩物、软骨碎片或粉末以及滑液膜。本发明的组合物可与一纤维蛋白胶组合使用。本发明的组合物使得新的一阶段导向的软骨修复手术成为可能，而无须细胞培养的GTP实验室及制造新支架的GMP工厂。此可降低临床可实行性的门坎并使从实验室到临床的表现获益。
另一方面，本发明提供一种用于在个体中治疗软骨缺陷的方法，其包含施加本发明的组合物至所述软骨缺陷中，以及施加一纤维蛋白胶至所述组合物上以覆盖所述软骨缺陷。本发明的方法的一特征在于，施加所述组合物之后不需要骨膜或膜缝合的步骤来固定所述组合物。
又一方面，本发明提供所述组合物，其用于在个体中治疗软骨缺陷的方法，所述方法包含施加所述组合物至所述软骨缺陷中，以及施加一纤维蛋白胶至所述组合物上以覆盖所述软骨缺陷。在本发明的一具体实施例中，所述组合物是通过填入所述软骨缺陷来施加。根据本发明，所述方法可不包含骨膜或膜缝合的步骤膜来覆盖所述软骨缺陷。
根据本发明，所述个体较佳为一哺乳类动物。所述哺乳类动物包括但不限于人类、啮齿目动物、猴子、猪、狗及猫。更佳地，所述个体为人类。
在本发明中可使用来自具有与接受治疗的个体相同或不同属名的捐赠者的软骨及滑液膜。
应理解前述一般性说明及以下的详细说明均仅为提供范例及解释之用，而非用于限制本发明。
附图说明
配合随附图式阅读将可较佳地理解前述的发明内容、以及下方的本发明实施方式。为说明本发明，图式中所示的具体实施例中为目前较佳的。
在图式中：
图1A显示组别A1(BMC(5×105)的培养的RT-PCR结果。
图1B显示组别A2(软骨-滑液膜)的培养的RT-PCR结果。***p<0.001。
图1C显示组别A3(BMC(5×105)-软骨-滑液膜)的培养的RT-PCR结果。***p<0.001。
图1D显示组别A3的结果对组别A1的结果的比较。
图1E显示组别A3的结果对组别A2的结果的比较。
图1F显示组别B1(BMC-MSCs(5×105)-软骨-滑液膜)的培养的RT-PCR结果。
图1G显示组别B2(BMC-MSCs(5×104)-软骨-滑液膜)的培养的RT-PCR结果。
图2A显示一产生的软骨缺陷的照片。
图2B显示本发明的组合物可保持在缺陷位置处的照片。
图2C显示在使用本发明用于软骨缺陷修复的组合物时不需要骨膜移植或骨膜缝合的照片。
图2D显示移植后6个月的软骨修复的照片。
具体实施方式
在一方面，本发明提供一种用于修复软骨缺陷的组合物，其包含骨髓浓缩物、软骨碎片或粉末以及滑液膜。
本发明的组合物可与一纤维蛋白胶组合使用。纤维蛋白胶已经证实在许多矫形程序中十分有用；然而，其却未在膝关节完全厚度软骨缺陷中成功固定柔软的材料，诸如细胞。
另一方面，本发明提供所述组合物，其用于在个体中治疗软骨缺陷的方法，所述方法包含施加所述组合物至所述软骨缺陷中，以及施加一纤维蛋白胶至所述组合物上以覆盖所述软骨缺陷。在本发明的一具体实施例中，所述组合物是通过填入所述软骨缺陷来施加。根据本发明，所述方法可不包含骨膜或膜缝合的步骤来覆盖所述软骨缺陷。
此外，本发明提供一种用于在个体中治疗软骨缺陷的方法，其包含施加本发明的组合物至所述软骨缺陷中，以及施加一纤维蛋白胶至所述组合物上以覆盖所述软骨缺陷。
非预期地发现的是，施加在本发明的组合物上的纤维蛋白胶表现极佳的黏合性且不会如通常用于软骨缺陷位置上随时间而消散或损失，如此便不需要通过缝合骨膜或合成膜来覆盖，填充有用于修复的以细胞为基础的组合物的软骨缺陷，此惯常的步骤。据此，在本发明的较佳具体实施例中，所述方法不包含通过骨膜或膜缝合的步骤来覆盖所述软骨缺陷。
根据本发明，所述个体较佳为一哺乳类动物。所述哺乳类动物包括但不限于人类、啮齿目动物、猴子、猪、狗及猫。更佳地，所述个体为人类
本发明中所使用的
Figure BDA0001475075630000041
其较佳的形式为(有核细胞的)细胞沉淀并可运用如离心的惯常方法由一骨髓浓缩物溶液来制备。所述骨髓浓缩物溶液可通过以惯常方法移除血浆及红血球碎片由骨髓抽吸物来制备，例如，所述骨髓浓缩物溶液可由CellPointTM浓缩骨髓抽吸系统来制备(美国，密苏里州，ISTO科技)。其得到的骨髓浓缩物较骨髓抽吸物富含有核细胞。
在本文中所使用的术语
Figure BDA0001475075630000042
包括但不限于骨髓干细胞、嗜中性球、淋巴球及单核白血球。
根据本发明，所述组合物可含有提供所欲的有核细胞数目的量的BMC。
例如，对于尺寸为深度1～3毫米及直径约8.5毫米的软骨缺陷(即，一圆形缺陷)，所使用的骨髓浓缩物可包含104-107个有核细胞。亦即，所述组合物可含有提供104-107个有核细胞的量的BMC。较佳地，所述骨髓浓缩物包含105-106个有核细胞。在本发明的一具体实施例中，所述骨髓浓缩物包含5×105个有核细胞。
在本发明的部分具体实施例中，所述骨髓浓缩物的形式为细胞沉淀且实质上由源自骨髓抽吸物的有核细胞所构成。例如，有核细胞占本发明中所使用的骨髓浓缩物重量的至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或更多。
软骨碎片或粉末可由来自包括但不限于膝关节、髋关节及踝关节的关节的软骨组织来制备。在部分具体实施例中，软骨粉末为无细胞软骨粉末，例如，
Figure BDA0001475075630000043
根据本发明，软骨碎片的尺寸范围较佳为从1毫米×1毫米至3毫米×3毫米。在一具体实施例中，软骨碎片的尺寸为1-2毫米×2-3毫米。
对于尺寸为深度1～3毫米且直径约8.5毫米的软骨缺陷(即，一圆形缺陷)，可使用30-65毫克的软骨碎片或粉末。例如，所述组合物可包含60毫克的软骨粉末。
本发明的组合物中所使用的滑液膜可为碎片形式。较佳地，所述滑液膜尺寸范围从1毫米×1毫米至3毫米×3毫米的滑液膜碎片。在本发明的一具体实施例中，碎片的尺寸为约2毫米×3毫米。
对于尺寸为深度1～3毫米且直径约8.5毫米的软骨缺陷(即，一圆形缺陷)，可使用30-65毫克的滑液膜。例如，所述组合物可包含60毫克的滑液膜。
本发明中可使用自体骨髓浓缩物或来自具有与待接受治疗的个体相同或不同属名的捐赠者的非自体骨髓浓缩物。
本发明中可使用来自具有与待接受治疗的个体相同或不同属名的捐赠者的软骨及滑液膜。
根据本发明，组合物可通过均匀混合一骨髓浓缩物、一软骨碎片或粉末、及一滑液膜来制备。
例如，包含104-107个有核细胞的骨髓浓缩物可与40-100毫克软骨碎片或粉末及40-100毫克滑液膜混合以形成用于软骨缺陷修复的组合物。所述组合物可进一步与0.2-1毫升的生物兼容载体混合。本领域技术人员可根据欲进行修复的软骨缺陷尺寸轻易地调整实际的量。在本发明的一具体实施例中，所述组合物是通过混合包含约5×105个有核细胞的骨髓浓缩物与60毫克软骨碎片及60毫克滑液膜碎片、进一步与0.2毫升的纤维蛋白胶混合来制备。
根据本发明，所述组合物可包含0.1-1重量百分比的BMC、30-60重量百分比的软骨碎片或粉末及30-60重量百分比的滑液膜。
在本发明的一些其他具体实施例中，所述组合物未事先与生物兼容载体混合。所述组合物可直接施加至所述软骨缺陷中，并随后将一适当载体或封闭剂施加至其中或其上以便能固定。较佳地，所述载体或封闭剂为一纤维蛋白胶。
本发明进一步由下列实施例加以阐明，其是以例示的目的提供，而非限制的目的。
实施例1.活体外研究
1.骨髓浓缩物(BMC)的制备
猪的骨髓浓缩物是利用蔗糖梯度进行快速分离。简言之，猪的骨髓是通过注射器从胫骨抽取。骨髓随后是以70微米筛孔滤过。加入至50毫升圆锥管中的17.5％蔗糖梯度(15毫升)中的经过滤的骨髓(10毫升)，进行5分钟的1,500rpm离心一次。分馏层中的骨髓浓缩物随后是通过进行5-10分钟的1,500rpm离心萃取出。将获得的沉淀物分散至1毫升DPBS中，以便藉由自动细胞计数器来计算总细胞数。
2.骨髓间质干细胞(BM-MSCs)的制备
从分馏层采集到的骨髓浓缩物转移至一新的试管中，随后并以进行5-10分钟的1,500rpm离心，以获得有核细胞。这些细胞是接种到培养烧瓶中并在含10％FBS的α-MEM中培养。
3.软骨组织碎片的制备
软骨组织从猪的膝关节获取并以DPBS溶液清洗。以手术刀将组织剁碎成小碎片。尺寸大约1-2毫米×2-3毫米的软骨碎片以DPBS清洗并进行5-10分钟的1,500rpm离心来收集。
4.滑液膜碎片的制备
滑液膜从猪的膝关节获取并以DPBS溶液清洗。以手术刀将组织剁碎成小碎片。尺寸大约2毫米×3毫米的滑液膜碎片以DPBS清洗并进行5-10分钟的1,500rpm离心来收集。
5.用于修复软骨缺陷的组合物的制备
(1)BMC-软骨碎片-滑液膜组合物
将含有1-10×105个细胞的骨髓浓缩物悬浮液及包含30-60毫克软骨碎片及30-60毫克滑液膜的组织碎片混合在一起。离心之后，丢弃上层澄清液，并获得BMC-软骨碎片-滑液膜混合物。进一步将所述混合物在48孔培养盘上埋入于含有纤维蛋白原及凝血酶的0.2毫升TISSEEL溶液中以形成一生物构筑体。所形成的构筑体转移至24孔培养盘中并在含有10％FBS的α-MEM中培养。制备其他没有组织碎片且没有骨髓浓缩物的类似构筑体供比较。
(2)BM-MSCs-软骨碎片-滑液膜组合物(供比较用)
简言之，BM-MSCs经一系列的的胰蛋白酶作用。将含有1-10×104个干细胞的细胞悬浮液及包含30-60毫克软骨碎片及30-60毫克滑液膜的组织碎片混合在一起。离心之后，丢弃上层澄清液，并获得BM-MSCs-软骨碎片-滑液膜混合物。进一步将所述混合物在48孔培养盘上埋入于含有纤维蛋白原及凝血酶的0.2毫升TISSEEL溶液中以形成生物构筑体。所形成的构筑体转移至24孔培养盘中并在含有10％FBS的α-MEM中培养。制备其他具有不同BM-MSC数目的类似构筑体供比较。
6.基因表达上的RT-PCR分析
使用Trizol纯化系统(Invitrogen)依制造商的建议来分离全RNA。全RNA的反转录(RT)至单股cDNA使用高通量cDNA RT试剂盒(Applied Biosystems)来完成。基因表现使用ABI SteponePlusTM实时PCR系统(Applied Biosystems)来分析。
Figure BDA0001475075630000071
探针购自Applied Biosystems，其包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Hs99999905_m1)、软骨可聚蛋白多糖(Hs00153936_m1)、SOX9(Hs00165814_m1)、第I型胶原蛋白(Hs00164004_m1)、第II型胶原蛋白(Hs00156568_m1)、及第X型胶原蛋白(Hs00166657_m1)。数据估计为在构筑体中细胞的mRNA量。周期阈值(Ct)获自每个样本，并求取三次重复获得的样本值的平均。2-ΔΔCt方法是用以计算每一目标基因的相对表现。
7.结果
以下组别的培养物在第II型胶原蛋白的基因表达上是经RT-PCR分析，且结果显示于图式中：(A1)BMC(5×105)(图1A)；(A2)软骨-滑液膜(图1B)；(A3)BMC(5×105)-软骨-滑液膜(图1C)；(B1)BM-MSCs(5×105)-软骨-滑液膜(图1F)；以及(B2)BM-MSCs(5×104)-软骨-滑液膜(图1G)。图1D显示组别A3的结果相对于组别A1的结果的比较，以及图1E显示组别A3的结果相对于组别A2的结果的比较。
组别A3(根据本发明的组合物)相较于组别A1(只有BMC)及A2(只有软骨-滑液膜)，显示第II型胶原蛋白表现随培养时间有较多的增加(直到6个星期)(参见图1A-1E)。同时在使用BM-MSCs而非BMC的组别B1及B2的情况中，第II型胶原蛋白表达则并未随培养时间而有显著增加。
第II型胶原蛋白在关节软骨(或透明软骨)的细胞外基质(ECM)中的胶原蛋白中占90％至95％，并因此被认为对成功的软骨缺陷修复中是关键性的。
实施例2.动物研究
1.骨髓浓缩物(BMC)的制备
猪的骨髓浓缩物是利用蔗糖梯度进行快速分离。简言之，10毫升猪的骨髓是通过注射器从胫骨抽取。加入至50毫升圆锥管中的17.5％蔗糖梯度(15毫升)中的经过滤的骨髓(10毫升)，进行5分钟的1,500rpm离心一次。分馏层中的骨髓浓缩物随后通过5-10分钟的1,500rpm离心萃取出。沉淀物分散至1毫升DPBS中，以便通过自动细胞计数器来计算总细胞数。
2.软骨组织碎片的制备
软骨组织从猪的膝关节获取并以DPBS溶液清洗。以手术刀将组织剁碎成小碎片。尺寸大约1-2毫米×2-3毫米的软骨碎片以DPBS清洗并进行5-10分钟的1,500rpm离心来收集。
3.滑液膜碎片的制备
滑液膜从猪的膝关节获取并以DPBS溶液清洗。以手术刀将组织剁碎成小碎片。尺寸大约2毫米×3毫米的滑液膜碎片以DPBS清洗并进行5-10分钟的1,500rpm离心来收集。
4.活体内动物模型
在本研究中所采用的是小型猪。所有的猪只在进行手术时都已经性成熟。所有的操作及介入均在全身麻醉下执行。在两膝关节的内侧髁中制成全厚度的缺陷(参见图2A)，其中两者之一接受包含骨髓浓缩物、60毫克软骨碎片及60毫克滑液膜的组合物，以及随后的Tisseel溶液(纤维蛋白胶)(0.2-0.4毫升)以固定；以及另一者接受微断裂处理以作为对照组。缺陷的直径为8毫米且深度为1毫米。
5.结果
观察到的是，在施加至组合物上之后，纤维蛋白胶表现高度黏合性，且纤维蛋白胶以及组合物可保持在缺陷位置处，而不会四处流散，尽管从缺陷位置处有出血的情况，并因此不需要骨膜移植或骨膜缝合以便使组合物固定在位置上。相反地，已知的组合物会从缺陷位置处流走，并需要在手术时进行骨膜缝合(或其他膜缝合)。参见图2B及2C。
在从手术复原的阶段里，允许动物自由活动。手术之后，猪只行走缓慢且不会久站，除了进食的时候之外。他们趴在地板上休息。这样类型的行为持续了几天，而在这段时间过后猪只们的行为便回归往常。移植后六个月观察到良好的软骨缺陷修复(图2D)。
本领域技术人员将会明了，不背离主要的发明概念下可对上述的具体实施例进行修改。因此，可以理解的是，本发明并不限于所揭示的特定具体实施例，而是意欲涵盖申请专利范围所定义的本发明精神与范围内的任何修饰。

Claims (6)

1.一种组合物用于制备治疗软骨缺陷的药物的用途，其特征在于，所述组合物包含0.1-1重量百分比的骨髓浓缩物、30-60重量百分比的软骨碎片或粉末以及30-60重量百分比的滑液膜。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述滑液膜为碎片的形式。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物是通过均匀混合骨髓浓缩物、软骨碎片或粉末以及滑液膜来制备。
4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物的使用方法包含施加所述药物至所述软骨缺陷上，以及施加一纤维蛋白胶至所述药物上以覆盖所述软骨缺陷。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物是通过填入所述软骨缺陷来施加。
6.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物的使用方法不包含通过骨膜或合成膜缝合以覆盖所述软骨缺陷的步骤。
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