CN101448933A - 培养肌腱细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于培养肌腱细胞的方法。特别地,本发明涉及一种用于培养肌腱细胞的方法,该方法包括在含有胰岛素或其功能性衍生物的培养基中培养肌腱细胞的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养肌腱细胞的方法。特别地,本发明涉及一种使用选择性的培养基培养肌腱细胞以生成充分纯的肌腱细胞培养物的方法。
背景技术
细胞培养是具有许多应用的技术,但是,有些细胞(例如肌腱细胞、肝细胞、成骨细胞、成肌细胞和心肌细胞)很难培养和/或培养很慢和/或在培养中易于表现出不稳定的表型和去分化。培养的肌腱细胞尤其可以用于修复损伤的肌腱和韧带。
肌腱损伤的一个常见的例子是肩袖撕裂(tear in the rotator cuff tendon)。这通常由过头的行动引起的,并且表现出高的临床发病率。旋转带肌腱(rotator cuff tendon)完整性的丧失导致强度测量减弱,运动和功能范围降低。尽管肩袖撕裂的外科修复实现了高水平的功能改善,并且患者的满意度也很高,但是,有些肌腱修复,特别是大的肌腱或收缩肌腱撕裂,不能治愈或者在外科手术后再被撕裂。和初次治疗相比,对旋转带修复失败后的再修复外科手术的成功率极低。
肌腱修复的基本原理是防止肌腱细胞的凋亡和在受损的肌腱内再生正常的肌腱细胞,但是这需要发展体外培养的表型稳定的肌腱细胞。但是肌腱或韧带的再生需要大量的肌腱细胞。此外,该肌腱细胞的表型应该与机体内的肌腱细胞的表型尽可能接近。理想情况下,培养的肌腱细胞与需要肌腱修复的受试者的肌腱细胞是自体同源的。
目前,没有适当方法来培养一致性程度足够用于修复肌腱或韧带损伤的肌腱细胞。文献中描述的许多方法包括在生长因子(例如类胰岛素生长因子I或II,即IGF-I或IGF-II)的存在下,培养完整的肌腱或者极细碎的肌腱(例如,参见Dahlgren,等2001,AJVR,62(10):1557-1562;Kang和Kang,1999,Yonsei Med.J.,40(1):26-29;Abrahamsson,1996,J.Ortho.Res.,15:256-262;Abrahamsson和Lohmander,1996,J.Ortho.Res.,14:370-376;Abrahamsson等,1991,Ortho.Res.Soc.,9:495-502和503-515;以及Anitua等,2005,J.Ortho.Res.,23:281-286)。虽然这些方法显示出促进了“类肌腱”或“衍生自肌腱”细胞的生长,但是已经充分确定的是,肌腱不仅仅含有肌腱细胞。实际上,肌腱中的大多数细胞为与内皮细胞在一起的成纤维细胞、滑膜细胞和一些软骨细胞。因此,已知的用于培养肌腱细胞的方法不能产生纯的肌腱细胞培养物,而是产生含有纤维细胞、内皮细胞和少量肌腱细胞的混合细胞群。众所周知,肌腱细胞是生长很慢的细胞,这样经常使培养过程中存在的其它细胞过度生长。这就意味着现有技术中的培养衍生自肌腱细胞的方法一般不能产生足够用于组织修复过程的肌腱细胞。
因此,需要一种能培养足以用于组织修复过程的肌腱细胞的方法。
发明内容
因此,本发明的第一方面提供了一种肌腱细胞培养基,该肌腱细胞培养基含有胰岛素或其功能性衍生物。在一些实施方式中,该培养基含有约0.00005%重量/体积至0.1%重量/体积的胰岛素或其功能性衍生物。在其它的实施方式中,该培养基含有约0.0001%重量/体积至0.001%重量/体积的胰岛素或其功能性衍生物。在其它的实施方式中,该培养基含有约0.0006%重量/体积的胰岛素或其功能性衍生物。
第一方面的培养基还可以含有糖皮质激素,例如合成的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。在一些实施方式中,该糖皮质激素为倍他米松(betamethasone)。该培养基可以含有约0.00001%重量/体积至0.1%重量/体积的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。在一些实施方式中,该培养基含有约0.0001%重量/体积至0.001%重量/体积的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。在其它的实施方式中,该培养基含有约0.0002%重量/体积的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。
本发明的第二方面提供了一种肌腱细胞培养基,该肌腱细胞培养基含有糖皮质激素或类糖皮质激素分子。在一些实施方式中,该糖皮质激素为合成的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。在其它的实施方式中,该糖皮质激素为倍他米松。该培养基可以含有约0.00001%重量/体积至0.1%重量/体积的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。在一些实施方式中,该培养基含有约0.0001%重量/体积至0.001%重量/体积的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。在其它的实施方式中,该培养基含有约0.0002%重量/体积的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。
在一些实施方式中,本发明提供了一种肌腱细胞培养基,该肌腱细胞培养基主要由胰岛素或其功能性衍生物组成。在其它的实施方式中,该肌腱细胞培养基主要由胰岛素和糖皮质激素或类糖皮质激素分子组成。本领域技术人员易于理解的是,这些培养基的非必要成分包括血清、抗生素和本领域公知的任何其它常规培养补充物质。
因此,第一和第二方面的培养基还可以含有血清,例如胎牛血清(FBS)。该培养基可以含有约15%体积/体积的血清。
第一和第二方面的培养基还可以含有抗生素。在一些实施方式中,该抗生素可以选自由氨苄青霉素、羧苄青霉素、青霉素、两性霉素、制霉菌素、多粘菌素-B、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素、四环素、大环内酯、里诺霉素(linomycin)、泰妙菌素(tiamutin)和氯霉素所组成的组中的一种或几种。该培养基可以含有1%体积/体积的抗生素。
第一和第二方面的培养基还可以含有L-脯氨酸。在一些实施方式中,第一和第二方面的培养基含有0.0006%重量/体积的L-脯氨酸。
本发明的第三个方面提供了一种培养肌腱细胞的方法,该方法包括在本发明的第一和第二方面的培养基中培育肌腱细胞的步骤。在一些实施方式中,在10%的CO2下培养该肌腱细胞。在其它的实施方式中,该肌腱细胞在2维培养物中。在其它的实施方式中,通过胰蛋白酶和胶原酶从肌腱和/或韧带组织中获得肌腱细胞。
在一些实施方式中,本发明的肌腱细胞培养方法产生充分纯的肌腱细胞培养物(例如,所有存在的细胞中至少80%为肌腱细胞,优选为至少90%,更优选为至少95%)。
本发明的第四个方面提供了由本发明的第三个方面的方法培养的肌腱细胞在肌腱和/或韧带疾病治疗中的应用。在一些实施方式中,该肌腱疾病为肌腱变性(tendinosis)。在其它的实施方式中,肌腱疾病为肌腱撕裂。
本发明的第五个方面提供了由本发明的第三个方面的方法培养的肌腱细胞在肌腱和/或韧带再生中的应用。
本发明的第六个方面提供了由本发明的第三个方面的方法培养的肌腱细胞在肌腱和/或韧带重建中的应用。
本发明的第七个方面提供了治疗肌腱和/或韧带疾病的方法,该方法包括向动物施用由本发明第三个方面的方法培养的肌腱细胞的步骤。在一些实施方式中,该肌腱疾病为肌腱变性。在其它的实施方式中,该肌腱疾病为肌腱撕裂。
本发明的第八个方面提供了再生肌腱和/或韧带的方法,该方法包括向有需要的动物施用由本发明第三个方面的方法培养的肌腱细胞的步骤。
本发明的第九个方面提供了重建肌腱和/或韧带的方法,该方法包括向有需要的动物施用由本发明第三个方面的方法培养的肌腱细胞的步骤。
附图说明
图1表示了逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增的结果,由于检测到了胶原的I和III条带,这表明肌腱细胞在体外保持它们的表型。条带1、3和5为肌腱组织,而条带2、4和6来自体外培养的肌腱细胞。条带1和2代表I型胶原的mRNA。
具体实施方式
在详细描述优选的实施方式之前,应该理解的是,此处所用的术语仅仅是为了描述本发明的特殊的实施方式,而不是为了限定本发明的范围。
此处所引用的所有出版物、专利和专利申请,不管在上文还是在下文中,引入它们的全文作为参考。但是,引用此处所提及的出版物仅仅是为了描述和公开该出版物中报道的可能在本发明中使用的方案和试剂。此处不应理解为承认本发明没有权利通过在先发明使这种公开内容的日期提前。
除非有另外的说明,本发明的实施将使用本技术领域内的组织离解、细胞生物学和细胞培养的常规技术。这些技术在文献中有描述。例如,参见《细胞和分子生物学中的免疫化学方法(Immunochemical Methods in Cell andMolecular Biology)》(Mayer和Walker主编,Academic Press,London,1987);《细胞的分子生物学(Molecular Biology of the Cell)》(Alberts等,GarlandScience,New York,2000);Kruse和Patterson主编的《组织培养(TissueCulture)》(Academic Press,1977)和《动物细胞培养(Culture Of Animal Cells)》(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)。
必须注意的是,此处和随附的权利要求中所使用的单数形式“一个”和“该”包括复数形式,除非上下文明确地表明相反。因而,例如提到的“一个细胞”包括多个细胞,“一个分子”指的是多个分子,等等。
除非有相反的定义,此处所用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域的普通技术人员所理解的通常意义相同。
在下面的描述中,如果没有说明,应当了解的是,细胞培养技术是本领域公知的技术,并且可以采用任何这样的技术。
尽管可以使用与此处描述的材料和方法相似或者等价的材料和方法实施或试验本发明,但是此处描述的是优选的材料和方法。
在一种实施方式中,本发明提供了一种肌腱细胞培养基。此处使用的术语“肌腱细胞培养基”和“培养基”可交换使用,并且指的是用于有选择地使肌腱细胞生长的营养液。本发明的培养基含有如上文和下文中所述的特定的成分,还含有其它非必要成分,这些主要取决于该肌腱细胞的动物源或含有肌腱细胞的组织和使用的培养环境,例如,细胞密度和/或最终用途。该肌腱细胞培养基通常含有有机和无机材料的混合物,并且典型地含有如下种类的一种或几种成分中的至少一种:
1)能源,通常以碳水化合物的形式,例如葡萄糖;
2)全部的必需氨基酸,通常,20种氨基酸加上半胱氨酸构成基本的氨基酸组;
3)维生素和/或其它以低浓度需要的有机化合物;
4)游离的脂肪酸;和
5)痕量元素,其中,痕量元素定义为典型地以极低的浓度需要的无机化合物或天然存在的元素,一般以微摩尔级的量使用。
该培养基可以选择性地添加如下的任意种类中的一种或多种成分:
1)激素和其它生长因子,例如转铁蛋白和表皮生长因子;
2)盐和缓冲剂,例如钙、镁和磷酸盐;
3)核苷和碱基,例如腺苷和胸腺嘧啶核苷、次黄嘌呤;和
4)蛋白质和组织水解产物。
该培养基典型地含有可商购得到的培养基,例如伊格基础培养基(BasalMedia Eagle)(BME)、BGJb Medium、布瑞士特氏BMOC-3培养基(Brinster’sBMOC-3 Medium)、CMRL培养基(CMRL Medium)、不依赖CO2的培养基、杜比科氏改进的伊格培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(D-MEM)、F-10营养素混合物、F-12营养素混合物、格拉斯哥最低极限培养基(GlasgowMinimum Essentia Medium)、改进的Zn++选择性MEM(里克特氏改进)(Improved MEM Zn++Option(Richter′s Modification))、伊斯蔻伍氏改进培养基(Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium)、莱波维特氏L-15培养基(Leibovitz′s L-15 Medium)、麦蔻伊氏5A培养基(McCoy′s 5A Medium)(改进的)、MCDB 131培养基(MCDB 131 Medium)、培养基NCTC-109(MediumNCTC-109)、最低极限培养基(Minimum Essential Media)(MEM)、改进的伊格培养基(Modified Eagle Medium)(MEM)、 I还原的血清培养基( I Reduced Serum Media)、RPMI培养基1640(RPMIMedium 1640)、维伊冒斯氏MB 752/1培养基(Waymouth’s MB 752/1Media)、威廉斯培养基E.(Williams Media E.)和培养基199(Medium 199)。
本发明的肌腱细胞培养基含有胰岛素或胰岛素功能性衍生物。胰岛素是一种激素,天然存在形式的胰岛素由胰脏产生。但是,本发明使用的胰岛素可以是合成的,例如,重组胰岛素,或者是天然胰岛素。
胰岛素的“功能性衍生物”是如Chan等,2000,“Insulin-through the ages:Phylogeny of a growth promoting and metabolic regulatory hormone”(美国动物学家;可以在http://www.findarticles.com/p/articles/mi qa3746/is 200004 /ai n8899929中得到)中所述的分子,该分子具有胰岛素活性,即培养肌腱细胞的能力;该分子包括胰岛素的生物活性片段、胰岛素的变体和胰岛素的衍生物。
在一些实施方式中,胰岛素的“功能性衍生物”或胰岛素的片段或胰岛素的变体具有一个或几个被20种标准氨基酸的天然存在或合成的氨基酸同系物取代的氨基酸残基。这样的同系物的例子有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、3-甲基组氨酸、高丝氨酸、鸟氨酸、β-丙氨酸和4-氨基丁酸(butanoic acid)、β-丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羧基脯氨酸、甲状腺氨酸、γ-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸等等。
可以根据Sehon及其同事(Wie等,同上)的制备与聚乙二醇(PEG)分子共轭的胰岛素的方法,用PEG制备胰岛素的功能性衍生物。此外,可以在胰岛素的化学合成过程中加入PEG。制备胰岛素衍生物或其片段的其它方法包括还原/烷基化(Tarr,Methods of Protein Micro-characterisation,J.E.Silver ed.,Humana Press,Clifton N.J.155-194,1986)、酰化(Tarr,同上)、与适当的载体化学耦合(Mishell和Shiigi,eds,Selected Methods in CellularImmunology,W H Freeman,San Francisco,Calif.(1980),美国专利No.4,939,239)、或适度的甲醛水处理(Marsh,1971,Int.Arch.of Allergy and Appl.Immunol.,41:199-215)。
应该注意的是,术语“功能性衍生物”不包括像类胰岛素生长因子I或II这样的分子。
可以在向培养基中加入待培养的肌腱细胞之前将胰岛素或功能性衍生物加入到培养基中。可选择地,可以在培养的整个过程中向培养基中加入胰岛素或功能性衍生物,例如,在细胞饲养层存在下培养细胞,该细胞饲养层如由分泌胰岛素或功能性衍生物的β细胞形成的层。
此处所用的“片段”是保持胰岛素的功能的胰岛素蛋白的一部分,特别是能够支持培养的肌腱细胞的生长。胰岛素的片段的长度可以为至少约10个氨基酸残基,优选约10-16个氨基酸残基,更优选约10-20个氨基酸残基。
胰岛素的“变体”是具有一处或多处取代的胰岛素分子,因此其二级构象保持不变。这样的保守性的取代包括与原有的氨基酸残基具有基本上相同的疏水性、尺寸和电荷的氨基酸。这样的取代为蛋白或肽化学领域的技术人员所公知的。例如,保守性的取代包括用脯氨酸代替甘氨酸或者相反;用丙氨酸或缬氨酸代替甘氨酸或者相反;用异亮氨酸代替亮氨酸或者相反;用组氨酸代替赖氨酸或者相反;用苏氨酸代替半胱氨酸或者相反;用谷氨酰胺代替天冬酰胺或者相反;以及用精氨酸代替谷氨酸或者相反。
胰岛素的变体的另一个例子为其中的半胱氨酸残基被取代以使由二硫键导致的二聚作用最小化。优选地,半胱氨酸残基被丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸或谷氨酸残基取代。此外,胰岛素或胰岛素片段或胰岛素衍生物的氨基酸侧链可以被化学修饰。另一种改性方式是胰岛素的环化。
本发明的培养基中的胰岛素或功能性衍生物的量一般为约0.00005%重量/体积至0.1%重量/体积。在一些实施方式中,胰岛素或功能性衍生物的含量为约0.0005%重量/体积至0.01%重量/体积。在其它的实施方式中,胰岛素或功能性衍生物的含量为约0.0001%重量/体积至0.001%重量/体积。在其它的实施方式中,胰岛素或功能性衍生物的含量为约0.0006%重量/体积。
在一些实施方式中,所述培养基含有糖皮质激素或类糖皮质激素分子。糖皮质激素是类固醇激素的一类,其特征在于能够与皮质醇受体结合并引发相似的作用,例如影响代谢或消炎或抑制免疫的作用。糖皮质激素可以为天然存在的激素或合成的药物。
适用于本发明的合成的糖皮质激素的例子包括氢化可的松、醋酸可的松(cortisone acetate)、强的松(predisone)、强的松龙、甲基强的松龙、地塞米松、倍他米松、氟羟脱氢皮甾醇、氯地米松、醋酸氟氢可的松(fludrocortisonesacetate)、醋酸脱氧皮质酮(DOCA)和醛基甾酮。
“类糖皮质激素”分子可以为具有糖皮质激素活性(即具有培养肌腱细胞的能力)的任何分子。适用于本发明的类糖皮质激素分子的例子包括抗肝癌物、鱼藤酮(Youssef等,2003,J.Carcinogenesis 2:2)、利福平(Calleja等,1998,Nat.Med.,4:92-96)、甘草皂苷(甘草的一种成分)(Kuroyanagi和Sato,1966,Allergy,15:67-75)、以及醉茄内酯(来自草药睡茄(herb withanthiasomnifera))(Grandhi等,1994,J.Ethnopharmacol.,44:131-135)。
在一些实施例中,该糖皮质激素为倍他米松。倍他米松是一种合成的糖皮质激素,其化学式为C22H29FO5。
本发明的培养基中的糖皮质激素或类糖皮质激素分子的含量一般为约0.00001%重量/体积至0.1%重量/体积。在一些实施方式中,糖皮质激素或类糖皮质激素分子的含量为约0.0001%重量/体积至0.001%重量/体积。在其它的实施方式中,糖皮质激素或类糖皮质激素分子的含量为约0.0002%重量/体积至0.001%重量/体积。
该培养基还可以含有血清。该血清可以来自任何动物,但是一般为牛血清。在一些实施方式中,该血清为胎牛血清。该培养基中的血清的含量可以为约1%%体积/体积至30%体积。在一些实施方式中,该培养基中的血清的含量为约5%体积/体积至20%体积/体积。在其它的实施方式中,该培养基中的血清的含量为约10%体积/体积至15%体积/体积。
该培养基还可以含有一种或多种抗生素。该抗生素为天然的或合成的物质,能杀灭或抑制微生物的生长。适用于本发明的培养基的抗生素的例子包括氨苄青霉素、羧苄青霉素、青霉素、两性霉素、制霉菌素、多粘菌素-B、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、链霉素、四环素、大环内酯、里诺霉素(linomycin)、泰妙菌素(tiamutin)和氯霉素。
该培养基可以含有约0.001%体积/体积至5%体积/体积的抗生素。在一些实施方式中,抗生素的含量为约0.01%体积/体积至0.05%体积/体积。在其它的实施方式中,抗生素的含量为约1%体积/体积。
L-脯氨酸为脯氨酸的L-型立体异构体,是动物蛋白中常见的20种氨基酸之一。只有L-型立体异构体出现在哺乳动物蛋白中。
该培养基的pH值可以为待培养的细胞能够生长的任何pH值。在一些实施方式中,该培养基的pH值为约9.0至约3.0。在其它的实施方式中,该pH值为约5.0至8.0。在其它的实施方式中,该pH值为约7.0至7.5。在其它的实施方式中,该pH值为约7.2。
本发明的培养基可以通过本领域公知的任何方法制备。例如,可以通过将干成分溶解在水中,并调节液体的pH值到适当的值而制备。可以用众多方法中的一种进行灭菌,例如过滤或辐射。然后可以向该培养基中加入任何无菌的流态成分。
然后,可以将待培养的肌腱细胞或含有肌腱细胞的组织加入到该培养基中。此处所用的术语“肌腱细胞”指的是在动物的肌腱中可见的纺锤状成纤维样细胞。肌腱细胞一般具有伸长的细胞核和薄的细胞质,常见于肌腱的胶原纤维上。通常可以根据产生I型胶原和表达标记“软骨发生早期特异性转录因子(scleraxis)”鉴定肌腱细胞。可以用各种方法从任何含肌腱细胞的组织中分离肌腱细胞,这些方法为本领域技术人员所公知。在一些实施方式中,可以通过常规方法从活组织检查材料中分离肌腱细胞。例如,可以从需要肌腱治疗或再生的动物的机体的任何肌腱中提取活体组织。这样的肌腱包括但不限于,屈肌腕桡骨(flexor carpi radialis)肌腱和跟骨肌腱。
在一些实施方式中,该肌腱细胞或含肌腱细胞组织为“自体同源的细胞或组织”,即来自于待接受治疗的动物机体的肌腱细胞或组织。
此处所用的“动物”指的是任何动物,例如人类或对人类有经济价值和/或社会价值的哺乳动物,例如,除人类之外的食肉动物(例如,猫和狗)、猪科动物(猪、大食用猪和野猪)、反刍动物(如畜牛、牛、绵羊、长颈鹿、鹿、山羊、野牛(bison)和骆驼)、以及马。因为鸟类对人类也具有经济价值,因此,本发明还提供了对鸟类的治疗,包括治疗濒临灭绝的、动物园的和家养的鸟类,特别是驯养的禽类,例如,家禽,如火鸡、小鸡、鸭子、鹅、珍珠鸡等。因此,本发明提供了对家畜的治疗,包括但不限于,驯养的猪科动物(猪和大食用猪)、反刍动物、马、家禽等等。该术语不表示特殊的年龄。因此,包括成年的和初生的受试者。
可以从任何含肌腱细胞的组织中(如,肌腱)获得或分离肌腱细胞。肌腱是动物体内连接肌肉与骨胳的组织。该肌腱可以来自动物的任何解剖部分,可以为旋转带肌腱、冈上肌腱、肩胛下肌腱、胸大肌肌腱、腓骨肌腱、跟肌腱(achille’s tendon)、前胫肌肌腱(tibialis anterior)、膝关节前交叉韧带、膝关节后交叉韧带、后腿肌腱、外侧韧带(lateral ligament)、内侧韧带(medial ligament)、髌骨肌腱(patella tendon)、二头肌腱和三头肌腱。
在一些实施方式中,将由活组织检查分离出来的肌腱组织清洗并切碎成外植块,该外植块能够在细胞培养中生长产生自由肌腱细胞。在一些实施方式中,将切碎的组织进行酶消化和/或与能和Ca2+连接或螯合的试剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))作用,细胞和细胞之间的粘接依赖于Ca2+。适用的酶的例子包括胶原酶、胰蛋白酶和蛋白酶中的一种或几种。
在一种优选的方法中,在含有2.5%重量/体积的胰蛋白酶和5.5%重量/体积的胶原酶的不含苯酚红的标准组织培养基中培养不大于1mm的切碎的肌腱组织,在5%的CO2中37℃下培养至少3小时。
在一些实施方式中,在酶消化后,活组织检查材料中的细胞通过将活体组织溶液离心并用细胞生长培养基将得到的沉淀清洗分离。可选择地,然后可以通过过滤将肌腱细胞从该肌腱的其它成分中分离出来,例如使用筛网,如150微米的无菌尼龙筛网。另一种途径是基于一些细胞类型易于强烈地吸附在塑料或玻璃上,从而将它们与吸附不强烈的肌腱的成分分离开。可选择地,可以使用与细胞特异性结合的抗体将细胞从肌腱的其它成分中分离出来,例如,使用与基体结合的或与荧光染料耦合的抗体,然后可以通过具有荧光活性的细胞分选(FACS)技术分离该抗体。
然后可以将细胞加入到本发明的培养基中,在适当的条件下孵育。在一些实施方式中,分离后,在5%的CO2气氛中于37℃下将细胞培养约3天至5周。当然,培养细胞的时间周期可以改变。
如上所述,本发明的培养基含有胰岛素或功能性衍生物和/或糖皮质激素或类糖皮质激素分子。肌腱细胞一般很难在细胞培养中生长,并且易于变得不稳定和去分化。但是,本发明的发明人发现胰岛素尤其能够使肌腱细胞更稳定地生长,甚至在包括软骨细胞、成纤维细胞等其它细胞的存在下的培养中也能够生长。因此,只要本发明的培养基中存在胰岛素,那么肌腱细胞就可以选择性地生长。如在其它地方所描述的,可以将胰岛素由外界加入到该培养基中。可选择地,可以通过将肌腱细胞和能够向培养基中分泌胰岛素的饲养细胞共同培养来天然地产生胰岛素。
因此,在本发明的上下文中,“饲养细胞”或“供食者(feeders)”是能够分泌胰岛素的细胞,这样,共培养的肌腱细胞就能够像本发明要求的那样生长。不管肌腱细胞实际上是在无饲养细胞存在下生长还是在饲养细胞的存在下生长,在一些实施方式中,肌腱细胞达到了需要分离成一个或多个传代培养的细胞密度。每一轮的传代培养称作传代。当将肌腱细胞进行传代培养时,称为将肌腱细胞传代。肌腱细胞的特异性种群有时称作,或者特征在于,其传代的次数。例如,传代了十次的培养的细胞种群被称作P10培养。初级培养,即细胞从组织中分离后的首次培养,记作P0。首次传代培养之后,该细胞被称为二级培养(P1或传代1)。第二次传代培养之后,该细胞成为三级培养(P2或传代2),依此类推。本领域技术人员可以理解的是,在传代过程中可能有许多种群翻倍;因此培养的种群翻倍数大于传代数。传代期间的细胞的增殖(即种群翻倍数)取决于许多因素,包括但不限于,接种密度、基质、培养基、生长条件和传代间隔。
优选地,本发明的方法制备了培养或传代培养的充分纯的肌腱细胞。此处所用的术语“充分纯的”指的是在培养物中,肌腱细胞是主要的细胞,其它污染性细胞(例如成纤维细胞、软骨细胞等等)的数目很少。优选地,培养物中存在的细胞的至少80%为肌腱细胞,更优选为至少90%,最优选为所有细胞中的至少95%为肌腱细胞。
当得到充足数量或体积的肌腱细胞后,可以用标准方法将其存库或储存。例如,可以通过在-180℃下深低温保藏将肌腱细胞常规地储存。本发明的肌腱细胞可以在各种条件下深低温保藏,例如本领域公知的条件。
重要地,优选情况下,在培养阶段或者传代后或者深低温保藏后对肌腱细胞的表型进行评定。有许多种方法评定进行了细胞培养的细胞的表型。一种方法是评定培养的细胞的形态。例如,肌腱细胞是具有伸长的细胞核和薄的细胞质的纺锤状细胞。
对肌腱细胞的表型进行评定的另一种方法是确定该细胞的表达标记是否对该细胞类型具有特异性。例如,肌腱细胞表达转录因子,软骨发生早期特异性转录因子,软骨发生早期特异性转录因子是所有介导肌肉与骨骼连接的连接组织的高度特异性标记。肌腱细胞还表达分化标记,如I型胶原、III型胶原和饰胶蛋白聚糖。
本领域技术人员可以理解的是,可以根据肌腱细胞最终用途对本发明的肌腱细胞进行单层或3-维培养。“单层”是只有一层细胞(2-维)。3-维培养指的是具有深度、宽度和高度的培养,例如在基质或支架上培养生长。
因此,本发明还关注包括接种到基质或支架上的用于组织修复和/或再生的肌腱细胞的组合物,该肌腱细胞优选为自体同源的肌腱细胞。“接种”指的是使肌腱细胞与支持基质或支架接触,在移植前粘附(用粘合剂或不用粘合剂)在支持基质上一段时间。
在本发明的一些实施方式中,细胞只保持在支持基质的一个表面或边缘,或到特定的深度(如此处所述的),即,细胞附着在支持基质的一个表面或与支持基质相邻,如美国公开号20020173806所述,此处一并全部引用作为参考。
在本发明中,优选为均匀接种。众所周知,接种的肌腱细胞的数量不限制最终生成的组织,但是最佳的接种可能提高再生率。最佳的接种量取决于特殊的培养条件。在一些实施方式中,在该基质上接种约0.05-5倍的天然组织类型的生理细胞密度,即,在肌腱中的生理细胞密度。在另外的实施方式中,细胞密度可以为每毫升约1×105-1×108个细胞,一般为每毫升约1×106个细胞。
该支持基质或支架可以为用粘合剂或不用粘合剂的适于肌腱细胞或细胞粘附的任何形式的支持基质或支架。例如,而不限于,该支持基质或支架可以为膜、微珠、羊毛、纤维或凝胶和/或它们的混合物的形式。该支持基质或支架可以由具有移植所需的物理或机械特性的各种材料制成,例如作为止血屏障。止血屏障防止附属的细胞和组织渗透到处理过的缺陷区域。
该支持基质或支架优选由半渗透性材料制成,可以包括交联的或非交联的胶原,优选为与III型胶原或II型胶原结合的I型胶原。该支持基质或支架还可以包括天然获得的或合成的多肽或者蛋白质,例如透明质酸、小肠粘膜下层(SIS)、腹膜、心包膜、聚乳酸和相关酸、血液(即,包括具有悬浮的成形的成分(血红细胞、白细胞、血小板)的流动部分(血浆)的循环组织),或者可生物再吸收的其它材料。本发明也可以使用可生物再吸收的聚合物,例如,弹性蛋白、纤维蛋白、昆布氨酸和纤连蛋白。本发明还可以使用美国公开号20020173806中所述的支持基质或支架的材料,该专利全部引入此处作为参考。
此外,该支持基质或支架优选为最初(例如,在与待移植的细胞接触前)没有与完整的细胞接触过的,并且在动物受体内能够再吸收。该支持基质或支架可以具有一个或多个表面,例如多孔的表面、致密的表面或它们的结合。该支持基质或支架还可以包括半渗透性、不渗透性或完全渗透性表面。例如,美国专利No.6569172中描述的具有多孔表面的支持基质,该专利全部引入此处作为参考。
该支持基质为自体同源的或异源的。在一些实施方式中,适用的自体同源的支持基质由血液形成,例如在2002年4月9日公开的Berretta等的美国专利No.6368298中的基质实例,该专利全部引入此处作为参考。
适用的基质或支架可以为固体的、半固体的、凝胶的或类凝胶的基质或支架,其特征在于,能够在一段时间内保持稳定状态,以使在移植前后细胞能在其上附着和/或生长,并且提供与细胞生长的自然环境相似的体系以使细胞能最好地生长。适用的支持基质的例子由美国公开No.20020173806中所描述,该专利全部引入此处作为参考。
在一些实施方式中,支持基质或支架和/或细胞单个地或组合地通过粘结剂(例如,生物相容的胶,如自体同源或异源的纤维蛋白胶)或物理的或机械的保持方式(如可再吸收的针状物)结合,以有助于将本发明的修复结构保持在移植位点中或者之上。
适用于肌腱细胞生长的支持基质或支架的其它例子包括VitrogenTM(一种含有胶原的溶液,其中,该溶液形成凝胶以成为细胞生长的基质)、Hwang(美国专利申请No.20040267362)的结缔组织支架、Kladaki等(美国专利申请No.20050177249)的结缔组织支架、Giannetti(美国专利申请No.20040037812)的结缔组织支架和Binette等(美国专利申请No.20040078077)的结缔组织支架。适用的支架(例如Hwang的)不仅能够理想地支持肌腱细胞生长,而且能够被移植到动物体内以修复受损的肌腱或韧带组织。
该支持基质或支架可以被切割成或形成为任何规则或不规则的形状。在一种优选的实施方式中,该支持基质或支架可以切割成与损伤处的形状相符的形状。该支持基质或支架的形状可以是平面的、圆的和/或圆柱的。该支持基质的形状还可以制成与受损的特殊组织的形状相符合的形状。如果该支持基质为纤维材料或者具有纤维特性,该支持基质可以织成所需要的形状。可选择地,该支持基质可以为凝胶、类凝胶或非纺织材料。
在一些实施方式中,本发明的支持基质或支架可以接种多种细胞类型,并且在该支持基质或支架的不同部位上和/或该支持基质或支架的不同部位中和/或该支持基质或支架的不同部位整个部分和/或与该支持基质或支架的不同部位相邻具有不同的细胞类型。例如,该支持基质的一部分可以包括第一细胞类型(例如肌腱细胞),该基质的其它部分可以包括第二细胞类型(例如肌肉细胞)。
再例如,如果该支持基质或支架为具有两个面和一个边缘的盘形,第一面可以包括位于其上的第一细胞类型(例如肌腱细胞),第二面或边缘可以包括位于其上的第二细胞类型(例如肌肉细胞)。
在另一种实施方式中,可以使两个或多个支持基质或支架彼此接触。在这样的实施方式中,第一支持基质可以在任意一个支持基质与一种或多种细胞类型接触前、中或后与第二支持基质接触。
将肌腱细胞或其它细胞接种到该支持基质或支架上后,将该支持基质或支架和细胞移植到受损的组织中,使细胞与待治疗的表面相对。在一种实施方式中,可以使用覆盖贴(covering patch)进行保护(例如)。
在一些实施方式中,该覆盖贴用于将受损处遮盖以进一步防止周围环境中的不利的物质(例如成纤维细胞或巨噬细胞)渗透。在一种实施方式中,该覆盖贴可以为此处所述的任何支持基质,和/或可以包括胶原(I/III型)、透明质酸、纤维蛋白和聚乳酸。优选地,该覆盖贴为不含有细胞的并且可以再吸收,而且可以为半渗透性的。
在一种实施方式中,可以利用或不用粘结剂或胶,将该支持基质或支架和细胞注射到移植位点。
本发明的接种后的支持基质或支架还可以具有各种药理学的活性,包括但不限于,抗微生物、抗病毒;在注入到支持基质之前,可以向生物相容的且可生物分解的支持基质材料中加入抗生素,适于待再生和/或修复的组织类型的生长因子、血液凝结调节剂(例如肝素等等),以及它们的混合物或它们的合成层。
本发明的接种后的支持基质或支架还可以包括生长因子,例如适用于待再生和/或修复的组织类型的自体同源的和非自体同源的生长因子,包括但不限于,转化生长因子(例如TGF-β-3)、骨形态发生蛋白(例如BMP-2)、甲状旁腺相关蛋白(PTHrP)、护骨蛋白(OPG)、印度刺猬因子(Indianhedgehog)、核因子κB活化因子的配体(RANKL)和类胰岛素生长因子(IgF1),如美国申请No.20030144197中所述,它们一并全部引入此处作为参考。
如上所述,本发明还可以包括与基质和/或生物相容性材料和/或细胞接触的生物相容性胶。这样的生物相容性胶或粘结剂可以包括有机纤维蛋白胶(例如,可以从澳大利亚的Baxter得到的基于纤维蛋白的粘结剂TisseelTM,或者在外科手术室用自体同源血液样品制备的纤维蛋白胶)。
如上所述,培养的肌腱细胞可以用于肌腱和/或韧带的再生和重建。肌腱和/或韧带的再生和重建可以为部分的或全部的,可以部分或全部地恢复受损肌腱或韧带的运动范围。例如,可以用本发明培养的肌腱细胞修复损伤的肌腱,修复的方法如Cao等2002(Plast Reconstr Surg 110:1280-1289)或Curtis等2005(欧洲细胞和材料(European Cells and Materials)9:50-57)所述。
培养的肌腱细胞可以用于任何肌腱和/或韧带的再生和/或重建。例如,肩、肘、膝盖和踝关节是肌腱或韧带最常受到损伤的部分。因此,培养的细胞可以用于旋转带肌腱、冈上肌腱、肩胛下肌腱、胸大肌肌腱、腓骨肌腱、跟肌腱、前胫肌肌腱、膝关节前交叉韧带、膝关节后交叉韧带、后腿肌腱、外侧韧带、内侧韧带、髌骨肌腱、二头肌腱和三头肌腱的再生或重建。
该培养的肌腱细胞还可以用于治疗或预防肌腱或韧带疾病。
此处所用的“治疗”或同等语法词语包括对动物受试者内肌腱或韧带疾病的任何治疗,所述动物受试者优选为人类;所述治疗包括:(a)防止易患但未诊断出患有肌腱或韧带疾病的受试者出现肌腱或韧带疾病;(b)抑制肌腱或韧带疾病的发展,即阻止它的发展;或者(c)减轻或改善肌腱或韧带的症状,即使该病的症状减轻。就完全或部分抑制该病或其征兆或症状的发展而言,其效果可以是预防性的;和/或就部分或完全治疗该病而言,其效果可以是治疗性的。
“疾病”指的是不正常的状态,例如身体的一部分结构或功能处于不正常的状态。因此,例如,肌腱或韧带疾病指的是肌腱或韧带的不正常的结构或功能。
肌腱疾病的例子包括肌腱变性和肌腱炎。
术语“肌腱变性”指的是由萎缩(老化、微创、血管损伤)引起的肌腱内部变性。组织学中存在一种伴随纤维定向障碍、骨髓功能抑制、散生脉管向内生长和偶发的局部坏死或硬化的非炎症性肌腱内部胶原变性。临床上经常存在可触诊的肌腱结节,该可触诊的肌腱结节可以是无症状的,但是也可以为压痛点。不存在腱鞘的肿胀。
“肌腱炎”指的是肌腱的扭伤或撕裂,是伴随脉管断裂和炎症性修复反应的肌腱的有症状的变性。其症状是炎症性的。根据肌腱炎的阶段(急性的-两周内,亚急性的-四或六周,和慢性的-六周后),可能出现血肿或细胞坏死相关的萎缩。组织学上存在三种可识别的子群:1)因急性出血和撕裂导致的纯炎症性;2)由于先出现的变性并发(superimpose)炎症;和3)在慢性疾病中的硬化和肌腱变性的变化。
“包括”指的是包括但是不限于,“包括”这个词后面的任何物质。因此,使用的词语“包括”指的是列出的项目是必需的或强制性的,但是其它项目是可选择的,可以存在或不存在。“由......组成”指的是包括并且限制于短语“由......组成”后边的任何物质。因此,术语“由......组成”表示列出的项目是必需的或强制性的,不可能存在其它的项目。“主要由......组成”指的是包括该短语后边列出的任何项目,对其它项目的限制是不干扰或不影响列出的项目在本发明中的特异性的活性或作用。因此,短语“主要由......组成”指的是列出的项目是必需的或强制性的,但是,根据是否影响列出的项目的活性或作用,选择性地包括其它项目,这些项目可以存在或不存在。
下面,将通过参照下面的非限制性实施例进一步对本发明进行描述。然而,应该理解的是,下面的实施例只是作为说明的目的,决不能不能当作对上述发明的概括的限定。特别地,当本发明的详细描述中涉及使用胰岛素时,应该清楚理解的是,此处的发现不限于胰岛素本身,而且包括上述胰岛素的衍生物。
实施例1用于培养的肌腱组织的获得
通过针活组织检查从人和马的髌骨肌腱获得50克至100克正常的肌腱组织。将该组织在含有10%体积/体积的胎牛血清(FBS)的不含酚红的199培养基(Invitrogen公司)中在室温下贮藏不超过72小时。
用199培养基清洗该组织,切成尺寸不超过1mm的块,将切碎的组织块在5%CO2培养箱中在含有2.5%重量/体积的胰蛋白酶和5.5%重量/体积的胶原酶的不含酚红的199培养基中于37℃下消化至少3小时。
将肌腱消化物通过45微米的过滤器以将肌腱细胞与肌腱消化物的残余物分离。然后对该肌腱细胞进行计数,然后接种在25cm2的培养瓶中进行培养。
实施例2肌腱细胞的培养
将实施例1制得的肌腱细胞以103至104个细胞/毫升的密度置于含有培养基的培养瓶中。该培养基含有杜比科氏改进的伊格培养基(DMEM)(Invitrogene公司)、15%体积/体积的胎牛血清、0.0006%重量/体积的胰岛素、0.0002%重量/体积的倍他米松、0.5%重量/体积的青霉素、0.5%重量/体积的链霉素和0.6%的L-脯氨酸,pH值为7.0。在5%的CO2中,37℃下培养该细胞。每三天更换培养基,培养3至5周,直到细胞在第五次传代时达到最大细胞数,一般为20×107个细胞。
实施例3人类肌腱细胞的特征
检测由实施例2所述的条件下培养的肌腱细胞的肌腱细胞标记的表达,I型和III型胶原mRNA,以确定该肌腱细胞是否在体外保持其生物合成能力。用RNAeasy Mini Kit(QIAGEN,澳大利亚)从肌腱组织(对照)和在实施例2所述的条件下培养的肌腱细胞中提取总的RNA。进行RT-PCR以产生并扩增I型和III型胶原cDNA以及来自管家基因(甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH))的DNA。用如下的引物对进行PRC扩增:
I型胶原
有义链
5′CTCGCTCACCACCTTCTCTC 3′(SEQ ID NO:1)
反义链
5′TGTTCTGAGAGGCGTGATTG 3′(SEQ ID NO:2)
生成大小为464bp的产品。
III型胶原
有义链
5′ACCAACCTCTTCCTGAAGCC 3′(SEQ ID NO:3)
反义链
5′CACCATTGAGACATTTTGAA 3′(SEQ ID NO:4)
生成大小为254bp的产品。
人类甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)
有义链
5′TCACCATCTTCCAGGAGCGA 3′(SEQ ID NO:5)
反义链
5′CACAATGCCGAAGTGGTCGT 3′(SEQ ID NO:6)
生成大小为293bp的产品。
标准条件下,在热循环机中进行30个PCR循环,除了退火时间为40秒,I型和III型胶原的引物的杂交在60℃下进行,GAPDA引物的杂交在62℃下进行。
用电泳分析该PCR反应产物,结果如图1所示。可以看出,在本发明的培养基中培养的肌腱细胞和肌腱组织一样表达I型和III型胶原mRNA。
序列表
<110>西澳大利亚大学
<120>培养肌腱细胞的方法
<130>FP25319
<140>PCT/AU2007/
<141>2007-03-22
<150>澳大利亚临时专利申请No.2006901495
<151>2006-03-23
<160>6
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>现代人(Homo sapiens)
<400>1
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>现代人
<400>2
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>现代人
<400>3
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>现代人
<400>4
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>现代人
<400>5
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>现代人
<400>6
Claims (17)
1、一种肌腱细胞培养基,该肌腱细胞培养基含有胰岛素或其功能性衍生物。
2、根据权利要求1所述的肌腱细胞培养基,该肌腱细胞培养基含有约0.00005%重量/体积至0.1%重量/体积的所述胰岛素或其功能性衍生物。
3、根据权利要求1或2所述的肌腱细胞培养基,该肌腱细胞培养基含有约0.0001%重量/体积至0.001%重量/体积的所述胰岛素或其功能性衍生物。
4、根据权利要求1-3中的任意一项所述的肌腱细胞培养基,该肌腱细胞培养基含有约0.0006%重量/体积的所述胰岛素或其功能性衍生物。
5、根据权利要求1-4中的任意一项所述的肌腱细胞培养基,该肌腱细胞培养基还含有糖皮质激素或类糖皮质激素分子。
6、根据权利要求5所述的肌腱细胞培养基,其中,所述糖皮质激素为合成的糖皮质激素或类糖皮质激素分子。
7、根据权利要求5或6所述的肌腱细胞培养基,其中,所述糖皮质激素为倍他米松或倍他米松的生物活性片断、变体或衍生物。
8、根据权利要求5-7中的任意一项所述的肌腱细胞培养基,该肌腱细胞培养基含有约0.00001重量/体积至0.1%重量/体积的所述糖皮质激素或类糖皮质激素分子。
9、根据权利要求5-8中的任意一项所述的肌腱细胞培养基,该肌腱细胞培养基含有约0.0001%重量/体积至0.001%重量/体积的所述糖皮质激素或类糖皮质激素分子。
10、根据权利要求5-9中的任意一项所述的肌腱细胞培养基,该肌腱细胞培养基含有约0.0002%重量/体积的所述糖皮质激素或类糖皮质激素分子。
11、一种肌腱细胞培养基,该肌腱细胞培养基主要由胰岛素或其功能性衍生物组成。
12、一种肌腱细胞培养基,该肌腱细胞培养基主要由胰岛素或其功能性衍生物、和糖皮质激素或类糖皮质激素分子组成。
13、一种培养肌腱细胞的方法,该方法包括在权利要求1-12中的任意一项所述的培养基中培养肌腱细胞或含有肌腱细胞的组织的步骤。
14、由权利要求13所述的方法培养的肌腱细胞在治疗肌腱和/或韧带疾病中的应用。
15、由权利要求13所述的方法培养的肌腱细胞在肌腱和/或韧带的再生或修复中的应用。
16、一种治疗肌腱和/或韧带疾病的方法,该方法包括向动物施用由权利要求13所述的方法培养的肌腱细胞的步骤。
17、一种使肌腱和/或韧带再生的方法,该方法包括向有需要的动物施用由权利要求13所述的方法培养的肌腱细胞的步骤。
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