JPH05502578A - 冷却の方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 冷却の方法及び装置 本発明は物質の冷凍方法及びかかる方法に用いる装置に関する。

本発明は、凍結時の過冷却の影響を最小限に止めることかできて被冷凍物質に与 える損傷を軽減或いは防止することができるので、数多くの分野に用途を有する 。特に、本発明は次の用途に用いることができる（Ａ）冷凍食品工業。

（Ｂ）　ヒトの胚やその他の動物の胚の凍結保存。

（Ｃ）移植のためのヒトの器官の冷凍：（Ｄ）少量又は大量の、血液、骨髄及び 微生物などの細胞懸濁液の冷凍。

（ε）その他の生物材料、特に細胞（植物であっても動物であってもよい）材料 の冷凍：及び （Ｆ）その他の物質の冷凍、特に、例えば凍結乾燥及び／又は非常に規則正しい 結晶質固体の製造の場合のように、制御された条件の下で冷凍しなければならな い場合。

種々の商工業プロセスにおいて数多くの物質を冷凍又は凝固させる必要がある。

冷凍は、製造プロセスの一部である場合もあるし、物質の貯蔵特性を向上させる ための手段である場合もある。冷凍による食料品の貯蔵は、それらの鮮度を長期 間維持するだめの一般的な方法である。他の技術分野においても同様に、凍結保 存か、生物材料、特にヒトや他の動物の胚などのように極めて損傷し易くしかも 貴重な材料を必要な時まで保存するための最も重要な方法であると認められてい る。凍結保存技術の生物材料への応用の可能性はさらに増加すると期待されてお り、角膜、膵臓、腎臓、肝臓及び心臓などの移植用のヒトの組織及び器官は大幅 に不足している。

食料品の冷凍、生物材料の凍結保存、及びその池の物質の凝固は、同等共通点を もたない商工業プロセスのようにみえるが、実際には共通の大きな問題かある。

「物質」　（この用語は包括的な用語として用いる）を冷却する際、固相の核発 生（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）が起こる前に物質中の液体（例えば生物試料中の細 胞を取囲む媒質中の液体）がその凝固点より低い温度まで過冷却されることかよ くある。これは過冷としても知られる。過冷却又は過冷は物質に損傷を与える恐 れがあり、例えば胚の場合、以下に述べる作用のために、それらの生存を妨げる ことさえある。（以下の説明は液体の水を含む物質と氷晶の生成に関するもので あるが、同じ原理がその他の液体／固体系に当てはまる。） 従来の方法に従って水性物質を一定速度で冷却すると、該物質の温度は液体の核 発生点に到達するまで周囲の温度降下とともに降下する。過冷却傾向のために、 核発生は融点より低い温度で起こるであろう。核発生点において物質中の水は水 晶となり、その際に融解の潜熱を放出する。物質の温度はここで核発生点からほ ぼ融点まで上昇する。物質及び／又はその会合水から融解潜熱が失われるとと、 物質の温度は再び降下し始める。しかし、周囲の温度はこの段階に至るまでの間 にさらに低下しているので、物質の温度と周囲の温度との間にかなりの温度差が でき、物質の冷却速度が増大する。このため、十分に制御できないまま氷晶が生 成してしまい、その大きな結晶によって悪影響がもたらされることもある。

このことが冷凍食品工業で現実の問題となっている。

食品工業において従来用いられてきた技術は、食品を冷凍するのに送風式又はト ンネル式冷凍機を用いるもので、食品は低温の気体で冷却される。冷凍機内には 気体温度の勾配があり、食品が導入される末端部分が最も暖かく、食品が冷凍機 内を進むにつれて徐々に低くなる。試料は最初のうちは気体温度と平行して冷却 される。しかし、核発生後、食品の温度は潜熱プラトー域まで上昇する。

ここで、食品から周囲の環境への熱の喪失速度は温度差に比例するが、この温度 差は潜熱が奪われている間は増大する。従って、食品温度降下は融解潜熱の放散 が終わるまでこの発熱域に止められるか、潜熱の放散か終わった時点で試料の温 度は環境温度と急速に平衡化し、その結果温度の急激な降下が起こる。

冷凍食品工業において、ある種の小果樹の果実（例えば、モモ、プラム、キイチ ゴ）及び海産食物（例えば、ロブスタ−１蟹、海老、魚）などは解凍時の品質の 悪いことが多い。その他の小果樹の果実（例えば、ストロヘリ−、キーライフル ーツ、マンゴ−）、各種の野菜（新ジャガイモ及びアスパラガスのような）及び 乳製品（例えば、シングルクリーム）においてはこの問題はさらに深刻で、これ らの製品は商業ベースでは冷凍されない。

このような凍結・融解による損傷の主な要因は、氷晶核が制御されないまま生成 することと氷晶核か潜熱プラトー域において長期にわたって引き続き成長するこ とによって起きる機械的損傷のためにテクスチャーが損なわれることにある。

アイスクリーム、シャーベット及び氷のような冷凍状態で消費される製品の品質 は、氷晶の大きさと分布に関連するが、それらの生成を制御するのは困難なこと が多い。さらに、従来の冷凍方法においては、試料中の水は外側から核発生し始 めて、中心に向かって氷が広がる。

試料の周辺部で潜熱が放出されるので中心部は熱的に緩衝されており、そのため 「外殻」凍結（ｓｈｅｌｌ　ｆｒｅｅｚｉｎｇ）が起こる。

敏感な生物学的細胞材料及び細胞材料を凍結保存する場合、過冷却又は適冷によ って別の有害な影響ももたらされる。氷は媒質中で生成するので、残存液体中の 溶質濃度は増大する。浸透圧によって水が濃度の高い媒質の方に移動する結果、 細胞が脱水される。細胞が脱水するほどの時間がなかったとしても、その場合に は細胞内で水が生成して、概して細胞に致命的な作用を与える。

過冷却に起因する潜在的問題を最小限に食出めるために、欧州特許公開（ＥＰ− Ａ）第０２４６８２４号には、何種類かの固体物質を使用すると、水性媒質中の 水を媒質の凝固点又はその付近で核発生させることができると教示されている。

しかし、従来法に比して相当な改良がみられるこの方法にしても、改良点以外の 従来の冷却方法においては、媒質の融解潜熱の少なくとも若干が放出される温度 プラトー期後の比較的急速な冷却が起こる際に損傷が起きないように依然として 注意する必要がある。

上記の議論は、水を含む（特に相当な量の水を含む）物質を中心にしたものであ る。水はその凝固点よりも低い温度に冷却される傾向が強く（過冷却又は適冷効 果）、氷の成長を制限するような膜結合区画を数多く有する生体組織を冷却する 場合には問題が生じる。氷核発生を起こさせるための種々の方法が記載されてい る。多数の無機化合物（代表例としてはヨウ化銀）、有機化合物（土掘の欧州特 許公開第（１２４６８２４号参照）並びに「氷核発生Ｊ細菌（キサンモナス　（ Ｘａｎｌｈａ＋ｎｏｎａ＋）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ＋）属 及びエルウィニア　（Ｅ＋ｖｉｎｉａｌ属に属するもの）が、過冷却状態の水中 での有効な氷核発生剤となる結晶格子構造を有していることが実証されている。

上記の化合物はそれぞれ、例えば、雨雲の種、生物学的凍結保存並びに雷発生な どの用途に用いられるが、これらは毒性、法規又は適用上の問題のために食料品 に用いるのは難しい。

前述の通り、食料品を工業的に冷凍する場合、未制御状態での核発生の問題が大 きな障害となる。生物試料の凍結保存という幾分特殊な分野においても、同様の （或いはいっそう困難な）問題が生じているが、欧州特許公開第０２４６８２４ 号に開示された種添加の方法以外にも、比較的制御された状態で核発生を起こさ せる幾つかの試みか行なわれてきた。例えば、氷核発生はこれまで（ａ）機械的 振動、ｆｂ）熱電気衝撃、（ｃｌ熱衝撃又は（ｄ）氷晶の直接添加のいづれかに よって開始されてきた。

機械的振動法は試料を損傷する恐れのある非効率的で面倒な方法である。熱電気 衝撃は、液体試料を封入した固体ケース又は容器内の試料に電流を通すことによ って与えることかできる。この方法はペルティエ熱電対効果の逆を利用したもの である。熱衝撃は、試料をはるかに低い温度の表面と接触させるか、或いは予冷 した金属線又はガラス棒を挿入することによって達成できる。上記の方法の中で 最も難点の少ないのは、液体試料又は固体表面に直接氷晶を加える方法であろう 。最後の３つの投入式方法は食料品には不適切である。従って、過冷却とそれに 続く核発生の重大な因果関係を回避するための優れた非投入式方法に対する必要 性が存在する。

本発明は上述の問題に取り組んだもので、種々の比較的簡単な方法によって実施 できる驚くほど簡単でかつ洗練された解決法を与えるものである。

本発明は、その最も広範な第一の態様において、液体含有物質の冷凍方法にして 、物質から熱を抽出すること、及び凍結時に失われる潜熱を少なくとも部分的に 補償するために熱抽出速度を変化させることを含んでなる方法を供する。

より詳細には、本発明はその第二の態様において、液体含有物質の冷凍方法にし て、物質から該物質の融解潜熱が失われつつありしかも物質の温度がさほど降下 していない間に第一の速度で物質から熱を抽出すること、及びその後物質の温度 か降下する時に第二の速度で物質から熱を抽出することを含んでなり、しかも第 一の熱抽出速度が第二の熱抽出速度より犬である方法を供する。

本発明は、このように、融解潜熱の失われる際に試料か温度「プラトー域」で費 やす時間を最小限に抑えること、或いは少なくとも減少させることを目的とする 。生物試料の冷凍に関連して、凍結保存した雄牛精子の生存率が潜熱プラトー域 での時間と反比例することか実証されている（Ｐａ＋ｋｉｎｓｏｎ及びＷｈｉｆ ｔｉｅｌｄ、　Ｔｈｅ＋ｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ２７　（５）　７８１−７９７． 　（１９８７））　、しかし、Ｐ＋＋ｋｉｎ＋ｏｎ及びＷｈｉｔｌｉｅｌｄの提 唱する冷却速度は、−１５℃〜−２５℃ではなく５℃〜−１５°Ｃという遅いも のである。さらに、問題は生体系の生存率たけに限られない。特に食料品の場合 、潜熱プラトー域における時間が長すぎると、機械的には氷晶の影響による損傷 が生じ、化学的には例えば準凍結状態における異常な浸透圧の影響による損傷が 生じる。

潜熱プラトー域における時間が長くなると長い結晶が生成し、後で製品を解凍し たときに製品の品質か劣化することか観察されている。

本発明の方法の熱抽出制御によれば、被冷凍物質が有害な影響を殆どもしくは全 く受けないように冷却速度を制御することかできる。特に、融解潜熱の少なくと も一部が物質から放出されるので熱抽出速度が増大する。ただし、かなりの量の 融解潜熱が物質から放出される間は物質の温度はさほど降下しない。潜熱の少な くとも若干か放出された後は、温度降下幅か過大にならないように熱抽出速度を 下げる必要がある。従って、熱抽出の第一速度は温度が上昇もしくは一定の時又 は物質の温度降下速度が十分てない（例えば毎分１℃未満１．場合によっては毎 分０．１℃）時に適用し、第二速度は温度降下速度か０１℃／分以上の時、場合 によっては１°Ｃ／分のときに適用する。

本発明によれば、被冷凍物質を低温貯蔵環境下に移す前の冷凍装置内での滞留時 間の短縮が可能になるが、これは大きな利点である。

熱抽出に関して用いる「速度」と言う用語は、熱抽出の第−又は第二速度が一定 であるという意味でないことに留意されたい。これらの速度の一方又は両方か変 化することもあり、場合によっては非直線的及び／又は断続的な冷却を達成する ために熱抽出速度を変化させた方が好ましいこともある。一つの「断続的冷却」 プロフィールとしては、初期冷却速度、それに続く等温維持、さらその後の冷却 速度（この速度は初期冷却速度と異なってもよい）からなるものか挙げられる。

非直線的及び断続的冷却プロフィールは、生物学的用途たけてなく非生物学的用 途にも用いられる。総括すれば、本発明においては第二の熱抽出速度は第一の熱 抽出速度よりも低くなければならない。

熱抽出速度に関して用いる「第一」という用語は、潜熱プラトー域に到達する以 前に異なる熱抽出速度を用いることを除外するものではない。

本明細書で用いる「凍結」という用語は、例えば生物材料及び／又は食料品のよ うに、それぞれ１種類もしくはそれ以上の溶媒と溶質との複雑な混合物に用いら れる場合、必ずしもその材料に含まれるすべての物質か固体状態にあることを意 味しない。例えば−２５℃のイチゴなどの冷凍食品の場合、この温度で果物の約 １０％は液体であるが、かかるイチゴは通常の言い方では「凍結」されていると 呼ばれる。「凍結」という用語はこのような意味で用いられており、これと同語 源の用語はこれに準じて解釈されなければならない。

熱抽出の第二速度は凝固しつつある又は固体の物質の冷却速度を決定する。選択 すべき冷却速度は、例えば水溶液系中で大きな氷晶を生成させてしまうことなど によって、物質に損傷を与えることのないような速度でなければならない。

熱抽出の第二速度は、物質の性質に応じて大幅に変化する。例えば哺乳類の胚の 場合、第二熱抽出速度は、少なくとも一５℃から一３０℃の温度範囲において、 冷却速度が毎分０．５°Ｃ以下（好ましくは毎分約０３°Ｃ）となるようなもの でなくてはならない。ただし、便宜上の理由から、上記の制限内で冷却はできる たけ迅速でなければならない。これらの基準は哺乳類の胚に適用されるもので、 その他の物質にはそれぞれ独自の基準かある。例えば、ハイブリドーマ、リンパ 球、組織培養細胞（例えば哺乳類）及び各種の微生物はこれより高い速度、例え ば毎分０５℃〜１．５°Ｃ（毎分約１°Ｃなど）で冷却することができる。さら に他の物質の場合、例えばカキの胚においては冷却速度は毎分約５°Ｃであり、 赤血球の場合のこの速度は毎分数千℃、例えば毎分約３０００’Ｃ／分にも達す る。

本発明においては、熱抽出の第一速度は、物質の融解潜熱が失われている間に適 用される。ただし、熱抽出の第一速度が適用される間に融解潜熱の「全部」が放 出されることを意味すると解釈してはならない。例えばどんな水性試料において も、潜熱は核発生温度から共晶温度又はガラス転移までに至るまでの間放出され る。しかし、凝固点及び摂氏温度にしてそれより数度（例えば５又は１０℃）低 い温度において、大部分（例えば７０％以上又は８０％、さらには９０％以上） が放出されるのが一般的である。熱抽出の第一速度は、水の大部分（例えば８０ ％以上、さらには９０％以上）が氷に変化する間、換言すれば、物質の融解潜熱 全体のうちの大部分（例えば８０％以上、さらには９０％以上）が放出されてい る間に適用するのが好ましい。

塩化ナトリウムのような単純な溶質の相図から、系内に存在する未凍結水の量が 温度に従って指数関数的に減少することが分かる。零度以下の温度においては、 未凍結水の割合は未凍結溶液の浸透度に直接関係する。食品工業で重要な溶液の 場合（例えば０５及び０．２５Ｍの塩化ナトリウム溶液及びそれらの等何物）、 氷の８０％は−１゜℃までの間に生成する。

本発明は、このように、冷凍の間又は好ましい具体的態様においては約８０％の 水が氷に変化する間に、潜熱を効率よく除去するという思想を具体化したもので あることが分る。相図が利用できない系においても、融点（即ち、潜熱プラトー 域）からそれより５℃又はＩＯ’Ｃ低い温度までの間に潜熱が効率的に除去され る。効率性はある程度相対的な概念であるが、本発明の一つの具体的態様におい ては、仮に、−３０℃における従来の送風式冷凍方法に従った場合の時間の５０ ％以下で潜熱の除去（例えば、上記の程度までの）が達成された場合には効率的 であると考えられる。

本発明の方法は生物試料の冷凍及び凍結保存に特に適しており、これらの試料は 本発明で冷凍てきる物質の好ましい具体例を構成する。「生物試料」という用語 は、細胞（真核細胞及び原核細胞の両者を含む）、多数の細胞で構成される器官 及び組織、胚、ウィルスなど（これらは天然物でもよいし、遺伝学的手法その他 の方法て修飾されたものでもよい）、並びに核酸、タンパク質、糖タンパク質、 脂質及びリポタンパク質などの生物学的に活性な分子を包含したものである。物 質に存在又は物質を構成する液体は通常は水であるが、本発明は水性物質に限定 されない。

本発明は動物の細胞、特に配偶子又は受精卵／胚の凍結保存に用いることができ るが、その他の動物細胞及び植物細胞も本発明によって好適に冷凍できる。

本発明のもう一つの重要な用途は冷凍食品工業にあり、この分野では風味及び／ 又はテクスチャーの保存などの理由から、食品を迅速かつ効率的にしがも食品を 構成する生物材料その他の物質をさほど損傷することなく冷凍することが重要で ある。例えば、小果樹の果実を従来の方法で冷凍すると、その風味及び／又はテ クスチャーの大半が損なわれる。従って、物質は、好ましくは、野菜、パンその 他のベーカリ製品、肉、魚、海産食物（例えば、ロブスタ−１蟹、エビ、魚）な どの食料品、又は果物、特にモモ、プラム、キイチゴ、イチゴ、キーライフルー ツ、マンゴ−などの小果樹の果実である。非水系及び懸濁液、例えばチョコレー ト（ブラック、ミルク又はホワイト）、アイスクリーム、クリーム及びマヨネー ズなども、再構成食品と同様に本発明によって冷凍できる。

本発明は制御状態で冷凍する必要のある非生物材料にも適用できる。このことは 、結晶生成の速度と性質が重要となるある種の食料品及び／又はその他の物質に 必要とされる又は望まれることである。シャーベットと水がこの範鴫に入る。

本発明は、移植用の器官、並びに血液、骨髄及び微生物などの大量の細胞懸濁液 の凍結保存にも適用できる。

被冷凍試料の容積はさほど重要ではないか、生物科学において配偶子又は受精卵 ／胚を冷凍又は凍結保存するときの試料の容積は一般的には１ｍ１未満て、０． ５ｍ１未満であるのが典型であり、さらにはａ、２ｍ１未満である場合もある。

０５ｍ１及び０．２５ｍ１の容積が一般的である。冷凍食品工業の場合、扱う容 積はいうまでもなく格段に大きく、数ｄｍ’さらには数ｄであることが多い。

科学的・臨床的又は商業的用途に対して生物試料を凍結保存する場合には特に、 被冷凍物質を容器に入れるかキャリヤーに担持させる。適切な容器としては、ア ンプル、チューブ、ストロ−及びバッグ（特に、２枚の熱伝導性（例えば金属） 板の間に保持される断面の薄いバッグ）が挙げられる。適当なポリマーには、ポ リプロピレン又はポリ塩化ビニルのようなプラスチック製材料が含まれる。少な くとも一方向の寸法の小さい容器が好ましいが、これはその方向の温度勾配が無 視できるようになるからである。この観点から、チューブ、ストロ−及び断面の 薄いバッグが特に好ましい。

別の重要な態様において、本発明では、音波、特に高周波音又は超音波として一 般に知られている種類の音波を使用する。金属鋳物の結晶構造を改善するために 音波／超音波を使用することが動的核発生として知られている。音波／超音波は 適冷金属中での核発生を促すが、主たる効果は粒子の調質である。音波の照射は 境界層での熱伝導をも向上させる。音波による氷核発生はこれまで殆ど注意を喚 起してこなかった。例えば、Ｈｏｂｂｓは当分野の権威的著書（ｒ　Ｉｃｅ　Ｐ ｈｙ＋ｉｃＪ　、　Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ　Ｆｌｅｓｈ社、　０ｘｆｏｒｄ、　１ ８７４）の中で音波による氷形成の可能性については述べていない。ただし、工 業的に実施不可能な教示の記載された２件のソ連特許文献が知られている。

ソ連特許（Ｓ［１−＾）第１１１６１８０９８号には、食品を冷却剤に入れ、同 時に１８〜６６　ｋＨｚ及び１６〜４ａＷの超音波を当てることによって、食品 をより迅速に冷凍し、その品質を改善することが記載されている。この処理によ って境界層における熱交換が増大し微細氷晶が秩序正しく生成すると記載されて いる。この文献には氷核発生については開示されておらず、冶金工業との関連か らすると、粒子の調質が上記超音波処理の効果であろうと考えられる。

ソ連特許第０３９５０６０号にも類似の方法が教示されているが、この方法では 冷凍時間が５分１０秒から３分５秒に短縮されており、熱伝導が向上したことが 明示されている。超音波が結晶化過程に有益な作用を与えるとも記載されている が、超音波による核発生は同様に記載されていない。また、これらの方法は共に 、多（の理由から工業的には受け入れ難い。

まず、イチゴ又はイチゴのスライス（４，５ｍ＋）を用いて上記方法を再現した 場合、解凍製品の品質は容認し難いものであった。超音波を用いない従来の（− ３０℃）送風式冷凍機内で冷凍された物質に比して、果実の品質には何等の改善 もみられなかった。

第二に、記載の方法では、食品をエチレングリコール（−２２℃）又はフレオン ＋２（−２９，８℃）浴に浸漬する必要がある。食品がこれらの物質で汚染され る可能性があることは商業的観点からすると望ましくない冒険であろうし、また 、これらの化学物質の費用からしても実用的な実施は難しい。

第三に、使用電力が非常に大きい（２〜３　Ｗ／ａｄ）ために、食品に対するか なりの温暖効果を有するだけでなく、冷凍中の物質の細胞損傷を誘発する恐れも ある。

過冷却による影響を最小限に抑えるため、食品中での氷核発生後に融解潜熱をで きるだけ速やかに除かなければならない。これを行なうのに試料を液体窒素（− １９６℃）、液体ＣＯ２又はフレオンなどの寒剤に浸漬することは、冷凍食品工 業ではよく知られている。たたし、これには関連する幾つかの問題かある。

第一に、大きな生物試料（直径５ｍ１１１以上のような）の場合には、「外殻」 凍結か起こって試料の破壊と亀裂をもたらす。

第二に、イチゴなどの幾つかの果実においては、果実を一１００°Ｃよりも低い 温度に冷却すると組織の２次的な損傷か生しる。液体窒素浸漬法を行なう際に、 最低貯蔵温度を超えることによる損傷を避けることは極めて困難である。

第三に、液体窒素への試料の浸漬は費用のかかる方法であって、そのため非経済 的で冷凍食品工業においては支持されないであろう。

ソ連特許第０６１８０９８号及び同第０３９５０６０号の教示を、生物材料及び ／又は食料品のような液体含有物質の冷凍に直接適用したとしても実用ベースで の実施は不可能と考えられるので、冷凍プロセスに音波を使用することは冷凍食 品工業では殆ど無視されててきた。

音、特に高周波音の使用は、発明の第一態様に基つく熱抽出方法と併用しても或 いは単独で使用しても非常に有益であることか発見されている。従って、好まし くは、冷凍中の物質に音波、特に高周波音波を施す。

高周波音波は一般的には超音波で１６　ｋＨ＋以上、例えば１８〜８０　ｋＨｘ の周波数のものが好ましい。音波の周波数は２０　ｋＨ＋から５０　ｋＨｘまて の範囲が好ましい。典型的な周波数は２０　ｋＨ＋〜３０　ｋＨｒてあり、少な くともある種の用途において最適と考えられる範囲は２２．５ｋＨｘ〜２５　ｋ ｌである。

過冷却物質に０１〜１０秒間音波を施す。別法として、全冷凍工程を通して、物 質にパルスその他の方法による音波を施す。音波を１個以上のパルスとして用い るのか好ましい。パルスの時間幅は平均してパルスとパルスの間の合計時間の５ ％〜２０％であるのか好ましく、好ましくはパルスの長さは０５〜５秒で、約２ 秒が最適である。

２０秒間のうちの約２秒のパルスが特に有効であることが判明している。使用時 の出力及び／又は周波数を変化させてもよい（不連続的又は連続的に）。１以上 の周波数を同時に用いてもよい。冷凍中の物質が液体相であるときに音波を加え ると特に好適であって、このことは特にアイスクリームに当てはまる。

音波使用時の出力に関する限り、条件上明らかな矛盾か生しる。一方では出力は 音波が有効となるのに十分なだけ高くなければならす、他方では出力は冷凍中の 物質が過度に加熱されるほど高くてはいけない（投入エネルギーが熱として放散 するからである）。００５から１．９又は２．０Ｗｌａｉの出力が無難で、０１ 〜ｌ　５Ｗ／ｃｄの範囲が好ましく、約０２〜Ｉ　Ｗ／ａＪが最適である。

氷核発生を促すための上記の非投入式方法は、このようにして、従来法に伴う問 題を少なくとも軽減又は解消する。

音波は、超音波浴、圧電式発信器及び適当な変換器なとの、当業者に公知の音波 発生器によって発生させることかできる。従って、物質を、例えば圧電式発信器 と接触した成型体などの容器内又は適当な変換器と接触したコンベヤーヘルド上 などで、音波発生器と接触させる。

後の具体例の場合、物質は従前の送風式又はトンネル式冷凍機のような温度勾配 を有する環境の中を移動させてもよい。

高周波音波を用いて氷核発生を促す好ましい方法として以下の４つが挙げられる 。

１、試料を、好ましくは該物質の凝固点又はその付近に（例えば−２０℃）に維 持した超音波浴に浸漬する。こうすると、音波発生器は高周波音波を与えるだけ てなく、物質の冷却にも役立つ。物質は、液体、好ましくは水なとの水性媒質に ｉ＋７ｊｌするのが一般的である。しかし、物質は、所望によっては、氷の凍結 に特に適した成型体の中に収容又は封入してもよい。

２、物質を、冷凍浴中て冷却した成型体などの容器に入れる。高周波音波を与え るために、圧電式発信器を成型体に接触又は組込む。この方法は、冷凍シャーベ ット、氷及びアイスクリームに特に適している。

３、物質を、１個以上の変換器と接触或いは該変換器で中断されたコンベヤーベ ルト上に置く。この方法は、小果樹の果実などの食品の薄片のような薄層物質に 特に適している。物質とコンベヤーベルトとが接触しているので、音波が物質全 体に効率よく伝達されるようになる。

物質の冷却は、コンベヤーベルトを例えば従前の送風式冷凍機内に通すことによ っても行ない得る。材料中で最も効率的に核発生させるために、コンベヤーベル トに沿ったある特定の点に音波変換器の短い領域を設けるのが好ましい。

４　より大きな材料並びに球形又は円筒形などの非平面状の材料の場合には、点 接触よりも良好な状態で超音波源と接触させるために、試料を部分的又は全体的 に容器中の液体に浸漬するのが好ましい。次に高周波音波を変換器などから加え るが、物質を液体に浸漬する時間はほんの短時間である（例えば１秒未満）。物 質をその凍結温度（例えば約−５℃）に維持するように、容器の温度を維持する のが好ましい。容器内の液体は好ましくは非毒性化学物質（例えば食品級の化学 物質）の添加によってその凝固点より低い里度に維持するのが好ましい。

こうすると、物質が同時に食品級の化学物質によって被覆されるという利点があ る。好ましい食品級の化学物質としては、例えば物質を冷凍しかつ光沢を与える ための砂糖及びグリセロールか含まれる。この具体的態様は、上述の物質をコン ベヤーベルトで運ぶ連続方法と組合わせてもよい。例えば、超音波を施す際にコ ンベヤーベルトを超音波浴に好適には１秒未満程度の短時間浸漬する。

氷核発生を誘発するための高周波音波を施す前に、物質を予め冷却しておくのが 好ましい。好適には、物質を周囲の環境と同じ温度、即ち熱平衡状態になるまで 冷却しておく。これは、物質とその周囲の環境との間に大きな温度勾配が存在し た場合、物質内に温度勾配か生し、その結果、外側で核発生して氷の先端か中心 方向に伸びて望ましくない「外殻」凍結を起こすからである。従って、物質全体 が周囲の環境の温度となるように（特に物質内部も周囲の環境と同し温度となる ように）予冷しておけば、高周波音波を加えた場合の氷核発生は物質の内部（好 ましくは中心で）で誘起される。通常、物質はその凝固点より低い温度で環境と 熱的に平衡化させる。

上述の通り、本発明において好ましい音波の使用は、それ自身で独立した発明の 一態様をなす。前述のソ連特許文献で示唆された浸漬法を回避すると、音波を有 益かつ工業的に実施可能なものにすることができる。本発明のさらに別の態様に よれば、液体含有物質の冷凍方法にして、物質から熱を抽出すること、及び物質 との非液体接触手段によって物質に音波を加えることを含んでなる方法か供され る。一般的には、本発明のこの態様においては、高周波音波源と被冷凍物質との 間に固体又は機械接触が存在するが、気体を介した接触も適している。接触は、 例えば、ＢＲＡＮＳＯＮ　ＬＵＣＡＳ−ＤＡＷＥ探針などの探針の形をした高周 波音波源を物質と直接接触させることによって達成することもできる。別法又は 追加方法として、高周波音波源と機械的に連結した（直接又は間接的に）固体表 面上に物質を乗せてもよい。例えば汚染及び／又は望ましくない粘着を避けるた めに、適当な物質の層を被冷凍物質と固体表面との間に挿入することも考えられ る。

ただし、これは機械的連結の範鴫に入らないと考えるべきてはなく、幾分間接的 になっただけである。さらに、物質と表面とが一様に接触している必要はなく、 ここでは音波か効率的に伝達されるのに十分なだけの接触が必要とされるに過ぎ ない。

流体充満（好ましくは液体充満）層を高周波音波源と被冷凍物質との間の音波通 路内に挿入してもよい。このことは、被冷凍物質が液体と接触していることを意 味するものではなく、流体層は単に高周波音波の物質内への伝達及び／′又は分 布に役立つ。流体は如何なる有機溶媒であってもよいか、好ましくはフレオン、 グリコール、エタノール又はｌ５ＯＰＡＲという商品名で市販されている食品に 適合した溶媒である。ｌ５ＯＰＡＲＫという製品か最も好ましい。

被冷凍物質の「非液体接触」は必ずしも完全な乾燥状態を意味するものではない 。例えば果実片を冷凍する場合など、果実自体から少量の液体か放出されること があるが、これは、発明のこの態様の範囲外にある音波伝達用の液体中への浸漬 とは区別すべきである。

土掘のソ連特許文献に教示されている比較的高い出力を避けると、予想に反して より良好な結果か得られること、さらにはより経済的な装置によって低出力を与 え得ることか判明した。従って、本発明のまた別の態様によれば、液体含有物質 の冷凍方法にして、物質から熱を抽出すること、及び物質に２　Ｗ／ｃｒ１未満 の出力で音波を加えることを含んでなる方法が供せられる。本発明のこの態様の 好ましい態様は上述の通りである。

さらに、音波を断続的に使用すると上記ソ連特許文献に開示された挙動を改良す るための基礎が与えられる。

従って、本発明は、また別の態様において、液体含有物質用の冷凍装置にして、 該装置は液体から熱を抽出する手段及び物質に音波を付与する手段を含んでなる 装置に関するが、該装置において、ｆａ）音波は物質との非液体接触によって物 質に加えられ、及び／又は（ｂ）音波を物質に適用する手段は２　Ｗ／ａ（未満 の出力で音波を供給するのに適合しており、及び／又は（ｃ）物質に音波を施す 手段は音波を断続的に供給するのに適合したものである。好ましい態様は上述の 通りである。

本発明の方法は、氷核発生を促すその他の手段、例えば欧州特許公開第０２４６ ８２４号などに開示された化学的（例えば結晶質の）氷核発生剤を併用するとう まくいく。

かかる核発生剤は氷の核発生時期を合理的かつ正確に決定するのに用いることが できる。核発生剤を、物質用の容器の１つ以上の壁及び／又は物質のキャリヤー に被覆してもよい。欧州特許公開第０２４６８２４号に開示されている通り、コ レステロールが好ましい核発生剤である。

熱抽出はどんな従来法で行なってもよい。理論的には物質内で吸熱反応を起こさ せて熱を抽出することも可能である。しかし、通常は、物質の周囲の環境の少な くとも一部を物質よりも低温にして物質と環境との間に温度勾配を作るほうがよ り簡便である。本発明のこの具体的態様は、温度差が少ない場合熱損失は物質と 周囲と間の温度差に比例するというニュートンの冷却の法則を利用したものであ る。

従って、発明の多くの用途においては、熱抽出は物質を低温環境に置くことによ って最も容易に達成できる。

このことから次のことがいえる。即ち、第一の熱抽出速度の後に第二の熱抽出速 度を適用ししかも第一熱抽出速度のほうが第二の熱抽出速度よりも大きいという 条件の下で第−及び第二の熱抽出速度を達成するには、試料を低温環境から低温 の度合いの緩い環境に例えばコンベアなどを用いて移動させればよい。現実に幾 つかの用途においては、試料を移動させるよりも周囲の環境の温度を変えるほう が容易な場合があり、かかる場合には、第一速度と第二速度との間の境界で周囲 の環境温度が増すことになる。

第−及び第二の熱抽出速度として適した環境温度は当業者には明らかであろう。

第一の熱抽出速度に対する環境温度は第二の熱抽出速度に対する環境温度よりも １５°Ｃ以上低く、好ましくは２５℃以上低い。被冷凍物質が水を含んでいると き、例えば器官などの生物材料或いは特に食料品の場合、第一の熱抽出速度に対 する環境温度は具体的には一５０℃より低く、時には一８０’Ｃ〜−１００’Ｃ になることさえあるか、第二の熱抽出速度に対する環境温度は一２０℃〜−３０ ℃でよい。食料品の場合、第二の熱抽出速度に対する環境温度は、最終的に望ま れる貯蔵温度でよい。凍結保存すべき生物材料の場合、例えば第二の熱抽出速度 の後で、環境温度をさらに低下させることか望ましい。

第一の熱抽出速度に対する好ましい最低環境温度は、被冷凍物質の温度勾配に対 する耐性によっである程度定まる。少なくとも果実については（恐らく他の食料 品及び生物材料の場合にも）、室温と平衡状態にある被冷凍物質を、−１００’ Ｃ以下の第一熱抽出速度に対する環境下に置くことは温度勾配が大き過ぎて許容 し難い場合がある。例えばイチビなどはかがる条件の下ではガラス及び共晶の不 均一な生成に起因するものと思われる損傷を受ける。

環境温度を変化させる代わりに、環境か物質から熱を抽出する効率を変化させる ことによっても異なる熱抽出速度が得られる。低温の空気その他の気体を異なる 速度で物質上を通過させる。風の冷たさについて日々経験している通り、気体速 度が高くなると熱抽出速度も高くなる。

本発明は、適切な熱抽出プロトコルが実行できるような調整及び修正を加えるこ とによって実行できる。上述の通り、これは環境温度を変化させるための適当な プロトコルによって達成し得る。各種の食料品及びその他の生物材料に対するこ のようなプロトコルは、それぞれの物質の例えば以下のような関連パラメーター を考慮に入れることによって容易に作成できる。

Ｃ）水分含量。

ｄ）凝固点（これは第一近似として食料品又はその他の物質中の溶質濃度に依存 する）： ｅ）冷凍前及び凍結状態の両方における物質の熱物理的な値；及び ｒ）容器の大きさ及びその他の詳細。

これらのパラメーターは物質ごとに異なっているのでコンピューターを用いて容 易に最適なプロトコルを作成できる。

速度制御式冷凍機（例えばＰｌａｎａＩＢｉｏｍｅｄ社（英国、５ｕｎｂｕ＋７ −ｏｎ　Ｔｈａｍｅ＋）のＫＲＹＯ１０シリーズのチャンバー・モデル１０〜１ ６など）内で冷却される試−料の温度履歴は、適当な熱伝導又はその他の境界条 件を用いて試料についてのフーリエ熱伝導式を解くことによって計算できる。

（上記ＫＲＹ０１０は商品名である）。一般に、計算法には、冷凍時に組成変化 及び相変化の生じる水溶液その他の物質の冷却を見込まなければならない。その ためには、氷の発生と融点との関係を与えるための適切なモル濃度−凝固点降下 のデータが利用できなければならない。試料の過冷却もまた適切に計上し得る。

薄いスライスの場合には、試料中の温度勾配は無視できるので、伝導式は試料の エンタルピー変化の時間速度とその境界を横切る熱伝導速度との間の簡単な非定 常熱収支に単純化される。

この単純化された計算の妥当性は実験的に得られたデータに匹敵する。この計算 方法は、環境温度を操作してプラム薄片内の潜熱プラトー域を減少させるための 予測法として用いられている。

しかしながら、試料内部における伝導が無視できない程の厚さを有する試料にお ける温度履歴を計算するためには、完全な式を解く必要がある。三次元の完全な 非定常式を解くには計算に非常に時間がかかる。しかし、一方向の温度勾配か他 の二方向のものよりも格段に大きいことか多く、かかる系では一次元モデルから 温度履歴を合理的に予測できる。このモデルは、１−ｄデカルト幾何学、１−ｄ 球幾何学、又は１−ｄ円筒幾何学に対して展開できる。

装置に関する最も広い態様において、本発明は、液体含有物質の冷凍装置にして 、物質から熱を抽出する手段、及び冷凍時に失われる潜熱を少なくとも部分的に 補償するために熱抽出速度を変化させる制御手段を含んでなる液体含有物質の冷 凍装置を供する。

発明のまた別の態様によれば、液体含有物質の冷凍装置物質にして、該物質から 該物質の融解潜熱が失われつつありしかも物質の温度がさほど降下していない間 に第一の速度で物質から熱を抽出する手段、及びその後物質の温度が降下する時 に第二の速度で物質から熱を抽出する手段を含んでなり、熱抽出の第一の速度が 熱抽出の第二の速度より大きくなるような液体含有物質の冷凍装置が供される。

上述の通り、この装置は音波発生器（好ましくは高周波数の）を含むのが好まし い。発生器から物質に伝達される音波の媒体は気体（例えば空気）又は固体であ る。

個々の熱抽出手段は一般には冷却要素（ｒｅｆｒｉｇｅｔａｔｅｄｅｌｅｍｅｎ ｔ）を含んでいてもよく、該冷却要素は気体の膨張によって能動的に冷却される ものであってもよい。従前の拡散又は圧縮／膨張式冷凍装置をこの具体的態様に 用いてもよい。しかし、これだけが熱抽出手段として用いることのできる唯一の 方式ではない。例えば、物質から熱を抽出したときに消散するような低温の液体 又は固体を用いることもできる。このようにして用いることのできる低温の液体 の具体例は液体窒素であり、生物材料か通常液体窒素温度で貯蔵されていること からも、液体窒素は生物材料を凍結保存する場合の熱抽出手段の少なくとも一つ として好ましい物質である。同しように消散する低温固体は固体二酸化炭素（ト ライアイス）であるか、固体二酸化炭素は液体窒素に比してその昇華温度が後者 の沸騰温度よりも高いので、その冷却効果は液体窒素の冷却効果よりも劣る。熱 抽出手段としての第三の可能性は、有効時間内に被冷凍物質との平衡点に達する まで或いは介在（例えば断熱）物質か存在するときはその存在の許す限り平衡点 近くまで、暖まるようなヒートシンクを用いることである。ヒートシンクとして は従って比較的低温の物質、特に熱伝導率の高い物質（例えば金属ブロック）を 用いることかできる。凝縮という不都合な問題に対処するため、金属は耐蝕性の もの、例えば真鍮型又はステンレス鋼製のものか好ましい。ただし、必要に応し て適切に保護してあればどんな金属も使用できる。

好適な断熱物質は、ポリスチレン（発泡性又は非発泡性のもの）又はポリテトラ フルオロエチレンもしくはアセタールなどの他の可塑性ポリマーであるが、好適 な性質を有するものであれば如何なるものを使用してもよい。

本発明の装置は、単一の熱抽出手段（上記で説明したものなど）と、第−及び第 二の速度で熱を抽出するために上記単一の熱抽出手段を制御するための制御手段 を含んでなるものであってもよい。例えば、本発明のこの具体的態様における「 能動」装置は冷却要素、制御手段及び温度フィードバック手段を含んでなる。該 制御手段は、コンピューター、マイクロプロセッサ−又はその他の電子工学的手 段を含んでいてもよい。温度フィードバック手段は、連続的又は継続的に被冷凍 物質の温度をモニターし、その情報を制御手段に中継するもので、それによって 冷却要素が適切な速度で熱を抽出するようになるものである。かかる能動装置は 多種多様な被冷凍物質（特に食料品）に対するかなりの融通性をもたらすが、量 の少ない物質に対しては比較的高価にっ（。

類似してはいるがより単純な具体的態様では、２通りの熱抽出速度で運転できる 冷却要素を含んでなる。冷却要素は、最初は高い熱抽出速度で運転されるがその 後タイマーによって冷却要素か遅い熱抽出速度で運転するように切り替わるよう にしてもよい。かかる具体的態様は試料又は少なくとも試料周囲の環境の特性が 明らかなときに使用できるか、特に各種の試料か本発明の装置に比べて小さいと きなと、個体間の性質のばらつきか比較的小さくなる種々の状況下で使用できる 。

「能動装置Ｊの上記以外の具体的態様としては以下のものかある。

りバッチ系。機械冷凍機は一般にノユールートムスン効果て冷却され、−８０’ Ｃまでの温度で運転される（最低一１３５℃まて運転可能である）。物質を密閉 室に入れ、必要な温度に達するまで放置し、その後取り出して貯蔵する。室内の 空気は攪拌しなくてもよいし、強制対流を起こすためのファン式でもよい。なお 、被冷凍物質は冷凍機内の棚に静置してもよいし、回転させてもよい。

かかる密閉式装置では、所望の温度プロフィールは電気的又は機械的手段による 圧縮機温度の直接的な制御によって達成される。かかる制御装置の応答か遅すぎ て所望のプロフィールを得ることかできずに、実際に応用するには困難な場合も ある。しかし、プロセス開始時に最低運転温度か要求されるので、温度制御は、 圧縮機温度を一定に保つ一方で、所望のプロフィールが得られるように電気的又 は機械的にプログラムした独立ヒーターから系内に投入される熱量を変化させる ことによって達成される。さらに、圧縮機出力の直接制御と外部ヒーターとを組 合わせてもよい。温度制御は、予めプログラムしてもよいし、気体又は被冷凍試 料内に設けた温度センサーによって能動的に行なってもよい。

２）連続系。物質は水平コンベヤーベルト又は螺旋装置上で冷凍機内を移動する 。冷凍機内での滞留時間後、物質は貯蔵に適した温度で出てくる。気体循環は通 常ファン駆動式であるが、多孔性コンベヤーベルトに対して上向きに低温気体を 流して施動床の場合のように試料を浮遊させる場合もある。入口温度は常に出口 温度よりも高い。冷却は機械的手段によっても液体窒素などの低温液体蒸気によ ってもよい。後者の場合、達成し得る最低運転温度（＞−１６ｆ１℃）は機械式 の場合よりも低い。

所望の温度プロフィールは装置内の気体の温度分布を操作することによって達成 できる。従来の操作方式と異なり、装置の温度は食品入口において最低であり、 出口に向かって高くなる。連続式装置内の温度勾配は、低温気体の再循環又は除 去を確保するための整流装置、温風の導入又はヒーターの設置などを含む多くの 手段によって決定できる。気体流速も熱伝導に影響するが、入口で最大になり、 後段では流速一定又は低下するように選ぶ。

加えて、コンベヤーベルト速度の制御によって試料の温度履歴も調整できる。異 なる速度で走行する一連のコンベヤーベルトを用いることによって、冷凍機の異 なる領域での滞留時間を加減することもできる。これらの方法の幾つかの組合せ も適している。温度の制御は予めプログラムしてもよいし、気体又は被冷凍試料 内に設けた温度センサーによって能動的に行なってもよい。

３）低温浴中での浸漬。これは一般には氷、シャーベツトなどに適用される方法 であり、これらを液体として鋳型に注入し、次に通常−３０℃の温度の攪拌低温 浴に半浸漬する。かかる低温浴は通常はジュールートムスン効果で冷却される熱 交換器と接触させて冷却させる。冷凍後、試料を鋳型から取出し、貯蔵する。鋳 型に入れていない食品を直接液体寒剤中に浸漬するのは一般的には良い方法とは いえない。ただし、無害でしかも通常の貯蔵温度で蒸発する液体ＣＯ２に浸漬す る方法は各種の食料品に対して安全に採用できる。

浸漬法で達成し得る温度プロフィールは幾つかの方法によって改良し得る。零度 以下の異なる温度に維持された一連の浴を用い、各種の浴に試料を順次浸漬する 。或いは、単一の浴の温度勾配を操作して所望のプロフィールを得ることもてき 、また、かかる勾配の浴の中を通過する速度を直線的又は非直線的に修正して所 望のプロフィールを得ることもてきる。上述の通り、温度制御は予めプログラム してもよいし、気体又は被冷凍試料内に設けた温度センサーによって能動的に行 なってもよい。

本発明の全く異なる具体的態様においては、本発明の装置は、それぞれ第−及び 第二の熱抽出速度を提供する別個の熱抽出手段を有していもよい。

好ましい設計は第−熱抽出手段及び第二熱抽出手段を有することであるが、かか る熱抽出手段は両方−緒に第一の熱抽出速度を与え、かつ片方のみ（例えば第一 熱抽出手段）が第二の熱抽出速度を与えるように設計する。

この設計は特に生物材料の凍結保存に対し格別有効な設計となる。第一の熱抽出 手段は一１００℃以下と考えられる液体窒素浴でもよいし低温窒素気体（例えば 、液体窒素浴の上方）でもよい。冷凍すべき生物材料その他の物質は同様に低ａ （例えば気体窒素）雰囲気の入ったデユア−瓶に入れることができ、物質を適切 に断熱して許容範囲内の第二の熱抽出速度を与えるようにすることもできる。低 温の気体窒素環境は好ましくは「ドライジッパ−（ｄＢ　５ｈｉｐｐｅｒ）Ｊと いう当業者に知られた特殊な容器内に供するが、次善の策として液体窒素浴上に 供してもよい。別の可能性として商業用法冷凍機が適正な低温環境を与えるが、 これらは−８０℃乃至−１３５℃の温度にすることができ、しかも保温できるこ と多い。より一般的には、商業用機械式冷凍機は一２０°Ｃ乃至−１４０℃の運 転温度にすることができ、また極低温気体による液体／気体冷凍機はこれらの温 度乃至絶対零度もしくは絶対零度に近い温度で運転できる。

窒素その他の１次冷却剤の熱抽出効果を十分に増大させてより大きな熱抽出第一 速度を得るために、熱抽出第一速度を起こす時に第二熱抽出手段を供してもよい 。好適には、第二熱抽出手段はヒートシンク、例えば上述の低温の真鍮その他の 適当な材料のブロックである。冷凍すべき生物試料その他の物質は、適当な第一 速度での冷却が起こるようにヒートシンクから断熱してもよい。

好ましい具体的態様においては、被冷凍物質はデユア−瓶内の断熱材ブロック内 のブロックの中心と周辺の間に位置する１力所以上の場所に置く。ブロックの周 辺部は低温環境によって連続的に冷却される。真鍮その他のヒートシンクをブロ ックの中心に収容することもてきるが、こうすると第一速度の冷却に必要な冷却 速度が追加される。

熱抽出手段の構成方法は上述の具体的態様に限られず、例えば上述の具体的態様 の特定の組合わせでも全く別の適当な設計のものでもよい。

受動的設計の好ましい具体的態様に関する上記議論から明らかなように、本発明 は、上述のものも含め、ドライジッパ−１液体窒素浴、冷凍機又はその他の低温 環境と組合わせて使用できる手段を供する。

本発明の別の態様においては、液体含有物質の冷凍に使用する器具にして、ヒー トシンク、ヒートシンクの少なくとも一部を囲む断熱手段、及び断熱手段の中に 被冷凍物質を保持する手段を含んでなり、かつ物質の冷凍温度に耐えるように適 合させた器具が供される。

ヒートシンクは、上述の通り、金属（例えば真鍮）などの熱伝導性物質のブロッ クから成るものでもよい。ヒートシンクは芯状（例えば一般的には円柱形の芯） に成型してもよく、その周囲に断熱手段を置いてもよい。かかる芯は断熱手段か ら取外し可能なものが好ましい。その理由を以下に述べる。

断熱手段は、適当な気体、液体、又は好ましくは固体の断熱材である。ポリスチ レン、ポリテトラフルオロエチレン（ｐ　ｔ　ｆ　ｅ）及びアセタールが使用で きる。断熱材の熱伝導率及び／又は熱拡散率は零ではないにしても低くなければ ならない。例えば、ポリスチレン（非発泡）の熱伝導率は０．０４　Ｗ／ｍ／に てあり、熱拡散率は２．９ＸＩＯ−’ｒｄ／ｓである。ｐｔ　ｆｅ及びアセター ルの数値は以下の通熱伝導率　０．２４　０．２２〜０．２４Ｗ／ｍ／に０２３ ℃ 熱拡散率　０．７４　０．３０ ｍ／ｓ 保持手段は被冷凍物質を保持するのに適した形状又は構成であればよい。物質の 少なくとも一部は液体であるから、保持手段は物質用容器（例えば上述のストロ −、アンプル又はバッグ）の収納に適合させてもよい。アンプルはガラス、プラ スチック又はその他の適当な材料でできたものであり、適当なプラスチックアン プルには商品名ＣＲＹＯＴＵＢＥＳて市販されているものが含まれる。固体の断 熱ブロック内にストロ−又はアンプルを保持する場合、保持手段は単にブロック にドリルその他の手段で開けた穴であってもよい。同じ穴に幾つかの容器を入れ てもよい。器具を一度操作するだけで使用可能にてきる複数部分で断熱ブロック を構成しても良い。構成部分を段々に積上げてもよいが、この場合には円柱形の 芯を積上げた断熱ブロック構成要素全体の深さに対応するよう適切に伸ばす。

使用の際には、ヒートシンク（好ましい具体的態様においては真鍮の芯）を例え ば低温環境に置くことによって先ず冷却する。次に、断熱手段と被冷凍物質をヒ ートシンクの周りに取付けて、低温環境が少なくとも部分的には断熱手段を取囲 むようにする。被冷凍物質はヒートシンクの温度かそれに隣接する断熱手段の部 分の温度と平衡化するまでヒートシンクと低温環境の両者の作用による第一抽出 速度で冷却されるが、その後、被冷凍物質は低温環境の作用のみによる第二の熱 抽出速度で冷却される。如何なる時も、温度は、低温環境の特性並びに断熱手段 及びヒートシンクの熱的性質及び寸法に依存する。

（温度プロフィールはこの設備部分の設計に関与したコンピューターシミュレー ションを用いて予測できるし、上述のパラメータを変化させて必要な用途に適合 するように調整できる。） ヒートシンク及び断熱手段の熱特性、断熱手段の中の保持手段の位置、及び低温 環境の性質は、適切な時間の間（即ち、潜熱か物質から抽出されつつありしかも 物質の温度がさほど低下していない間）熱が被冷凍物質から第一の抽出速度で抽 出されるように選択する。

本発明の他の態様においては、液体含有物質の冷凍方法にして、断熱手段の中に 被冷凍物質を置くこと、低温のヒートシンクを該断熱手段で少なくとも部分的に 取囲むこと、及び該断熱手段を少なくとも部分的に取囲む低温環境を与えること 、を含んでなる方法が供される。

低温環境は、例えば真空断熱のように十分断熱された（即ち断熱手段よりも熱伝 導率の低い）容器で画定する。

従って、この環境はデユア−瓶又はドライジッパ−で画定する。

音波による水溶液の核発生のさらに別の用途としては、凍結乾燥の冷却段階にお ける、制御された状態での複数試料の同時核発生が挙げられる。可能なシナリオ はワクチンの凍結乾燥であり、凍結乾燥装置内において幾千ものガラス製バイア ルが一回の運転で冷却、凍結、乾燥されるようなものである。凍結乾燥の冷却段 階における試料の過冷却はある程度避けられず、しかも同時に核発生するように しないと個々のバイアル（又は他の試料容器）の水発生温度が散文も異なってく る。これは、処理時間及び乾燥開始時の品質の変動、並びに乾燥終了後の試料群 内の品質のばらつきをもたらす。この問題は、音波源を適切に設計して使用凍結 乾燥機内に取付けることによって核発生を制御して核発生が所要の温度でしかも 各試料間で均一に起こるようにすれば、解決できる。

これまでの説明において、液体の水が氷に凍結する系を主として引用した。しか し、本発明が水系に限定されないことは明白である。

本発明の各態様の上記以外の好ましい特徴は、他の態様に必要な変更を加えたも のと同様である。

本発明のより深い理解、並びに本発明を如何にして実施するかを示すため、発明 の好ましい具体的態様を添付図面を参照して以下に説明する。

図１は、生物試料を凝固点以下にまで冷却した時に、該生物試料の温度が時間経 過と共に如何に変化するかを示したグラフである。

図２ａは、本発明の「受動冷凍装置」の−具体例である器具の垂直断面図を示し たものである。

図２ｂは、また別の受動冷凍装置の具体例の分解斜視図を示したものである。

図２０は、さらに別の受動冷凍装置の具体例の分解斜視図を示したものである。

図３は、本発明に従って冷却した物質の５通りの温度冷却曲線を示したものであ る。

図４は、本発明の例１て冷凍したプラム片の温度冷却曲線、及び従前の送風式冷 凍装置によって冷凍したプラム片の対照温度冷却曲線を示したものである。

図５は、本発明の例２で冷凍したイチゴ半切れの温度冷却曲線、及び従前の送風 式冷凍装置によって冷凍した残る半切れのイチゴの対照温度冷却曲線を示したも のである。

図面を参照すると、図１は本発明の方法によって解決される一般的な問題を示し たものである。図１は、ウシ胚をその凝固点を通して液体窒素中での凍結保存温 度まで冷却したときの温度と時間の関係を示したグラフである。胚は従来通り凍 害保護剤として１０％ｖ／ｖグリセロールを含むウシの胚培養液中に保存し、０ ．２５ｍ１のプラスチック製の胚凍結保存ストロ−に入れた。線Ａは胚の周囲の 冷却環境の温度を示し、線Ｂはストロ−内の胚そのものを直接取囲んでいる凍害 保護剤の温度を示す。環境温度は時間と共に一定速度で降下する。一方、凍害保 護液の場合（これは胚そのものであると仮定できる。凍害保護剤と胚の温度は殆 ど変わらないと推測できるからである）には、温度は、胚を含んだ媒質の融点（ Ｔ　ｍ）に向かって一定速度で降下し始めて該融点以下に下がる。生物材料は続 いて過冷却されて核発生点（Ｔ　ｎ）に達する。ここで物質中の水が晶出し始め て、試料中の水の融解潜熱が放出される。そこで胚試料の温度がＴｎからＴｍま で上がる。融解の潜熱が放出された後、試料は引き続き冷却されるが、ここまで の段階で試料と環境の温度差は以前より拡大している。従って、ニュートンの冷 却法則の作用により、試料の温度降下速度は増加する。曲線Ｂの傾斜は許容でき ないほど急になり、胚の損傷につながる。

ここで、「許容できない」とは記録された冷却速度が成功裡に凍結保存するため に従来推奨又は使用されてきた速度と異なる（速すぎる）ことを意味し、許容で きない速度とは凍結試料の重大な損傷の原因になると予測される速度である。こ の一般原則は、公知の手順において推奨されている冷却速度がプロトコルに基づ く運転の際に記録される速度とかなり異なるときにはいつでも適用され、従って 冷却速度の制御が必要となる。

かかる問題は本発明によって解決でき、その一つの具体例を図２ａに示す。この 図は、本発明の第三の態様に基づく器具１を示しており、液体窒素の入ったデユ ア−瓶又はドライジッパ−中のような低温環境に置くのに適したものである。

器具１は、長さ１４０−１直径２７０の垂直円柱状の真鍮製の芯３を含む。芯３ の下端にスピゴット５があり、これが、台板９内部の中心に位置する傾斜したボ ス７の中の対応ソケットに入り込む。台板９及びボス７は積層ポリスチレン製で ある。台板９は直径２００ｍｍ、厚さ２０肛の円盤形をしている。ボス７は、真 鍮製の芯３に対応して、最低直径２７０、高さ２０ｍｍであり、台板９に向かっ て外側に４５°で傾斜している。使用する際には、真鍮製の芯３をボス７及び台 板９にしっかりと取付ける。

断熱ブロック１１は、一般的には中空円形断面の円柱形で、真鍮製の芯３に滑ら かにフィツトしかつボス７及び台板９にぴったりと座わるような構成を有する。

断熱ブロック１１も積層ポリスチレン製で、最大高さ１８０ｍｍ、直径２００ｍ ｍである。その中空の直径は、真鍮の芯に対応して、直径２７αである。

第一列の１２個の穴１３は、断熱ブロック１１内に作る。

これらの穴は、真鍮製芯３の軸と平行に垂直下方に伸び、芯の軸の回りに対称的 に配置される。第一列の穴１３は各々直径３ａ＋ｍで、円柱ブロック１１の最上 端の表面から１４０ｍｍの深さまで下に伸びる。穴１３の各軸は真鍮製芯３の軸 から３５順又は真鍮製芯３の周縁部から２１．５ｍｍのところに位置する。

１２個の穴からなる第二、第三及び第四列などは、第一列よりも外側の円周上に 位置する。参考のため、代表的な穴をそれぞれ１５．１７、及び１９で示す。第 二列の穴１５の軸は真鍮製芯３の軸から５０−外側の円周上にあり、第三及び第 四列の１７と１９に対応する距離は６５ｍｍと８０皿であり、第二、第三及び第 四列の穴１５．１７及び１９のその他の事項は第一列１３と同し・である。

穴１３．１５．１７及び１９のそれぞれの列の目的は、哺乳類の胚及び配偶子の 凍結保存に慣用されているプラスチック製ストロ−（図示していない）を保持す ることである。かかるストロ−はＩＶＹ社（仏国Ｌ′＾１ｇ１ｅ）から市販され ており、その内側は欧州特許公開第０２４６８２４号の教示する通りコレステロ ールで被覆されている。ストロ−（又はその他の容器）をコレステロールで被覆 する代わりに、コレステロールなどの適当な核発生剤の結晶を内容物に加えても よい。適当な核発生剤は、セル・システムズ（Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｌｅｍ＋）社か らＣＲＹＯ３ＥＥＤ又はＸＹＧＯＮという商品名で市販されている。

真鍮製の芯３及び第一から第四列までの穴を覆うため、断熱ブロック１１の上に 、断熱ブロック１１に対応する２　００ｍｍ直径の円盤状の遮蔽蓋２１を取付け る。蓋２１は積層ポリスチレン製で厚さ２０ｍｍである。

使用に際して、真鍮製芯３及び台板９を先ず低温環境（例えばドライジッパ−） 内に入れる。（ドライシ、ツバ−は十分に断熱された容器で大きなデユア−瓶に 類似しており、液体窒素を含む吸収剤で内張すされている。窒素が吸収されてジ ッパ−内に自由液体は殆ど或いは全く存在しないからである）。真鍮製芯３が低 温環境と平衡に達した後、第一列の穴１３の中に、ウシ胚の入った１２本のスト ロ−を収納する断熱ブロック１１を真鍮製芯３の周りに取付けて台板９の上に乗 せる。次に蓋２１を断熱ブロック１９の上に取付け、器具１を冷却する。

最初のうち、ストロ−は真鍮製芯３及び低温環境の両方の影響によって冷却され る。この共同作用によって比較的速い速度で胚から熱が抽出される。第一列の穴 １３の中のウシ胚用の５つの冷却媒質試料に関する冷却曲線を図３に示す。（胚 は、凍害保護剤としてｌＯ％ｖ／ｖグリセロールを含む胚培養液を入れた凍結保 存ストロ−に入っている）。第一熱抽出速度は水が過冷却されている間（曲線の 領域Ｃで示す）に適用される。試料の温度は融点（Ｔｍ）以下に降下し、核発生 点（Ｔｎ）まで僅かに過冷却される。ストロ−内にコレステロールからなる氷核 発生剤が存在するので、核発生温度は融点より余り低くはならない。しかし、温 度が核発生点（Ｔｎ）に達すると試料の温度はＤに示すように融点（Ｔｍ）まで 上昇する。胚の温度が再び大幅に降下し始めるまで、真鍮製芯３は胚及び介在物 質たる断熱ブロック１１と実質的平衡に達している。従って、それに続く熱抽出 は断熱ブロック１１の周縁部に向いてのものだけで、試料の熱抽出速度はより低 くなる。Ｅにおけるグラフの傾斜はなだらかで許容範囲内であり、傾斜しすぎて おらず、胚にはまったく損傷がない。従って、低温環境の温度（−８０’Ｃ）ま で引続き安全に冷却することができる。かかる構成の場合、−２５〜−３０℃の 温度範囲における平均冷却速度は毎分０３２℃であった。

図２ｂは図２ａのものとほぼ同し受動冷凍装置の別の具体例を示したものである が、ハンドル部１０１、及び蓋１０７を貫通してハンドル部１０１の位置決め盤 １０９の開口と結合するような断熱ブロック１０５上の位置決め突起１０３を含 んでいる。蓋１０７の位置決め突起１１１はハンドル部１０１のスピゴット内に 収まる。断熱ブロック１０５はアセタール製で、哺乳類細胞系などの凍結保存用 ２．５ｍｌアンプルを収めることのできる試料取付は穴１０６を有している。断 熱ブロック１０５は台板１１７上の傾斜ボス１１５上に乗せ、真鍮製芯１１９を 取囲む。真鍮製の芯以外の部品はすべてアセタール製である。図２ｂの器具の主 な寸法は以下の通りである。

アセクール構造 構成要素 一−−−−−−−−−−−−−−−〜−Ｊ」ヨｉｓ乙五Ｊ１蓋＋０７　２００１ ４０ ２　ブＯツ’）　１０５　２００　：　１４０３　位置決め突起１０３［２］　 １５：　５２４　真鍮棒＋１９　５７１１４０ ６　試料取付は穴１０６　１３１５０ ７　ボスＮ５用さら穴　５ ８　試料収納穴１０６の中心から ブロック１０５の周縁部まで　４４ ９　位置決め突起１０３の中心から ブロック１０５の周縁部まで　２２５ ＋１）　真鍮棒１１９用の穴　５７　ｌ４（１注記１　位置決め突起＋０３の高 さはブロックに挿入されるねじ部分を含まない（さほど重要な寸法ではない）。

注記２　真鍮棒＋１９の高さは合板に位置決めするための突起部を含まない（さ ほど重要な寸法ではない）。

注記３　台板は周囲に均等に配置された３個の小さなアセタール製陶を備える。

脚は高さ５−×直径５ＩＩＩ１１１である。真鍮棒及びブロックを位置決めする ボスの寸法はさほど重要でない。

この構造は、液体窒素含有ドラインツバ−と併用すると、毎分−１℃の冷却速度 を達成できる。

別の具体例は、図２ｂに示すものと基本的には同じ構造であるか、凍結保存スト ロ−（ウシ胚などのための）を用いるためにアセタール製の部品をＰＴＦＥ製の 部品に置き換えたものである。主な寸法は以下の通りである。

ＰＴＦＥ構造 構成要素　直径　深さ／高さ １蓋１０７　２Ｈｌ　２０ ２　ブロック　！０５　２００　：　１６０３　位置決め突起１０３［２］　３ ５１　１０４　真鍮棒＋＋９　２２　：　１６０ ６　試料取付は穴＋０６　３１１３３ ７　ボス１１５用さら穴　５ ８　試料収納穴１０６の中心から ブロック＋０５の周縁部まで　６３ ９　位置決め突起１０３の中心から ブロック＋０５の周縁部まで　３０ １０　真鍮棒１１９用の穴　２２　：　１６０注記１　位置決め突起１０３の高 さはブロックに挿入されるねじ部分を含まない（さほど重要な寸法ではない）。

注記２コ真鍮棒１１９の高さは合板に位置決めするための突起部を含まない（さ ほど重要な寸法ではない）。

注記３１台板は周囲に均等に配置された３個の小さなアセタール製陶を備える。

脚は高さ５皿×直径５ｍｍである。真鍮棒及びブロックを位置決めするボスの寸 法はさほど重要でない。

この構造は、液体窒素含有ドライジッパ−と併用すると、毎分−０，３℃の冷却 速度を達成できる。

図２ｃは受動冷凍装置のまた別の具体例を示したものである。構造は図２ｂのも のの変形であり、類似部品には同じ参照番号を与えた。主たる相違は、図２０の 構造では断熱ブロック１０５が半分の高さのブロック１０５ａ及び１０５ｂの２ つに置き換えられていることで、これによって存在するアンプル数を増やすこと ができる（１５個まで）。図２０の器具の主な寸法は以下の通りである。

アセタール構造 低温アンプル［ｃ２．５ｍｌ］ 寸法［皿］ 構成要素　直径、深さ／高さ １蓋１０７　２００１４０ ２　ブロックｌ０５ａ　２００　：　７０３　ブロック＋０５ｂ　２００　：　 ７０４　位置決め突起＋０３　［２］　１５　：　１２３５　真鍮棒＋１９　５ ７・１２０ 注記１：位置決め突起１０３の高さはブロックに挿入されるねじ部分を含まない （さほど重要な寸法ではない）。

注記２．真鍮棒１１９の高さは合板に位置決めするための突起部を含まない（さ ほど重要な寸法ではない）。

注記３・台板は周囲に均等に配置された３個の小さなアセタール創製を備える。

脚は高さ５順×直径５■である。真鍮棒及びブロックを位置決めするボスの寸法 はさほど重要でない。

機械加工穴 ７　試料取付は穴１０６　＋３１５０ ８　ボス１１５用さら穴　５ ９　試料収納穴１０６の中心から ブロック１０５の周縁部まで　４４ １０　位置決め突起１０３の中心から ブロック＋０５の周縁部まで　２２５ １１　真鍮棒１１９用の穴　５７１１２０ここに詳述した構造は、必要な冷却速 度及び冷却すべき試料保持器の種類（ストロ−又はアンプルなど）に応じて可能 な多数の構造のうちの僅かにすぎないことに留意されたい。

変更可能なものは以下の通りである。

ａ　断熱材の直径（ただし、実際には、製造及び市場の理由から、ある範囲の製 品について標準直径を用いるのが好都合である）。

ｂ　断熱ブロックの深さ。

Ｃ金属芯の直径。

ｄ　試料穴の数量、大きさ及び配置。

ｅ　断熱ブロック及び金属芯の材料。

次に本発明を、能動装置並びに受動装置に関する以下の例によって説明する。特 記しない限り、本発明の能動装置の例はすべて（即ち比較例以外の能動装置例） は、ＰＬＡＮＡＲＫＲＹＯ１０／＋６の速度制御冷凍機を用いて行なった。（Ｐ ＬＡＮＡＲＫＲＹＯ１０／１６は商品名である）。温度は５ＱＵＩＲＲＥＬデー タロガ＝（＋２００シリーズ）に繋いだＴ型熱伝対を用いて測定した。（ＳＱＩ ｉｌＲＲＥＬは商品名である）。

データを記憶及び解析するためＩＢＭコンバーチプルコンピューターに移送した 。様々な処理と比較するため、試料が潜熱プラトー域に置かれている時間として 定義される発熱時間（ＥＴ）を用いた。これを最終温度でさらに定義した。例え ば、ＥＴ−’及び）：Ｔ−１０は発熱からそれぞれ一５℃又は−１０℃までの時 間である。音波は、２０　ｋＨｘて操作するａｂａｎｄｏｎモデル２５Ｇソニケ ーター、ｔｌ＋ａｎ＋ｏｎモデル２２００超音波洗浄機、Ｌｕｃａｓ−Ｄａｒｅ シリーズ６２６６浸水式トランスジューサー、タイプＵＳＲ−２０超音波発生器 （２０ｋＨｒ）に接続したＴｅ１ｅｓｏｎｉｃ＋チユ一ブ式共振器タイプＴＲ， 又は旧ＬＳＯＮＩＣ３音波ドライバーモデルＩＭＧ　４００　（Ｈｉｌｓｏｎｉ ｃ社、英国Ｍｅ＋＋ｅ７＋１ｄｅ）から発振させた。

例１ この例は、本発明の効率的な潜熱除去プロトコルを用いると、たとえ音波を当て なくても従前の方法よりもプラムが良好に冷凍されることを示したものである。

朝鮮産の黒ずんだ皮のプラム（Ｔｅｓｃｏ食料品店）を４．５ａｎの薄片にスラ イスし、本発明の方法で冷凍した。比較のため、プラムの薄片を従来の方法で冷 凍した。これらの方法は以下の通りであった。

１、薄片を本発明の方法で冷凍した。初期環境温度は一７５℃で、この温度に２ 分間維持した。次に環境温度を毎分１０℃ずつ−３０’Ｃまで暖めた。プラム片 の温度低下は送風式冷凍機処理（次の２）の場合よりも相当速く、測定発熱時間 （ＥＴ−１０）は８０秒であった（図４）。

２、（これは対照方法である）。薄片を一４０℃で運転した商業用送風式冷凍機 に入れた。測定発熱時間（ＥＴ−１ｏ）は５５４秒であった（図４）。薄片を次 いで一２０℃で運転した商業用深冷凍機に移した。

３、（これは対照方法である）。材料を液体窒素の中に直接浸し、商業用深冷凍 機に移した。試料はその発熱時間を経由して迅速に冷却され、最終到達温度は一 １００℃よりも低かった。

凍結・融解物質の官能検査を新鮮なプラム薄片を基準にして行なった。冷凍プラ ムを検査の４５分前にフリーザーから取り出し、ぴったりとしたフィルムで包ん で板の上に置いた。プラムを板紙の上に置いた後、パネルの各メンバーが単独で との命を受けて統計的に無作為な計画に従って評価した。パネルの各メンバーは 果実の実だけを評価し、皮は廃棄するように指示されていた。試料と試料の間に 、モールヴアン水を用いて口を洗浄した。各試料について２４回試食を行なった 。色の相違を隠すために紫色の照明の下で評価を行なった。

結果 試験全体の補正平均点数は以下の通りである。評点の段階は１〜１０である。

堅さ　５．４６　３．４６　６，０８　７．８３湿り気　６．４６　７，７５　 ５，６７　２．９２歯切れのよさ　５．４２　４，００　６．３３　６．７９靭 性／噛み応え　６，２５　５，２９　６．７１　７．４２粒状性　５，２５　４ ，７１　５．７５　６．Ｈ多汁性　６，９２　７，４６　６，０８　３．７９風 味： 全体的強さ　６．３３　６，８８　６，０４　３．７５甘味　４，７９　４．８ １１　４３８３６３刺激性／酸味　４，７９　４．７］　５．Ｈ２，９６苦さ　 ２，８３　２，９６　２，８８　２．２５略号・１＝本発明、２＝送風冷凍、３ ＝液体窒素４＝新鮮 検討 本発明　対　新鮮。

新鮮な試料は本発明の冷凍試料よりかなり堅く、乾燥しており、より靭性／′噛 み応えがある。風味の項目では、新鮮な試料は本発明の冷凍プラムより全体的風 味が弱く、甘味が少なく、刺激性／酸味が少ない。

本発明　対　送風冷凍。

本発明の冷凍プラムは送風冷凍プラムよりかなり堅く、靭性／噛み応えが大であ る。その他のパラメータには有意差がない。

本発明　対　液封窒素冷凍。

すべてのパラメータについて有意差は認められなかった。

例２ａ 本発明の効率的な潜熱除去プロトコルを用いると、たとえ音波を当てなくても従 前の方法よりもイチゴか良好に冷凍されることを示したものである。スペイン産 の１級品のイチゴ（Ｓａｉｎ＋ｂｕｒｙｓ食料品店）を三等分し、以下の方法で 冷凍した。

１）気体温度の冷却速度か毎分１°ＣのＰｌａｎａｔ式速度制御冷凍機中での送 風冷凍の模擬実験。測定発熱時間は６６０秒であった（図５）。

２）本発明の方法による冷凍。初期環境温度は７分間の間−５０°Ｃて、毎分１ ０°Ｃの速度て一３０℃まで上げた。上記処理１の残りの半分のイチゴの測定発 熱時間は２８０秒であった（図５）。

３）イチゴを液体窒素に浸漬して冷凍した。

椛玉 液体窒素中で冷凍すると多くのイチゴが破損した。送風冷凍及び液体窒素浸漬し たイチゴは、細胞成分がかなり漏出した。本発明の冷凍イチゴの方が漏出が少な く、かなり堅かった。滲出液は送風冷凍又は液体窒素冷凍後のものよりも着色が 少なく、細胞内の損傷がより少ないことを明らかに示していた。

凍結・融解物質の官能評価を新鮮なイチゴを基準にして行なった。評価の４５分 前に、冷凍イチゴをフリーザーから取出した。各試料について２５回の独立した 試食を灰処理 段階評価　１　２　３ 最良　−−− 優良　０　３　１ 良　２　６　２ やや良　３　７　Ｉｌｌ 全く不可　１　０　１ 略号　１＝送風冷凍：２一本発明、３＝液体窒素風味。

処理 段階評価　１　２　３ 全く不可　５　３　２ 略号　１−送風冷凍；２＝本発明：３；液体窒素１乃至３０日の範囲内であれば 、貯蔵期間は本発明の方法による冷凍物質の品質に殆と影響しない。

イチゴの品種と成熟度も共に解凍時の品質に影響するので、ここでの観察結果は 絶対的なものではなく、むしろ一般的傾向のガイドとなる。やや未熟な１級品の スペイン産イチゴのときに最良の結果が得られた。同一品種のより成熟した１級 品のイチゴの場合、あまり良い結果は得られなかった。やや未熟な２級品のカル メル産（イスラエル）イチゴの場合も結果は良好であった。成熟した１級品のカ ルメル産イチゴ並びに１級品のケニア産イチゴ（ＳａｉｎｓｂｕｒＢ食料品店） の場合には劣る結果が出た。

ただし、このように熟した出発材料の場合でも、本発明の方法による結果の方が 、同一材料の送風冷凍又は液体窒素冷凍の場合よりも常に優れていたことを強調 しておく。

例２ｂ この例では、音波を適用して有効な潜熱除去プロトコルを用いてイチゴを冷凍す れば結果がいっそう優れたものになることを示す。イチゴ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉ ａｎ　ｇｕａｄａｌｕｐｅ）を一つの小売店から大量に集め、熟しすぎたものと 未熟なものを選り分けて廃棄した。選りすぐったイチゴを洗浄して、三等分した 。それぞれの果実から半分を分けて１つに集め、対応する半切れのイチゴ２８０ 個からなる２群を準備した。

７０個の半片からなるバッチ毎にイチゴを冷凍した。

１２’　Ｘ　１２’　（３０，５ａｎ　Ｘ　３Ｇ、　５ａｎ）の音波プレート（ ２２，５ｋＨ＋、　２２０　Ｖ、　Ｈｉｌｓｏｎｉｃ　Ｌｔｄ、社、英国Ｂｉｒ ｋｅｎｈｅａｄ）をＣｔｙｏＭｅｄ　２７Ｇ（ｌ冷凍機中で一７１１℃まで予備 冷却して、イチゴ半片をその上に乗せた結果、−５０℃まで温度が上昇した。以 下のプロトコルに従って材料を冷却した。即ち、（１）−５８℃の初期環境温度 を１分間付与する；（２）毎分１０℃で一４８℃まで暖める。

試料温度は、マイクロプロセッサ−・データロガ−（Ｇｒａｎｔ　Ｉｎｓｔｒｕ ｍｅｎｔｓ社、英国Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）に繋いだＴ型熱伝対を代表的なイチゴ 半片の中心に組み込んでモニターした。試料が一２０℃に達した時に、それらを −３０℃で５日間貯蔵した。官能評価の前に、室温に９０分分間−て試料を解凍 した。

音波処理を行なう場合、全冷却サイクルを通して３０秒毎に２秒のパルスを用い た。

イチゴを解凍した後に官能評価を行なった。結果は以下の通りであった。

特性　−音波　＋音波　音波処理による処理　処理　平均点の有意差 イチゴの色　５．６　６．２　ｎｓ＋１１；鈍い赤 ９・鮮かな赤 板上の遊離液　４．３　３．４　０．０１堅さ　３．２　４．５　０．０１ 潰れ易さ　６．２　４．９　０．０１ １・潰れ難い ９・漬れ易い 全体的外観　５．４　６．４　０．０５１＝極めて悪い ９・極めて良好 全体的テクスチャー　４．２　５．５　０．０１１・極めて悪い ９・極めて良好 全体的風味　５．０　６．Ｏｎ５ｄ １−極めて悪い ９・極めて良好 全体的所見　４．６　５．８　Ｇ、ｌＯｌ・極めて悪い ９・極めて良好 例３ａ この例では、発明の有効な潜熱除去プロトコルを用いると従来の方法よりも良好 に、湯通し野菜（セロリ）を冷凍でき、さらに音波が存在すればいっそう良好な 結果が得られることを示す。

セロリは小売店から入手した。セロリ試料を０６ａｎ　（１／４インチ）の小片 に切断し、１回に２５０ｇを９０℃（１９０°Ｆ）で２分間湯通しした。湯通し の際に、物質が１０％失われた。試料を冷水で洗って、室温（２０℃）まで冷却 した。次に、本発明に従って以下のプロトコルで冷凍した。

（１）−７５℃の初期環境温度を２分間維持した。

（２）次いて環境温度を毎分１０’ｃで一３０℃まで上げた。

音波の使用の有無にかかわらず、このプロトコルに従った。音波を使用する場合 には２２．５　ｋＨｘの超音波周波数を用いた。出力レベルは９２９ａＩ（１４ ４平方インチ）の面積当り２２０ワツト、即ち０２４ワツト／ｃｉであった。超 音波は連続的なものではなく、３Ｇ秒毎に３秒間適用した。

対照として、場通しセロリを一４０℃の環境温度で送風冷凍した。試料が一３０ ℃に達したときに試料を取出した。

処理後、冷凍セロリ試料の若干を一２０℃で貯蔵し、残りは標準的な温度誤用プ ロトコルに供した。

得られた試料は、４２人のメンバーからなる試食パネルによってバランス良く順 次評価されたが、これらのパネルメンバーは解凍した冷凍セロリ片の評価に確信 的な態度を有するように予備選抜した人々である。所定の処理を施した６枚のセ ロリ片を与えた。セロリは室温で６０分間解凍したものであるが、かかる解凍処 理は依然として少々冷えているものの氷晶を一掃するには十分である。

パネルメンバーは、そのランク付けが薄片の大多数を反映するように、所定の処 理を施した薄片すべてを評価した後でその属性をランク付けするよう指示されて いた。

その結果、本発明の有効な潜熱除去プロトコルは、送風冷凍した対照試料よりも 、良好な堅さで、潰れ難く、かつ風味の新鮮さの全体的印象が良好なものを与え た。

さらに音波も使用した場合、その試料は対照試料よりもテクスチャーが優れてい ただけでなく、温度誤用下でも対照試料よりも良好な結果を与えた。本発明のそ の他の利点として、試料温度を室温から貯蔵温度（−３０℃）まで低下させるの に要する時間が短縮されることが判明した。従前の送風冷凍の場合、−３０℃に 達するのに２０分程度の時間がかかる。本発明の有効な潜熱除去プロトコルを用 いるとこの時間が約８，２分に短縮される。音波を加えると約５２分に短縮され る。

例３ｂ セロリの茎を地元のスーパーマーケット（Ｔｅ＋ｃｏ食料品店食料品詞達し、洗 浄して１ｃｍの断片に切断した。これらを８０℃で３分間湯通しし、多量の冷水 で洗浄した。

試料を次の３通りの方法で冷凍した。

（１）模擬実験済送風冷凍（−４０℃に設定したＰｌａｎａｒＫＢｏ　１０）。

（２）本発明に従って、初期環境温度−５０°Ｃ１保持時間８分、次いで毎分１ ０’Ｃの速度で一２０℃まで温度を上げる。

（３）　（２）　と同しであるが、−５０℃で平衡化した２０ａｎＸ　２０ａｎ のプレートからの音波（２５ｋＨｘ　、　２６０　Ｗの出力、３０秒毎に２秒間 のパルス）を加える。

解凍後、３種類の試料のテクスチャーを主観的検査によって評価した。結果は以 下の通りであった。

０〜５段階で評点を付けた（０＝不良、５＝最良）。

それぞれの処理に対する試食パネルの評点の平均は以下の通りであった。

処理（１）　−２，５ 処理（２）　−３，０ 処理（３）　−４，０ 例４ａ 直径４ｃｍ未満の小さな新ジャガイモ（Ｓａｉｎ＋ｂ＋ｕｙ＋食料品店）を以下 の食料品上って冷凍し、解凍後に評価した。

ジャガイモは冷凍前に調理も湯通しもしなかった。

１）ジャガイモを上記の例２ａのイチゴの場合と同しく「送風冷凍」した。解凍 後のジャガイモは非常に柔らかく、細胞から水の漏出し、調理後も許容し難いも のと判断された。

２）ジャガイモを液体窒素に浸漬して冷凍した。これらは冷凍時に破砕されるの が常であった。

３）ジャガイモを（１）−８０℃の初期環境温度に１分間保ち、（２）毎分ｌＯ ℃で一２０℃まで環境温度を上げることによって、本発明の方法で冷凍した。解 凍したジャガイモは無傷であり、漏出も見られず、本来のテクスチャーか保持さ れていた。煮沸した後のジャガイモは許容できるものであった。

例４ｂ 新ジャガイモの小片（３〜５ａｎの長さ、Ｌ　Ｂａｌｄ種、Ｔｚｃｏ食料品店） を沸騰水中で１５分間調理した後、大量の冷水を流して冷却した。２００ｇのバ ッチを以下の諸方法で一３０℃まで冷凍した。

（１）模擬実験済Ｐｌａｎａｒ　Ｋ＋ｙｏ　１０冷凍機における送風冷凍（−４ ０’Ｃ）。

（２）　Ｐｌａｎｅｔ　Ｋ「ｙｏ　１０冷凍機を用い、本発明に従う。

初期温度は−５０’Ｃて、６５分間保持した。次いて温度を毎分１０℃の速度で 一２０℃まで上げた。

（３）上記（２）と同じであるが、２０ｃｍＸ２０ｃｍにわたって３６０　Ｗ、 　２５　ｋＨ＋及び以下のパルス幅で超音波を供給した。

上記の各種処理における潜熱プラトー域の長さを測定した。解凍後のバッチを試 食パネルによって評価すると共に、ジャガイモを三等分し、ガーゼに包んで漏斗 に入れ、試料上に３ボンド（１，３６ｋｇ）の重りを２０分分間−て、滴り落ち た損失分を定量的に評価した。試料を顕微鏡用のスライド上にのせて、光学顕微 鏡で観察した。

結果は以下の通りであった。

（１）各種冷却処理における潜熱プラトー域の長さくＬ　ＨＰ）は以下の通りで あった。

ＬＨＰの長さく分） 処理１８ 処理２６．５ 処理３１５秒中２秒間　７０ １０秒中２秒間　５．０ ５秒中２秒間　４，０ 各処理は、テクスチャーに関し、官能評価に基づいて以下の順にランク付けされ た。

処理３（５秒中２秒間）〉処理３（１０秒中２秒間）〉処理３（１５秒中２秒間 ）〉処理２〉処理１゜（２）流体の滲出。

３　４０秒中２秒間　７ （３）顕微鏡 処理１と処理３の細胞を比較した。送風冷凍の細胞は、組織的な細胞構造と内容 物か失われ、細胞膜も過度に折りたたまれていた。これとは対照的に、処理３（ 音波）で冷凍した細胞は細胞の完全性が良好に保持されており、細胞膜の折りた たみも少なかった。

例５ ペルーとタイを原産地とする２種類のアスパラガスを５ａｉｎｓｂｕ＋ｙ＋食料 品店から入手し、以下の諸方法によって冷凍し、解凍物を蒸煮した後に評価した 。

１）２種類のアスパラガスを例２ａに記載した通り送風冷凍した。その後解凍し たものは、風味及びテクスチャーに乏しく、評点は２０点満点中の４点てあった 。

２）２種類のアスパラガスを液体窒素中で冷凍した。

芽か破砕し、解凍後の風味及びテクスチャーに極めて乏しかった。評点は２０点 満点中の２点であった。

３）２種類のアスパラガスを、（１）−８０℃の初期環境温度を１分間保ち、（ ２）環境温度を毎分１５°Ｃで一２０℃まで上げることによって、本発明の方法 で冷凍した。解凍後の芽の風味は、調理後の芽のテクスチャーと同様に向上して おり、評点は２０点満点中の１０点であった。

例５ｂ 生のアスパラガスの芽（タイ産、５ａｉｎ＋ｂｕｒｙ＋食料品店で購入）を６イ ンチ（１５ａｎ）の長さに細切りにし、以下の諸方法で冷凍した。

（１）−４０℃に設定したＰｌａｎ、ａ＋速度制御冷凍機中での送風冷凍模擬実 験。

（２）本発明に従ってコンピューター設計によって至適化した、Ｐｌａｎａｒ　 Ｂｉｏｍｅｄ社製のにＩＩＹＯ１０系チヤンバー・モデル１０−１６速度制御冷 凍機中での冷凍。初期環境温度は一５０℃で、１２分間保持した。次に温度を毎 分１０’ｃの速度で一２０℃まで上げた。

（３）音波（２２，５ｋＨｚ、３５０　Ｗの出力、２０秒につき２秒間）を加え て上記（２）の通りに冷凍する。音波は、ｌ５ＯＰＡＲＭ液で満たしたチャンバ ーを経由して、冷凍庫の床を形成する８’　Ｘ　８’　（２［１ａｎＸ２０ａｎ ）のプレートに連結したＨＩＬＳＯ１ｆｌＣ音波ドライバー・モデルＩＭＧ　４ ００（Ｈｉｌｔｏｎｉｃ　Ｌｔｄ社）から供給した。冷凍後、試料を６時間かけ て室温まで解凍した。次に、芽を沸騰水中で４分間調理した。３種類の冷凍処理 試料を試食パネルが未冷凍試料と比較した。

試食パネルは平均点を記録した（０〜５．ｏ＝不良。

５＝最良）。

未冷凍　−５ 方法（１）　−１，５ 方法ｆ２）　−２，５ 方法（３）　−３ 例６ａ シングルクリームは水中油型エマルジョンの一例である。５ａｉｎ＋ｂｕＢ＋食 料品店から低温殺菌シングルクリームを入手した。この製品を冷凍及び解凍する とクリームの固体と液体が分離する。冷凍による損傷は細かいメツシュのフィル ターを通過する液体の損失によって評価できる。ガラス製ユニバーサルに１０ｍ １の等量試料液を入れ、以下の諸方法で冷凍した。

１）例２に記載した通りの送風冷凍。解凍後、りＩＪ−ムは黄色に変色し、凝乳 する。液体損失は３４％。

２）例２ａに記載した通りの液体窒素浸漬。解凍後、クリームは視覚上では分離 していないか、非常に粘稠になる。液体損失は１２％。

３）　−８０℃の初期環境温度を１分間保持し、次いで毎分１５℃の速度で温度 を一２０℃まで上げる、本発明の方法による冷凍。解凍後、クリームは視覚上分 離していない。

粘度は増すが、液体窒素冷凍の場合はど酷くはない。液体損失は１０％。

４）クリームを０から一２０℃まで冷却する際に１°Ｃ冷却するごとに０１秒間 の音波をかけること以外は、上記方法（３）と同一の冷凍。音波による核発生と 潜熱の有効な除去とを併用することによって、５回の独立した試験において、− 貫して、落滴損失は方法（３）の場合よりもさらに１０〜１６％減少した。

このように、本発明は、送風冷凍よりも明らかに優れており、また高価で比較的 不便な液体窒素浸漬方法よりも優れた結果を与える。

シングルクリーム（Ｔｚｃｏ食料品店）品詞［１０ｍ１のバッチに分け、金属枠 に支持されたフリーザーバッグ又は金属成型体に入れた。

クリームを以下の諸方法で冷凍した。

（１）　ＰｌａｎａｒＫ＋ｙｏ　１０を用いた模擬実験済送風冷凍（−４０°Ｃ ）。

（２）本発明に従って、試料を最初−８０℃のＰｌａｎａ＋Ｋｒｙｏ　１０速度 制御冷凍機に入れ（１０分間保持）、次ぎに冷凍機の温度を毎分１０℃の速度で 一２０’Ｃまで上げ、かつ冷凍時に音波（２Ｇａｎｘ２０ａｏに対して３ＧＯＷ 、２２　ｋｔ（ｒ、６゜秒毎に２秒間のパルス）を加えた。

（３）本発明に従って、−５０℃のＰｌａｎａｒ　Ｋｔｙｏ　Ｉｌｌ冷凍機を用 いて１５分間保持し、冷凍時に音波を上記（２）と同様に加えた。

３通り処理・解凍後の官能評価の結果は以下の通りであった。

（１）クリームの分離が起こり、流体損失、非常にざらついたバタ一様風味をも たらした。

（２）非常に良好なテクスチャー、流体損失はなかった。

（３）流体損失はなかったが、テクスチャーは上記（２）の場合はど良くなかっ た。

［ マヨネーズは油中水型エマルジョンの一例である。市販のマヨネーズ（Ｈｅｌｌ ｍａｎ社製のものなど）は種々の冷凍方法で処理しても安定している。これは製 品の物理化学的安定度を反映しているのであろう。自家製マヨネーズ又は非安定 化市販マヨネーズ（Ｋｉｔｅ社製の自然食品マヨネーズなど）は冷凍・解凍によ って分離する。かかるマヨネーズのＩ　Ｇ　ｍ１等量試料をガラス製ユニバーサ ルニ入れ、以下の方法で冷凍した。

））例２ａと同一の送風冷凍。解凍時に油が完全に分離した。

２）例２ａと同一の液体窒素浸漬。解凍時に浦か完全に分離した。

３）本発明の方法による冷凍。マヨネーズを０°Ｃから一５０℃まで毎分２０℃ で冷却し、−５０℃に２分間保持し、毎分１５℃で一２０℃まで温度を上げた。

解凍時に成分の分離は殆ど或いは全く見られず、テクスチャーは良好に保存され た。

例８ 調理エビとマヨネーズのサンドウィッチをＴｅ５ｃｏ及び５ａｉｎ＋ｂｕＢ＋の 食料品詞から入手し、以下の方法で単独に冷凍した。

１）例２ａに記載した送風冷凍。解凍時にマヨネーズが完全に分離した。油成分 は下のパン片から滲み出し、製品は全く容認できないものであった。

２）例２ａに記載した液体窒素浸漬。サンドウィッチが破砕し、解凍時に上記（ １）と同じくマヨネーズが完全に分離した。

３）本発明の方法による冷凍。各サンドウィッチを毎分２０℃で一５０℃まで冷 却し、この温度に３０分間保温し、次に毎分１０℃で一２０℃まで温度を上げた 。解凍時の製品は満足できるものであった。マヨネーズの分離は殆ど又は全くな く、エビの品質も良好に保持され、パンの破砕新鮮なスコツトランド産スモーク サーモン（Ｓａｉｎ＋ｂｕ＋ｙ＋食料品店）を以下の二通品詞方法で冷凍した。

（１）　ＰｌａｎａｒＫ＋ｙｏ　１０速度制御冷凍機内での一４０℃の送風冷凍 模擬実験。

（２）熱模擬実験を行ないかつ音波照射を用いて、本発明に従う。初期環境温度 を一５０℃とし、４分間保持した、次に毎分１０℃の速度で温度を一２０℃まで 上げた。２゜ａｎＸ２［１ｃｍにわたって３６０　Ｗ、　２２．５　ｋＨｘ及び ４０秒毎に２秒間のパルスの超音波を供給した。

解凍後に試食パネルが試料のテクスチャー及び風味について試験した。試食パネ ルの記録した平均点は以下の通り。

未冷凍　：５ 方法＋１）：１ 方法（２）３ （０〜５．０＝不良、５＝最良）。

アイスキャンデー（シャーベットに類似）２５ｍｌを地元のスーパーマーケット （Ｔｅ＋ｃｏ食料品店食料品等手し、以下の二通りの方法で冷凍した。

（１）本発明の方法で、最初−５０℃に５分間保持し、次に試料内の熱電対で検 出した温度が一２０℃になるまで毎分１０℃で温度を上げた。

（２）上記（１）に加えて、２６０Ｗ、　２２゜５　ｋＨｘの発生器を備えかつ 一５０℃で平衡化した２０ａｎＸ２０ａｎのプレートから４０秒毎に２秒間のパ ルスで超音波を供給した。その結果は以下の通りであった。２つの処理の冷却プ ロフィールは異なっており、音波処理の場合、潜熱プラトー域及び−２０℃まで の冷却時間はかなり短縮された。結晶の大きさの目視検査によれば、音波を用い て冷凍した試料は、音波を用いなかった試料よりも微細な氷晶を含んでいた。

なお、音波を用いて冷凍したアイスキャンデーの方か噛んだときに堅く、テクス チャーはカリカリしていた。

例１１ クリームチーズ（Ｋ＋ａｌｌ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｆｏｏｄ＋社製）を１７２イン チ（１，３ａｎ）の立方体に切り、試料を以下の方法で冷凍した。

ＣＩ）−４０°Ｃに設定したＰｌａｎａｒＫＢｏ　１０速度制御冷凍装置内での 送風冷凍模擬実験。

（２）本発明に従い、同しく　Ｐｌａｎａｒ　Ｋ＋ｙｏ　１０（７）装置を用い るが、−５０°Ｃに５分間保持し、次に毎分１００Ｃで一２０℃まで温度を上げ た。

（３）上記（２）に加えて、２０ａｎＸ２０ｃｍ当り３６０Ｗ、２５ｋＮ＋、３ ０秒毎に２秒間のパルスで超音波を供給した。

解凍時に試食パネルが試料を０〜５段階のランク付け（０＝不良、５−最良）で 評価した。平均評点は以下の通り。

未冷凍　５ 方法（１）３ 方法＋２）　：　３．５ 方法（３ｊ　：　４．０ 例１２ 赤身肉を地元の自店から入手し、約１インチ（２，５ｃｍ）の立方体に切った。

各３７５ｇの試料４個を以下の方法で冷凍した。

（１）−２０°Ｃのボックスフリーザーを使用。

（２）送風冷凍の模擬実験（−４０℃、ＰｌａｎａＩＫＢ。

１０）。

（３）本発明に従い、ＰｌａｎａｒＫ＋ｙｏ　ＩＱ速度制御冷凍機中で、最初− ５０８Ｃで１５分間保持し、次に一２０°Ｃに達するまで毎分１００ｃで温度を 上げた。音波（２０ｃｍＸ２０ａｎ当り３６０Ｗ、　２５　ｋＨ＋、　３０秒毎 に２秒間のパルス）を供給した。

一２０℃で一晩低温放置した後、試料を解凍し、試料からの流体損失を６時間に わたって測定した。

ｆｌ）　１４ｍ１ （２）　３’ｍ１ （３）　２．５ｍｌ この例では音波によって従来の送風冷凍法が改良されることを実証する。

ベルギー産イチゴを地元のスーパーマーケット（Ｔｅｓｃｏ食料品店）か品詞手 し、洗浄し、三等分してｌｏｎｇのバッチに分けた。

バッチを以下の方法に従って冷凍した。

（１）　−４０’Ｃに設定したＰｌａｎｅ「Ｋ【Ｙｏ　１０速度制御冷凍機内で の送風冷凍模擬実験。

（２）上記（１）と同じであるが、３６０　Ｗ、　２５　ｋＨｘの外部発生器か ら３０秒毎に２秒、６０秒毎に２秒及び１２０秒毎に２秒間のパルスが供給され る一４０℃で平衡化した２０ａｎＸ　２ｆｌａｎの超音波プレートを加える。

（３）上記（２）と同じであるが、出力は２６０　Ｗ０解凍後、試料の落滴損失 を６時間にわたって測定した。

結果は以下の通りであった。

冷凍方法　落滴損失（ｍｌ） 出力２６０Ｗ　出力３６０Ｗ ｆ２）　Ｈ秒中２秒　１３１８ ６０秒中２秒　１０　１５ これらの結果は、送風冷凍／音波を併用する際にパルス間隔か至適化されていれ ば、優れた冷凍結果が得られることを示している。

例１４ａ この例では、従来のボックス冷凍法が音波によって改良されることを実証する。

カンロメロンｆｌ（ｎｅｙｄｅｗ　ｍｅｌｌｏｎ）を２通りの方法で−２０００ まで冷凍した。

（１）−２０℃に設定されたボックスフリーザー内。

（２）　２２．５　ｋｌ（ｘ、出力２６０　Ｗで４０秒毎に２秒間隔て発生する 発生器を備え、かつ−２０℃で平衡化した２０ａｎＸ２０国の超音波プレート上 。

（３）上記（２）と同一であるが、グリコール充満層を含む流体充満プレートの 場合。

解凍後に試食パネルが処理を評価し、テクスチャーに関してＯ（不良）〜１０（ 最良）の範囲の評点付けをした。

処理（Ｉ）２ 処理（２）　４．５ 処理（３）　３．５ 例＋４ｂ カンロメロン（Ｔｅ＋ｃｏ食料品店食料三等分し、直径３印の大匙を用いて試料 を取り出し、混合し、２００ｇの部分を以下の諸方法で冷凍した。

Ｅｌ）−４０℃に設定したＰｌａｎａｒ　Ｋ＋ｙｏ　ＩＱ速度制御冷凍機内での 模擬実験。

（２）本発明に従う冷凍。環境温度は最初−５０℃で、１６分間保持し、次に温 度を毎分１０℃の速度で〜２０’Ｃまで上げた。

（３）上記（２）と同様に冷凍するが、音波（２２，５ｋＨ＋、２０ａｎＸ２０ ａｎ当り２６０　Ｗ、　３０秒毎に２秒間）を加えた。

冷凍後、試料を一晩−２０℃に維持し、次いて６時間にわたって解凍した。各試 料からの流体損失量を記録した。

保存料を含まない代表的アイスクリームミックスを一５θ℃のボックスフリーザ ー内で音波を加え又は加えずに冷凍した。１３個の試料（２５乃至２７　ｍｌ　 ）をステンレス鋼製の円筒形成型体（長さ１２ａｎ、平均直径２．２ａｎ）に入 れ、Ｂ＋ａｎ＋ｏｎ　（米国コネチカソト州５ｈｅｌｌｏｎ）　モデル２２００ 超音波洗浄器内のＮｔ４ｗ／ｖ塩化カルシウム溶液に浸漬した。

この超音波洗浄浴をボックスフリーザーに入れ、浴溶液を一４０℃に維持した。

試験中の試料に対して、音波を４７ｋｌＬ＋の周波数、最大出力レベル（１２０ Ｗ）の７０〜８０％で加えた。頻度は３５秒毎に４５秒間のパルスであった。温 度が一３０℃に達したとき試料を取出した。凍結アイスクリームミックスの標準 及び実験試料を二つに分け、一方は一３０℃で貯蔵し、残りは極度の熱的誤用に 供した。

冷凍中に音波を施したアイスクリームの試食試験において、品質が相当改善され ていることが明らかになった。

さらに、−３０℃に達するまでの時間は、音波を加えるさ相当短縮された。冷凍 はこのように音波を加えるとより迅速に達成できた。

ΔＵ この例では、本発明の音波に関する態様かフリーズドライ（凍結乾燥）操作の冷 却段階に適用できることを実証する。

２０個の従前のガラス製凍結乾燥バイアルの各々に蒸留水０．５ｍｌを入れ、− ４℃に冷却したが凍結しなかった。

このバイアルを予備冷却した（−５°Ｃ）　２０ａｎＸ２０ａｎの音波プレート （Ｈｉｌｔｏｎｉｃ社製）上に！き、直ちＩＺ２５ｋＨｚ（Ｄ音波を３２０Ｗで ２秒間加えた。各バイアルの内容物は直ちに核発生した。このことは、バイアル の置ける棚としでも使えるように設計した音波源を用いて、ガラス製バイアル中 の過冷却水溶液又はその他の溶液を核発生させることかできることを実証したも のである。

一旦 斜面培地から細菌を採取してｌＧｍ１のブイヨン＋１ｏ％ｖ／ｖグリセロール中 に植え、得られた細菌懸濁液をポリプロ　−ピレン製のＣＲＹＯＴＵＢＥＳ　Ｃ ２ｍｌ　］の中に１ｍｌづつ加えた。

ＣｒｙａＳｅｅｄｓ　（商標）コレステロール結晶（Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ 社製）を各チューブに加えて、再現性のある氷核発生を確保した。

チューブを、従前のプログラム可能なＰｌａｎａｒＫ＋ｙｏ　１０冷凍機（Ｐｌ ａｎａｒＰｒｏｄｕｃｔ＋社製）又は図２ｂに関して既述した毎分１℃で冷却さ れるように設計された受動冷凍装置に移した。チューブを−７（１’ｃまで冷却 し、取出して液体窒素中に入れた。試料の温度は、探針を試料の一つに浸けたＴ 復熱電対／電子温度計の組合わせでモニターした。

２５℃の水に漬けてチューブを解凍し、栄養培地上に試料を螺旋状に接種して生 存細胞数を数えた。。

Ｐｌａｎａｒ　受動 冷凍機　冷凍機 大腸菌　８２．４５　８２．７０ （Ｅ＋ｃｈ＋＋１ｃｈｉａ　ｃｏ［ｉ）黄色ブドウ球菌　８０．７０　８＋、４ ５ｆＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ＋　ａｕ＋ｅｕｓ）髄膜炎菌　６３．８５　５ ９．４５ （Ｎｅ１ｓｌｅｒ（ａ　ｍｅｎｉＢｉｌｉｄｉｓ）インフルエンザ菌　５９．５ ０　７０．６５（Ｈａｅｍｏｐｈｉｔｕ＋　１ｎｌｌｕｅｎｘａｅ）コレラ菌　 ７５．７０　７２．４５ これらの結果は、本発明の受動冷凍機が小容量の可搬式装置の場合でも良好な結 果が得られることを示している。

例１８−ウシ胚 ４細胞期の発生段階にある複数個のウシ胚を、即用培地＋１０％ｖ／ｖグリセロ ール中で培養し、次に各々を０．２５ｍ１のプラスチック製ストロ−に移した。

５本のストロ−にＸＹＧＯＮ　（商標）コレステロールを入れ、それらを図２に 関して既述の毎分−０３°Ｃの冷却速度を与えるように設計した受動冷凍機中で 冷却した後、液体窒素中に投入した。

残りの５本のストロ−はＰｌａｎａｒＲ２０６速度制御冷凍機中で冷却し、−６ ℃において結晶種を手動添加した。

この機械の冷却プロフィールは以下の通りであった。

２０℃から一５℃まで毎分５．０℃で冷却＝５℃から一６℃まで＠毎分０，２° Ｃ冷却第二工程で結晶種添加 一６℃から一３２℃まで毎分０．５℃で冷却液体窒素中に投入 ストロ−を３０℃の水に漬けて胚を解凍し、凍害保護剤の濃度を低下させながら 培養液で数回洗浄して洗い、−晩培養液中で培養した。

受動冷凍機中で冷凍した５検体の胚の中で４検体は培養後も申し分のない状態に あり、５番目のものも依然として移植可能な品質であった。Ｐｌａｎａ「冷凍機 中で冷却した胚の評価は、申し分のないもの（３検体）及び依然として生存して はいるが移植には向かないもの（２検体）所定の哺乳類培養細胞を１０％ｖ／ｖ ＤＭＳ○を含む９１％ＦＢＳ培地に懸濁し、２５ｍｌのプラスチック製アンプル に入れ、次に図２ｂに関して既述の毎分１．０’ｃて冷却するように設計した受 動冷凍機で冷凍した。試料か一１８℃に達したときに細胞を冷凍機から取り出し 、直ちに液体窒素に投入して２４時間以上貯蔵した。

回収した細胞をインビトロで培養し、生存細胞数を数えて２つのアンプルの平均 値をめた。

細胞系　生存率％ ＴＲＫ１９Ｆ　９７ （ラット繊維芽細胞） ＣＯ３−７９８ （サル腎臓細胞） ３Ｔ３−Ｌｉ　９５ （マウス繊維芽細胞） 時間分割１時間 材料温度 国際調査報告 ｌｓｌ、ｌ、１．、ｓｌ　Ａｍｌｌｃａｍｌ＊　１１゜ＰＣＴ／ＧＢ　９０１０ １２３１１自四（馴１＾−畦＋ｕ−舛ｓ、　ＰＣＴ／ＧＢ　９０１０１２３１国 際調査報告

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．液体含有物質の冷凍方法にして、物質から熱を抽出すること、及び凍結時に 失われる潜熱を少なくとも部分的に補償するために熱抽出速度を変化させること を含んでなるなる方法。
2. ２．液体含有物質の冷凍方法にして、物質から該物質の融解潜熱が失われつつあ りしかも物質の温度がさほど降下していない間に第一の速度で物質から熱を抽出 すること、及びその後物質の温度が降下する時に第二の速度で物質から熱を抽出 することを含んでなり、しかも第一の熱抽出速度が第二の熱抽出速度より大であ る方法。
3. ３．請求項１又は請求項２記載の方法において、前記液体が水性液体である方法 。
4. ４．請求項３記載の方法において、潜熱の除去が、従来の送風式冷凍方法を−３ ０℃で実施したときに観察される時間の５０％以内で達成される方法。
5. ５．請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法において、被冷凍物質が生 物細胞を含んでなる方法。
6. ６．請求項５記載の方法において、前記細胞が動物の配偶子又は胚である方法。
7. ７．請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法において、被冷凍物質が食 料品を含む方法。
8. ８．請求項８記載の方法において、食料品が人間の消費用である方法。
9. ９．請求項７又は請求項８記載の方法において、前記食料品が、野菜、パンその 他のベーカリ製品、肉、魚、海産食物又は果実を含む方法。
10. １０．請求項９記載の方法において、前記果実が小果樹の果実である方法。
11. １１．請求項７又は請求項８記載の方法において、前記食料品がアイスクリーム 及び／又はチョコレートを含む方法。
12. １２．請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法において、凝固可能な 液体の核発生を開始させることを含む方法。
13. １３．請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法において、冷凍中の物 質を音波に付す方法。
14. １４．液体含有物質の冷凍方法にして、物質から熱を抽出すること、及び物質と の非液体接触手段によって物質に音波を加えることを含んでなる方法。
15. １５．液体含有物質の冷凍方法にして、物質から熱を抽出すること、及び物質に ２Ｗ／ｃｍ２未満の出力レベルで音波を加えることを含んでなる方法。
16. １６．液体含有物質の冷凍方法にして、物質から熱を抽出すること、及び物質に 断続的に音波を加えることを含んでなる方法。
17. １７．請求項１３乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法において、前記音波 の周波数が１６ｋＨｚ以上である方法。
18. １８．請求項１３乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法において、前記音波 をパルスで与える方法。
19. １９．請求項１３乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法において、音波を２ Ｗ／ｃｍ２未満の出力レベルで加える方法。
20. ２０．請求項１２記載の方法において、前記核発生を少なくとも部分的に化学的 核発生剤によって行なう方法。
21. ２１．請求項１乃至請求項２０のいずれか１項記載の方法において、物質が凍結 乾燥されつつある方法。
22. ２２．液体含有物質用の冷凍装置にして、液体から熱を抽出する手段、及び冷凍 時に失われる潜熱を少なくとも部分的に補償するために熱抽出速度を変化させる 制御手段を含んでなる液体含有物質の冷凍装置。
23. ２３．液体含有物質の冷凍装置物質にして、該物質から該物質の融解潜熱が失わ れつつありしかも物質の温度がさほど降下していない間に第一の速度で物質から 熱を抽出する手段、及びその後物質の温度が降下する時に第二の速度で物質から 熱を抽出する手段を含んでなり、熱抽出の第一の速度が熱抽出の第二の速度より 大きくなるような液体含有物質の冷凍装置。
24. ２４．液体含有物質の冷凍に使用する器具にして、ヒートシンク、ヒートシンク の少なくとも一部を囲む断熱手段、及び断熱手段の中に被冷凍物質を保持する手 段を含んでなり、かつ物質の冷凍温度に耐えるように適合させた器具。
25. ２５．請求項２４記載の器具において、前記ヒートシンクが金属からなる器具。
26. ２６．請求項２４又は請求項２５記載の器具において、前記断熱手段がプラスチ ック材料からなる器具。
27. ２７．液体含有物質の冷凍方法にして、断熱手段の中に被冷凍物質を置くこと、 低温のヒートシンクを該断熱手段で少なくとも部分的に取囲むこと、及び該断熱 手段を少なくとも部分的に取囲む低温環境を与えることを含んでなる方法。
28. ２８．液体含有物質用の冷凍装置にして、該装置は液体から熱を抽出する手段及 び物質に音波を付与する手段を含んでなるもので、（ａ）音波は物質との非液体 接触によって物質に加えられ、及び／又は（ｂ）音波を物質に適用する手段は２ Ｗ／ｃｍ２未満の出力で音波を供給するのに適合しており、及び／又は（ｃ）物 質に音波を施す手段は音波を断続的に供給するのに適合したものである装置。