JPH0536035B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、一般式 （式中R₁はアルキル基、アラルキル基又はア
リール基、R₂はアルキル基、ｎは１又は２を示
す）で表わされる光学活性カルボン酸及びその対
掌体エステルの製造法に関する。 式のカルボン酸及びその対掌体エステルは光
学活性を有する種々の生理活性物質を合成するた
めの原料として利用されている。従来、式の光
学活性カルボン酸の製造法としては、あらかじめ
有機合成的にラセミ体のカルボン酸を合成したの
ち、光学分割剤を用いて分割する方法、すなわち
物理化学的に一方の光学活性体とその対掌体とに
分別する方法が知られている（特開昭55−118455
号、同56−81557号、同57−188563号、ヨーロツ
パ特許公開第79200477号各明細書参照）。一方、
光学活性カルボン酸エステルの製造法としては、
カルボン酸を分割したのちエステル化反応を行
い、光学活性エステルに導く方法が知られてい
る。しかしこれらの方法では高価な分割剤が多量
に必要とされること、この分割剤が不純物として
製品中に混入しやすいこと、分割工程が複雑であ
ることなどの欠点があり、工業的な製法としては
必ずしも満足できるものではない。そこで、本発
明者らは、Ｄ体及びＬ体のカルボン酸エステルの
混合物を生物化学的に不斉分解することから成る
式の光学活性カルボン酸及びその対掌体エステ
ルの製造法を先に提案しており、この中にはシユ
ードモナス属の微生物を用いるものもある（特開
昭60−30692号公報及び特開昭60−94091号公報参
照）。このうちシユードモナス属の微生物を用い
る場合の製造法に関しては、カルボン酸エステル
の不斉加水分解能を有効に発揮させる点では優れ
ているものの、より生産性を高めるためには、よ
り長期間この能力を安定させた状態で微生物を回
収して再使用するか又は固定化して繰り返し使用
したいという要望があつた。 本発明はこれらの要望にこたえて、シユードモ
ナス属に属する微生物を、その不斉加水分解能を
長期間安定に維持させた状態で繰り返し使用する
ことにより、式の光学活性カルボン酸及びその
対掌体エステルを効率的に製造することを目的と
する。 本発明は、一般式 （式中R₃はアルキル基を示し、R₁，R₂及びｎ
は前記の意味を有する）で表わされるエステル
に、該エステルを不斉加水分解する能力を有する
シユードモナス属に属する微生物の培養液、菌体
又は菌体処理物をPH範囲５〜８、温度範囲35℃以
下で繰り返し作用させ、不斉加水分解することを
特徴とする、一般式 （式中R₁，R₂及びｎは前記の意味を有する）
で表わされる光学活性カルボン酸及びその対掌体
エステルの製造法である。 式及び式の化合物の置換基R₁のためのア
ルキル基としては例えばメチル基、エチル基な
ど、アラルキル基としては例えばベンジル基、ア
リール基としては例えばフエニル基が挙げられ
る。本発明に用いられるエステル（）として
は、例えばＳ−アセチル−β−メルカプトイソ酪
酸メチル、Ｓ−アセチル−γ−メルカプト−α−
メチル−ｎ−酪酸メチル、Ｓ−ベンゾイル−β−
メルカプトイソ酪酸メチル、Ｓ−フエニルアセチ
ル−β−メルカプトイソ酪酸メチルなどが挙げら
れる。本発明に用いられるシユードモナス属の微
生物は前記（）の化合物のエステル結合を不斉
加水分解する能力を有する微生物であつて、シユ
ードモナス（Pseudomonas、以下Ｐと略す）、ア
レウギノザ（aeruginosa）、シユードモナス・ア
プテータ（P.aptata）、シユードモナス・オウレ
オフアシエンス（P.aureofaciens）、シユードモ
ナス・オーリクラリス（P.auricularis）、シユー
ドモナス・アゾトフオーマンス（P.
azotoformans）、シユードモナス・カラギノボラ
（P.carrageenovora）、シユードモナス・カリオ
フイリイ（P.caryophylli）、シユードモナス・セ
パシア（P.cepacia）、シユードモナス・クロロラ
フイス（P.chlororaphis）、シユードモナス・コ
ンベクサ（P.convexa）、シユードモナス・コロ
ナフアシエンス（P.coronafaciens）、シユードモ
ナス・クルシビエ（P.cruciviae）、シユードモナ
ス・ダカンフエ（P.dacunhae）、シユードモナ
ス・デントリフイカンス（P.denitrificans）、シ
ユードモナス・デイミヌータ（P.diminuta）、シ
ユードモナス・フルオレセンス（P.
fluorescens）、シユードモナス・フラツジ（P.
fragi）、シユードモナス・インドロキダンス（P.
indoloxidans）、シユードモナス・マルトフイリ
ア（P.maltophilia）、シユードモナス・マルギナ
リス（P.marginalis）、シユードモナス・マルギ
ネート（P.marginate）、シユードモナス・メラ
ノゲナ（P.melanogena）、シユードモナス・ニト
ロレデーセンス（P.nitroreducens）、シユードモ
ナス・オレオボランス（P.oleovorans）、シユー
ドモナス・オバリス（P.ovalis）、シユードモナ
ス・オキザラリカス（P.oxalalicus）、シユード
モナス・パボナセア（P.pavonaceae）、シユード
モナス・フアセオリコラ（P.phaseolicola）、シ
ユードモナス・ポリカラー（P.polycolor）、シユ
ードモナス・プチダ（P.putida）、シユードモナ
ス・プトレフアシエンス（P.putrefaciens）、シ
ユードモナス・レプチリホラ（P.reptilivora）、
シユードモナス・リボフラビナ（P.
riboflavina）、シユードモナス・ストリアフアシ
エンス（P.striafaciens）、シユードモナス・スト
リアタ（P.striata）、シユードモナス・スタツセ
イ（P.stutzei）、シユードモナス・シユリンガー
（P.syringae）、シユードモナス・トリフオーラ
（P.trifolu）、シユードモナス・シンキサンタ（P.
synxantha）などが挙げられる。特にシユードモ
ナス・フルオレセンス、シユードモナス・プチダ
及びシユードモナス・オバリスが好ましい。 これらの微生物の培養は、通常は液体培養で行
われるが、固体培養によつても行うことができ
る。培地としては、微生物が通常資化しうる炭素
源、窒素源、ビタミン、ミネラルなどの成分を適
宜配合したものが用いられる。微生物の加水分解
能を向上させるため、培地にエステルを少量添加
することが好ましい。培養は微生物が生育可能で
ある温度及びPHで行われる、微生物の生育を促進
させるために通気攪拌を行つてもよい。 加水分解反応を行うに際しては、培養時又は途
中で培地にエステル（）を添加してもよく、あ
らかじめ微生物を培養したのち培養液にエステル
（）を添加してもよい。また増殖した微生物の
菌体を遠心分離等により採取し、これをエステル
を含む反応媒体に加えてもよい。この菌体は反応
後に反応媒体から分離され、再び新たな反応媒体
に加えて反応させる。この場合菌体は取り扱い上
の便宜から、乾燥菌体例えば凍結乾燥菌体、噴霧
乾燥菌体又は有機溶媒例えばアセトン、トルエン
等で処理した菌体、あるいは菌体破壊物、菌体抽
出物等の菌体処理物を用いることもできる。また
これらの菌体等を固定化して用いてもよい。固定
化する方法としては、例えば不溶性の担体例えば
セルロース、アガロース等の多糖類の誘導体、多
孔性ガラス等への担持、架橋剤例えばグルタルア
ルデヒドによる架橋、合成高分子例えばポリアク
リルアミドゲル、光硬化性樹脂又は天然高分子例
えば殿粉、カラギーナン等による包括等があげら
れる。反応媒体としては、例えばイオン交換水又
は緩衝液が用いられる。反応媒体又は培養液中の
エステルの濃度は0.01〜50重量％が好ましい。エ
ステルは水に懸濁した状態で加えることもでき
る。メタノール、アセトンなどの有機溶媒を反応
液に加えてエステルの溶解性を向上させることも
できる。本発明のシユードモナス属に属する微生
物を用いて式の化合物の不斉加水分解を行う際
には、反応時のPH及び温度を調整することが好ま
しい。この微生物の不斉加水分解能を長期間にわ
たつて有効に発揮させて繰り返し使用を可能にす
るには、反応時のPHを５〜８に調整し、かつ反応
温度を35℃以下に維持する必要がある。PHに関し
ては、反応が進行するに伴い生成したカルボン酸
により、PHが低下してくるので、この場合は中和
剤例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭
酸ナトリウムなどを添加することが好ましい。本
発明の微生物が示す不斉加水分解の能力は強酸
性、強アルカリ性のPH及び比較的高温側で急速に
失われる。また、反応を35℃をこえる温度で行う
と不斉加水分解能を長期間維持するのが難しくな
る。反応速度は低温域では低下するので、反応温
度は５℃以上が好ましい。反応液又は培養液から
の生成物の分離精製は通常の方法、例えば抽出、
再結晶、カラムクロマトグラフイ等により行うこ
とができる。また菌体は例えば遠心分離により反
応媒体から分離できる。 本発明方法によれば、シユードモナス属の微生
物が示す不斉加水分解能を長期間安定に持続する
ことができる。また微生物のこの能力は反応時は
もとより反応終了後も維持され、反応液から回収
された菌体を再度反応に用いるので、菌体の有効
利用という観点からも優れている。 下記実施例中の％は重量％を意味する。 実施例 １ シユードモナス・フルオレセンスIFO12055を
肉エキス1.0％、食塩0.5％及びペプトン1.0％から
成る液体培地（PH7.2）100mlに植菌し、25℃で１
日間振とう培養を行つた。培養終了後、培養液を
遠心分離し、得られた菌体の全量をイオン交換水
で洗浄したのちPH３〜８のＭ／2Mcllvaine緩衝
液50mlに懸濁した。この菌体懸濁液に（±）−Ｓ
−アセチル−β−メルカプトイソ酪酸メチル１ml
を加え、30℃で６時間反応させた。この時製造さ
れたＳ−アセチル−β−メルカプトイソ酪酸の生
成量を液体クロマトグラフイを用いて測定した。
この時の生成量を活性発現率として第１表に示
す。なお、活性発現率とは、PH７での活性を100
とした時の活性の比率である。

【表】 なお反応終了後、菌体を遠心分離により回収し
同様の反応を５度繰り返して行つたところ、PH５
〜８の範囲においては再現性よく活性が発現され
るが、PH３及びPH９ではほとんど失活した。 実施例 ２ シユードモナス・フルオレセンスIFO12055を
肉エキス1.0％、食塩0.5％及びペプトン1.0％から
成る液体培地（PH7.2）100mlに植菌し、25℃で１
日間振とう培養を行つた。培養終了後、培養液を
遠心分離し、得られた菌体の全量をイオン交換水
で洗浄したのち、PH7.0、Ｍ／２燐酸緩衝液50ml
に懸濁し、この菌体懸濁液に（±）−Ｓ−アセチ
ル−β−メルカプトイソ酪酸メチル１mlを加え、
20℃から45℃の温度範囲で17時間振とうして反応
させた。この時製造されたＳ−アセチル−β−メ
ルカプトイソ酪酸の生成量を液体クロマトグラフ
イを用いて測定した。この時の生成量を活性発現
率として第２表に示す。なお、活性発現率とは、
30℃で反応させた時の活性を100とした時の活性
の比率である。

【表】 なお、反応終了後、菌体を遠心分離により回収
し同様の反応を５度繰り返して行つたところ、35
℃以下においては再現性よく活性が発現される
が、50℃ではほとんど失活した。 実施例３及び４ シユードモナス・フルオレセンスIFO12055の
代わりにシユードモナス・プチダIFO3738（実施
例３）及びシユードモナス・オバリスIAM1153
（実施例４）を用いた他は、実施例１と同条件で
実験を行つたところ、実施例１とほぼ同様の結果
が得られた。 実施例５及び６ シユードモナス・フルオレセンスIFO12055の
代わりにシユードモナス・プチダIFO3738（実施
例５）及びシユードモナス・オバリスIAM1153
（実施例６）を用いた他は、実施例２と同条件で
実験を行つたところ、実施例２とほぼ同様の結果
が得られた。

【特許請求の範囲】

１ (a)アルコールオキシダーゼと、(b)ペルオキシ
ダーゼと、(c)色素としてビリルビン又はオレンジ
Ｉと、(d)担体とからなるアルコール検出用試験
片。