JPH05294995A - 抗菌性反転ペプチド、抗菌性オリゴペプチド及び他の抗菌性組成物、及びそれらの製造法ならびにそれらの使用法 - Google Patents

抗菌性反転ペプチド、抗菌性オリゴペプチド及び他の抗菌性組成物、及びそれらの製造法ならびにそれらの使用法

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JPH05294995A
JPH05294995A JP4059848A JP5984892A JPH05294995A JP H05294995 A JPH05294995 A JP H05294995A JP 4059848 A JP4059848 A JP 4059848A JP 5984892 A JP5984892 A JP 5984892A JP H05294995 A JPH05294995 A JP H05294995A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 少くとも一つの微生物病原体特に少くとも一
つの微生物性植物病原体に対する活性を持つ、抗菌性反
転ペプチド（ｒｅｖｅｒｓｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉ
ａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）組成物を提供する。 【構成】 抗菌性反転ペプチド、抗菌性オリゴペプチド
及び他の抗菌性組成物たとえばセクロピンＰ１を包含す
る抗菌性ペプチド。微生物病原体からの保護を生物、特
に植物に与えるために、これら抗菌性ペプチドを用いる
方法。また、抗菌性ペプチドの植物毒性を測定するため
に有用なスクリーニング方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【産業上の利用分野】本発明は、病原体に対して活性
な、抗菌性反転ペプチド（ｒｅｖｅｒｓｅ ａｎｔｉｍ
ｉｏｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含む或る抗菌
性組成物、抗菌性オリゴペプチド、抗菌性ペプチドの混
合物を含む混合物、および病原体、特に植物病原体から
保護するための該組成物の使用に関する。
【従来の技術】たとえば後天性ヒト免疫不全症候群（Ａ
ＩＤＳ）、及びヒト免疫応答及び病原体防禦系を作用さ
せる又は損う日より見病原体の感染により引き起される
関連疾病のような状態を包含する、ヒト免疫応答及び病
原体防禦系の構成及び機能について更に発見をなすこと
に、科学界のかなりの分野が取り組んでいる。この研究
の一部として、基礎理論のモデルとして及び潜在的に移
植可能性のある因子のソースとして他の生物の免疫は防
禦系の生化学に多数の探求がなされてきた。そのような
免疫又は防禦因子の一群は、二つの研究者グループ、つ
まり一つはダットリーウイリアムズに指導されたグルー
プ、もう一つはミハエルザスロフに指導されたグループ
によって１９８７に初めて報告された抗菌性ペプチドで
ある。抗菌性を持つように見えるアフリカツメがエル、
Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｕｉｓの皮膚内に含まれる腺に
より分泌される多数のペプチドを、これらグループは成
功裡に特徴づけ、報告した。ギオバニニ（Ｇｉｏｖａｎ
ｎｉｎｉ）ら、「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ
Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｄ
ｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌｅａｖｉ
ｓ Ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅｓ」、バイオケミストリージ
ャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）２４３、（１９８
７）、１１３−１２０、及びザスロフ（Ｚａｓｌｏ
ｆ）、「Ｍａｇａｉｎｉｎｓ，ａ Ｃｌａｓｓ ｏｆ
Ａｎｔｉ−Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄａｓ ｆ
ｒｏｍ Ｘｅｎｏｐｕｓ Ｓｋｉｎ：Ｉｓｏｌａｔｉｏ
ｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ
ａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ
ｃＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｐｒｅｃｕ
ｒｓｏｒ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
（ＵＳＡ）８４、（１９８７）、５４４９−５４５３、
及びテリー（Ｔｅｒｒｙ）ら、「Ｔｈｅ ｃＤＮＡＳｅ
ｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｒｅｐｒｏ−
ＰＧＳ（Ｐｒｅｐｒｏ−Ｍａｇａｉｎｉｎｓ） ａｎｄ
Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎ
ｇ ｏｆ Ｔｈｉｓ Ｐｒｅｐｒｏ−Ｐｏｌｙｐｅｐｔ
ｉｄｅ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６３、
（１９８８）、５７４５−５７５１を参照されたい。こ
れらの研究は、少しの術後処置で又は術後処置なしで傷
回復の間にかなりの回復力及び感染しない能力をこのカ
エルの種が持つという観察によって、少くとも一部促進
された。これらペプチドは、集合的にマガイニン（ｍａ
ｇａｉｎｉｎｓ）と呼ばれる。研究者が気付いているマ
ガイニン及び他のクラスの抗生又は抗菌性ペプチド（た
とえばセクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎｓ）、デフェンシ
ン（ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）、サルコトキシン（ｓａｒｃ
ｏｔｏｘｉｎｓ）、メリティン（ｍｅｌｉｔｔｉｎｓ）
など）に関する刊行された研究は、一般にヒト医薬関連
健康技術に集中していた。しかしながら、例外としてジ
ェインズ（Ｊａｙｎｅｓ）らの二つの特許出願（ＷＯ
８９／０４３７１及びＷＯ ８８／００９７６）が挙げ
られ、これらは一般に、遺伝子的に病気抵抗を高められ
た植物に関する。ジェインズらは、抗菌性ペプチドのた
めの表現しうる異種遺伝子を含む遺伝子的に軽質転換さ
れた植物が作られると、支持データなしに推定した。こ
の方法で、植物が病気に対する抵抗を高めたと望まれ
る。しかしジェインズらによれば、約３０未満の残基を
持つペプチドたとえばメリティン、ボムビニン（ｂｏｍ
ｂｉｎｉｎ）及びマガイニンは、作物保護分野での使用
には好ましくない。他の人は、植物における抗菌性ペプ
チドの存在又は実際に植物病原菌から植物を保護するた
めの抗菌性ペプチドの使用に関する情報を刊行した。Ｅ
ＰＯ ０，２９９，８２８；Ｐ．カスチールズ（Ｃａｓ
ｔｅｅｌｓ）ら、「Ａｐｉｄａｅｃｉｎｓ：Ａｎｔｉｂ
ａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｆｒｏｍ Ｈｏ
ｎｅｙｂｅｅｓ」Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．６、（１９８
９）、２３８７−２３９１；Ｆ．エブラヒム−ネスバッ
ト（Ｅｂｒａｈｉｍ−Ｎｅｓｂａｔ）ら「Ｃｕｌｔｉｖ
ａｒ−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ
ｔｈｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ
−Ｗａｌｌ−Ｂｏｕｎｄ Ｔｈｉｏｎｉｎｓｉｎ Ｃｏ
ｍｐａｔｉｂｌｅ ａｎｄ Ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ
Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｂｅｔｗｅｅｎ Ｂａｒ
ｌｅｙ ａｎｄ Ｐｏｗｄｅｒｙ Ｎｉｌｄｅｗ」Ｐｌ
ａｎｔａ １７９、（１９８９）、２０３−２１０参
照。この研究の殆んどは、基本的に全長の天然抗菌性ペ
プチドの、植物又は動物における同定及び使用に集中し
た。この研究に加えて、天然に生じるペプチドの多数の
バリエーションが調べられた。詳しくは、種々の程度の
活性を持つマガイニンに基づく誘導体の多数が作られ、
調べられた。ジュレティク（Ｊｕｒｅｔｉｃ）ら、「Ｍ
ａｇａｉｎｉｎ ２Ａｍｉｄｅ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇ
ｕｅｓ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｃｔｉｖｉｔ
ｙ，Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ
ａｎｄＳｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏ
ｔｅｏｌｙｓｉｓ」Ｆｅｂｓ Ｌｅｔｔ．２４９、（１
９８９）、２１９−２２３；チエン（Ｃｈｅｎ）らａ
ｌ，「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍａｇａｉｎｉｎ Ａｎａ
ｌｏｇｕｅｓ Ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｎｔｉ
ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」ＦｅｂｓＬｅ
ｔｔ．２３６、（１９８８）、４６２−４６６；チエン
（Ｃｈｅｎ）ら、米国特許出願Ｎｏ．２８０，３６３、
１９８８年１２月６日出願；クエルボ（Ｃｕｅｒｖｏ）
ら「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ
ｂｉａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍａｇａｉｎｉｎ
Ａｌａｎｉｎｅ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ａｎａ
ｌｏｇｓ」Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ
ｌｅｖｅｎｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ；Ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ
（Ｊ．Ｅ．リビエル（Ｒｉｖｉｅｒ）ら）、（１９９
０）、ｐｐ．１２４−１２６、ＥＳＣＯＭ−Ｌｅｉｄｅ
ｎ発行、Ｎｅｔｈ．，クエルボら「Ｔｈｅ Ｍａｇａｉ
ｎｉｎｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｒｅｌ
ｅｖａｎｔ ｔｏＩｎｃｒｅａｓｅｄ Ａｎｔｉｍｉｃ
ｒｏｂｉａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄＤｅｃｒｅａ
ｓｅｄ Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １、（１９８８）、８
１−８６；国際特許出願Ｎｏ．ＷＯ ８８／０６５９
７；及び日本国特開平１−２９９２９９参照。これら
は、マガイニン１及び２の完全単一残基欠落同族体を含
み、マガイニン２のＮ末端欠落、ならびにマガイニン２
の完全アラニン（Ａｌａ）置換同族体及び抗菌及び又は
抗ガン医薬として有用であるにも知れずかつ第５及び１
２位で置換されているマガイニン２同族体と選択する。
このような研究のもう一つは、バスコム（Ｂａｓｃｏｍ
ｂ）らによって行われ、米国特許出願Ｎｏ．５６６，１
５２（１９９０年８月１０日出願）に報告されている。
バスコムらは、活性、少くとも一つの植物プロテアーゼ
に対する蛋白質分解感受性及び／又は植物毒性のために
重要な天然マガイニン上の特定の位置を同定した。バス
コムらはまた、戦略的アミノ酸置換及び／又はそれに関
する削除を開発した。上記の努力は、完成とはほど遠
い。抗菌性ペプチド構造を機能と関係づける最も単純な
モデルについてさえ完全な解明をまだ与えていない。従
って、抗菌性ペプチド及びその使用について更に研究す
る必要が残っている。更に、天然ペプチド構造のモデル
を作ったバスコムらを含む人々によって提供された有望
な情報に鑑み、天然に生じるペプチドの種々の変性形の
効果の研究は、更なる研究のための有用なモデル及びま
た植物及び動物微生物病原体と戦うための有用なペプチ
ドを提供するかも知れない。本発明は、いくつの発見に
向けられている。第一に、本発明者は、或る新しいペプ
チド及び、少くとも一つの微生物性病原体及び好ましく
は少くとも一つの植物病原体に対して活性である抗菌性
反転ペプチドを包含する、それらの機能性誘導体を同定
した。本発明者らはまた、先に同定した化合物（ＰＧＬ
ａ）の非アミド形（本明細書ではＰＧＬｃと云う）の有
用性を発見した。本発明者らはまた、抗菌活性を持つオ
リゴペプチドを発見し、またこれらペプチド及びオリゴ
ペプチドならびにたとえばセクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉ
ｎ）Ｐ１（これはブタ起源であって、こん虫起源でない
ので、本明細書ではＰ１と呼ぶ）のようなペプチドが、
単独で又は混合物に含有されて、植物病原体に対する保
護を与えるのに有用である。これらペプチド又はそれら
の機能的誘導体ペプチドは更に、低減された植物毒性、
及び／又は蛋白質分解的減成に対する低減された感受性
を有しうる。すなわち、これら化合物及びその或る混合
物は、少くとも一つの植物病原体に対する保護を与える
のに有用であり、また実際に、動物及び食品でのより広
い用途を持ちうる。
【発明が解決すべき課題】本発明の目的の一つはく、抗
菌性であり、かつ少くとも一つの病原体に対する保護を
与えうる化合物を提供することである。本発明の他の目
的は、少くとも一つの植物病原体に対して特に活性な抗
菌性ペプチドを提供することである。本発明の更に他の
目的は、蛋白質分解に対する低減された感受性及び／又
は低減された植物毒性を更に有しうる、少くとも一つの
植物病原体に対して活性な抗菌性ペプチドを提供するこ
とである。本発明の別の目的は、生きた細胞の産生物と
して天然に表現されうる抗菌性ペプチドを提供すること
である。これら目的に従い、本発明の一面は、少くとも
一つの微生物病原体特に少くとも一つの微生物性植物病
原体に対する活性を持つ、抗菌性反転ペプチド（ｒｅｖ
ｅｒｓｅ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ）として知られる新しいクラスの組成物を提供す
る。そのような組成物は、夫々、ＲＡＭＰＰ及びＲＡＭ
ＰＰＰと名付けられうる。この新しいクラスの組成物
は、先に同定された天然マガイニン１ペプチド（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１）の正確に逆である（ＳＥＱＩＤ Ｎ
ｏ．９）の構造を持つペプチドを含む。このクラスの組
成物の別の一員は、マガイニン２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．２）と呼ばれる天然ペプチドの同じで、しかし逆の
配列である（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０）の構造を持つ
ペプチドである。反転構造の組成物は、Ｉ．チャイケン
（Ｃｈａｉｋｅｎ）ら、「Ｓａｑｕｅｎｃｅ Ｓｉｍｐ
ｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒａｎｄｍｉｚａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｅｐｔ
ｉｄｅ ＲｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎＳｕｒｆａｃｅｓ」Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １
０ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐ
ｏｓｉｕｍ，Ｇ．Ｒ．マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）
編、ＥＳＣＯＭ，ライデン、オランダ（１９８８）、３
５４−３６３に開示されている。これらのペプチドは認
識表面を模倣するために用いられた。シャイ（Ｓｈａ
ｉ）ら、「Ａｎｔｉ−Ｓｅｎｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒ
ｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｎｓｅ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ：Ｄｉｒｅｃｔ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｚｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｒ
ｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ−Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓ
ｔａｍ Ｕｓｉｎｇ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｈｉｇｈ
−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
（１９８７）、２６、６６９−６７５を参照されたい。
また、Ｄ−アミノ酸含有エニアチン（抗菌性環状ペプチ
ド）の反転構造が、Ｍ．Ｍ．シェミアキン（Ｓｈｅｍｙ
ａｋｉｎ）ら「Ｔｏｐｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ ｉｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎ：
Ｅｎａｎｔｉｏ−ｅｎｎｉａｔｉｎ Ｂ」Ｎａｔｕｒ
ｅ，Ｊａｎ．２８、（１９６７）、４１２−４１３、及
びＭ．Ｍ．シェミアキンら「Ｔｏｐｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｎ Ｐｅｐｔｉｄ
ｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ」Ａｎｇｅｗ−Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔ．Ｅｄｉｔ．，８、（１９６９）、４９２−４
９９に報告されている。マガイニン１及び２がバスコム
らにより初めて研究されたとき、これらペプチドは少く
とも一つの植物病原性真菌に対する保護を与えることが
でき、かつ植物病原性バクテリアに対するある程度の保
護を与えることができることが発見された。しかし、こ
れら化合物は、植物、動物、食品などへの添加及び使用
に関して重大な疑問を生じるいくつかの望ましくない特
性を持つと見い出された。詳しくは、これらペプチド
は、植物組織内に含まれる又は動物源から分離される酵
素により著しく蛋白分解的減成を受けることが発見され
た。また、マガイニン２は、比較的高レベルの植物毒性
を持つ。従って、植物へのそのような天然ペプチドの添
加は、ホスト細胞の死を起しえた。最良でも、これらペ
プチドは、植物細胞がこれらを消化するので、保護を少
ししか又は全く与えない。これら天然に生じるペプチド
の欠点を直す試みにおいて、バスコムら（前出）は、マ
ガイニン１及び２及び彼らがそれらから誘導した化合物
の構造及び機能を広く研究した。変性されたマガイニン
ペプチドの植物毒性及び／又は蛋白分解的減成速度を低
下し、かつ同時に少くとも一つの植物病原体に対する許
容できる程度保護を維持するところの変性を同定した。
バスコムらはまたこれらペプチドを、植物病原体に対す
る保護の提供を含む種々の分野により有用となす多数の
変性を検討した。
【課題を解決するための手段】今般、天然に生じる抗菌
性ペプチド内に含まれるアミノ酸の配列を、ペプチド結
合の方向性を維持しながら、反転することによって、少
くとも一つの微生物病原体及び特に少くとも一つの微生
物性植物病原体に対する許容できる活性及び従って許容
できる保護レベルが得られることが見い出された。また
本発明者らは、ＰＡＭＰＰ及び特にＲＡＭＰＰＰは更
に、比較的低い植物毒性及び／又は蛋白分解的減成に対
する低い感受性を持つことを見い出した。即ち、これら
ペプチドは、植物又は動物に植物病原体に対する保護を
与えるために植物又は動物に用いる及び／又はそれらに
添加するのに適する新規かつ重要なペプチドのクラスを
表わす。見込みある他の反転ペプチドは、（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．８）のアミノ酸構造を持ちかつＣ末端アミド
形であるセクロピン（Ｃａｃｒｏｐｉｎ）Ａの反転であ
る（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）のアミノ酸構造を持
つ。セクロピン及びその誘導体は、昆虫起源の活性組成
物でありかつ、植物及び動物病原体に対して潜在的に有
用なものとして同定されてきた。Ｊ．Ｍ．ジェインズ
（Ｊｏｙｎｅｓ）ら、「Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｙｔｏｃ
ｉｄａｌ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＬｙｔｉｃＰｅｐｔｉ
ｄｅｓ ｏｎ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅ
ｄ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ」Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．２、１９８９、１５７−１６０；
Ｊ．Ｍ．ジェインズら「Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｙｔｏｃ
ｉｄａｌ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｌｙｔｉ
ｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆ
ａｌｃｉｐａｒｕｍ ａｎｄ Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ
ｃｒｕｚｉ」ＦＡＳＥＢ Ｊ．２、１９８８、２７７
８−８３；Ｊ．Ｍ．ジェインズら「Ｉｎｃｒｅａｓｉｎ
ｇ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ
Ｐｌａｎｔｓ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂａｃ
ｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｉｎｓｅｃｔｓ」
Ｂｉｏａｓｓａｙｓ ６、（１９８７）、２６３−２７
０；Ｊ．Ｍ．ジェインズら「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｉ
ｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｓｅｓｅ ａｎｄ
Ｐｅｓｔ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎｔｏ Ｐｌａ
ｎｔｓ ａｎｄ Ｎｏｖｅｌ Ｇｅｎｅｓ Ｉｎｃｏｒ
ｐｏｒａｔｅｄ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ Ｗｈｉｃｈ
Ｃｏｄｅ Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」ＷＯ ８８／００９７
６、１９８８年２月１１日、米国特許出願８８９，２２
５、１９８６年７月２５日；Ｊ．Ｍ．ジェインズら「Ｐ
ｌａｎｔｓ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｈａｎｃｅ
ｄ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ」
ＷＯ ８９／０４３７１、１９８９年５月１８日、米国
特許出願１１５，９４１、１９８７年１１月２日参照。
しかし、本発明者らは、たとえばセクロピンＡ（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．８）（Ｃ末端アミド形の）は非常に植物
毒性であることを発見した。従って、そのアミノ酸配列
の反転（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）は、マガイニンに
基づくペプチドの構造が反転されたときに見い出された
のと同じ利点を提供するにちがいない。（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１３）の構造を持つＰ１及び（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１５）の構造を持つＰＧＬｃの抗菌性反転ペプチ
ド及び同等のペプチドはまた、これら反転ペプチドの総
ての機能的誘導体であると考えられる。本発明は、少く
とも一つの微生物病原体に対する保護を与えるためにこ
れらペプチドを用いることを包含し、またこれら抗菌性
反転ペプチドが標的にされ、たとえば培地又は植物組織
中の植物細胞の間の細胞外空間に輸送されるのを可能に
するＮ末端に結合されたシグナルペプチドを含む反転ペ
プチドを包含する。上述の目的に従い、本発明の他の面
は、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７）の構造を持つ新規な群
の化合物及びそれらの非アミド機能的誘導体を提供す
る。本発明者は、天然に生じるＰＧＬａのアミド不含形
（非アミド形はＰＧＬｃとして本明細書に示される）が
少くとも一つの微生物性病原体及び好ましくは少くとも
一つの微生物性植物病原体に対する活性を有することを
見い出した。ウイリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、
「Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ｓｙ
ｎｔｈｅｔｉｃ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｆｒｏ
ｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｍａｇａｉｎｉｎ ２ａ ａｎ
ｄ ＰＧＬａ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９、（１
９９０）、４４９０−４４９６参照。更に別の本発明の
一面に従い、本発明者は、そのＮ又はＣ末端を置換する
又はこれに結合するのではなくて、その構造内で置換さ
れた孤立Ｃｙｓを含む被置換ペプチドの新規なクラスを
開発した。これらペプチドは、少くとも一つの微生物性
病原体及び好ましくは少くとも一つの微生物性植物病原
体に対して活性を有し、本明細書で提供される特定のジ
スルフィド結合されたオリゴペプチドにおいて用いるの
に理想的に適している。本発明の別の目的は、抗菌性で
あり、かつ少くとも一つの病原体に対する保護を与えう
る化合物を提供することである。本発明の別の目的は、
少くとも一つの植物病原体に対して特に活性な抗菌性ペ
プチドを提供することである。本発明の更に別の目的
は、蛋白質分解に対する低減された感受性を更に持つで
あろう。少くとも一つの植物病原体に対して活性な抗菌
性ペプチドを提供することである。本発明の別の目的
は、細胞内小室（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａ
ｒｔｍｅｎｔｓ）及び特に培養細胞又は植物組織中の細
胞間の細胞外空間に容易に排せつされうる組成物を提供
することである。本発明の更に別の目的は、比較的長期
間細胞間の細胞外空間で活性を保持するであろうペプチ
ドを提供することである。本発明の別の目的は、複数の
異る抗菌性ペプチドのデリバリーのためのプリカーサー
として用いうるペプチドを提供することである。本発明
の別の目的は、正常な細胞メカニズムにより容易に表現
されるペプチドを提供することである。されら及び他の
目的に従い、本発明の一つの面は、抗菌性オリゴペプチ
ドである新規なクラスの化合物を提供することである。
これら新規なペプチドは更に、蛋白分解的減成に対して
低い感受性を有しうる。広い意味において、本発明のオ
リゴペプチドは、少くとも一つの第一のペプチドモノマ
ー及び少くとも一つの第二のペプチドモノマーとして少
くとも二つのペプチドサブユニットを含む機能的蛋白質
である。これら二つのペプチドモノマー、又は個々のオ
リゴペプチドを成す任意的な追加的ペプチドモノマー
は、ペプチド結合により直接に、又はジスルフィド結合
又は一以上のブリッジにより間接に相互接続される。レ
ーガン（Ｒｅｇａｎ）及びＷ．デグラド（Ｄｅｇｒａｄ
ｏ）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｚａｔｉｏｎ ｏｆａ Ｈ
ｅｌｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｆ
ｒｏｍ Ｆｉｒｓｔ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ」Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ，２４１，（１９８８），９７６−９７８及びチ
エン（Ｃｈｅｎｇ）ら、前出（非抗菌性ペプチドの二量
体及び多量体を記載）参照。また、本発明のオリゴマー
は、少くとも一つのペプチドモノマーをジスルフィド結
合に関与するＣｙｓから隔てるために一以上のブリッジ
を用いることにより、又はペプチドユニットをブリッジ
に結合するペプチド結合の少くとも一つを横切るジスル
フィド結合が形成するのを許すことにより、複数のブリ
ッジ及びジスルフィド結合によって結合されうる。本発
明に従い、オリゴペプチドを構成する個々のペプチドモ
ノマーの夫々は一般に、微生物性病原体に対して活性で
ありかつ、より好ましくは、少くとも一つの微生物性植
物病原体に対して活性である、自体抗菌性のペプチドで
ある。しかし、任意的なブリッジではなくてペプチドサ
ブユニットの少くとも二つが少くとも一つの微生物性病
原体及び好ましくは少くとも一つの微生物性植物病原体
に対する活性を持つ限り、ペプチドモノマーの夫々が単
独でそのような活性を示す必要はない。得られるオリゴ
ペプチドは自体、少くとも一つの微生物性病原体に対
し、及びより好ましくは少くとも一つの微生物性植物病
原体に対して活性である。従って、二量体（すなわち二
つのペプチドサブユニットのみ）について、用いられた
少くとも一つの第一の及び少くとも一つの第二のペプチ
ドモノマーの両者及び得られたオリゴペプチドは、少く
とも一つの病原体に対し活性である。本発明の三量体
は、少くとも一つの病原体に対し活性なペプチドサブユ
ニットのみを含む必要はない。たとえば、残り二つのモ
ノマーが少くとも一つの病原体に対して活性であり、か
つ得られる三量体も少くとも一つの病原体に対して活性
である限り、本発明の三量体オリゴペプチドの末端ペプ
チドモノマーの一つ又は中間のモノマーが、抗菌性を示
さなくてもよい。本発明のオリゴペプチドは、驚くほど
多数の形を取りうる。しかし、簡単のために、本発明の
オリゴペプチドは、二量体すなわち介在するブリッジ有
り又は無しで二つのペプチドより成るオリゴペプチドと
して最良に概念化されうる。これらの最も単純なもの
は、少くとも一つの第一のペプチドモノマーと少くとも
一つの第二のペプチドモノマーから成る、いわゆる頭尾
オリゴペプチドである。各ペプチドモノマーは、Ｎ末端
（アミノ末端）及びＣ末端（カルボキシル末端）を有
し、この両者はペプチド結合を形成しうる。頭尾構造に
おいて、少くとも一つの第一のペプチドモノマーのＣ末
端アミノ酸は、何らの介在するブリッジ基なしで、ペプ
チド結合により、少くとも一つの第二のペプチドモノマ
ーのＮ末端に直接結合される。このタイプの頭尾ペプチ
ドの例は、下記構造を持つオリゴペプチドである。（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
２）；（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．３）ここでＸａａ５はＰｈｅ，Ｘａａ６はＬｅｕ，
Ｘａａ７はＨｉｓ，Ｘａａ８はＧｌｕ，Ｘａａ１０はＧ
ｌｙ，Ｘａａ１１はＬｙｓ，Ｘａａ１２はＰｈｅ，Ｘａ
ａ１３はＧｌｙ，Ｘａａ１８はＧｌｙ，Ｘａａ１９はＧ
ｌｕ，Ｘａａ２１はＭｅｔ，Ｘａａ２２はＬｙｓそして
Ｘａａ２３はＰｒｏである（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１
０）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）；（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）；（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．１３）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）；
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．１０）；及び（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）−（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．９）。上記例の総てにおいて、ハイフ
ンは、ハイフンの左のペプチドモノマーのＣ末端アミノ
酸とハイフンの右のペプチドモノマーのＮ末端アミノ酸
の間の直接ペプチド結合を表す。上記例から容易に判る
ように、本発明のオリゴペプチドは、夫々が植物病原体
に対し活性である同じペプチドモノマー（該ペプチドモ
ノマーの塩基構造は類似し、しかしそれは互に相対的に
置換されている）、ＲＡＭＰＰＰ、及び／又はその構造
及び起源が大きく異るペプチドモノマーから構成される
ことができる。本発明に従う別のタイプのオリゴペプチ
ドは、いわゆるブリッジされたオリゴペプチドである。
一実施態様において、これらオリゴペプチドは、上記の
ように少くとも一つの第一のペプチドモノマー及び少く
とも一つの第二のペプチドモノマーより成る。しかし、
加えて、少くとも一つのアミノ酸から成る少くとも一つ
のブリッジが備えられる。ブリッジは、Ｎ末端及びＣ末
端を持つ。結合されると、本発明のブリッジされたオリ
ゴペプチドは、ブリッジのＮ末端に直接結合した少くと
も一つの第一のペプチドモノマーのＣ末端を有し、そし
てブリッジのＣ末端は少くとも一つの第二のペプチドモ
ノマーのＮ末端に直接結合される。そのようなオリゴペ
プチドの例として、下記が挙げられる。（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）−（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２）；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）−
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
３）ここでＸａａ５はＰｈｅ，Ｘａａ６はＬｅｕ，Ｘａ
ａ７はＨｉｓ，Ｘａａ８はＧｌｕ，Ｘａａ１０はＧｌ
ｙ，Ｘａａ１１はＬｙｓ，Ｘａａ１２はＰｈｅ，Ｘａａ
１３はＧｌｙ，Ｘａａ１８はＧｌｙ，Ｘａａ１９はＧｌ
ｕ，Ｘａａ２１はＭｅｔ，Ｘａａ２２はＬｙｓそしてＸ
ａａ２３はＰｒｏである；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１
０）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）−（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２）；（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．９）−（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．５）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）；及び
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
５）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）。上記例の総てお
いてブリッジ内に含まれるアミノ酸の五つ総てがＧｌｙ
である好ましい五員ブリッジ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
５）が用いられる。他のブリッジ、たとえば長さにおい
て好ましくは１００以下のアミノ酸又はより好ましくは
２０以下のアミノ酸のオメガループ又は他の構造もまた
有用である。本発明の別の面において、ブリッジは、一
つという少いアミノ酸を成してもよい。そのような場合
のオリゴペプチドの例は、下記の通りである。（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２）−Ａｌａ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
２）；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）−Ｇｌｙ−（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２０）；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）
−Ａｌａ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）；（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．９）−Ｇｌｙ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１
４）；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）−Ｇｌｙ−（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．９）；及び（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）
−Ａｌａ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４）。しかし、本
発明のオリゴペプチドがペプチド結合により結合されて
いる必要はない。事実、それらは、ジスルフィド結合に
より結合されてよい。即ち、本発明の別の面において、
オリゴペプチドは少くとも一つの第一のペプチドモノマ
ー及び少くとも一つの第二のペプチドモノマーを含み、
その夫々はＮ末端及びＣ末端を含む。そして、少くとも
一つの第一のペプチドモノマー及び少くとも一つの第二
のペプチドモノマーは、ジスルフィド結合により結合さ
れる。得られるオリゴペプチドは頭尾構造であり、それ
によって少くとも一つの第一のペプチドのＣ末端はＣｙ
ｓであり、少くとも一つの第二のペプチドのＮ末端のＣ
ｙｓにジスルフド結合により結合される。これらオリゴ
ペプチドはまた、本明細書で述べるように頭頭又は尾尾
構造で結合されてもよい。あるいは、本発明のこの面に
従うオリゴペプチドは、ペプチドモノマーの少くとも一
つがその末端でオリゴペプチドに結合されていないよう
にして結合されることができる。むしろ、本発明のこの
面におけるオリゴペプチドは、その末端ではなくてＣｙ
ｓにより置換された少くとも一つのペプチドモノマーを
用いる。すると、このＣｙｓは、第二のペプチドモノマ
ーのＮ又はＣ末端に置換された又は結合されたＣｙｓ
（ブリッジのＮ又はＣ末端はＣｙｓにより置換された又
はそれを結合されている）、又は第二のペプチドモノマ
ーの末端以外で置換されたＣｙｓとジスルフィド結合を
形成する。本発明の頭尾態様に従い有用な少くとも一つ
の第一の及び第二のペプチドモノマーは、その末端の一
つに結合された追加的Ｃｙｓを持ってよく、たええば
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）−Ｃｙｓ、又は一つの末端
で置換されたＣｙｓを持ってよく、たとえば（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．３）であり、ここでＸａａ１はＰｈｅ、Ｘ
ａａ６はＬｅｕ，Ｘａａ７はＡｒｇ，Ｘａａ８はＳｅ
ｒ，Ｘａａ１０はＧｌｙ，Ｘａａ１１はＬｙｓ，Ｘａａ
１２はＰｈｅ，Ｘａａ１３はＧｌｙ，Ｘａａ１８はＧｌ
ｙ，Ｘａａ１９はＧｌｕ，Ｘａａ２１はＭｅｔ，Ｘａａ
２２はＬｙｓそしてＸａａ２３はＣｙｓである。もし、
これら二つのペプチドモノマーが夫々の末端でＣｙｓア
ミノ酸の間のジスルフィド結合により結合されている
と、得られる構造は（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）−Ｃｙ
ｓ−Ｓ−Ｓ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）＊と表わされ
ることができ、ここで−Ｓ−Ｓは二つのＣｙｓの間の酸
化されたジスルフィド結合を示し、＊はこのペプチド
が、そのＣ末端が他のペプチドのＣ末端に向くように転
倒されていることを示し、本例では＊により示された同
じペプチドはＣ末端にＣｙｓを持つマガイニン１の複数
残基置換である。これは、尾尾構造の例である。頭頭構
造は、二つのペプチドモノマーのＮ末端でＣｙｓを置換
し又は結合し、次にジスルフィド結合によりモノマーを
結合することにより得ることができる。Ｎ末端に結合さ
れたＣｙｓを持つペプチドモノマーの例は、Ｃｙｓ−
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）の構造（ここでマガイニ
ン１（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．１）の位置７のＨｉｓがＡｒ
ｇで置き代えられ、位置８のＳｅｒがＧｌｎで置き代え
られ位置２３のＳｅｒがＰｒｏで置き代えられている）
の構造を持ち、ここでＣｙｓは位置１のＧｌｙにペプチ
ド結合される。本発明のこの面における頭尾オリゴペプ
チドは、構造（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）−Ｃｙｓのペ
プチドモノマーと、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）（こ
こでＮ末端付加はＣｙｓである）の単一残基Ｎ末端付加
誘導体である第二のペプチドモノマーの間にジスルフィ
ド結合を形成することにより得られる。得られる構造
は、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃ
ｙｓ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）であろう。本発明
者は更に、本発明に従うジスルフィド結合されたオリゴ
ペプチドがまた、たとえばその末端以外で一つのアミノ
酸Ｃｙｓにより置換されたＡＭＰＰＰである少くとも一
つのペプチドモノマーを用いて作ることができることを
見い出した。得られるオリゴペプチドの最も単純な形
は、構造（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ
−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）を持つ構造により示され
ることができ、ここでたとえばペプチド（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．１）中の位置Ｘａａ７に通常見られるＨｉｓは
アミノ酸Ｃｙｓで置き代えられる。すると、ジスルフィ
ド結合は、二つのペプチドモノマー上のＣｙｓ間で形成
される。上記のいずれも、所望のように結合されること
ができ、得られるオリゴペプチドはかなりの数の繰返し
単位で伸びることができる。たとえば、本発明のオリゴ
ペプチドは、単一アミノ酸（Ａｌａ）を持つブリッジに
そのＣ末端Ｓｅｒでペプチド結合されている（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２）の構造を持つ第二のペプチドのＮ末端
に直接に、そのＣ末端でペプチド結合された構造（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．１）を持つことができ、ここでＡｌａ
は（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）の構造を持つ第三のペプ
チドのＮ末端に結合され、この第三のペプチドのＣ末端
は（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．１２）（ここでＸａａ１＝Ｓｅ
ｒ、Ｘａａ２＝Ｌｙｓ，Ｘａａ６＝Ｇｌｙ，Ｘａａ１１
＝Ａｌａ，Ｘａａ１４＝Ｇｌｙ，Ｘａａ１６＝Ｇｌｕ，
かつＸａａ１７＝Ａｒｇ）の構造を持つ第四のペプチド
のＮ末端に直接結合される。得られるペプチドの例は下
記の通りである。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）＝（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．２）−Ａｌａ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．６）−（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．１２）。本発明のオリ
ゴペプチドの別の例は下記の通りである。（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．６）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）−Ｇｌｙ
−（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
２）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）−（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．１４）−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．３）＊＊，＊。ここで＊で示されたペプチドモノマ
ーは、この構造における順（尾尾構成）で左にそのＣ末
端があるように転倒されており、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．３）＊＊のＸａａ７はＣｙｓにより置換されてお
り、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）はＸａａ５＝Ｐｈｅ、
Ｘａａ６＝Ｌｅｕ，Ｘａａ７＝Ｈｉｓ，Ｘａａ８＝Ｇｌ
ｕ，Ｘａａ１０＝Ｈｉｓ，Ｘａａ１１＝Ｌｙｓ，Ｘａａ
１２＝Ｐｈｅ，Ｘａａ１３＝Ｇｌｙ Ｘａａ１８＝Ｇｌ
ｙ，Ｘａａ１９＝Ｇｌｕ，Ｘａａ２１＝Ｍｅｔ，Ｘａａ
２２＝Ｌｙｓ，及びＸａａ２３＝Ｓｅｒを有し、−Ｓ−
Ｓ−はジスルフィド結合を示す。オリゴペプチドの他の
例は、下記である。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）−Ｃ
ｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）
−（ＳＥＱ ＩＤＮＯ．５）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
１）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２）。ここで（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）のＸａ
ａ１〜Ｘａａ５はＧｌｙである；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．６）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）−（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．４）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）−Ｃｙ
ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）＊
−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）＊−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．７）＊−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）＊（ここで
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）及び（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．４）＊のＸａａ１〜Ｘａａ４はＧｌｙである；及び
Ｍｅｔ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ
−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）。ここで（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２）の位置７のＨｉｓはＡｒｇで置換されてい
る。本発明のこの面における別の実施態様において、種
々の形のブリッジがジスルフィド結合により結合され
て、複合ブリッジ化分子を作ってもよい。得られるオリ
ゴペプチドは、ここで述べたジスルフィド結合されたオ
リゴペプチドと本質的に同じである。しかし、それらは
更に、一以上のペプチドサブユニットをジスルフィド結
合から隔てるブリッジを含む。このような構造の一例
は、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．５）−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２）但し（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）のＸａａ１
〜Ｘａａ５はＧｌｙである、の構造を持つオリゴペプチ
ドである。もし得られるオリゴペプチドが頭尾なら、Ｃ
ｙｓに結合される（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）の残基は
Ｇｌｙである。もし得られるオリゴペプチドが尾尾な
ら、Ｃｙｓに結合される残基はＳｅｒであり、ジスルフ
ィド結合の左のペプチド構造は（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
２）＊と表わされる。このオリゴペプチドにおいて、五
つのＧｌｙ残基のブリッジは追加的なスペースを提供
し、更なるフレキシビティ及びモノマー間相互作用を可
能にし、同時にジスルフィド結合により種々のモノマー
を結合する能力を与える。本発明のより好ましい面にお
いて、複合ブリッジは構造（ＳＥＱ ＩＤＮＯ．５）−
Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−、ここで（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．５）のＸａａ１〜Ｘａａ５はＧｌｙであ
る、を持つ。この構造は、ジスルフィド結合により隔て
られた二つのブリッジを含む複合ブリッジを用いる。別
の態様において、ブリッジとジスルフィド結合の組合せ
は、独特なオリゴペプチドを与えるために用いられう
る。本発明のこの面において、ここで記載するようなブ
リッジされたオリゴペプチドは、二つのペプチドモノマ
ーか又は一つのペプチドモノマーと一つのブリッジを含
み、これらは単一Ｃｙｓにより置換されており、あるい
はブリッジは二つのＣｙｓを含む。ジスルフィド結合
は、ジスルフィド結合がまた、Ｃｙｓ含有モノマーをブ
リッジに結合する又は全体的にブリッジ内にあるペプチ
ド結合の一つを横切るように、Ｃｙｓアミノ酸間に形成
されてよい。そのような得られるオリゴペプチドの一つ
はたとえば、構造（ＳＥＱ ＩＤＮＯ．１）−（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．４）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を持
ち、ここで構造（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）を持つペプ
チドの位置２１に通常見られるアミノ酸ＭｅｔはＣｙｓ
で置換されており、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）中でＸ
ａａ１はＧｌｙ、Ｘａａ２はＣｙｓ、Ｘａａ３はＧｌ
ｙ、Ｘａａ４はＧｌｙであり、ジスルフィド結合は二つ
のＣｙｓアミノ酸の間に形成される。同様に、得られる
オリゴペプチドの例は、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）−
（ＳＥＱ ＩＤＮＯ．４）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
２）の構造を持ち、ここで構造（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．
１）を持つペプチドの位置２１に通常見られるアミノ酸
ＭｅｔはＣｙｓで置換されており、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．４）中でＸａａ１〜Ｘａａ４はＧｌｙであり、（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）の構造を持つペプチドの位置２
に通常見られるアミノ酸ＩｌｅはＣｙｓで置換されてお
り、ジスルフィド結合は二つのＣｙｓアミノ酸の間に成
形される。オリゴペプチドの別の例は、構造（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）−
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）を持ち、ここで（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．４）についてＸａａ１はＣｙｓ、Ｘａａ２
はＧｌｙ、Ｘａａ３はＰｒｏ、Ｘａａ４はＣｙｓであ
り、ジスルフィド結合はブリッジ内の二つのＣｙｓ間に
形成される。ムター（Ｍｕｔｔｅｒ）、「Ｔｈｅ Ｃｏ
ｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗ Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓ ａｎｄＥｎｚｙｍｅｓ−−ＡＰｒｏｓｐｅｃｔ ｆ
ｏｒ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ？」Ａｒｇｅｗ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，２４，（１９８５），
６３９−６５３参照。本発明の別の面に従い、そのＮ末
端にシグナルペプチドを付着させたオリゴペプチドが提
供され、これはそれによって、本明細書記載のオリゴペ
プチドをオリゴペプチド産生のリボソーム部位から細胞
間の細胞外空間へと輸送するのを促進し、従って得られ
るオリゴペプチドは少くとも一つの微生物病原体による
侵入に対する保護を与えるのにより有効でありうる。本
発明はまた、病原性微生物の攻撃、移転増殖又は感染の
悪影響から生物及び好ましくは植物を保護するために、
本明細書記載のオリゴペプチドを用いる技術を含む。本
発明の別の目的は、植物病原体を含む病原体に対する高
められた活性を持つ化合物を提供することである。本発
明の他の目的は、組成物の一成分により提供されうるよ
りも広い範囲の可能性ある微生物保護を示す組成物を提
供することである。本発明のこの面において、二以上の
別個の抗菌性ペプチドの混合物を含む新規化合物が提供
される。このような抗菌性組成物の一つは、一つの群の
病原体に対して比較的活性であり、他の群の病原体に対
して比較的不活性な少くとも一つの第一の抗菌性ペプチ
ド、及び上記少くとも一つの第一の抗菌性ペプチドが比
較的不活性であるところの病原体の群に対して比較的活
性であり、かつ上記少くとも一つの第一の抗菌性ペプチ
ドが比較的活性であるところの病原体の群に対して比較
的不活性である少くとも一つの第二の抗菌性ペプチドを
含む。本発明者は、特定の抗菌活性、蛋白分解的減成及
び／又はペプチドの植物毒性の低減を与えるために、上
記のバスコムらの適用に従ってマガイニン１及び２を変
性（修飾）するにおいて、マガイニンに構造的に関係す
るペプチドの活性に或る犠牲が時に生じることを発見し
た。すなわち、たとえば、得られたペプチドは、低減さ
れた植物毒性又は蛋白分解的減成に対する高められた抵
抗、又はこの両者を持つことができ、かつ特定の病原体
又は特定のクラスの病原体に対してなおも活性でありう
る。しかし、しばしば、これら改良されたペプチドは、
他の病原体に対する実質的な活性を失う。たとえば、本
発明者は、位置８のＳｅｒをＧｌｎで置換することによ
って（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）の構造を持つマガイニ
ン２を修飾することにより、得られたペプチドは植物毒
性における実質的低減及び蛋白分解程度における実質的
低減を有する。Ｐ３フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）の
ような植物病原性真菌の生長を禁示するのに必要な最小
完全阻止濃度は、２０〜２５μｇ／ｍｌから４０μｇ／
ｍｌへ高められる。しかし、エルウィニア カルトボラ
カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ Ｃａｒｔｏｖｏｒａ
ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）のような植物病原性バクテリア
に対する保護を与えるのに必要な組成物の最小完全阻止
濃度は約４０〜５０μｇ／ｍｌから１５０μｇ／ｍｌ超
へと増大する。明らかに、この組成物は、その低減され
た植物毒性及び蛋白分解感受性の故に、大きな見込みが
ある。しかし、その使用は、他の植物病原体の顕著なク
ラス（すなわちバクテリア性病原体）に対するその不活
性により幾分損なわれる。本発明者は、他のペプチド
が、植物病原体に関し、対応するしかし相補的挙動を示
すことを発見した。たとえば、上記のマガイニン２誘導
体と違ってＰ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）はエルウィ
ニア カルトボラ カロトボラに対して非常に活性であ
り、しかしＰ３フサリウムに対して比較的不活性である
ことを、本発明者は見い出した。そのような相補的ペプ
チドの二以上の混合物は、一つの抗菌性ペプチド単独の
使用により実現できない広いスペクトルの保護を与える
ことができる。さらに、これらペプチドは植物細胞ホス
トの生育性を阻害せず、かつ少くとも一つの植物プロテ
アーゼの存在下で不必要に短いライフスパンの欠点を有
さない。これら化合物は、植物病原性真菌及びバクテリ
アに対する広いスペクトルの活性を持ち、同時に低減さ
れた植物毒性及び蛋白分解に対する増大された総体的抵
抗を持つ混合物として提供されうる。これら混合物は、
二以上の抗菌性ペプチドを作り、集めそして混合するこ
とにより、及び／又は形質転換されたホスト細胞中でこ
れらペプチドを同時表現するように一又は複数の遺伝子
を操作することにより提供されうる。また、これらペプ
チドは、本明細書記載のようにリンクされてオリゴペプ
チドを形成し、次にたとえば植物内に含まれる蛋白分解
酵素により開裂されることができる。これは、二つの相
補的抗菌性ペプチドの混合物のインサイツ形成を結果す
る。本発明の他の目的は、抗菌性ペプチドの相対的毒性
を測定するために抗菌性ペプチドを簡便にスクリーニン
グする方法を提供することである。本発明の一面に従
い、少くとも一つの抗菌性ペプチドと、培養された全体
細胞を含む溶液とも混合すること、及び上記培養された
全体細胞による酸素消費の変化を測定することの工程を
含む、相対的毒性を測定するために、抗菌性ペプチドを
スクリーニングする方法が提供される。培養された全体
細胞により消費される酸素の抑制の程度は、培養された
細胞と一般の細胞の両者に対する、ペプチドの相対的毒
性の指標である。このスクリーニング法に従う好ましい
実施態様において、培養された全体植物細胞が用いられ
る。本発明の別の好ましい実施態様において、植物細胞
はプロトプラストである。本発明の好ましい実施態様を
以下で説明する。本発明に従い用いられる種々のペプチ
ドは、少くとも一つの微生物病原体に対して活性な抗菌
性ペプチドである。しかし、本発明の好ましいペプチド
は、ＡＭＰＰＰという言葉で表わされ、これはＡｎｔｉ
ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｃｔｉｖｅ
Ａｇａｉｎｓｔ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎの略で
あり、本明細書で定義する如く、植物病原体に対する少
くとも抗真菌及び／又は抗バクテリア活性を持つ蛋白質
又はペプチドである。本発明の目的のために好ましいこ
れら抗菌性ペプチド及び特にＡＭＰＰＰ組成物は、多数
の基準の少くともいくつかを満すようなものである。本
発明に従うペプチド及びオリゴペプチドのための主な基
準は、一以上の病原体及び特に植物病原体に対する活性
である。即ち、これらペプチドは、好ましくは、植物病
原体の生長を阻止しかつ／又は植物病原体の生存を制限
するにおいて有効である。植物病原体という言葉は、植
物に損傷及び／又は病気を起すことができる生物を包含
し、真菌、原核生物（バクテリア及びマイコプラズ
マ）、ウイルス及びウイロイド、線虫、原生動物などを
含む。たとえば、植物の病気を起しうる８０００種以上
の真菌がある。ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，第３
版、Ｇｅｏｒｇｅ Ｎ．Ａｇｒｉｏｓ，Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８８；Ａ Ｌｉｔｅｔ
ａｔｕｒｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｓ，Ａ．Ｙ．Ｒｏｓｓｍａｎら、Ａｍ
ｅｒｉｃａｎＰａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔ
ｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，１９８８；Ｔｈｅ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｅｎｔｉ
ｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅ
ｎｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｎ．Ｗ．Ｓｃｈａｄ．Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｌｏｇｉｃａｌ Ｓ
ｏｃｉｅｔｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ ＭＮ．１９８０参照。
そのような病原体の広汎な列挙に照し、本発明の文脈に
おいて最も有用なＡＭＰＰＰは、多数の植物病原体の生
長又は生存を禁止する又は阻げる広いスペクトルの活性
を持つ、又は特定の群の病原体、特に多くの作物に病気
を起す群に対して極めて有効であるものである。たとえ
ば、エルウィニア種は、１年に数１０億ドルを農家に支
出させる種々の腐敗病及びしおれ病に対して責任があ
る。従って、エルウィニア種の生存又は増殖を抑制でき
る一以上のＡＭＰＰＰが望まれる。しかし、特定の種の
真菌に対し及び／又は特定のホストを攻撃するのに加わ
るかも知れない他のクラスの病原体に対しある程度の活
性をも備えるＡＭＰＰＰがより望ましい。そのような状
況の例はメイズにおける茎腐敗病であり、これはいくつ
かの種の真菌及びバクテリア（たとえばＦｕｓａｒｉｕ
ｍ種、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ種、Ｄｉｐｌｏｄｉａ種、
Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ種、Ｐｙｔｈｉｕｍ種、Ｃｅ
ｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ種、Ｅｒｗｉｎｉａ種、Ｐｓ
ｅｕｄｏｍｏｎａｓ種）の種々の組合せにより起され
る。他の例は、損傷した組織が植物生産物の収穫後の病
気におけるように、腐生生物により浸入された状況であ
る。多数の芝生の又は良性の微生物（それは主にバクテ
リア種である）が植物に関連して見られる。有用なＡＭ
ＰＰＰは、これら微生物の生存に影響を有さず、一以上
の区別される植物病原体の有効的抑制を示すものであ
る。従って、ある状況において、ある程度の特異性が有
利である。たとえば、根系の保護が望まれるとき、空気
中窒素を固定するリゾビウム種のような生物又は根を或
る病原体から保護するよう働くシュードモナス種のよう
な根生生物を無傷のままに残すことが有利である。これ
ら有益な又は良性の生物の多くはバクテリアであるの
で、バクテリアに対して低減された活性を持つＡＭＰＰ
Ｐに特定の有用性がある。この言葉は抗菌性ペプチドの
一以上の全類に広く適用されうるが、少くとも一つの病
原体に対し活性な抗菌性ペプチド及び言葉「ＡＭＰＰ
Ｐ」は下記を包含する：マガイニン１；マガイニン２；
反転マガイニン；Ｐ１及び反転Ｐ１、ＰＧＬｄ及び反転
ＰＧＬｃ；セクロピン（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ）Ａ、Ｂ及び
Ｄを含むセクロピン及びそれらの反転ペプチド、Ｈ．
Ｇ．ボーマン（Ｂｏｍａｎ）ら、「Ｏｎｔｈｅ Ｐｒｉ
ｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｌｙｓｏｚｙ
ｍｅｒｓ，ｃｅｃｒｏｐｉｎｓ，ａｎｄ Ａｔｔａｃｉ
ｎｓ ｆｒｏｍ Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ ｃｅｒｏｐｉ
ａ」Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａ
ｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９，（１９８
５），５５１−５５８参照；サルコトキシン（Ｓａｒｃ
ｏｔｏｘｉｎ）及びその反転ペプチド；ボンビニン（Ｂ
ｏｍｂｉｎｉｎ）及びその反転ペプチド、Ａ．クソーダ
ス（Ｃｓｏｒｄａｓ）及びＨ．ミクル（Ｍｉｃｈｌ）、
「Ｉｓｏｌｉｅｒｕｎｇ ｕｎｄ Ｓｔｒｕｋｔｕｒａ
ｕｆｋｌａｒｕｎｇ ｅｉｎｅｓ Ｈａｍｏｌｙｔｉｓ
ｃｈ ｗｉｒｋｅｎｄｅｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ
ａｕｓ ｄｅｍ Ａｂｗｅｈｓｅｋｒｅｔ ｅｕｒｏ
ｐａｉｓｃｈｅｒ Ｕｎｋｅｎ」Ｍｏｎａｔ．ｆｕｒ
Ｃｈｅｍｉｅ，１０１（１９７０），１８２−１８９参
照；ＸＰＦ及びその反転ペプチド；チオニン（Ｔｈｉｏ
ｎｉｎ）及びその反転ペプチド；デフェンシン（Ｄｅｆ
ｅｎｓｉｎ）及びその反転ペプチド、Ｈ．ボーゲル（Ｖ
ｏｇｅｌ）ら、「ＴｈｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｍ
ｅｌｉｔｔｉｎ ｉｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．Ｊ．，５０，（１９８６），５７３−５８２参
照；メリチン（Ｍｅｌｉｔｔｉｎ）及びその反転ペプチ
ド、Ｈ．ボーゲルら、「Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ｏｆ Ｍｅｌｉｔｔｉｎ ｉｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」
Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，５０，（１９８６），５７３−
５８２参照；及び他の同等のペプチド及びその機能性誘
導体。本明細書で機能的誘導体という言葉は、単一残基
欠如誘導体、複数残基欠如誘導体、単一残基置換誘導
体、複数残基置換誘導体、単一残基末端付加誘導体、及
びペプチドのＣ末端アミドを包含する。単一残基欠如誘
導体という言葉は、特定に述べられたペプチドの残基の
一つが欠如している他はそれと同じである又はこれに関
係づけられる構造を持つ特定のペプチドを意味する。た
とえば、〔ＤＥＳ Ｍｅｔ ２１〕ＭＡＧ１は、その構
造が（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）により示されるマガイ
ニン１の構造と同じペプチドであるが、Ｎ末端Ｇｌｙに
対し２１番目の位置に通常見られるＭｅｔが除去されて
いる。（Ｄｅｓという表示は除去を示し、Ｍｅｔは除去
されたアミノ酸を示し、２１は除去されたＭｅｔが天然
に生じるペプチドで占める位置を示し、ＭＡＧ１はその
ように変性されたペプチド（マガイニン１）を示す。）
得られる２２のアミノ酸のペプチドは、ここで定義し
たように単一残基欠如誘導体である。同様に、複数残基
欠如誘導体とは、さもなくば同一である又は関連づけら
れるところの配列から一より多いアミノ酸が除去されて
いるペプチドを云う。たとえば（ＤＥＳ（Ｌｙｓ ２
２，Ｓｅｒ ２３）〕ＭＡＧ１は、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１）により示されるマガイニン１と構造が同じペプ
チドであるが、位置２３のＣ末端Ｓｅｒ及び位置２２に
ある隣りのアミノ酸Ｌｙｓが共に除去されている。得ら
れる２１のアミノ酸のペプチドは、本発明に従い複数残
基欠如誘導体であり、より詳しくは二残基欠如誘導体で
ある。本発明に従う単一残基置換誘導体とは、一つの残
基が変えられていることを除いては同一である又は関連
づけられる化合物の構造に同じであるペプチドを包含す
る。たとえば「Ｇｌｎ ８〕ＭＡＧ２は、（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．２）により示されるマガイニン２と同じペプ
チドであるが、マガイニン２の位置８に通常見られるＳ
ｅｒがＧｌｎで置き代えられ、つまり置換されている。
得られた２３のアミノ酸のペプチドは、本発明に従い単
一残基置換誘導体である。本発明に従う単一残基置換誘
導体という言葉はまた、一つのＣｙｓアミノ酸で内部的
に（すなわち末端ではなく、又はそれに付着されるので
はなく）置換されたペプチドの群を包含する。そのよう
な化合物の例は、〔Ｃｙｓ ２２〕Ｍａｇ２、〔Ｃｙｓ
８〕Ｍａｇ１、〔Ｃｙｓ ８〕Ｍａｇ２などである。同
様に、本発明に従う複数残基置換誘導体とは、複数の置
換がなされていることを除いては、特定の又は関連づけ
られるペプチドと同一のペプチドを云う。たとえば〔Ａ
ｌａ １３，１８〕ＭＡＧ１は、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１）で示されるマガイニン１と同一のペプチドであ
るが、マガイニン１の位置１３及び１８に通常見られる
ＧｌｙがＡｌａで置き代えられている。同様に、〔Ａｒ
ｇ ７，Ｇｌｎ ８，Ｐｒｏ ２３〕ＭＡＧ１（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．２０）は、位置７のＨｉｓがＡｒｇで置
き代えられ、つまり置換され、位置８のＳｅｒがＧｌｎ
で置き代えられ、位置２３のＳｅｒがＰｒｏで置換され
ていることを除き、マガイニン１に同一のペプチドであ
る。得られたペプチドは、複数残基置換誘導体である。
このタイプの他のペプチドは〔Ａｒｇ ７，Ｃｙｓ
８〕ＭＡＧ１である。これら誘導体は、排他的な変性で
はない。すなわち、ペプチドは、置換及び欠如の両者の
誘導体であることができる。たとえば〔Ｄｅｓ Ｇｌｙ
１，Ｍｅｔ２〕ＭＡＧ２は、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
２）を持つマガイニン２と同じ構造のペプチドである
が、Ｎ末端Ｇｌｙが除去されており、かつＮ末端に対し
位置２に通常見られるＩｌｅがアミノ酸Ｍｅｔで置き代
えられ、つまり置換されている。得られるペプチドは、
本発明に従い単一残基欠如誘導体であり、かつ単一残基
置換誘導体である。何らかの特定の欠如又は置換に限定
されるものではないが、マガイニンに構造的に類似する
ペプチドのためのより好ましい置換のいくつかは、（Ｓ
ＥＱ ＩＤＮｏ．３）の構造を持つペプチドにより示さ
れる。この配列で用いられる「Ｘａａ」は、可変物を示
し、そこにアミノ酸の選択された群のいずれかが位置さ
れうる。従って「Ｘａａｎ」は、可変物を示すのに用い
られるのみでなく、その可変物の相対的位置又はその可
変物が示すアミノ酸を表すためにも用いられる（すなわ
ちｎは、位置又は第ｎ番の位置のアミノ酸を表す）。従
って、Ｘａａ６は、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）の構造
を持つＡＭＰＰＰの第６番の位置の可変物を示す。第ｎ
番の位置は、ペプチドのＮ末端（これらペプチドについ
ては通常グリシン（Ｇｌｙ）である）に対する。上記の
ペプチドが（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）の構造を持つペ
プチドのＮ末端アミノ酸（通常Ｇｌｙ）にペプチド結合
により付着された単一残基Ｎ末端付加たとえばメチオニ
ン（Ｍｅｔ）又はＮ−ホルミル化Ｍｅｔ「（ｆ）Ｍｅ
ｔ」，Ｃｙｓ，Ｈｉｓ又はＳｅｒを含むときに、可変物
Ｘａａ６はその表記及びＮ末端に対する位置を保持す
る。これは、絶対的な意味において今や第６番の位置は
得られたペプチドにおける第７番残基である事実に拘ら
ずである。同様に、もしＮ末端Ｇｌｙが欠如して、たと
えば可変物Ｘａａ６が得られたペプチドで第５番残基で
あるなら、しかしこの可変物はＸａａ６という表記のま
まである（すなわちＩｌｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
ＸａａについてＸａａはなおもＸａａ６である）。その
ような言葉で表わすと、マガイニン１はあるいは、（Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）（ここでＸａａ５はＰｈｅ，Ｘ
ａａ６はＬｅｕ，Ｘａａ７はＨｉｓ，Ｘａａ８はＳｅ
ｒ，Ｘａａ１０はＧｌｙ，Ｘａａ１１はＬｙｓ，Ｘａａ
１２はＰｈｅ，Ｘａａ１３及びＸａａ１８はＧｌｙ，Ｘ
ａａ１９はＧｌｕ，Ｘａａ２１はＭｅｔ，Ｘａａ２２は
Ｌｙｓ，そしてＸａａ２３はＳｅｒである）の構造を持
つペプチドとして表わすことができる。マガイニン２
は、Ｘａａ１０がＬｙｓであり、Ｘａａ２２がＡｓｎで
ある点を除き、マガイニン１と構造的に類似である。図
１において、本発明に従う好ましいペプチドのいくつか
が一文字表現で示されている。この表現で用いられる
「Ｘ」は可変物であり、上記のＸａａと同じである。す
なわち、図１の第３行（ＧＩＧＫＸ……）における第５
番の文字はＸａａ５に等しく、Ｘａａ５と同じくアミノ
酸で置き代えられうる。第８行のＣ末端の「ＮＨ２」
は、そこで示されるペプチドのＣ末端アミド形を示す。
そのような修飾の利点の一つは、病原体に対して改善さ
れた活性を示す抗菌性ペプチド及び特にＡＭＰＰＰの製
造でありうる。本発明に従う好ましいペプチド組成物を
選択するため及び、実際に特定の変性を選択するの別の
基準は、一以上のプロテアーゼ及び特に一以上の植物プ
ロテアーゼ又は植物病原体プロテアーゼによる消化即ち
減成に対する抵抗である。植物は、細胞内、細胞内小器
官内、小室内、又は細胞間の細胞外空間内に、蛋白質を
減成するのに用いられる酵素を含む。これら酵素（プロ
テアーゼとしても知られている）は、アミノ酸配列を結
合している特定の結合を切り、不活性な又は低活性なフ
ラグメントを作ることにより、蛋白質又はペプチドを減
成する。植物病原体もまた、多くの場合、抗菌性蛋白質
又はペプチドを減成しそしてたぶん不活性にすることが
できるプロテアーゼを作り分泌する。本発明の文脈にお
いて、この自然現象は、さもなければ植物病原体を阻止
することによって植物を保護するであろうＡＭＰＰＰを
失活させうるので、不都合である。この問題は、細胞外
空間に含まれるプロテアーゼに曝される典型的に適用さ
れるＡＭＰＰＰ及び細胞内には細胞外プロテアーゼに曝
される表現されたＡＭＰＰＰの両者に生じる。天然のマ
ガイニンにおけるＸａａ１０−Ｘａａ１１位置の翻訳後
開裂は、アフリカツメガエルの皮膚の浸出物に特有のプ
ロテアーゼにより自然に引き起こされ、これはこの部位
が消化のためにプロテアーゼにとって利用しうることを
示している。Ｍ．Ｇ．ギオバニニら（前出）参照。一以
上の植物プロテアーゼに感受性であると特性づけられう
るペプチド結合に隣接する部位における少くともいくつ
かのアミノ酸置換及び／又は欠如は、蛋白質分解を低減
する又は除去するにちがいない。これは、プロテアーゼ
酵素とＡＭＰＰＰ基質開裂部位の間の乏しい適合性の誘
発による個々の植物プロテアーゼの作用の抑制に少くと
も部分的に起因するであろう。植物プロテアーゼを含む
植物細胞外液によるＡＭＰＰＰの処理による植物蛋白分
解的減成は、マガイニン１及びマガイニン２の夫々位置
７及び８のＨｉｓとＳｅｒの間、及び夫々マガイニン２
及び１の位置２１及び２２のＭｅｔとＡｓｎ又はＭｅｔ
とＬｙｓの間の結合の開裂により起ることが、予期され
ず見い出された。これら現象の認識において、植物プロ
テアーゼによる不都合な蛋白分解的減成を大きく低減す
るのに有効な特定の置換が、これら位置の一以上で見い
出された。従って、そのように修飾されたペプチドは、
突然変異植物における表現のための可能性ある候補であ
り、また作物保護のための慣用の適用のために有用であ
りうる。植物及び／又は植物病原体プロテアーゼによる
不都合な蛋白分解的減成を低減する（除去しないとして
も）のに有効でありうる上記位置での置換は、下記を包
含する。Ｘａａ７におけるＰｈｅ，Ａｌａ，Ｇｌｕ，Ａ
ｓｐ，Ｌｙｓ，Ｓｅｒ，又はＡｒｇ，Ｘａａ１１におけ
るＴｈｒ，Ａｓｐ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，又はＧｌｕ，Ｘａ
ａ２１におけるＡｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ｇｌｎ，Ｔｒ
ｐ，Ｔｙｒ，Ｔｈｒ，Ｖａｌ，Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌ
ｅ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，又はＰｈｅ，Ｘａａ２２における
Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｔｈｒ，Ａ
ｌａ，Ｃｙｓ，Ｌｙｓ，Ｇｌｙ，Ａｓｐ，Ａｓｎ，Ｐｒ
ｏ又はＭｅｔ，Ｘａａ２３におけるＰｒｏ，Ｌｅｕ，Ｃ
ｙｓ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，又はＴｒｐ。本発明のこの面に
おけるより好ましい置換は、Ｘａａ７におけるＡｒｇ又
はＬｙｓ置換、Ｘａａ８におけるＧｌｎ置換及び／又は
Ｘａａ２３におけるＰｒｏである。ＡＭＰＰＰにおける
位置７、８、２１又は２２及び／又は２３における好ま
しいアミノ酸置換のいずれか又は全部は、本発明に従う
他の置換、欠如及び／又は延長と組み合せられることが
でき、蛋白分解に抵抗性であるのみでなく、一以上の植
物病原体に対する増大された活性、特定の植物病原体に
対する選択された活性及び／又は低い植物毒性を持つペ
プチドを提供する。本明細書で、単一残基末端付加誘導
体とはたとえば、Ｃ又はＮ末端に一つの追加的残基がペ
プチド結合により加えられたところの、（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１）の構造を持つマガイニン１のようなペプチ
ドを云う。そのような単一残基末端付加誘導体の例は、
マガイニン１分子のＮ末端にアミノ酸Ｍｅｔがペプチド
結合されている〔Ｍｅｔ〕ＭＡＧ１、マガイニン１のＮ
末端にホルミル化Ｍｅｔがペプチド結合されている
〔（ｆ）Ｍｅｔ〕ＭＡＧ１、及びマガイニン１のＣ末端
ＳｅｒにＣｙｓがペプチド結合されている〔Ｃｙｓ ２
４〕ＭＡＧ１である。この言葉はまた、他の末端付加、
たとえばＮ又はＣ末端に付着されたＨｉｓ又はＳｅｒの
使用をも包含する。上記のように、本発明で用いられる
べき好ましい組成物を選択するための更に別の基準は、
比較的低い細胞毒性及び植物においては植物毒性であ
る。本発明の抗菌性ペプチドは、そのホスト細胞に対
し、又は該ペプチドが適用される組織に対し比較的低い
毒性を持たねばならない。ＡＭＰＰＰは好ましくは、植
物細胞又は植物組織に対して相対的に最小の毒性挙動を
示す。特に、抗菌性を増すよう又は蛋白分解的減成への
抵抗を増すデザインされた修飾は、植物毒性を実質的に
増大してはならない。毒性挙動は、死、生長低下、空気
中炭素の光固定の低下、栄養たとえば窒素又はリンの同
化の低下、又は作物収量の低下により現わされる。従っ
て、ホストと機能的に相容性であるペプチドを提供する
ことが重要である。従って、一つのＡＭＰＰＰを、他の
ＡＭＰＰＰと、又は天然のマガイニン又は他の天然の抗
生ペプチド又は工業的価値が実際にある又は見込める他
の天然又は合成の抗生化合物と比較するにおいて、植物
毒性のいくつかの相対的指標が好まれる。そのような一
つの指標は、正常な植物細胞小器官機能の抑制における
ＡＭＰＰＰの可能性ある効果である。好ましい指標は、
分離された植物葉緑体による酸素発生又は炭素固定又は
分離された植物ミトコンドリアによる酵素吸吸、又は生
きた細胞又は組織による酵素消費の抑制である。これら
効果は、当業界で利用できる種々の手法及び装置、たと
えばワーブルグ（Ｗａｒｂｕｒｇ）装置又は好ましくは
酸素電極によりモニターできる。「Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ａｎ
ｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎ
Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｐｈ
ｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｄ．Ｗａｌｋｅｒ，１９８
７，Ｈａｎｓａｔｅｃｈ Ｌｔｄ．，Ｋｉｎｇｓ Ｌｙ
ｎｎ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，Ｉｎｇｌａｎｄ 参照。反転ペプチド ＲＡＭＰＰという言葉は、少なくとも一つの病原体に対
して活性な抗菌性反転ペプチド（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ａｎ
ｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｃｔｉｖ
ｅ ａｇａｉｎｓｔ ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ Ｐａ
ｔｈｏｇｅｎ）の略である。ＲＡＭＰＰＰは、ＲＡＭＰ
Ｐのサブセットであり、少なくとも一つの植物病原体に
対して活性な抗菌性反転ペプチド（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ａ
ｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｈｉ
ｃｈ ａｒｅ ａｃｔｉｖｅ ａｇａｉｎｓｔ ａｔ
ｌｅａｓｔ ｏｎｅ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎ）
の略である。上述のように或る抗菌性ペプチドの配列を
反転することにより、著しい利点を持つＲＡＭＰＰＰを
作ることができる。詳しくは、ＲＡＭＰＰ及び特にＲＡ
ＭＰＰＰは、病原体及び特に少なくとも一つの植物病原
体に対する抗菌活性を持つようである。更に、特定のペ
プチドの配列を反転することにより、対応する正常な
「前進」配列の欠点のいくつかを持たない抗菌性ペプチ
ドをうることができる。ＲＡＭＰＰＰの文脈において、
たとえば、対応する「前進」配列ＡＭＰＰＰに比べて、
一つの植物プロテアーゼによる蛋白分解的減成を著しく
受けない及び／又は植物毒性でないペプチドが得られ
る。従って、これらペプチドは、植物病原性真菌及び／
又はバクテリアから植物を保護するのに用いる見込みあ
る候補である。本発明に従い、同じであるが反転された
ペプチド配列を持つＲＡＭＰＰを作ることができ、例え
ば反転マガイニン１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９）、反転
マガイニン２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０）、反転Ｐ１
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３）、反転セクロピンＡ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）、ならびに反転ＰＧＬｃ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７）及び他のセクロピン、サルコト
キシン、ボンビニン、ＸＰＦ，チオキン、デフェンシ
ン、メリティン、及び同様の抗菌性ペプチドの反転形で
ある。本発明のＲＡＭＰＰは、置換されていない天然に
生じる抗菌性ペプチドを反転することに限定されない。
適当な場合、或る置換、修飾及び／又は欠如がなされて
よい。たとえば、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１）を持つ
反転ペプチドは、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）の構造を
持つペプチドと同じであるが、正に反転した配列であ
る；つまり、それらは、マガイニン１及び２に構造的に
関連する化合物の反転ペプチドである。これらペプチド
は位置Ｘａａ１−Ｘａａ３，Ｘａａ５，Ｘａａ６，Ｘａ
ａ１１−Ｘａａ１４及びＸａａ１６−Ｘａａ１９におい
て可変物を含み、ここでＸａａ１，Ｘａａ２，Ｘａ
ａ３，Ｘａａ５，Ｘａａ６，Ｘａａ１１，Ｘａａ１２，
Ｘａａ１３，Ｘａ１４，Ｘａａ１６，Ｘａａ１７，Ｘａ
ａ１８及びＸａａ１９は同じでも異ってもよく、Ａｌ
ａ，Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌ
ｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅ
ｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ
及びＶａｌより成る群から選ばれる。好ましくは、（Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１）のペプチドは天然のマガイニ
ン１及び２に構造的に関連するＲＡＭＰＰであり、ここ
でＸａａ１及びＸａａ３は同じでも異ってもよく、Ａｒ
ｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌ
ｎ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ａｌ
ａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＰｒｏより成
る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ２はＡｒｇ、
Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｔ
ｙｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、及びＴｈｒ、
より成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ５はＡ
ｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ及びＴｒｐから
成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ６はＴｒ
ｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌ
ｎ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、及びＧｌｙより成る群か
ら選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１１はＬｅｕ、Ｉｌ
ｅ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ及びＧｌｙより成
る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１２はＰｈ
ｅ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ及びＶａｌより成る群から
選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１３はＭｅｔ、Ｔｒ
ｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ
及びＡｒｇより選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１４は
Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｍ
ｅｔ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｌｙ
ｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、及びＡｒｇより
成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１６はＡｌ
ａ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌ
ｎ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ及びＡｒ
ｇより成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１７
はＰｈｅ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、
ＴｙｒＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｓ
ｐ及びＡｒｇより成る群から選ばれたアミノ酸であり、
Ｘａａ１８はＡｓｎ、Ｉｌｅ及びＬｅｕより成る群から
選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１９はＰｈｅ、Ｉｌ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ及びＶａｌよる成る群から選ばれた
アミノ酸である。本発明に従う他の置換されたＲＡＭＰ
Ｐとして、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２）（ここでＸａ
ａ１はＳｅｒ、及びＰｒｏより成る群から選ばれたアミ
ノ酸であり、Ｘａａ２はＬｙｓ及びＡｓｎよる成る群か
ら選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ６はＧｌｙ及びＡｌ
ａより成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１１
はＧｌｙ及びＡｌａより成る群から選ばれたアミノ酸で
あり、Ｘａａ１４はＧｌｙ及びＬｙｓより成る群から選
ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１６はＳｅｒ、Ａｌａ、
Ｇｌｕ及びＴｈｒより成る群から選ばれたアミノ酸であ
り、そしてＸａａ１７はＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＰ
ｈｅより成る群から選ばれたアミノ酸である）の構造を
持つＲＡＭＰＰが挙げられる。本発明の植物病原体に対
して活性な抗菌性反転ペプチド（ＲＡＭＰＰＰ）を包含
するＲＡＭＰＰは、一般にペプチドの化学的及び／又は
遺伝子的合成に関して本明細書で述べられる手順に従っ
て作ることができる。これらペプチドはまた、本発明に
従いオリゴペプチド内に入れられることができる。ま
た、本発明のオリゴペプチドの構造を全体に反転するこ
とが可能であり、かつ実際に有利でありうる。そうする
ことによって、反転ペプチドにより実現されると同様の
利益を実現できる。また、これら反転ペプチドは、植物
の根系に局所適用、注入、導入により、これら化合物を
表現するであろう遺伝子を生成に入れそしてその表現を
開始することにより、及び／又は同様のデリバリー法に
より、病原体に対して生物及び特に植物を保護するため
に、本明細書記載のように用いうる。ペプチドモノマー 上記のペプチドモノマーならびに本明細書記載の他のも
のが、本発明に従うオリゴペプチドの構築に用いられう
る。これらオリゴペプチドは、ペプチドポリマーはコポ
リマーを構築するのに用いられるペプチドモノマーとし
て概念化されうる複数のペプチドサブユニットから形成
される。従って本明細書において、ペプチドモノマー及
びモノマーという言葉は、本発明のオリゴペプチドを構
築するのに特に有用なペプチドを云う。オリゴペプチド
の構築に有用な本発明のモノマーの一群は、上記のＲＡ
ＭＰＰ及びＲＡＭＰＰＰ、たとえば反転マガイニン１
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９）、反転マガイニン２（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．１０）、構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１２）を持つ反転マガイニン化合物、反転セクロピンＡ
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４）、反転ＰＧＬｃ（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１５）及び反転Ｐ１（ＳＥＱ ＩＤＮ
ｏ．１３）である。本発明に従い有用な他のペプチドモ
ノマーは、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）の構造を持つマ
ガイニン１、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）の構造を持つ
マガイニン２、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）の構造を持
つＰ１、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７）の構造を持つＰＧ
Ｌｃ、構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８）のセクロピンＡ
のようなセクロピン、サルコトキシン、ホンビニン、Ｘ
ＰＦ、チオニン、デフェンシン、メリティン及び同様の
抗菌性ペプチドである。モノマー又はペプチドモノマー
という言葉はまた、自体は抗菌性でないが、得られたオ
リゴペプチドの抗菌活性を高める、又はそれに他の利点
を与えるペプチドを包含するものとして用いられる。た
とえば、これらペプチドは、特に好ましいコンホメーシ
ョン、アラインメント、特定の酵素に対する抵抗又は他
の類似の利点を与えうる。また、単一残基欠如誘導体、
複数残基欠如誘導体、単一残基置換誘導体、複数残基置
換誘導体、単一残基末端付加誘導体、及び適当な場合に
は直上で述べたペプチドのＣ末端アミドがまた、得られ
るペプチドアミドが得られるオリゴペプチドのＣ末端で
用いられる限り、モノマーとして用いられうる。本発明
でペプチドモノマーとして有用な特に好ましい単一残基
末端付加誘導体は、本発明のペプチドのＣ又はＮ末端に
ペプチド結合されたＣｙｓの付加を含むもの、又は上記
ペプチドのいずれかのＮ末端にペプチド結合されていて
よいＭｅｔ又は（ｆ）Ｍｅｔの付加を含むペプチドモノ
マーである。本発明のこの面に従う他の置換は、これら
ペプチドのＮ又はＣ末端に付着されたＳｅｒ又はＨｉｓ
を含む。構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）（ここでＸａ
ａ５，Ｘａａ６，Ｘａａ７，Ｘａａ８，Ｘａａ１０，Ｘ
ａａ１１，Ｘａａ１２，Ｘａａ１３，Ｘａａ１８，Ｘａ
ａ１９，Ｘａａ２１，Ｘａａ２２及びＸａａ２３は、互
に同じでも異ってもよく、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ａ
ｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌ
ｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅ
ｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ及びＶａｌから成る群から
選ばれるアミノ酸である）を持つペプチドの複数置換誘
導体であるペプチドモノマーが、本発明で特に興味あ
る。好ましくは、これは可変物は、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａ
ｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌ
ｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈ
ｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ及びＶａｌより成る群のアミノ酸か
ら選ばれる。より好ましくは、本発明のペプチドモノマ
ーは、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）（ここでＸａａ５は
Ｐｈｅ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｔｒｐ及びＶａｌから成る群
から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ６はＡｓｎ，Ｉｌ
ｅ及びＬｅｕから成る群から選ばれたアミノ酸であり、
Ｘａａ７は、Ｐｈｅ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ｓｅｒ，Ｔｈ
ｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌ
ｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ及びＡｒｇから成る群から選ばれた
アミノ酸であり、Ｘａａ８はＡｌａ，Ｍｅｔ，Ｔｈｒ，
Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇ
ｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ及びＡｒｇより成る群から選ばれ
たアミノ酸であり、Ｘａａ１０はＧｌｙ，Ｌｅｕ，Ｉｌ
ｅ，Ｖａｌ，Ａｌａ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ，Ｔｈｒ，Ｓｅ
ｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌ
ｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ及びＡｒｇより成る群から選ばれた
アミノ酸であり、Ｘａａ１１はＭｅｔ，Ｔｒｐ，Ｔｙ
ｒ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ及びＡｒ
ｇから成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１２
はＰｈｅ，Ｉｌｅ，Ｔｒｐ，Ｌｅｕ及びＶａｌから成る
群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１３はＬｅｕ，
Ｉｌｅ，Ｔｒｐ，Ｐｈｅ，Ｖａｌ，Ａｌａ及びＧｌｙか
ら成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１８はＴ
ｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ａｒ
ｇ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ｍｅｔ，Ａｌａ及びＧｌｙから成
る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１９はＡｌ
ａ，Ｇｌｙ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ｍｅｔ，及びＴｒｐから
成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ２１及びＸ
ａａ２３は同じでも異ってもよく、Ａｒｇ，Ａｓｐ，Ｃ
ｙｓ，Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，Ｔｙｒ，Ｔｈ
ｒ，Ｔｒｐ，Ｍｅｔ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｐｈｅ，Ｖａ
ｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ及びＰｒｏより成る群から選ばれた
アミノ酸であり、Ｘａａ２２はＣｙｓ，Ａｒｇ，Ａｓ
ｐ，Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，Ｔｙｒ，Ｍｅ
ｔ，Ａｓｎ，Ａｌａ，Ｐｒｏ，及びＴｈｒより成る群か
ら選ばれたアミノ酸である）の構造を持つペプチドを包
含する。本発明に従い有用でありうる他のペプチドモノ
マーは、自体が少くとも一つの植物病原体による減成に
対し抵抗性であるものである。そのようなモノマーの一
つはＰ１である。本発明者は、Ｐ１がＡＭＰＰＰである
ことを見い出した。すなわち、Ｐ１が少くとも一つの植
物病原体に対し活性である化合物であることを本発明者
は発見した。詳しくは、Ｐ１がエルウィニアカロトボラ
カロトボラのような植物病原性バクテリアに対して高度
に活性であることを本発明者は見い出した。本発明者は
また、Ｐ１が天然に生じる植物プロテアーゼによる消化
に対して著しい抵抗を有し、かつ許容できるレベルの植
物毒性を有することをも見い出した。Ｐ１はセクロピン
として報告されているが、その起源（昆虫でなブタの
腸）及びその異る構造の故に別の分類が適当である。簡
略化のために、本発明者は、この化合物を単にＰ１と表
記することにした。リー（Ｌｅｅ）ら、「Ａｎｔｉｂａ
ｃｔｅｒｉａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｉｇ
Ｉｎｔｅｎｓｔｉｎｅｓ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ
ａ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｃｒｏｐｉｎ」Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６，
（１９８９）９１５９−９１６２参照。植物プロテアー
ゼに抵抗する他のペプチドモノマーは、本発明に従うＲ
ＡＭＰＰ及びＲＡＭＰＰＰならびに構造（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．３）（ここでＸａａ７，Ｘａａ８，Ｘａ
ａ２１，Ｘａａ２２及びＸａａ２３から選ばれる基の少
くとも一つは置換されている）のペプチドを包含する。
好ましくは、Ｘａａ１１はＰｈｅ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，Ｌ
ｙｓ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｓｅｒ，及びＡｒｇより成る群
から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ８がＴｈｒ，Ａｓ
ｐ，Ｈｉｓ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，及びＧｌｕより成る群か
ら選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ２１がＡｒｇ，Ｌｙ
ｓ，Ｈｉｓ，Ｇｌｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｔｈｒ，Ａｌ
ａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｐｈｅ，Ｇｌｕ，Ａｓ
ｐ，及びＭｅｔより成る群から選ばれたアミノ酸であ
り、Ｘａａ２２がＡｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｈｉｓ，Ｇ
ｌｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，Ｃｙ
ｓ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，及びＭｅｔより
成る群から選ばれたアミノ酸であり、そしてＸａａ２３
がＳｅｒ，Ｐｒｏ，Ｌｅｕ，Ｃｙｓ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，
及びＴｒｐより成る群から選ばれたアミノ酸である。本
発明のペプチドモノマーとして有用な特に好ましい単一
又は二個残基欠如誘導体は、構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．３）（ここでＸａａ５，Ｘａａ６，Ｘａａ７，Ｘａ
ａ８，Ｘａａ１０，Ｘａａ１１，Ｘａａ１２，Ｘａａ
１３，Ｘａａ１８，Ｘａａ１９，Ｘａａ２１，Ｘａａ
２２，及びＸａａ２３は同じでも異ってもよく、Ａｌ
ａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｃｒｌ
ｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅ
ｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙ
ｒ，及びＶａｌより成る群から選ばれる）を持つペプチ
ドモノマーの単一及び二個残基欠如誘導体である。本発
明の別の面に従い、モノマー及びペプチドモノマーは、
Ｎ又はＣ末端以外で単一のＣｙｓにより置換されてい
る、少くとも一つの病原体及び特に少くとも一つの植物
病原体に対し活性な抗菌性ペプチドを包含する。これ
は、これらペプチドが他の位置で他のアミノ酸により置
換されていない又は欠除を含まないと云うのではなく
て、得られる抗菌性ペプチドは一つの非末端Ｃｙｓを含
むと単に云っているのである。そのようなペプチドの例
は、構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）（ここで位置７に
通常見られるＨｉｓはＣｙｓで置換されている）又は構
造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）（ここで位置７のＨｉｓ
はＡｒｇで置換され、位置８に通常見られるＳｅｒはＣ
ｙｓで置換されている）のペプチドである。本発明のこ
の面におけるモノマーは、マガイニン関連化合物に限定
されず、Ｐ１、セグロピンＡ、ＰＧＬｃなど及び／又は
上述のＲＡＭＰＰＰのような抗菌性ペプチドにＣｙｓ置
換を含むことができる。すなわち、たとえば、本発明の
モノマーは、構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０）（ここ
でその第３番の位置に通常見られるＭｅｔはＣｙｓで置
換されている）を持つペプチドを包含する。このペプチ
ドはまた、付加がＣｙｓでない限りでＮ又はＣ末端付加
を含むことができる。合成後修飾 上述したペプチド及びペプチドモノマーの種々の合成後
修飾があり、これは一以上の病原体及び特に植物病原体
に対するその有効性を改善できる。そのような合成後の
修飾の一つは、本発明のＡＭＰＰ、ＡＭＰＰＰ、ＲＡＭ
ＰＰ、ＲＡＭＰＰＰ及びオリゴペプチドを含む種々のペ
プチドのカルボキシル末端のアミド化である。たとえば
クエルボ等「Ｔｈｅ Ｍａｇａｉｎｉｎｓ：Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅＦａｃｔｏｒｓ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｏ Ｉｎ
ｃｒｅａｓｅｄ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｃｔ
ｉｖｉｔｙ ａｎｄ Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ Ｈｅｍｏｌ
ｙｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅ
ｓ．１，（１９８８），８１−８６参照。これらペプチ
ドのアミド化は、一般にその抗菌活性を改善する。本発
明のペプチド、ペプチドモノマー及びオリゴペプチドの
他の合成後修飾は、抗菌活性、蛋白分解的減成、及び／
又は植物毒性への抵抗に関して有利であると判る。この
ような修飾は、ＤＮＡ配列から生物学的表現により作ら
れたペプチド及び／又はペプチドモノマーの翻訳後修飾
を含む。そのような翻訳後修飾は、アセチル化、ホスホ
リル化、グリコシル化、ファルネシル化、アミド化、チ
ロシンスルホン化、化学的又は酵素的手段による酸化た
とえばメチオニン残基の酸化、プロリン又はチロシンヒ
ドロキシル化及び／又はプロリン異性化を含み、しかし
これらに限定されない。オリゴペプチド 本発明のオリゴペプチドは、二以上のペプチドサブユニ
ット又はペプチドモノマー、及び任意的に一以上のブリ
ッジ及び／又はジスルフィド連結を含む蛋白質である。
より詳しくは、本発明のオリゴペプチドは、ペプチド結
合により直接に又はブリッジ化分子及び／又はジスルフ
ィド連結の使用によって接続された少くとも二つのペプ
チドサブユニット又はペプチドモノマーを含む。本発明
のオリゴペプチドの正確な性質及び作用の様式は完全に
は判っていない。しかし、これにより限定されるもので
はないが、これら化合物はペプチドモノマーの活性な集
合体の形成を促進しうる。それらはまた、蛋白分解的減
成に低感受性である又は低植物毒性である、又はこの両
者である構造を作りうる。理論又はメカニズム、又はそ
れらの作動の後にある理論にかかわらず、本発明者は、
本発明のオリゴペプチドが病原的微生物に対し及び特に
微生物的植物病原体に対して、対応するモノマーと同等
に又はそれ以上に活性であることを見い出した。本発明
に従う構造的に最も単純なオリゴペプチドは、いわゆる
頭尾二量体オリゴペプチドである。これら二量体は、第
一のペプチドモノマーのＣ末端残基が第二のペプチドモ
ノマーのＮ末端位置のアミノ酸にペプチド結合で結合さ
れるように、Ｎ及びＣ末端を持つ第一のペプチドモノマ
ーとやはりＮ及びＣ末端を持つ第二のペプチドモノマー
との直接ペプチド結合を含む。これら頭尾二量体は、少
くとも一つの病原体及びより好ましくは少くとも一つの
植物病原体に対して活性である。この点で、頭尾二量体
は、本明細書記載の他のオリゴペプチドと同じである。
また、本発明に従い頭尾二量体を構造する二つのペプチ
ドサブユニットの夫々は、自体単独で抗菌性である。す
なわち、頭尾二量体オリゴペプチドで用いるべく選択さ
れるペプチドモノマーは、抗菌性を欠くペプチドモノマ
ーを含まない。本発明の好ましい頭尾二量体は、二つの
サブユニット及び従って少くとも一つの第一の及び少く
とも一つの第二のペプチドモノマーが（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１）、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）又は（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．３）、（ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．６）のどち
らかの構造を持つところのものである。本発明の特に有
利な頭尾二量体は、構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．）及び
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）を持つペプチドの群から作
ることができる。上述のように、本発明者は、Ｐ１が植
物病原性バクテリアに対するその活性の故のみでなく、
蛋白分解的減成に対するその天然の抵抗性の故に、ＡＭ
ＰＰＰとして有用であることを見い出した。Ｐ１はま
た、モノマーとして植物毒性が天然に低い。しかしＰ１
は、その抗菌性インパクトの点で幾分限定されている。
従って、少くとも一つの植物病原体に対して活性であり
かつ蛋白分解的減成に対し比較的抵抗性であるように好
ましくは修飾された、修飾されたマガイニンとの二量体
形でのその組合せは、生物及び特に植物及び植物組織の
防禦のための有能なオリゴペプチドを提供する。得られ
るオリゴペプチドはまた、許容できる植物毒性を示す。
本発明の他の特に好ましい頭尾二量体は下記を包含す
る。（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．２）；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）−（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．１）；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）−（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．２）＊＊＊；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）＊＊＊＊；Ｍｅｔ−
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１）＊＊＊；Ｍｅｔ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）−
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）＊＊＊＊；Ｍｅｔ−（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．６）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）
＊＊＊；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）−（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．７）＊＊＊；Ｍｅｔ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９）；（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．６）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）＊＊＊＊；
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．３）＊＊＊＊；Ｍｅｔ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
７）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）＊＊＊＊；（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．３）＊＊＊＊−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１）；及びＭｅｔ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）
＊＊＊＊−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）。ここで＊＊＊
は、特定されるペプチドモノマーが順序を反転されうる
ことを示し、＊＊＊＊は、特定されるペプチドモノマー
が順序を反転されることができ、かつＸａａ５はＰｈ
ｅ、Ｘａａ６はＬｅｕであり、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｌｙ
ｓ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ及びＡｒｇより成る群から選ばれ、
Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ及びＧｌｕ
からなる群から選ばれ、Ｘａａ１０はＧｌｙ及びＬｙｓ
からなる群から選ばれ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ
１２はＰｈｒであり、Ｘａａ１３はＧｌｙ及びＡｌａよ
り成る群から選ばれ、Ｘａａ１８はＧｌｙ及びＡｌａよ
り成る群から選ばれ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１
はＭｅｔであり、Ｘａａ２２はＡｓｎ及びＬｙｓより成
る群から選ばれ、Ｘａａ２３はＳｅｒ及びＰｒｏより成
る群から選ばれる構造を持つことを示す。［Ｄｅｓ（Ｇ
ｌｙ １，Ｉｌｅ ２）］Ｍａｇ ２，［Ｄｅｓ（Ｇｌ
ｙ １，Ｉｌｅ ２）］，Ａｒｇ ７，Ｇｌｕ ８，Ｐ
ｒｏ ２３］Ｍａｇ１，［Ｄｅｓ（Ｌｙｓ ２２，Ｓｅ
ｒ ２３）］Ｍａｇ １及びこれらの誘導体を包含す
る、上記モノマーの単一及び複数残基欠如誘導体もまた
考えられる。本発明の頭尾三量体及び他の延長された頭
尾多量は、少くとも一つの第一のペプチドモノマー及び
少くとも一つの第二のペプチドモノマーを含まねばなら
ず、その夫々は少くとも一つの病原体及び好ましくは少
くとも一つの植物病原体に対し活性である。好ましくは
１〜約１４の員である残りのペプチドサブユニットもま
た、抗菌性ペプチド及び／又はＡＭＰＰＰでありうる。
最も好ましい頭尾オリゴペプチドは、抗菌性ペプチドモ
ノマーのみを含む。しかし、残りのペプチドサブユニッ
トが抗菌性を持つ必要はない。特に好ましい頭尾オリゴ
ペプチド多量体の例は下記のものである。（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）−（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．１）；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１）４；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）６；（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）−（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．２）；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）−
（ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１）＊＊＊；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）−〔（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．２）〕４−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）
＊＊＊＊；ａｎｄ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７）−（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９）
＊＊＊；ここで“＊＊＊”及び“＊＊＊＊”は上記と同
じ意味を持つ。直上で述べたオリゴペプチドと構造的に
類似のオリゴペプチドの別のタイプは、いわゆるブリッ
ジされたオリゴペプチドである。これらブリッジされた
オリゴペプチドは、オリゴペプチドを構成するペプチド
モノマーサブユニットの少くとも二つが介在するブリッ
ジにより隔てられていることを除き、直上で述べた頭尾
オリゴペプチドと同じでありうる。すなわち、その最も
単純な形において、本発明のブリッジされたオリゴペプ
チドは、少くとも一つの第一の及び少くとも一つの第二
のペプチドモノマー、及びブリッジより成る。該少くと
も一つの第一のペプチドモノマーのＣ末端は、ブリッジ
のＮ末端に直接にペプチド結合され、ブリッジのＣ末端
は上記少くとも一つの第二のペプチドモノマーのＮ末端
に直接にペプチド結合されている。得られる構造は、
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）−ブリッジ−（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．２）の構造を持つ二量体のブリッジされたオ
リゴペプチドと表わされることができ、これは二つのマ
ガイニン２サブユニットのブリッジされた二量体であ
り、ここで「−」は本発明に従うブリッジ化ペプチドで
ある。本発明のこの面に従う構造的に最も簡単なブリッ
ジされた多量体は、一つのブリッジを持つ三量体であ
る。たとえば、もし構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）を
持つペプチドモノマーがそのＣ末端を介して、上述のブ
リッジされた二量体において第２のマガイニン２のＣ末
端に直接付着されると、得られるオリゴペプチドは構造
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）−ブリッジ−（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）を持つであ
ろう。しかし、ブリッジされた三量体が単一のブリッジ
化分子に限定される必要はない。たとえば、直上で述べ
た構造は、追加的ブリッジの使用によって変更されるこ
とができ、得られる三量体のブリッジされたオリゴペプ
チドは（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）−ブリッジ１−（Ｓ
ＥＱＩＤ Ｎｏ．２−ブリッジ２−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１）を持つであろう。ブリッジ１とブリッジ２は、
同じでも異ってもよい。本明細書においてブリッジとい
う言葉は、オリゴペプチド内の二つのペプチドサブユニ
ットを隔てるために用いられる、アミノ酸に基づく分子
を包含する。本発明におけるブリッジは、Ｎ及びＣ末端
を持ち、従って慣用のペプチド結合によってペプチドサ
ブユニットの各々に結合されるところの分子である。本
発明におけるブリッジは、種々の長さ及び組成であるこ
とができる。しかし、その長さ及び組成に係わらずに、
本発明のブリッジは、特定のオリゴペプチド中のモノマ
ー間の分子内相互作用を促進できるものでなければなら
ない。また、ブリッジは、ブリッジされたオリゴペプチ
ド内の望ましくない細胞事象たとえばホスホリル化又は
グリコシル化（このようなプロセスが不利であるなら）
に対する抵抗を与える又は最小化することができるよう
に、選択されねばならない。本発明の特に好ましい面に
おいて、ブリッジは、ブリッジされたオリゴペプチドが
細胞膜及び特に真核植物細胞の細胞膜を通って動ける能
力を妨害してはならない。即ち、本発明の好ましいブリ
ッジされたオリゴペプチドは、細胞外空間に輸送されう
る。本発明のオリゴペプチドは、いくつかの利点を持
つ。そのより重要なものの一つは、病原体に対する保護
を与えるこれら蛋白の能力である。上述のように、本発
明者は、この抗菌活性のメカニズムを完全に判っている
訳ではない。しかし、特定の作用理論に限定されるもの
ではないが、本発明者は、この活性は、病原体の細胞膜
にいおいて集合体及び膜破壊的チャンネルを形成するペ
プチドの能力に関係すると考えている。これら現象を促
進するオリゴペプチドの能力は、個々のオリゴペプチド
及び実際に多くの場合に相互作用する複数のオリゴペプ
チドのサブユニットの能力に少くとも部分的に依存する
ようである。これに従う頭尾オリゴペプチドは分子間相
互作用及び／又はオリゴペプチド間相互作用により有益
な集合体を促進する能力を示しうるが、一方、本発明の
ブリッジの使用により得られる結局は、少くとも植物病
原性微生物に対するオリゴペプチドのより大きな活性
（関連するＡＭＰＰＰモノマーサブユニットに比べ）さ
え示す。この現象の説明の一部は、種々のオリゴペプチ
ド成分の分子内ダイナミックスにあるかも知れない。た
とえば、頭尾二量体（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）−（Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）は、高めらた活性を持つことが
判った。これは、二つのペプチドモノマーを結びつけて
いるペプチド結合を取囲む領域の「フレキシビティ」に
よるかも知れない。この領域が有利な二次及び三次コン
ホメーションを許す故に、結合されたペプチドモノマー
は相互作用を許される。この相互作用は、モノマーの一
部が遷移的期間でさえ、相対的に極近接して置かれる能
力に部分的に依存する。極近接という言葉は、少くとも
第一の及び少くとも第二のペプチドモノマーの夫々のあ
る部分が互に約１０オングストローム未満、より好まし
くは互いに約７オングストローム未満内にもたらされる
ことを意味する。本発明者は、ブリッジの使用が活性の
更なる向上を与えることを見い出した。即ち、ブリッジ
の使用は、おそらく、オリゴペプチドのサブユニット内
の分子間相互作用を促進する。本発明に従うブリッジ
は、種々の方法でこれを達成しうる。ブリッジ（少さい
ものさえ）の使用は、個々のモノマー内に十分な空間を
与えて、不利な立体障害を除く、又は有利な分子間相互
作用を高めるであろうエネルギー的に安定な結合の形成
を与えうる。更に、或るブリッジの使用は、有利なコン
ホメーションの形成を許すに十分な程度のフレキシビテ
ィをオリゴペプチドに与えうる。即ち、フレキシビティ
を与えることにより、ペプチドモノマー間に有利な間隔
を与え、そしてモノマー間相互作用を許すことができ
る。他の可能性は、「フレキシブル」ではないけれど
も、有利なモノマー間相互作用を促進する位置にペプチ
ドモノマーを置く特定のコンホメーションを与えるブリ
ッジの使用である。本発明者は、５つ以下のアミノ酸の
比較的小さなブリッジが、本発明に従うオリゴペプチド
の構築に特に有用であることを見い出した。これらブリ
ッジは、モノマー間相互作用を更に促進する運動範囲を
許し、又はそのような相互作用を直接促進する又は与え
る二次構造を提供するのに十分なフレキシビリティを、
得られた構造に与える。本発明者はまた、得られたオリ
ゴペプチドの構造を抑制しそしてモノマー間の可能性あ
る相互作用を阻げるかも知れない望ましくないペプチド
二次構造、たとえばアルファヘリックス又はベータスト
ランドは一般に５より多いアミノ酸長さを必要とするこ
とを見い出した。Ｗ．カブシュ（Ｋａｂｓｃｈ）とＣ．
サンダー（Ｓａｎｄｅｒ），「Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ
ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕ
ｃｔｕｒｅ：ｐａｔｔｅｒｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ
ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄｅｄ ａｎｄ ｇｅ
ｏｍｅｔｒｉｃａｌ ｆｉｇｕｒｅｓ」Ｂｉｏｐｏｌｙ
ｍｅｒｓ ２２，（１９８３），２５７７−２６３７お
よびＲ．ムスサミイ（Ｍｕｔｈｕｓａｍｙ）とＰ．Ｋ．
ポヌスワミイ（Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ），「Ｖａｒｉａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｐｒｏｐｅｒｔ
ｉｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，ａｌｐｈａ−ｈｅｌｉｃｅｓ
ａｎｄ ｂｅｔａ−ｓｔｒａｎｄｓ」，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３８，（１９
９０），３７８−３９５を、天然蛋白におけるアルファ
ヘリックス及びベータストランドの分析に関し参照され
たい。本発明の好ましいブリッジの一つは、（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．５（ここでＸａａ１〜Ｘａａ５は独立に、
Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇ
ｌｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ及びＶ
ａｌより成る群から選択される）の構造を持つ。特に好
ましいブリッジは、Ｘａａ１がＧｌｙ、Ｘａａ２がＧｌ
ｙ、Ｘａａ３がＳｅｒ、Ｘａａ４がＳｅｒ、Ｘａａ５が
Ｇｌｙのもの、又はＸａａ１〜Ｘａａ５が総てアミノ酸
Ｇｌｙであるものである。５つのアミノ酸を含む他の好
ましいブリッジは、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）（ここ
でＸａａ１がＧｌｙ、Ｘａａ２がＡｒｇ、Ｘａａ３がＡ
ｒｇ、Ｘａａ４がＰｒｏ、Ｘａａ５がＧｌｙである）の
構造を持つ。Ｇｌｙに富むブリッジである後者は、溶液
中でフレキシブルであると予想される。なぜなら、Ｇｌ
ｙ側鎖部分は、オリゴペプチドの何らかの有りうるたた
み込みを立体的に阻げて、オリゴペプチドのペプチドサ
ブユニットの間のモノマー間相互作用を許しかつ事実促
進することはなさそうであるからである。その結果は、
標的病原性微生物に対するオリゴペプチドの活性の増大
である。また、Ｇｌｙ側鎖分子は、有益なモノマー間相
互作用を妨害しうる水素結合又は静電荷ブリッジのよう
なエネルギー的に安定な構造又は相互作用に参加できな
い。同様に、種々の二次構造予測アルゴリズム〔Ｗ．カ
ブシュ及びＣ．サンダー〔Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２
２（１９８４）２５７７−２６３７；Ｊ．Ｇａｒｎｉｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２０（１
９７８）９７−１２０；及びＰ．Ｙ．Ｃｈｏｕ ＆
Ｇ．Ｄ．Ｆａｓｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
３（１９７４）２１１−２２２参照〕により予測される
ように水性溶液中でフレキシブルであることができ、か
つＧｌｙに富むペプチドブリッジは、従って本発明にと
って許容できるであろう。ブリッジされたペプチド配列
の好ましい例は（これらに限定されないが）、１〜５の
アミノ酸を含む下記のものである。Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙなど。好まし
いブリッジペプチド又はより好ましいブリッジペプチド
のサイズ要求を満たしうるブリッジペプチドの多数の他
の組成がある。好ましい組成は、ベータターンを含むも
のであるが、これに限定されない（Ｂ．Ｌ．Ｓｉｂａｎ
ｄａ及びＪ．Ｍ．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３
１６，（１９８５），１７０−１７４；及びＪ．Ｓ．Ｒ
ｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＤ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏ
ｎ，前出、を参照）。同様に、単一アミノ酸ブリッジた
とえば二つの抗菌性ペプチドモノマーの間のブリッジと
しての単一のＧｌｙの使用は、本明細書に記載したタイ
プのモノマー間相互作用を促進するのに十分なフレキシ
ビティ及び／又は十分な二次構造を与えうる。ブリッジ
は、本発明に従い有効であるために５以下のアミノ酸に
限られる必要はない。しかし、より大きいブリッジは得
られるオリゴペプチドに望ましくない二次及び／又は三
次コンホメーションを与えるかも知れないので、本発明
のオリゴペプチドの種々のペプチドサブユニット間のモ
ノマー間相互作用を与える又は促進するであろうブリッ
ジのみを選択することが重要である。本発明で有用なよ
り長いブリッジの群は、ヘリックス結合ペプチドユニッ
トたとえばトランスメンブラン蛋白質の細胞外ドメイ
ン、ループ又は他のフレキシブル結合ペプチド鎖を含
む。本発明で有用なトランスメンブラン蛋白の細胞外ド
メインは、約６〜約１００のアミノ酸の種々の長さであ
る。細胞又は細胞膜内にあるドメインではなくて、これ
らドメインは、それらが細胞膜を通って輸送されること
ができ、従って、モノマー間相互作用を促進するだけで
なく、細胞外空間への排せつをも促進するので、有用で
ある。また、これら細胞外ドメインは、ある場合に、本
明細書で述べるシグナル又は標的蛋白として働きうる。
Ｋ．ベルナー（Ｖｅｒｎｅｒ）及びＧ．シャッツ（Ｓｃ
ｈａｔｚ），「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔ
ｉｏｎ Ａｃｒｏｓｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ２４１，（１９８８），１３０７−１３１３；
Ｌ．Ｇｉｅｒａｓｃｈ，「Ｓｉｇｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｈｙ ２８，（１９８
９），９２４−９３０；及びｖａｎ Ｈｅｉｊｉｎｅ、
前出、参照。天然に知られている多くのそのような細胞
外ドメイン、たとえば（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６）又
は（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７）の構造を持つペプチド
がある。本発明に従いオリゴペプチドを形成するにおい
てブリッジとして有用でありうる別の公知の細胞外ドメ
インは、下記に同定されている。Ｐ．Ｒ．Ｓｃｈｏｆｉ
ｅｌｄら、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉ
ｏｎａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＧＡ
ＢＡＡ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｈｏｗｓ ａ Ｌｉｇａ
ｎｄ−Ｇａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒ−Ｆ
ａｍｉｌｙ，”Ｎａｔｕｒｅ ３２８，（１９８７），
２２１−２２７；Ｊ．Ｅ．Ｏ’Ｔｏｕｓａら．，“Ｔｈ
ｅ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｎｉｎａＥ Ｇｅｎｅ Ｅ
ｎｃｏｄｅｓ ａｎ Ｏｐｓｉｎ，”Ｃｅｌｌ ４０，
（１９８５），８３９−８５０；Ａ．Ｖａｓｓａｒｏｔ
ｔｉら、“Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎ
ｓａｔ ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ Ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｏｆ
ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｃｔ ａｓ Ｓｕｒｒｏｇａ
ｔｅ Ｓｉｇｎａｌｓ ｆｏｒ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｏ
ｒｉａｌ Ｉｍｐｏｒｔ，”ＥＭＢＯＪ．６，（１９８
７），７０５−７１１；Ｊ．Ｐ．Ａｄｅｌｍａｎら、
“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｅ Ｇｅｎｅ ａｎ
ｄ Ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｔ
ｈｅ Ｃｏｍｍｏｎ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｏｆ Ｇｏ
ｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｈｏｒｍ
ｏｎｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｌａｃｔｉｏｎ Ｒｅｌｅａｓ
ｅｓ−Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｈ
ｕｍａｎ ａｎｄ Ｒａｔ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８３，（１９８
６），１７９−１８３；Ｃ．Ｓ．Ｚｕｋｅｒら、“Ｉｓ
ｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ
ａ Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ｄ．ｍ
ｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ，”Ｃｅｌｌ ４０，（１９８
５），８５１−８５８；Ｈ．Ｖｏｇａｌら、“Ｔｈｅ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｌａｃｔｏｓｅ
Ｐｅｒｍｅａｓｅ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｒｏｍ
ａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｐｒｅｄｉ
ｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ，”ＥＭＢＯＪ．４，（１
９８５），３６２５−３１；Ｔ．Ｊ．Ｊｅｎｔｓｃｈ
ら、“Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｃｔｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｔ
ｏｒｐｅｄｏ ｍａｒｍｏｒａｔａＣｈｌｏｒｉｄｅ
Ｃｈａｎｎｅｌ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ Ｅｘｐｒｅ
ｓｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｉｎ Ｘｅｎｏｐｕｓ
Ｏｏｃｙｔｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ ３４８，（１９９
０），５１０−５１３；Ａ．Ｋａｍｂら、“Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｓｈａｋｅｒ，ａ Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ Ｇｅｎｅ ｔ
ｈａｔ Ｅｎｃｏｄｅｓ ａ Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｃ
ｈａｎｎｅｌ，”Ｃｅｌｌ ５０，（１９８７），４０
５−４１３；Ａ．Ｂａｕｍａｎｎら、“Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆｔｈｅ Ｍａｔ
ｅｒｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈ
ｅ Ｓｈａｋｅｒ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ Ｄｒｏｓｏ
ｐｈｉｌａ；Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｎ Ｉａ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｗｉｔｈ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ Ｖｅｒｔｅｂｒａ
ｔｅ Ｎａ＋ Ｃｈａｎｎｅｌ，”ＥＭＢＯ Ｊ．６，
（１９８７），３４１９−２９；Ｔ．Ｔａｎａｂｅら、
“Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ
Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｈａ
ｎｎｅｌ Ｂｌｏｃｋｅｒｓ ｆｒｏｍＳｋｅｌａｔａ
ｌ Ｍｕｓｃｌｅ，”Ｎａｔｕｒｅ ３２８，１９８
７，３１３−３１８；Ｕ．Ｂ． Ｋａｕｐｐら、“Ｐｒ
ｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉ
ｏｎａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｃｏｍｐ
ｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｏｄ
Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＧＭＰ−ｇ
ａｔｅｄ Ｃｈａｎｎｅｌ，”Ｎａｔｕｒｅ ３４２，
（１９８９），７６２−７６６；Ｍ．Ｎｏｄａら、Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２２，（１９８６），８２６−８２８． オメガループは、規則立った構造を持たず、その端から
端までの距離が約１０オングストローム未満である、一
般に約６〜約１６のアミノ酸の長さの構造である。いく
つかのオメガループは、もっと長い。これらループのい
くつかは、細胞外ドメインとしても分類できる。天然に
知られている多数のそのようなループ、たとえばファー
ジＴ４リゾチームのｊｐ．４８部分（残基１３４〜１３
９）（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８）又はＢａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ｔｈｅｒ
ｍｏｌｙｓｉｎの一部（残基１８８〜２０３）（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１９）がある。本発明に従いオリゴペプチ
ドを形成するにおいてブリッジとして有用でありうる他
の公知オメガループは、Ｊ．Ｆ．レジンスキー及びＤ．
Ｇ．ローズ（Ｊ．Ｆ．Ｌｅａｚｃｚｙｎｓｋｉ及びＧ．
Ｄ．Ｒｏｓｅ），“Ｌｏｏｐｓ ｉｎ Ｇｌｏｂｕｌａ
ｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ａ ＮｏｖｅｌＣａｔｅｇｏｒ
ｙ ｏｆ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４，（１９８６），８４９
−８５５に同定されている。本発明のオリゴペプチドで
用いられるとき、これらオメガループは、モノマーを十
分に近接させることによってモノマー間相互作用を促進
しうる。本発明に従いブリッジとして用いうる他のフレ
キブルな接続ペプチド鎖は、たとえば（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．２３）の構造を持つペプチドである。Ｊ．Ｓ．ヒ
ューストン（Ｈｕｓｔｏｎ）ら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｂｉｎ
ｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ：Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａｎ Ａｎｔ
ｉ−ｄｉｇｏｘｉｎ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ Ｆｖ
ａｎａｌｏｇ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，（ＵＳＡ）８５，（１９８８），５８７
９−８４３参照。本発明の好ましい実施態様において、
そのようなより長い鎖のブリッジは、一つのオリゴペプ
チド内の少くとも二つのペプチドモノマーの間隔を与え
又は促進して、約１０オングストローム、より好ましく
は約７オングストローム内に互を置くことができる。
Ｊ．Ｓ．リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ），
“Ｔｈｅ ａｎａｔｏｍｙ ａｎｄ ｔａｘｏｎｏｍｙ
ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，”Ａｄ
ｖ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．３４，（１９８１），
１６７−３３９及びＪ．Ｓ．リチャードソンとＤ．Ｃ．
リチャードソン、“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐ
ａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎ，”ｉｎ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ
ＰｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｈｅ
Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎ
ｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｇ．Ｄ．ファスマン編集；Ｐｌｅ
ｎｕｍＰｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ），ｐｐ．
１−９８（１９８９）を、上記いくつかの段落に述べた
ペプチド又は蛋白の二次構造要素の定義及び検討のため
に参照されたい。従って、本発明のブリッジは、１つの
アミノ酸のように小さくてもよく、また１００のアミノ
酸のように大きくてもよい、しかし、より好ましくは、
ブリッジは約１〜約２０のアミノ酸を含む。ブリッジの
長さは、多数の因子に基いて変わりうる。本発明の好ま
しい実施態様において、ブリッジは、Ａｌａ、Ａｒｇ、
Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈ
ｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒ
ｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌから成
る群から選ばれることができる一つのアミノ酸である。
本発明のこの面でのより好ましい実施態様において、ブ
リッジはＡｌａ、Ａｒｇ、、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、
Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍ
ｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ａｎ
ｄ Ｖａｌより成る群から選ばれた一つのアミノ酸から
成る。本発明で特に好ましくはブリッジは、Ｇｌｙ、Ａ
ｌａ又はＳｅｒである。２〜４のアミノ酸を持つブリッ
ジも、オリゴペプチドの作成のために有利に用いうる。
これらブリッジで用いられるアミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒ
ｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌ
ｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈ
ｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａ
ｌから成る群から選ばれることができる。より好ましく
は、アミノ酸は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃ
ｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｐｒ
ｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ及びＶａｌから成る群から
選ばれる。本発明の好ましいブリッジは、（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．４）（ここでＸａａ１〜Ｘａａ４は直上で述
べたように置換されてもよい）の構造を持つものを包含
する。得られるブリッジは、Ｘａａ１がＧｌｙ、Ｓｅ
ｒ、Ａｓｎ又はＬｙｓ、Ｘａａ２がＧｌｙ、Ｌｙｓ、Ａ
ｓｐ、Ａｌａ又はＡｒｇ、Ｘａａ３がＧｌｙ、Ｇｌｕ、
Ｔｈｒ又はＳｅｒ、Ｘａａ４がＧｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ
又はＳｅｒであるものを包含する。一以上のＣｙｓアミ
ノ酸を含むブリッジも含まれうる。２〜４のアミノ酸長
さのブリッジは、たとえばベータターンを形成するペプ
チドたとえば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ、Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｙ、Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、及びＳ
ｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、ならびに他のペプチ
ド、たとえばＳｅｒ−Ｓｅｒ、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅ
ｒ、Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ、Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｈｒ
−Ｇｌｕ、及びＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒを包含
する。２〜５のアミノ酸長さを含む他のブリッジはＡｌ
ａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌ
ｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅ
ｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙ
ｒ、及びＶａｌより成る群から選ばれたアミノ酸より構
成されるものである。より好ましくは、アミノ酸は、Ａ
ｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌ
ｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈ
ｒ、Ｔｙｒ、及びＶａｌより成る群から選ばれる。本発
明の好ましい他のブリッジは、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
５）（ここでＸａａ１〜Ｘａａ５は上記の群から選ばれ
ることができる）の構造を持つものである。好ましい実
施態様において、この５員ブリッジは、Ｇｌｙ、Ａｌ
ａ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ及びＰｒｏより成
る群から選ばれ、構造（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．５）の特に
好ましいブリッジは、Ｘａａ１〜Ｘａａ５がＧｌｙであ
るものである。本発明に従ういくつかの代表的ブリッジ
は、下記を包含するが、これらに限定されない。（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）−
（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．１）；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
２）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）−（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．２）；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）−（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．５）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０）
＊＊＊；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）−Ａｌａ−（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．３）＊＊＊＊；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．１）−（Ｇｌｙ）３−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）
＊＊＊＊；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）−（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．４）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
３）＊＊＊＊；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）−Ｃｙｓ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
３）＊＊＊＊；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）；（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）−
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１）−（ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．７）＊＊＊；（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．３）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）−（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．３）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）−
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）＊＊＊＊；（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．３）−Ｇｌｙ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）−
Ｇｌｙ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）＊＊＊＊；（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎｏ．３）−Ｇｌｙ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．３）−（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．５）−（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．３）＊＊＊＊；ａｎｄ（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．２
０）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）−（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．９）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）＊＊＊＊、こ
こで“＊＊＊”及び“＊＊＊＊”は上述と同じ意味を持
ち、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）のＸａａ１〜Ｘａａ５
は、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）のＸａａ１〜Ｘａａ４
と同様に、夫々Ｇｌｙである。ブリッジするペプチドを
用いずに、そして事実、ペプチド結合でペプチドサブユ
ニットを結合することなしに、オリゴペプチドを構成す
ることもできる。詳しくは、本発明のオリゴペプチド
を、ジスルフィド結合、又は隣接サブユニットの末端に
おける適当に配置されたＧｌｙアミノ酸の酸化から得ら
れる接続により、個々のペプチドサブユニットを結合す
ることによって作ることができる。本発明のこの面に従
うオリゴペプチドは、上記したものと違って、二つの隣
接するペプチドサブユニットの各Ｎ又はＣ末端が互にジ
スルフィド結合されて、頭頭又は尾尾配置で結合される
ことができる。これは、接続されるべき二つの隣接ペプ
チドモノマー夫々のＮ又はＣ末端にＣｙｓを付着する
（すなわち、本発明に従う種々のペプチドモノマーの二
つの単一残基Ｃ又はＮ末端付加導体を用いる）、又は特
定のペプチドに含まれる個々のＮ又はＣ末端アミノ酸を
Ｃｙｓで置き代える（すなわち、二つの単一又は複数残
基置換誘導体を結合する）ことによって達成しうる。本
発明に従うジスルフィド結合されたオリゴペプチドの第
一の形（即ち、頭頭）の例は、夫々がＮ末端Ｇｌｙに付
着されペプチド結合されたＣｙｓを有する、（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１）の構造の二つのペプチドから作られた
二量体である。二つのＮ末端Ｃｙｓは、ペプチドモノマ
ーのように、ジスルフィド結合により結合される。本発
明に従うジスルフィド結合されたオリゴペプチドの第二
の形（即ち、尾尾）の例は、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
３）（ここでＸａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘ
ａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＧｌ
ｙ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ
１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌ
ｕ、Ｘａａ２０はＭｅｔ、Ｘａａ２２はＬｙｓそしてＸ
ａａ２３はＣｙｓである）の構造を持つ二つのペプチド
のジスルフィド結合を含む。マガイニン１のこれら第一
残基置換誘導体はすると、二つのＣ末端Ｃｙｓの間に形
成されるジスルフィド結合により結合される。上記の例
で用いたペプチドモノマーは、ジスルフィド結合された
オリゴペプチドを形成するように組合わされてもよい。
たとえば、用いられる少くとも一つの第一のペプチドモ
ノマーは、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）（ここでＣ末端
アミノ酸（通常はＳｅｒ）がＣｙｓで置き代えられ、つ
まり置換されている）の塩基構造を持つ上記の単一残基
置換誘導体であり、そして少くとも一つの第二のペプチ
ドモノマーは、たとえば（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）
（ここでＣｙｓはそのＣ末端Ｓｅｒにペプチド結合され
ている）の構造を持つペプチドの単一残基Ｃ末端付加誘
導体でありうる。すると、ジスルフィド結合は、二つの
Ｃ末端Ｃｙｓアミノ酸の間に形成されることができ、本
発明に従う尾尾ジスルフィド結合された二量体オリゴペ
プチドが作られる。本発明に従うジスルフィド連結され
たオリゴペプチドはまた、頭尾配置で結合されてもよ
い。たとえば、構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）を持
ち、かつＣ末端アミノ酸をＣｙｓ置換された第一のペプ
チド及びＮ末端に付着されたＣｙｓを持つ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．１）の第二のペプチドは、ジスルフィド連結
により結合されて、二量体オリゴペプチドを形成でき
る。このオリゴペプチドは、構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．３）−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１）ここで（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）についてＸａａ
５−Ｐｈｅ、Ｘａａ６−Ｌｅｕ、Ｘａａ７−Ｈｉｓ、Ｘ
ａａ８−Ｓｅｒ、Ｘａａ１０−Ｇｌｙ、Ｘａａ１１−Ｌ
ｙｓ、Ｘａａ１２−Ｐｈｅ、Ｘａａ１３−Ｇｌｙ、Ｘａ
ａ１８−Ｇｌｙ、Ｘａａ１９−Ｇｌｕ、Ｘａａ２１−Ｍ
ｅｔ、Ｘａａ２２−Ｌｙｓ、及びＸａａ２３−Ｃｙｓ、
を持つであろう。好ましくは、本発明のオリゴペプチド
は、単一のみのジスルフィドブリッジを持つ。即ち、た
とえば、一つのジスルフィドブリッジを持つオリゴペプ
チドは、上述したような頭尾配置で直接結合された他の
ペプチドサブユニット、及び／又は上述のようにブリッ
ジで結合されてもよい追加的ペプチドサブユニットを含
みうる。これらオリゴペプチドの例としては、下記が挙
げられるが、これに限定されない。ＨＯ−（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．２０）＊−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−（ＳＥ
ＱＩＤ ＮＯ．２０）−ＯＨ：Ｈ２Ｎ−（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２０）−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−（ＳＥＱＩ
Ｄ ＮＯ．２０）＊−ＮＨ２；Ｈ２Ｎ−Ｍｅｔ−（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．９）−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）−ＯＨ；Ｈ２Ｎ−Ｍｅｔ−（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）−ＯＨ；Ｈ２Ｎ−Ｍｅｔ
−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．５）−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２０）−ＯＨ；Ｈ２Ｎ−Ｍｅｔ−（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２０）４−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）−Ｃｙ
ｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）−Ｏ
Ｈ；Ｈ２Ｎ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）４−（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．９）−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）−ＯＨ；Ｈ２Ｎ−（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５）−
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ
−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．５）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）−ＯＨ． 上述のように、「−」はペプチド結合を示し、「−Ｓ−
Ｓ−」はジスルフィド結合を示し、「＊」は反転された
位置でのペプチドを示す。隣接ペプチドサブユニット間
にジスルフィド結合を与える方法としての末端Ｃｙｓの
使用はまた、同じ末端Ｃｙｓがペプチド結合により他の
ペプチドに更に結合する可能性を許す。ここで「他のペ
プチド」とは、単一のアミノ酸残基のような小さな構
造、及び少くとも一つの病原体に対し活性なペプチドを
含む。それは、全く不活性なペプチドでもよい。従っ
て、特定のＣｙｓがペプチド結合により二つのペプチド
に機能的に結合され（その一つがペプチドモノマーであ
る）、また少くとも一つの他のペプチドモノマー上に含
まれるＣｙｓにジスルフィド結合により結合されている
枝分れしたオリゴペプチドを作ることができる。そのよ
うなペプチドの例は、少くとも一つの第一のペプチドモ
ノマーが構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）を持つペプチ
ドの単一残基Ｃ末端付加誘導体であり、かつ少くとも一
つの第二のペプチドモノマーが構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．２）のペプチドの単一残基Ｎ末端付加誘導体であ
り、かつたとえば構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）のも
う一つのペプチドが備えられるところのオリゴペプチド
を包含する。得られるペプチドは、下記のように示され
る。
【化１／】ここで「−」はペプチド結合を示し、「−Ｓ
−Ｓ−」はジスルフィド結合を示す。このタイプのオリ
ゴペプチドの他の例は、下記の構造を持つ。
【化２／】ここで、アスタリスクは、反転されたペプチ
ド（この例ではＣｙｓの単一残基Ｃ末端付加を持つ（Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）の反転形）を示し、「−」はペ
プチド結合を示し、「−Ｓ−Ｓ−」はジスルフィド結合
を示す。第一の例は、ジスルフィド結合されたペプチド
モノマーについて頭尾配置を含み、第二の例は、尾尾配
置を示す。本発明に従う別のオリゴペプチドは、内部的
にＣｙｓで置換された少くとも一つのペプチドモノマー
を含む。即ち、これらオリゴペプチドは、Ｎ又はＣ末端
以外でＣｙｓにより置換された少くとも一つのモノマー
を用いる。従って、各ペプチドモノマーの内部部分内で
ペプチドを「架橋」することができる。たとえば、夫々
が位置２２でＣｙｓにより置換された（即ち、位置Ｘａ
ａ２２で通常のＡｓｎをＣｙｓで置換）ところの構造
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）を夫々持つ二つのペプチド
モノマーがジスルフィド結合されうる。あるいは、一つ
の内部的にＣｙｓ置換されたペプチドモノマーは、上述
したＮ又はＣ末端Ｃｙｓモノマーにジスルフィド結合に
より連結されうる。そのようなオリゴペプチドの例は、
構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）−Ｃｙｓ（すなわち、
マガイニン２の単一残基Ｃ末端付加誘導体）を持つ第一
のペプチドモノマー及び構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
２）（ここでたとえば、位置Ｘａａ２２のＡｓｎはＣｙ
ｓで置換されている）を持つ第二のモノマーのジスルフ
ィド結合を介する連結を含む。すると、これらモノマー
は、二つのＣｙｓアミノ酸の間に形成されたジスルフィ
ド結合により接続される。本明細書で定義したブリッジ
及びジスルフィド結合の両者を含むブリッジ化構造を持
つオリゴペプチドを作ることも、本発明に従い有利であ
る。即ち、たとえば、構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）
−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４）−（Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）〔ここで（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．３）中のＸａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘ
ａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８はＣｙｓ、Ｘａａ１０はＧｌ
ｙ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ
１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌ
ｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、Ｘａａ２２はＬｙｓそしてＸ
ａａ２３はＳｅｒであり、そして（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．４）のＸａａ１〜Ｘａａ４は夫々Ｇｌｙである〕を
持つオリゴペプチドを作ることができる。ジスルフィド
結合は、第一のペプチドモノマーの位置８のＣｙｓと、
第二のモノマーに付着された、５つのＧｌｙを含むブリ
ッジに付着されたＮ末端Ｃｙｓの間に形成される。複数
のブリッジユニットを含めることも有用であり、たとえ
ば得られる構造は次の通りである。（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）−Ｃｙｓ−Ｓ−
Ｓ−Ｃｙｓ−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）−（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．３）又は（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）−Ａ
ｌａ−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎｏ．２）＊ ここで「＊」は、反転された位置のペプチドを示す。相補的ペプチド混合物 バスコムら（前出）は、公知の抗菌性ペプチドの構造を
修飾する試みにおいて、或るペプチドが、一つの特定の
病原体又は病原体群に対する有効性を失い、同時の他の
ものに対する活性を少くとも実質上失わないことを発見
した。即ち、たとえば、構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
２）（ここで位置８のＳｅｒはＧｌｕで置換されてい
る）を持つペプチドは、マガイニン２と比べて、植物病
原性真菌に対し比較的活性なままである。しかし、修飾
は予期せざることにかつ有利なことにも、得られたペプ
チドの蛋白分解的減成への感受性を５０％以上減少し、
またペプチドの植物毒性を５０％減少した。不幸にも、
このペプチドは、少くとも一つの植物病原性バクテリア
に対する有効性を大きく失った。同様に、本発明者は、
公知の天然に生じるペプチドＰ１が植物病原性バクテリ
アに対してＡＭＰＰＰのように高度に有効であり、かつ
植物毒性及び蛋白分解感受性が非常に低いことを見い出
した。しかし、Ｐ１は、少くともいくつかの植物病原性
真菌に対し、極少ししか有効でない。これら観察及び発
見は、直上の述べた二つのような組成物を組合せて、得
られる混合物が単独のペプチドの使用で達成できるより
もはるかに広いスペクトルの抗菌性を持つという概念へ
と導く。従って、これら二つの組成物の一体化の効果
は、相補的である。本発明のこの面における抗菌性組成
物は、一つの群の病原体に対して比較的活性であり、他
の群の病原体に対して比較的低活性な少くとも一つの第
一の抗菌性ペプチド、及び上記少くとも一つの第一の抗
菌性ペプチドが比較的不活性であるところの病原体の群
に対して比較的活性であり、かつ上記少くとも一つの第
一の抗菌性ペプチドが比較的活性であるところの病原体
の群に対して比較的不活性である少くとも一つの第二の
抗菌性ペプチドを含む。ペプチドという言葉が、本発明
のこの面で（つまり相補的ペプチド混合物に関して）用
いられるとき、相補的ペプチドのような「ペプチドモノ
マー」を意味しているのではない。活性な形において、
相補的ペプチドは互に結合されることを意図されてい
ず、従って「モノマー」ではない。少くとも一つの第一
の抗菌性ペプチドも、少くとも一つの第二の抗菌性ペプ
チドも、植物病原体に対して活性である必要はない。し
かし、上述の少くとも一つが少くとも一つの植物病原体
に対して活性であることが好ましく、またより好ましく
は、上記抗菌性ペプチドの両者が少くとも一つの植物病
原体に対して活性である。本発明のこのより好ましい態
様に従い、少くとも一つの第一の抗菌性ペプチドが植物
病原性バクテリアに対して比較的活性であり、かつ植物
病原性真菌に対して比較的不活性であり、少くとも一つ
の第二の抗菌性ペプチドが植物病原性真菌に対して比較
的活性であり、かつ植物病原性バクテリアに対して比較
的不活性である。本発明のこの面に従い、それから少く
とも一つの第一の抗菌性ペプチドが選択されうるところ
の代表的ペプチドは下記を包含する。（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．６）；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）ここでＸａａ
５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘ
ａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＬｙｓ、Ｘａａ１１はＬ
ｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＡｌａ、Ｘａ
ａ１８はＡｌａ、Ｘａａ１９はＩｌｅ、Ｘａａ２１はＭ
ｅｔ、Ｘａａ２２はＡｓｎ、そしてＸａａ２３はＳｅｒ
である；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）ここでＸａａ５は
Ａｓｎ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ
８はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＬｙｓ、Ｘａａ１１はＬｙ
ｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＡｌａ、Ｘａａ
１８はＡｌａ、Ｘａａ１９はＩｌｅ、Ｘａａ２１はＭｅ
ｔ、Ｘａａ２２はＡｓｎ、そしてＸａａ２３はＳｅｒで
あり、Ｎ末端Ｇｌｙにペプチド結合されたＭｅｔを持
つ；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）にペプチド結合された
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
５）のブリッジにペプチド結合された（ＳＥＱ ＩＤＮ
ｏ．２）、ここでブリッジは構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．２）の別のペプチドに結合されている；（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．３）、ここでＸａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６
はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａ
ａ１０はＬｙｓ、Ｓｅｒ１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰ
ｈｅ、Ｘａａ１３はＡｌａ、Ｘａａ１８はＡｌａ、Ｘａ
ａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、Ｘａａ２２はＡ
ｓｎそしてＸａａ２３はＳｅｒである；それにペプチド
結合されたＮ末端Ｍｅｔを更に含む直上で述べたＡＭＰ
ＰＰ、及び同じマガイニン１置換誘導体。上記少くとも
一の第二の抗菌性ペプチドは、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
１）、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）、Ｎ末端Ｇｌｙにペ
プチド結合されたＭｅｔを持つ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
２）、位置２１のＭｅｔが酸化されている（ＳＥＱ Ｉ
ＤＮｏ．２）、位置２１のＭｅｔが除去されている（Ｓ
ＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、Ｎ末端Ｇｌｙが除去されかつ
位置２のＩｌｅがＭｅｔで置き代えられている（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．２）、位置１０のＬｙｓがＨｉｓで置き
代えられている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）、位置１１
のＬｙｓがＨｉｓで置き代えられている（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．２）、位置１０及び１１のＬｙｓが夫々Ｈｉｓ
及びＨｉｓで置き代えらえている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．２）、位置８のＳｅｒがＴｈｒで置き代えられてい
る（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）、位置８のＳｅｒがＡｌ
ａで置き代えられている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）、
位置７のＨｉｓがＰｈｅで置き代えられている（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．２）、夫々位置２２及び２３のＡｓｎ及
びＳｅｒが除去されている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
２）、位置１０のＧｌｙがＨｉｓで置き代えられている
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、Ｎ末端Ｇｌｙが除去され
ている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）、Ｎ末端Ｇｌｙ及び
位置２のＩｌｅが除去されている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
ｏ．２）、Ｎ末端Ｇｌｙ及び位置２のＩｌｅが除去され
ている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、Ｎ末端Ｇｌｙが除
去されている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、Ｎ末端Ｇｌ
ｙにペプチド結合されたＭｅｔを有する（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．１）、Ｃ末端Ｓｅｒが除去されている（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．１）、Ｃ末端Ｓｅｒ及び位置２２のＬｙ
ｓが除去されている（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．１）、位置２
２のＡｓｎがＧｌｙで置き代えられている（ＳＥＱ Ｉ
ＤＮｏ．２）、Ｃ末端Ｓｅｒが除去され、位置７のＨｉ
ｓがＡｒｇで置き代えられ、位置８のＳｅｒがＧｌｕで
置き代えられ、かつＮ末端Ｇｌｙにペプチド結合された
Ｍｅｔを有する（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、及び位置
７のＨｉｓがＡｒｇで置き代えられ、位置８のＳｅｒが
Ｇｌｕで置きかえられ、位置２３のＳｅｒがＰｒｏで置
き代えられ、かつＮ末端Ｇｌｙにペプチド結合されたＭ
ｅｔを有する（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）（つまり
（（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０）から成る群から選択さ
れうる。もちろん、本発明の抗菌性組成物が二つのみの
相補的抗菌性ペプチドの使用に限定される必要はない。
たとえば、植物病原性バクテリアに対して高度に活性Ｐ
１は、他の二つのＡＭＰＰＰと組み合わされることがで
き、その各々は別の群の植物病原性真菌に対して活性で
ある。得られた三成分混合物は従って、いずれか一つの
ペプチド単独よりもはるかに広いスペクトルの保護を与
える。このように追加的な利益が、相補的混合物におけ
る３つ以上の抗菌性ペプチドの使用から得られる。たと
えば、混合物に第３の抗菌性混合物を加えることがで
き、これは混合物中の他二成分のペプチドの一つと幾分
類似の植物病原体に対する活性範囲を持ち、しかし、他
二成分ペプチドのいずれよりも植物毒性が極めて低く又
は蛋白分解的減成に対して極めて抵抗性でありうる。得
られる混合物は、従って、夫々の個々の成分の利点を共
有している。本発明の好ましい混合物は、下記の混合物
を包含する。（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）プラス（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．１）；（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．６）プラ
ス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．６）プラスＭｅｔ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）こ
こで（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）についてＸａａ５はＰ
ｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＡｒｇ、Ｘａａ８
はＧｌｕ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、
Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８
はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、
Ｘａａ２２はＬｙｓ、そしてＸａａ２３はＰｒｏ；（Ｓ
ＥＱ ＩＤＮＯ．６）プラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
３）ここで（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）についてＸａａ
５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘ
ａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ１１はＬ
ｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘａ
ａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭ
ｅｔであり、Ｘａａ２２及びＸａａ２３は除去されてい
る；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）プラス（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．３）ここで（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）につい
てＸａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨ
ｉｓ、Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＬｙｓ、Ｘａａ
１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌ
ｙ、Ｘａａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ
２１はＭｅｔであり、Ｘａａ２２及びＸａａ２３は除去
されている；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）プラス（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．３）ここで（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
３）についてＸａａ１は除去され、Ｘａａ５はＰｈｅ、
Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８はＳｅ
ｒ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ
１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８はＧｌ
ｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔそしてＸ
ａａ２２はＬｙｓかつＸａａ２３はＳｅｒ；（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．６）プラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）こ
こで（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）についてＸａａ１は除
去され、Ｘａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ
７はＨｉｓ、Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＬｙｓ、
Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３
はＧｌｙ、Ｘａａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、
Ｘａａ２１はＭｅｔ、そしてＸａａ２２はＡｓｎかつＸ
ａａ２３はＳｅｒ；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）プラス
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）ここで（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．３）についてＸａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅ
ｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０
はＧｌｙ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、
Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１９
はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、そしてＸａａ２２はＡ
ｓｎかつＸａａ２３はＳｅｒ；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
６）プラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）ここで（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．３）についてＸａａ１は除去されＸａａ
５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘ
ａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ１１はＬ
ｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘａ
ａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭ
ｅｔ、そしてＸａａ２２はＬｙｓかつＸａａ２３はＳｅ
ｒ；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）プラス（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．７）；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）−（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２）プラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
１）；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２）プラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）；（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）
プラスＭｅｔ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）ここで（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）についてＸａａ５はＰｈｅ、Ｘ
ａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＡｒｇ、Ｘａａ８はＧｌ
ｕ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ
１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８はＧｌ
ｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、Ｘａａ
２２はＬｙｓ、そしてＸａａ２３はＰｒｏ；（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）プラス
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）ここで（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．３）についてＸａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅ
ｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０
はＧｌｙ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、
Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１９
はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔであり、そしてＸａａ
２２及びＸａａ２３は除去されてぃる；（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）プラス（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）ここで（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．
３）についてＸａａ１は除去され、Ｘａａ５はＰｈｅ、
Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８はＳｅ
ｒ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ
１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８はＧｌ
ｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、そして
Ｘａａ２２はＬｙｓかつＸａａ２３はＳｅｒ；（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）プラ
ス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）ここで（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．３）についてＸａａ１は除去され、Ｘａａ５はＰ
ｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８
はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＬｙｓ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、
Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８
はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、
そしてＸａａ２２はＡｓｎかつＸａａ２３はＳｅｒ；
（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
２）プラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）ここで（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．３）についてＸａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ
６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘ
ａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２は
Ｐｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８はＧｌｙ、Ｘ
ａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、Ｘａａ２２は
Ａｓｎ、そしてＸａａ２３はＳｅｒ；（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）プラス（ＳＥ
Ｑ−ＩＤ ＮＯ．３）ここで（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
３）についてＸａａ１は除去され、Ｘａａ５はＰｈｅ、
Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８はＳｅ
ｒ、Ｘａａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ
１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌ
ｙ、Ｘａａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ
２１はＭｅｔ、Ｘａａ２２はＬｙｓ、そしてＸａａ２３
はＳｅｒ；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）−（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．２）プラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）；
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）プラスＭｅｔ−（ＳＥＱＩ
Ｄ ＮＯ．３）プラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）ここ
で（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）についてＸａａ５はＰｈ
ｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＡｒｇ、Ｘａａ８は
Ｇｌｕ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘ
ａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８は
Ｇｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、Ｘ
ａａ２２はＬｙｓ、そしてＸａａ２３はＰｒｏ；（ＳＥ
Ｑ ＩＤＮＯ．６）プラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）
プラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）ここで（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．３）についてＸａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６
はＬｅｕ、Ｘａａ７はＰｈｅ、Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａ
ａ１０はＬｙｓ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰ
ｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８はＧｌｙ、Ｘａ
ａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、Ｘａａ２２はＡ
ｓｎ、そしてＸａａ２３はＳｅｒ；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．６）プラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）プラス（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）
プラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）プラス（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．２）；（ＳＥＱ ＩＤＮＯ．６）プラス（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．７）プラスＭｅｔ−（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．３）；ここで（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）につい
てＸａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＡ
ｒｇ、Ｘａａ８はＧｌｕ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ
１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌ
ｙ、Ｘａａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ
２１はＭｅｔ、Ｘａａ２２はＬｙｓ、そしてＸａａ２３
はＰｒｏ；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）−（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．２）プラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）プラ
ス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）ここで初めの（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．３）についてＸａａ１及びＸａａ２は除去
され、Ｘａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７
はＨｉｓ、Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘ
ａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３は
Ｇｌｙ、Ｘａａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘ
ａａ２１はＭｅｔ、Ｘａａ２２はＬｙｓ、そしてＸａａ
２３はＳｅｒであり、二つめの（ＳＥＱ ＩＤＮＯ．
３）についてＸａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘ
ａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＧｌ
ｙ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ
１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌ
ｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、そしてＸａａ２２及びＸａａ
２３は除去されている；（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．１０）プ
ラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）プラス（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．３）ここで初めの（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）に
ついてＸａａ１及びＸａａ２は除去され、Ｘａａ５はＰ
ｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８
はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、
Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８
はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、
Ｘａａ２２はＬｙｓ、そしてＸａａ２３はＳｅｒであ
り、二つめの（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）についてＸａ
ａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、
Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ１１は
Ｌｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘ
ａａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１は
ＭｅｔそしてＸａａ２２及びＸａａ２３は除去されてい
る；Ｍｅｔ−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）プラス（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．３）プラス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．
３）ここで初めの（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）について
Ｘａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉ
ｓ、Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ
１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＡｌ
ａ、Ｘａａ１８はＡｌａ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ
２１はＭｅｔ、Ｘａａ２２はＬｙｓ、そしてＸａａ２３
はＳｅｒであり、二つめの（ＳＥＱＩＤ ＮＯ．３）に
ついてＸａａ１及びＸａａ２は除去され、Ｘａａ５はＰ
ｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８
はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、
Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘａａ１８
はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、
Ｘａａ２２はＬｙｓ、そしてＸａａ２３はＳｅｒであ
り、三つめの（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）についてＸａ
ａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、
Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＧｌｙ、Ｘａａ１１は
Ｌｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａａ１３はＧｌｙ、Ｘ
ａａ１８はＧｌｙ、Ｘａａ１９はＧｌｕ、Ｘａａ２１は
Ｍｅｔ、そしてＸａａ２２及びＸａａ２３は除去されて
いる；等々。上記のペプチドに加えて、本発明の相補的
混合物は更に、担体、希釈剤、保存剤、緩衝剤などを含
むことができる。これは、緩衝剤たとえばトリス（トリ
ス−〔ヒドロキシメチル〕アミノメタン）；ＭＥＳ（２
−〔Ｎ−モルホリル〕エタンスルホン酸）；及びＨＥＰ
ＥＳ（Ｎ−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジン−Ｎ−
〔２−エタンスルホン酸）、及び保存剤たとえばアシド
ナトリウム又はチメロサールを包含する。これら添加物
の混合物もまた、有用でありうる。用いられる場合、こ
れら添加物は一般に、約０．０１〜約１０％（ｗ／ｖ）
の量で存在する。本発明の相補的混合物で用いられるペ
プチドは、本明細書記載の化学的又は遺伝子方法で作る
ことができる。そして、これらのペプチドは集められ、
適当な比で混合され、従って、本発明のＲＡＭＰＰＰ及
びオリゴペプチドが提供するのとほぼ同じ方法で、植物
又は他の生物に保護を与える。また、これら混合物は、
たとえば上記したＰ１及び〔Ａｒｇ７〕Ｍａｇ１の共存
を許すことによって遺伝子的に作ることができる。得ら
れる表現されたペプチドは、従って、本発明の相補的混
合物をインサイツに形成する。そのようなインサイツ形
成は、細胞の内部小室内で実現でき、又は、ペプチドが
細胞間の細胞外空間に個々に排せつされた後に実現でき
た。また、該混合物は、たとえばＰ１のペプチドモノマ
ーのＣ末端が、Ｎ末端にＨｉｓそしてＣ末端にＳｅｒを
持つ二つのアミノ酸から成るペプチドブリッジのＮ末端
に結合され、ブリッジのＣ末端がたとえば上述のマガイ
ニン１の単一残基置換誘導体のＮ末端Ｇｌｙに結合され
ているところのブリッジされた二量体オリゴペプチドの
作成により、作ることができた。本発明者は、活性であ
り、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ結合を認識し、この間の結合を切る
植物プロテアーゼが存在することを確認した。すなわ
ち、得られたオリゴペプチドが細胞から排せつされると
き、細胞外プロテアーゼが二つのペプチドを開裂して、
Ｐ１の単一残基Ｃ末端付加誘導体（Ｈｉｓ）と上記置換
されたペプチドの単一残基Ｎ末端付加誘導体（Ｓｅｒ）
の相補的混合物をもたらすであろう。この例において、
少くとも一つの第一のペプチドＰ１は、そのＮ末端に付
着されたＭｅｔ又は（ｆ）Ｍｅｔを更に持つことができ
る。従って、得られるペプチドは、Ｐ１の単一残基Ｎ末
端及び単一残基Ｃ末端付加誘導体である。ペプチド、ペプチドモノマー（反転ペプチドを含め）、
及びオリゴペプチドの化学的合成法 本発明に従う抗菌性ペプチド（ＡＭＰＰＰを含め）、反
転ペプチドならびにオリゴペプチド、ブリッジ及びペプ
チドモノマーは、伝統的な化学的合成により、又は一以
上のペプチド、ブリッジ及び／又はフラグメントを遺伝
子的にエンコードする特定のＤＮＡ物質をホスト細胞に
挿入し、この細胞に望むペプチドを表現させる一以上の
方法により、有利に作ることができる。伝統的な化学的
合成については、本発明に従う抗菌性ペプチド、反転ペ
プチド、ブリッジ及びオリゴペプチドは、いずれかの公
知のペプチド合成手順、たとえば「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅ ２−“Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ”，Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅ
ｉｅｎｈｏｆｅｒ編 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０，及びＶｏｌｕｍｅ９−
「Ｓｐｅｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＰｅｐｔｉｄ
ｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ｃ」Ｓ．Ｕｄｅｎ
ｆｒｉｅｎｄ及びＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編，Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９８７
に記載された方法を用いて合成できる。ペプチドの化学
合成のために本発明で好ましく用いられるのは、固相法
である。なぜなら、これは、高度に純粋なペプチドの迅
速な合成を可能にするからである。そのような手順にお
いて、ペプチドのＣ末端から出発して、不溶性ポリマー
支持体（樹脂と呼ばれる）上で、好ましくは一度に一つ
のアミノ酸で、ペプチドが合成される。ペプチドのＣ末
端アミノ酸（ＣＴＡＡ）を樹脂に、化学的結合基たとえ
ばアミド又はエステルを介して付着することにより合成
は始められる。もしエステルとして樹脂に結合されるの
なら、得られるペプチドはＣ末端カルボン酸であり、ア
ミドとして結合されるのなら、得られるペプチドはＣ末
端アミドである。ペプチド合成に用いられるＣＴＡＡな
らびに他の総てのアミノ酸は、そのアルファアミノ基及
び側鎖官能基（もしあれば）を、合成の間に選択的に除
去（脱保護）されうる誘導体として差別的に保護されね
ばならない。合成（カップリング）は、アミノ酸の活性
化された（たとえば、その対称的無水物又は活性エステ
ル）を、樹脂に付着されたＮ末端アミノ酸のブロックさ
れていないアルファアミノ基と反応させることにより実
施される。そのようなアルファアミノ基の脱保護及び続
くカップリングの手順を、望むペプチド鎖が構築される
まで繰返す。次に、ペプチド中に存在する官能基の総て
を脱保護し、通常スカベンジャーと呼ばれる化合物（こ
のプロセスの間にペプチドとの副反応を禁止する）の存
在下で、樹脂から開裂する。次に、得たペプチドを、種
々の方法たとえばゲル濾過、イオン交換及び高速液体ク
ロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により精製する。開裂及び
精製のプロセスの間に、Ｎ末端に存在するアミノ基に又
はペプチドのリシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒ
ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）又はオルニチン（Ｏｒｎ）
に結合された多数の酸塩形のいずれに転化されるかも知
れず、従って、得られる純粋なペプチドは通常、そのよ
うな塩の形で得られる。下記に記載されているメリフィ
ールド型の固相法が本発明で好ましく用いられる。Ｇ．
バラニイ（Ｂａｒａｎｙ）とＲ．Ｂ．メリフィールド
（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｔｈｅ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ２，Ｃｈ．１，ｐｐ
３−２８４；及びＪ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔとＪ．Ｄ．Ｙ
ｏｕｎｇ，「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版」Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌ
ｌ．，１９８４。一般に、任意の標準的側鎖基保護手法
を有利に用いうるが、ｔ−Ｂｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオ
キシカルボニル；たとえば、バラニイとメリフィール
ド、及びスチュワートとヤング、前出）及びＦＭＯＣ
（９−フルオレニルメトキシカルボニル、たとえばＥ．
アーサートンとＲ．Ｃ．シェパード、「ＴｈｅＦｌｏｕ
ｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ Ａｍｉｎ
ｏ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ＧｒｏｕＰ」、前出、第９
巻、第１章、第１−３８頁）の手法が好ましい。Ｃ末端
カルボン酸を含むペプチドの先駆体として必要なペプチ
ド樹脂の合成は、典型的には、市販入手できる架橋ポリ
スチレン又はポリアミドポリマー樹脂、たとえばクロロ
メチル、ヒドロキシメチル、アミノメチル、ＰＡＭ（フ
ェニルアセトアミドメチル）、ＨＭＰ（ｐ−ヒドロキシ
メチル−フェノキシ酢酸）、ｐ−ベンゾイルオキシベン
ジルアルコール、Ｈｙｃｒａｍ（４−ブロモクロトニル
−β−アラニルアミドメチル）；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃ
ｈｅｍｔｅｃｈ社、ルイーズビル、ＫＹ）、又はＳａｓ
ｒｉｎ（２−メトキシ−４−アルコキシベンジル）アル
コール；Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、フィ
ラデルフィア、ＰＡ）上で始められる。アミノ酸のカッ
プリングは、たとえばＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド）、ＨＯＢＴ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール）から作られる対称無水物、又はたとえばＤＣＣ／
ＨＯＢＴから又はたとえば種々のＢＯＰ剤〔たとえば
Ｊ．コステ（Ｃｏｓｔｅ）ら“ＢＯＰ ａｎｄ Ｃｏｎ
ｇｅｎｅｒｓ：Ｐｒｅｓｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ａｎｄ
Ｎｅｗ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”，Ｐｒｏｃｅｅ
ｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅｖｅｎｔｈ Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ；Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｅ．Ｒｉｖｉｅｒ
とＧ．Ｒ．Ｍａｒｓｈａｌｌ、編、ＥＳＣＯＭ，Ｌｅｉ
ｄｅｎ．Ｎｅｉｔｈ．，１９９０、ｐｐ８８５−８８８
を参照）から作られた活性エステルを、溶剤たとえばＤ
ＣＭ（ジクロロメタン）、ＤＣＭ含有ＴＦＥ（トリフル
オロエタノール）、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムア
ミド）、ＮＭＰ（Ｎ−メチルピロリドン）又はＮＭＰ含
有ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中で用いることに
よって達成できる。本発明で好ましく用いられるのは、
ＤＭＦ又はＤＭＦ／ＤＣＭ溶液中でＰＡＭ樹脂上での、
ｔ−Ｂｏｃ保護されたアミノ酸〔但し、アルギニン（Ａ
ｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌ
ｎ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）を除く。これらは、好ま
しくはＤＣＣ／ＨＯＢＴから作られたＨＯＢＴ活性エス
テルとしてカップリングされる〕、及びＮＭＰ溶液中で
ＨＭＰ−ポリスチレン樹脂上での、ＦＭＯＣ保護された
アミノ酸のＤＣＣ／ＨＯＢＴ製造のＨＯＢＴ活性エステ
ルのカップリングである。本発明でより好ましいのは、
初めに１．９ミリモルのＤＩＥＡ／０．５ミリモルのＰ
ＡＭ樹脂を含むＮＭＰ中で、次にＮＭＰ／ＤＭＳＯの８
０／２０溶液中で、最後にＮＭＰ／ＤＭＳＯの８０／２
０溶液中でＰＡＭ樹脂へのｔ−Ｂｏｃ保護されたアミノ
酸のＤＣＣ／ＨＯＢＴ製造のＨＯＢＴ活性エステルのカ
ップリングである。Ｃ末端アミドを含むペプチドへの先
駆体としてのペプチド−樹脂の合成は、上述の手順を用
いて満足に行える。しかし、ベンズヒドリルアミン（Ｂ
ＨＡ）又は４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨ
Ａ）ポリスチレン樹脂のようなポリマー支持体を用いな
ければならない。本発明のこの面、すなわちＣ末端に結
合されたアミド基を持つＡＭＰＰＰの製造において、４
−メチルベンズヒドリルアミン−ポリスチレン樹脂が好
ましく用いられる。多くのタイプの側鎖保護基が、たと
えば、バラニイとメリフィールド（前出）、グロスとメ
インホファー編「Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｖｏ
ｌｕｍｅ ３−“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎ
ｃｔｉｏｎａｌ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１．およびスチュワート
とヤング（前出）によりｔ−Ｂｏｃアミノ酸について記
載されたように、またアサートンとシェパード（前出）
によりＦＭＯＣアミノ酸について記載されたように、ｔ
−Ｂｏｃ又はＦＭＯＣ固相合成のために用いられうる。
ｔ−Ｂｏｃアミノ酸のために本発明で好ましいのは、ア
ルギニンのためのＭＴＳ（メシチレン−２−スルホニ
ル）、アスパラギン酸のためのＯＢｚｌ（ベンジルエス
テル）、システインのための４−Ｍｅ Ｂｚｌ（４−メ
チルベンジルチオエーテル）、３，４−ジヒドロキシフ
ェニルアラニンのためのＢｚｌ２（ジベンジルジエーテ
ル）、グルタミン酸のためのＯＢｚｌ、ヒスチジンのた
めのＢｏｍ（ベンジルオキシメチル）又はＺ（ベンジル
オキシカルボニル）、３−及び４−ヒドロキシプロリン
のためのＢｚｌ、リシン及びオルニチンのためのＣｌ−
Ｚ（２−クロルベンジルオキシカルボニル）、セリン及
びスレオニンのためのＢｚｌ、トリプトファンのための
ＣＨＯ（ホルミル）、チロシンのためのＢｒ−Ｚ（２−
ブロムベンジルオキシカルボニル）である。メチオニン
は、そのスルホキシドとして〔Ｍｅｔ（０）〕保護され
うるが、好ましくは保護されずに用いられる。本発明に
従うＡＭＰＰＰ、ＲＡＭＰＰ、ＲＡＭＰＰＰ、オリゴペ
プチド及びブリッジを含むペプチドは、自動化装置で又
は人の手による方法で合成できる。しかし、自動化法が
好ましい。本発明で述べられるＡＭＰＰＰの例の総て
は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）
社のＭｏｄｅｌ４３０Ａ自動化ペプチド合成機を用い
て、そのユーザーマニュアル、バージョン１．３０、セ
クション６、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、
フォスター市、ＣＡ、１９８７年２月（１９８７年１１
月及び１９８８年１０月改訂）記載のｔ−Ｂｏｃプロト
コールを用いて実際に作られた。これらプロトコールに
従い、ペプチドは、ペプチドのＣ末端から出発して樹脂
で組立てられる。Ｃ末端カルボン酸の合成のために必要
なＰＡＭ又はＨＭＰ樹脂は、ＡＢＩ又は他の製造者から
購入でき、α−アミノ酸及び側鎖保護されたＣ末端アミ
ノ基に既に結合されている。しかし、Ｃ末端カルボキシ
アミドを作るとき、Ｃ末端アミノ酸は初めにＢＨＡ又は
ＭＢＨＡ樹脂にカップリングされねばならない。いずれ
の場合でも、α−アミノ酸及び側鎖保護されたＣ末端ア
ミノ酸を含む樹脂は反応容器に入れられ、ペプチド鎖
は、樹脂に付着されたＮ−末端アミノ酸のα−アミノ基
の脱保護及びこれに次のアミノ酸（これもα−アミノ及
び側鎖保護されている）へのカップリングの繰返しによ
って、一度に好ましく組立てられる（ペプチドのフラグ
メントの組立は可能であるが、本発明のＡＭＰＰＰのた
めには通常あまり好ましくない）。Ｎ−末端アミノ酸の
α−アミノ基の脱保護及び次の保護されたアミノ酸のカ
ップリングの順は、望むペプチド鎖が組立てられるまで
続けられる。ポリマー支持体に結合された、得られたＮ
末端及び側鎖保護されたペプチドは次に、適当な脱保護
及び開裂手順に付されて、通常、Ｎ末端及びリシン、ヒ
スチジン、アルギニン及びオルニチン酸塩として、保護
されていないペプチドを与える。合成は、カップリング
段階において０．５ミリモルのＣ末端アミノ酸樹脂及び
２．０ミリモルの側鎖保護されたｔ−Ｂｏｃアミノ酸か
ら出発して、ｔ−Ｂｏｃ保護ストラテジーを用いて実施
された。しかし、これらの量は重要でなく、用いる自動
化装置又はマニュアルの道具のタイプに依存して、比例
してより大きな又は小さな量を用いうる。たとえば、
０．１ミリモルのような少量及び０．６ミリモルのよう
な大量のアミノ酸−ＰＡＭ樹脂を用いる合成を、ＡＢＩ
装置を用いて本発明者は行った。この装置を用いると
き、カップリングされるべきアミノ酸対ＰＡＭ樹脂に付
着されたアミノ酸又はペプチドのモル比は４が好ましい
けれど、より大きい又は小さい比も用いうる。３．３３
のような小さな比（０．６ミリモルのＰＡＭ樹脂／２．
０ミリモルのアミノ酸）が、カップリング効率の何ら重
大な低下なしに用いられた。一回当り作られるペプチド
の量を増すために、より低い比を用いうるが、カップリ
ング効率、従ってペプチド純度が低るので、あまり好ま
しくない。より大きな比は、もはや効率的でないので、
一般に好ましくない。ＤＭＦ中でのｔ−Ｂｏｃ保護手法
に基づく合成において、α−アミノ基の脱保護は、ＴＦ
Ａ／ＤＣＭを用い、次にＤＩＥＡ／ＤＭＦでの中和によ
り、環境温度で行われる。対称的な無水物はＤＣＭ中で
ＤＣＣから形成される。但し、ロイシン、メチオニンス
ルホキシド、トリプトファン及びホルミル−トリプトフ
ァンはＤＣＭ中の１０％ＤＭＦ中で形成される。副生成
物ＤＣＵ（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルウレア）の濾過の
後、ＤＣＭは気化され、ＤＭＦで置き代えられ、この間
温度は１０〜１５℃に維持される。この手順を用いて合
成されるＡＭＰＰＰのために、成長するペプチド鎖の長
さが９のアミノ酸を越えた後、ダブルカップリングされ
る。これらの場合、濾過後のＤＣＭ溶液は、次の段階で
直接用いられる。ＨＯＢＴ活性なエステルは、アスパラ
ギン、グルタミン及び保護されたヒスチジンについては
８−１０％ｖ／ｖ ＤＣＭを含むＨＯＢＴとＤＣＣとの
反応から、及びアルギニン（ＭＴＳ）について２５−３
０％ｖ／ｖ ＤＣＭを含むＨＯＢＴとＤＣＣとの反応か
ら形成される。副生成物ＤＣＵの濾過後に、ＨＯＢＴ活
性エステル溶液は、ＤＣＭの除去なしに次の段階で直接
用いられる。これら４つのアミノ酸は常に、同じ手順を
用いてダブルカップリングされる。適当な溶剤中でアミ
ノ酸対称無水物又はＨＯＢＴ活性エステルが形成される
と、溶液は反応容器に移され、Ｎ末端α−アミン脱保護
されたペプチド樹脂と共に振り動かされる。この間にカ
ップリングが起り、これは当初、対称無水物については
１８〜２６分間、活性エステルについては２６〜４２分
間である。ペプチド鎖が長くなると、カップリング時間
は一般に増大される。たとえば１５のアミノ酸後には１
０分間が追加される。カップリングは当初、対無水物が
形成される温度で行われるが、カップリング期間の間に
序々に環境温度に達する。カップリング期間の完了時
に、樹脂をＤＣＭで洗い、ニンヒドリン検出のためにサ
ンプルを取り〔サリン（Ｓａｒｉｎ）ら、“Ｑｕａｎｔ
ｉｔａｔｉｖｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｓｏｌ
ｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓｂｙ ｔｈｅ Ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏ
ｎ，”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７，（１９８
１），１４７−１５７参照〕、そして次のカップリング
サイクルの準備のために乾燥させる。ＮＭＰ中でのｔ−
Ｂｏｃ保護手法に基づく合成において、α−アミノ基の
脱保護は上記のように行われるが、但し、過剰のＴＦＡ
の中和は、ＤＩＥＡ／ＤＣＭ、ＤＩＥＡ／ＮＭＰ、及び
ＮＭＰ単独での洗浄により行われるる。ＤＣＣ、ＨＯＢ
Ｔ及びＮ−末端及び側鎖保護されたアミノ酸の各１．０
当量をＮＭＰ中で環境温度で約４０〜６０分間反応させ
ることによって総てのアミノ酸はＨＯＢＴ活性エステル
へと転化される。副生ＤＣＵの濾過の後、ＨＯＢＴ活性
エステル溶液は、カップリング反応で直接用いられる。
カップリングは環境温度でＤＭＰ中で３０分間、ＤＭＳ
ＯのＮＭＰ中の２０：８０溶液を与えるべく十分なＤＭ
ＳＯを加えてから更に１６分間、そして最後に、１．９
ミリモルのＤＩＥＡの添加後に更に７分間行われる。ペ
プチド鎖が長くなるにつれて、より長いカップリング時
間が用いられる。たとえば、ペプチド鎖が１５のアミノ
酸に達した後は、カップリング時間は１５分間延長され
る。ダブルカップルサイクルは、シングルカップルサイ
クルと同じように行われるが、Ｌｙｓ４又はＡＭＰＰＰ
における均等物のためにのみ一般に用いられた。カップ
リングサイクルの完了時に、ペプチド−樹脂上に残る未
反応のアミノ基は、これを、ＤＣＭ中の１０％無水酢酸
及び５％ＤＩＥＡの溶液で５分間処理し、次にＤＣＭ中
の１０％無水酢酸と４分間振とうすることによってキャ
ップされる。ＤＣＭでよく洗った後に、樹脂のサンプル
を、上記のようにカップリング効率のニンヒドリン検出
のために採り、そして次のカップリングサイクルの準備
のために乾燥する。ＤＭＦ又はＮＭＰを用いてカップリ
ング効率は常に９８％より大きく、殆どの場合９９％よ
り大きかった。ＡＭＰＰＰ、オリゴペプチド、フラグメ
ント、逆ペプチドおよびフラグメントを含む本発明のペ
プチドはここに記載されかつＡＢＩモデル４３０Ａペプ
チド合成装置として入手できるＦＭＯＣ化学により上首
尾で合成できる〔Ｋ．Ｈ．オットソン（Ｏｔｔｅｓｏ
ｎ）“ＮＭＰ化学に関する最近の進展（Ｒｅｃｅｎｔ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＮＭＰ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ）の”タンパク化学は芸術か科学か？（Ｉ
ｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎＡｒｔ
ｏｒ ａ Ｓｃｉｅｎｃｅ）”アプライドバイオシス
テムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），Ｆ
ＡＳＥＢミーティング、ニューオルレアンズ、１９８９
年４月〕。また、Ｓ．ノザキ（Ｎｏｚａｋｉ）は、“連
続流動条件下でのマガイニン１の固相合成（Ｓｏｌｉｄ
Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆ Ｍａｇａｉｎ
ｉｎ １ Ｕｎｄｅｒ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏ
ｗＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）”Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１
９８９，ｐｐ．７４９−７５２において、ＨＭＰ樹脂を
使用し、ここに記載のものと極めて類似する自動化ＦＭ
ＯＣ法を用いてマガイニン１を合成する方法を詳細に記
載している。ここに記載するペプチドすべては別々に調
製されるが、多数のペプチドを同時に調製することもし
ばしば望ましく、かつ当を得たものである。このような
合成を実施する手順は文献で周知であり、このような仕
事を行うための市販の装置も入手できる。例えば、クエ
ルボ（Ｃｕｅｒｖｏ）等の上記文献の“マガイニン類：
高い抗生物活性および低い溶血活性に係る配列因子（Ｔ
ｈｅ Ｍａｇａｉｎｉｎｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｆａｃ
ｔｏｒｓ Ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ Ｉｎｃｒｅａｓｅ
ｄ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｄｉａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ
ａｎｄ Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ Ａ
ｃｔｉｖｉｔｙ）および上記文献の“マガイニンのアラ
ニン置換類似体の合成および抗生物活性（Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓａｎｄ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｃｔｉ
ｖｉｔｙ ｏｆ Ｎａｇａｉｎｉｎ Ａｌａｎｉｎｅ
Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ）”に
おいてＣ−末端アミドをもつ省略およびアラニン置換類
似体並びにマガイニン１および２のカルボン酸の、ＰＡ
Ｍおよび４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂両者上の
ｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸を用いるＳＭＰＳ（同時の多数
のペプチドの合成（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｍｕｌ
ｔｉｐｌｅ ｐｏｐｔｉｄｅｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）
法を利用した同時合成を報告している。また、Ｆ．Ｓ．
ツヨング（Ｔｊｏｅｎｇ）等は“単一の支持体を用いた
多数のペプチドの合成（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｎｇ
ｌｅ Ｓｕｐｐｏｒｔ（ＭＰＳ３）），”Ｉｎｔ．Ｊ．
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，１９９
０、３５、ｐｐ．１４１−１４６において、ｔ−Ｂｏｃ
保護アミノ酸およびＰＡＭ樹脂を用いた、２１−位にお
いて種々のアミノ酸で置換されたマガイニン２の類似体
の同時合成を報告している。しかし、同じ論文において
これらの著者は、この方法がブタアンジオテンシノーゲ
ンペプチドの１１−置換類似体の同時合成について、Ａ
ＢＩモデル４３０Ａペプチド合成装置を用いて自動化で
きることを示した。上記論文に記載されたものと同様な
手順が特に本発明の実施のために利用できる。これに従
えば、好ましい方法では、３種のマガイニン置換類似体
の同時合成のために、ｔ−Ｂｏｃアミノ酸、ＰＡＭ樹
脂、およびＤＣＣ／ＨＯＢＴカップリング（ＮＭＰ−Ｎ
ＭＰ／ＤＭＳＯ中）が利用できた。多数の置換類似体が
同時にカップリングできるが、生成したペプチドの分離
はより困難になり、かつ生成した各ペプチドの収量は減
少する。本発明の実施に際して、多くの共通なセグメン
トを含む種々のペプチド部分を同時に合成することが可
能である。例えば、置換のためにＣ−末端のみが異るペ
プチドまたは鎖長のみ異なるペプチドは、異るＣ−末端
配列を含むＰＡＭ樹脂を一緒に混合し、次いで同時に周
期的に共通のアミノ酸セグメントを通常の方法で該樹脂
混合物にカップリングすることにより同時に合成でき
る。このために、好ましい方法では、ＰＡＭ樹脂上でｔ
−Ｂｏｃアミノ酸を用い、ＮＭＰまたはＮＭＰ／ＤＭＳ
Ｏ中でのＤＣＣ／ＨＯＢＴを利用して生成したＨＯＢＴ
活性エステルを使用する。同様に、主としてＮ−末端の
異るペプチドの多数のセグメントを、まず共通のＣ−末
端鎖を含むペプチド−ＰＡＭ樹脂を、該Ｎ−末端におけ
る初めて異るアミノ酸に至るまで調製することにより、
同時に合成できる。次いで、このペプチド−樹脂を別々
の容器に分割し、各ペプチド合成を別々に続ける。２種
の生成したペプチド−樹脂をカップリングして完成する
か、あるいは更にペプチド合成の後の段階で、他の所定
の分岐部分に達した時点で分割する。本発明の範囲内の
多数ペプチド合成で使用するのに好ましいのは、ＮＭＰ
またはＮＭＰ／ＤＭＳＯ中でのＤＣＣ／ＨＯＢＴカップ
リングを利用したＰＡＭ樹脂上でのｔ−Ｂｏｃプロトコ
ルである。生成するペプチド−樹脂の量を増すために、
標準的な０．５ｍＭよりもむしろ０．６ｍＭの樹脂を、
多数ペプチドの合成でカップリング効率を損うことなく
利用できる。Ｃ−末端カルボン酸またはアミノ酸ペプチ
ド用の先駆体として得たペプチドは、文献に記載されて
いる周知の任意の標準的方法（例えば、バラニー（Ｂａ
ｒａｎｙ）およびマリフィールド（Ｍａｒｒｉｆｉｅｌ
ｄ）の上記文献、スチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）等の
上記文献、Ｊ．Ｐ．タム（Ｔａｍ）＆Ｒ．Ｂ．マリフィ
ールド（Ｍａｒｒｉｆｉｅｌｄ）の“合成ペプチドの強
酸脱保護：機構と方法（Ｓｔｒｏｎｇ Ａｃｉｄ Ｄｅ
ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ），”（“ペプチド・分折、合成、バイオロ
ジー（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ，
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ），”ｖｏｌ．
９、第５章、ｐｐ．１８５−２４８）およびアプライド
バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ），“ペプチド合成における戦略−開裂法の基礎（Ｓ
ｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ−Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｌｅ
ａｖａｇｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），”１９９０、ア
プライドバイオシステムズを参照のこと）を利用して、
該樹脂から開裂および脱保護できる。例えば、ｔ−Ｂｏ
ｃペプチド−樹脂についていえば、これらは標準無水Ｈ
Ｆ（弗化水素）、低／高ＨＦ、ＴＦＭＳＡ（トリフルオ
ロメタンスルホン酸）およびＴＭＳＯＴｆ（トリメチル
シリルトリフルオロメタンスルホネート）を含む。しか
し、標準ＨＦおよび低／高ＨＦ法は、ｔ−Ｂｏｃペプチ
ド−樹脂からの脱保護および開裂のために本発明で使用
するのに好ましい。また、Ｎ−末端ｔ−Ｂｏｃ保護基
は、該ペプチドをＨＦ脱保護および開裂する前に除去す
ることが好ましい。標準的な無水ＨＦ条件を用いたｔ−
Ｂｏｃ−ペプチド−ＰＡＭの開裂および脱保護は、一般
に上に挙げた参考文献に与えられている方法に従って行
われる。典型的には、約１ｇの該ペプチド−樹脂を、
１．０ｍｌのアニソール、０．４ｍｌのジメチルスルフ
ィド（ＤＭＳ）、０．２〜０．４ｍｌの１，２−エタン
ジチオールおよび３ｍｇの２−メルカプトピリジンをス
キャベンジャーとして含む１０〜１２ｍｌの無水ＨＦ溶
液中で、−５℃〜０℃にて約５０〜９０分攪拌する。存
在するスキャベンジャーの量のわずかな変動は結果に大
きな影響を与えず、また上で引用した文献中に記載され
たような他のスキャベンジャーを使用してもよい（例え
ば、トリプトファンを含むペプチドでは３ｍｇのスカト
ールをも添加すべきである）。しかし、上に特定した反
応時間および温度を用いることが好ましい。というの
は、短い反応時間および低い反応温度は不完全な脱保護
および開裂をもたらす可能性があり、一方高い反応温度
は副反応を生ずる恐れがある。長い反応時間は一般に望
ましくなく、副反応を起こす恐れがあるが、いくつかの
場合には、例えばトシル基で保護されたアルギニンまた
は数個のアルギニンが該ペプチド鎖中に存在する場合、
より完全な脱保護のためには２時間までの反応時間が必
要とされる可能性がある。このＨＦ法を実施するのに特
に好ましい方法は、イムノダイナミック社（Ｉｍｍｕｎ
ｏ−Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．）（カリホルニア州、
ラジョラ）の方法である。この方法では、ＨＦ／スキャ
ベンジャー／ペプチド−樹脂混合物を先ず−１０℃にて
３０分間攪拌し、次いで０℃にて３０分（０℃にてアル
ギニン１個当たり５分以上）攪拌する。該“低／高（ｌ
ｏｗ／ｈｉｇｈ）”無水ＨＦ法は、メチオニンのアルキ
ル化などの副反応を最小化するために、本発明に記載の
任意のペプチド−樹脂の脱保護および開裂に使用できる
が、複数のペプチドの同時合成で生成したペプチド−樹
脂混合物の脱保護および開裂のために特に好ましい。こ
れに続く好ましい手順は基本的にはＪ．Ｐ．タム（Ｔａ
ｍ）等の“ジメチルスルフィド中での低濃度ＨＦによる
合成ペプチドのＳＨ２脱保護：ペプチド合成における験
証および応用（ＳＮ２ Ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ
ａ Ｌｏｗ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈ
Ｆ ｉｎＤｉｍｅｔｈｙｌ Ｓｕｌｆｉｄｅ：Ｅｖｉｄ
ｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）”，Ｊ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８３、１０５、ｐｐ．６４４２
−６４５５およびタムおよびメリフィールドの上記文献
における“合成ペプチドの強酸による脱保護：機構およ
び方法（Ｓｔｒｏｎｇ Ａｃｉｄ Ｄｅｐｒｏｔｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ）”に記載のものであり、これらは２．５：６．５：
１の無水ＨＦ／ジメチルスルフィド／ｐ−クレゾール１
０〜２０ｍｌ（好ましくは１０〜１２ｍｌ）中に約１ｇ
のペプチド−樹脂を含む溶液を−５℃〜０℃にて約２時
間攪拌（該ペプチド−樹脂がＴｒｐ（Ｆｏｒ）を含む場
合には、次いで１０：２６：３：１の無水ＨＦ／ジメチ
ルスルフィド／ｐ−クレゾール／チオクレゾールの溶液
を代りに使用する）する。次に、ＨＦとＤＭＳとを約−
５℃〜０℃にて真空下で除去し、新たに無水ＨＦを添加
する。次いで、“高”または“標準”開裂を、−５℃〜
０℃にて更に４５〜９０分間該混合物を攪拌することに
より行う。この“高”ＨＦ脱保護を行うのにより好まし
い方法はイムノーダイナミックス社の方法である。この
方法において、１ｍｌのアニソール、０．４ｍｌのＤＭ
Ｓ、０．４ｍｌの１，２−エタンジチオールおよび３ｍ
ｇの２−メルカプトピリジンを１０ｍｌの新たな無水Ｈ
Ｆと共に添加して、この混合物を−１０℃にて３０分、
０℃にて３０分（０℃にてアルギニン１個当たり５分以
上）攪拌する。該“標準”または“低／高”ＨＦ脱保護
および開裂法のいずれかの完了後、ＨＦおよび任意の残
留ＤＭＳを−５〜０℃にて真空下で完全に蒸発させる。
次に、得られるペプチド−樹脂−スキャベンジャー混合
物を約１０〜１５ｍｌのジエチルエーテル、酢酸エチル
など（体積に制限はなく、ジエチルエーテルが好まし
い）と混合し、濾過し、残渣を２〜４回１０〜１５ｍｌ
のジエチルエーテル、酢酸エチルなど（体積は制限され
ず、ジエチルエーテルが好ましい）で洗浄して有機スキ
ャベンジャーを除去する。この時点で、５ｍｌの２−メ
ルカプトエタノール（ＢＭＥ）と共に３０分該残渣を攪
拌して、メチオニンスルホキシドをメチオニンに還元す
ることが好ましい。次に、このペプチドを２％のＢＭＥ
含有１０〜３０％酢酸５〜３０ｍｌで３回抽出し、この
抽出液を併合し、（必要ならば）水で希釈して酢酸の最
終濃度を１０％以下とし、次いで凍結乾燥する。得られ
る粗製ペプチドの重量は典型的には約５０〜９０％の範
囲にある。“低−高”ＨＦ開裂および脱保護の完了後、
該ペプチドの好ましい抽出法はイムノ−ダイナミックス
社の使用した方法である。この方法においては、ＨＦと
ＤＭＳの蒸発後、該ペプチド／樹脂混合物をクロロホル
ムで膨潤後、３回１０ｍｌのエーテルで洗浄し、５ｍｌ
のＢＭＥと共に２０〜３０分攪拌する。次に、この混合
物を３回５〜３０ｍｌの１：１の１０〜３０％酢酸／Ｂ
ＭＥで抽出した（しばしば、０．１％のＴＦＡ含有５０
％水性アセトニトリル２０〜３０ｍｌで更に抽出するこ
とが有利である）。次に、抽出物を併合し、２０ｍｌの
エーテルで３回抽出して残留するスキャベンジャーを除
去し、ペプチドを該水性酢酸／（アセトニトリル）／Ｂ
ＭＥ層の凍結乾燥により回収する。このＨＦ脱保護、開
裂法から得た粗製ペプチドはＮ−末端、リジン、アルギ
ニン、ヒスチジンおよびオルニチン弗化水素酸塩として
存在し、また他の弗化物塩およびスキャベンジャーで汚
染されている可能性もある（他の脱保護スキームを用い
た場合には、例えばトリフルオロメタンスルホン酸を用
いた場合には、他の無機塩、例えばトリフルオロメタン
スルホネートが代りに存在するであろう）。このような
ペプチドまたは無機塩は望ましくない。というのは、こ
れら単独もしくは水分の存在下では、これらは強酸とし
て作用する恐れがあり、該ペプチドを分解もしくは植物
に対して有害である可能性がある。従って、更に精製し
てこのような塩を除去することが好ましく、これにより
単位重量当たり高活性のペプチドを得ることも可能とな
る。このペプチドを精製する好ましい方法はアニオン交
換クロマトグラフィーにより弗化物塩を除去し、次いで
ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）により単離す
ることである。本発明の実施に際して典型的に好ましい
如く、アニオン交換クロマトグラフィーは該ペプチドを
酢酸塩として与え、一方ＨＰＬＣは該ペプチドをトリフ
ルオロ酢酸塩として与える。イオン交換クロマトグラフ
ィーを実施する典型的な方法は該粗製ペプチドを最小量
の５〜３０％酢酸（より高い酢酸濃度がより疎水性の高
いペプチドに対して必要とされる）に溶解し、あらゆる
残留不溶物（例えば吸蔵樹脂）を濾別し、該溶液を５〜
３０％酢酸中のアニオン交換樹脂、例えばバイオラド
（ＢｉｏＲａｄ）ＡＧ１Ｘ−８（アセテート型）（カリ
ホルニア州、リッチモンドのバイオラド社）（ＢｉｏＲ
ａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））に通すことであ
る。ニンヒドリンテストで検出（サリン（Ｓａｒｉｎ）
等の上記文献）したペプチド画分を併合し、凍結乾燥し
てペプチドをＮ−末端、リジン、アルギニン、ヒスチジ
ンおよびオルニチン酢酸塩として、無機不純物を含まな
い状態で得る。しかし、依然としてスキャベンジャーが
残されている可能性がある。こうして得たペプチドはＨ
ＰＬＣ分析（以下参照）によれば純度５０〜８０％であ
るが、それ自体は植物病原体を破壊する上で著しく有効
である。単位重量当たり幾分高い活性をもつペプチドは
該アニオン交換前またはその後に、該ペプチド塩を弱塩
基、例えば５〜１０％の重炭酸アンモニウムまたは６Ｍ
グアニジン塩酸塩で処理して、酸性開裂条件下でセリン
および／またはスレオニンを含有するペプチド中で起こ
るすべてのＮ→０アシルシフトを逆転させることにより
得られる。典型的には、これは該ペプチド塩を５〜１０
％重炭酸アンモニウムに溶解し、得られた溶液を１５〜
２５℃にて一夜放置し、次いで凍結乾燥により該ペプチ
ドを回収することで達成される。いくつかの場合におい
て、特にペプチド鎖の組立て中メチオニンがそのスリホ
キシドとして保護されている場合、該ペプチド混合物を
再度還元剤で処理して、あらゆる残留メチオニンスルホ
キシドをメチオニンに戻すことが有利である。この目的
のために文献中に多くの試薬が記載されているが、（例
えばＤＴＴ（ジチオスレイトール）およびＤＴＥ（ジチ
オエリスリトール）、ＭＭＡ（Ｎ−メチルカプトアセタ
ミド）が好ましい。この還元は典型的には、１〜５ｍｇ
／ｍｌの約１０％ｗ／ｖＭＭＡ溶液中のペプチドを１０
〜３０％酢酸中でインキュベート（１２〜４８時間、２
０〜４０℃にて窒素雰囲気下で行う）することにより実
施され、これはＡ．クリエル（Ｃｕｌｕｅｌｌ）の“Ｎ
−メチルメルカプトアセタミド（ＭＭＡ）を用いるペプ
チド中のメチオニンスルホキシドの還元（Ｒｅｄｕｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｓｕｌｆｏｘｉ
ｄｅ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｎ−ｍｅ
ｔｈｙｌｍｅｒｃａｐｔｏａｃｅｔａｍｉｄｅ），”ア
プライドバイオシステムズ、ペプチドシンセサイザユー
ザーブレタン（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ Ｕｓｅｒ
Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）Ｎｏ．１７、（１９８７）、カリ
ホルニア州、フォスターシティー法によって行う。この
還元はＨＰＬＣにより監視でき、還元が完了した際に該
インキュベーションは停止される。メチオニンスルホキ
シドのメチオニンへの還元は不要である。というのは、
本発明者等はこのようなメチオニンスルホキシド含有ペ
プチドが植物病原体に対し活性をもつことを明らかにし
たからである。しかし、単位重量当たり高い活性をもつ
ペプチドはこの還元法を実施することにより得ることが
できる。ペプチドをＭＭＡで処理した場合、過剰のＭＭ
Ａおよび関連する副生物を、５〜３０％酢酸に溶した該
ペプチド混合物の溶液をセファデックスＧ−２５カラム
（ニュージャージー州、ピスカタウェイのファルマーシ
アＬＫＢバイオテクノロジー社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）に通す
ことにより除去し、かつ流出液を２５４ｎｍで監視す
る。ペプチド含有画分を併合し、凍結乾燥により乾燥す
る。単位重量当たり最大の活性をもつペプチドは、これ
らを更にＨＰＬＣで精製することにより得られる。典型
的には、１〜２ｍｌの０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢
酸）中に溶解した該ペプチドを２．２×２５ｃｍ、１０
μ、３００Åビダック（Ｖｙｄａｃ）（マサーチュセッ
ツ、サウスボロのネストグループ（ＮｅｓｔＧｒｏｕ
ｐ））Ｃ−４カラムに注入し、０．１％ＴＦＡ含有アセ
トニトリル−水の種々の勾配で溶出する逆相ＨＰＬＣに
より精製される。このようにして得られるペプチドはＮ
−末端、リジン、アルギニン、ヒスチジンおよびオルニ
チントリフルオロ酢酸塩であり、これらは一般に２１５
ｎｍにおけるＨＰＬＣ積分によれば純度９５％以上であ
る。該ペプチド画分の解析的ＨＰＬＣは以下の如き溶出
条件、即ち３０分に亘るＡ中に０〜６０％のＢを含むよ
うな線形勾配の下で、流量１．０ｍｌ／ｍｉｎを利用し
た、０．４６×２５ｃｍ、１０μ、３００Å、ビグック
Ｃ−４カラム上で、２１５ｍｍにおけるＵＶ吸収により
監視しつつ行われ、ここで溶媒Ａは０．１％ＴＦＡ水性
溶液であり、溶媒Ｂは０．０８％ＴＦＡのアセトニトリ
ル溶液である。殆どの場合、ペプチドの構造はアミノ酸
分析または質量スペクトル分析で確認した。ペプチドの
アミノ酸分析は、イオン交換カラム（例えば、ベックマ
ンスフェロゲル（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｐｈｅｒｏｇｅ
ｌ）ＡＡ−Ｌｉカチオン交換カラムで１００℃にて２４
時間６Ｎ塩酸で加水分解した後、ベックマンシステムゴ
ールドアミノ酸アナライザ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔ
ｅｎ Ｇｏｌｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｙｚ
ｅｒ）（ベックマンインスツルメンツ社、カリホルニ
ア、フラートン）を用い、ニンヒドリン検出を利用した
ＨＰＬＣにより行われた。アミノ酸分析も、イムノ−ダ
イナミックスにより行われ、これはウォーターズアッソ
シェーツピコータグシステム〔Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏ
ｃｉａｔｅｓＰｉｃｏ−Ｔａｇ Ｓｙｓｔｅｍ，（ミリ
ポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ），マサーチュセッツ、ベッドフォード）〕上でアミ
ノ酸をＰＴＣ（フェニルチオカルバミル）誘導体として
検出された。このペプチドのアミノ酸分析は、またＦ．
ウェスタル（Ｗｅｓｔａｌｌ）等の“ペプチドの１５分
酸加水分解（Ｆｉｆｔｅｅｎ Ｍｉｍｕｔｅｓ Ａｃｉ
ｄＨｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ），”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９７４、６
１、ｐｐ．６１０−６１３に記載の方法に従ってペプチ
ド−樹脂を使用して得た。これらの場合において、該ペ
プチド−樹脂は塩酸単独の代りに１：１塩酸／プロピオ
ン酸により加水分解される。生成する混合物は２〜４容
の洗浄用の水を使用して０．４５μのナイロンフィルタ
を介して濾過し、濾液を凍結乾燥し、残渣を上記の如く
分析した。該ペプチドのＦＡＢ−ＭＳ（高速原子衝突−
マススペクトル（ｆａｓｔ ａｔｏｍ ｂｏｎｂａｒｄ
ｍｅｎｔ−ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ））か
らのスペクトルは、高エネルギーイオン生成にキセノン
を用い、８ＫＶおよび４０μＡの電流で動作するイオン
テック（Ｉｏｎ Ｔｅｃｋ）ＢＬＬＮＦサドルドフィー
ルドガン（ｓａｄｄｌｅｄ ｆｉｅｌｄ ｇｕｎ）を備
えたクラトス（Ｋｒａｔｏｓ）ＭＳ５０ＲＦマススペク
トロメータを用いて得た。スペクトルは該ペプチドの４
ｍＭ溶液１μｌと４０ｍＭ蓚酸中の９０％グリセリン１
μｌとをサンプルプローブの銅ターゲット上で混合する
ことにより調製した溶液から得た。この装置はヨウ化セ
シウムで校正し、質量範囲約５００原子質量単位から予
想される質量の上下に走査当たり５〜１０秒の速度で走
査させた。また、データはＤＳ９０データシステムとし
て得られるマルチチャンネルアナライザプログラムを用
いて集め（Ｍ＋Ｈ）＋フラグメントを得た。オリゴペプチドの化学的合成 ブリッジを含んでいようがいまいが、１４０アミノ酸ま
での長さの本発明に記載した型のオリゴペプチドの化学
合成は、上でｔ−Ｂｏｃ側鎖保護法について記載した方
法（クラークールイス（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ）等
“造血細胞用のタンパク成長因子、インターロイキン−
３の自動化学合成（ＡｕｔｏｍａｔｅｄＣｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｈｅｍｏｐｏｉ
ｅｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−
３），”Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８６、２３１、ｐｐ．１
３４−１３９）を利用して達成できる。しかし、これら
の方法は７５アミノ酸までの長さのオリゴペプチドの合
成について好ましく、また６０アミノ酸までの長さのオ
リゴペプチドの合成により好ましい。ペプチドの合成の
ための“セグメント縮合（ｓｅｇｍｅｎｔ ｃｏｎｄｅ
ｎｓａｔｉｏｎ）”法〔Ｅ．Ｔ．カイザー（Ｋａｉｓｅ
ｒ）等、“セグメント合成縮合によるペプチドおよびタ
ンパクの合成（Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉ
ｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ Ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ），”Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ，１９８９、２４３、ｐｐ．１８７−１９
２〕も６０〜７５アミノ酸の長さのオリゴペプチドの好
ましい合成法であるが、７６〜１０４アミノ酸の長さの
オリゴペプチドの合成にとってより好ましい。ペプチド
合成のための“酸素的半合成（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓ
ｅｍｉｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）”法も、６０〜約１２０ア
ミノ酸の長さのオリゴペプチド合成用の好ましいもう一
つの方法である。例えば、Ｖ．デフィリッピス（ＤｅＦ
ｉｌｉｐｉｓ）等、サーモリシンのカルボキシ−末端フ
ラグメントの半合成（Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏ
ｆ Ｃａｒｂｏｘｙ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｆｒａｇｍｅ
ｎｔ ｏｆ Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ），”プロシーデ
ィングズオブザエレブンスアメリカンペプチドシンポジ
ウム（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｌｅ
ｖｅｎｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙ
ｍｐｏｓｉｕｍ），ペプチド：化学、構造および生物学
（Ｐｅｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ），（Ｊ．Ｅ．リバー
（Ｒｅｖｅｒ）等），１９９０、ｐｐ．１０５１−１０
５３、エスコム（ＥＳＣＯＭ）刊、ライデン、ネザーラ
ンド；Ｃ．Ｊ．Ａ．ワーローン（Ｗａｌｌｏｎｅ）等、
“酵素的に活性化したフラグメントの縮合によるチトク
ロームの欠損ミュータントの半合成（Ｓｅｍｉｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｍｕｔａｎ
ｔ ｏｆ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｂｙＣｏｎｄｅｎｓ
ａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ Ａｃ
ｔｉｖａｔｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ），ｉｂｉｄｓ，
（Ｇ．Ｒ．マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）），１９８
８、ｐｐ．３７２−３７５；Ｊ．バンビンスバーゲン
（ｖａｎ Ｂｉｎｓｂｅｒｇｅｎ）等、”合成ペプチド
のトリプシン−触媒カップリング：高収率でのホスホリ
パーゼＡ２ミュータントの半合成生産（Ｔｒｙｐｓｉｎ
−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ Ｓｙ
ｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｓｅｍｉｓｙｎｔ
ｈｅｔｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆＰｈｏｓｐｈ
ｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ Ｍｕｔａｎｔｓ ｉｎ Ｈｉｇ
ｈ Ｙｉｅｌｄ），”ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３８１−３８
２を参照のこと。これら方法の組合せの改良もより長鎖
のオリゴペプチドの合成に利用できる。かくして、７５
アミノ酸までの長さのオリゴペプチドのセグメントは上
記のように調製でき、次いで周期的にもしくはブロック
として、溶媒、例えばＮＭＰ、ＤＭＦまたはＤＭＳＯ中
でカップリング剤としてジフェニルホスホリルアジドを
用いて相互に結合できる〔Ｔ．シオリ（Ｓｈｉｏｒｉ）
等、“ジフェニルホスホリルアミド。改良クルチウム反
応およびペプチド合成用の新規な便利な試薬（Ｄｉｐｈ
ｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ Ａｚｉｄｅ．Ａ Ｎｅ
ｗ Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ｆｏｒ
ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｕｒｔｉｕｓ Ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ ａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ），”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，
１９７２、９４、ｐｐ．６２０３−６２０５〕。縮合後
に除去することのできるＡｒｇ（ＮＯ２）およびＬｙｓ
（ＴＦＡ）の使用が、この方法では好ましい。単一のペ
プチドモノマーのマルチマーは同様な方法で調製できる
〔Ｈ．Ｒ．バッタチャルジー（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊ
ｅｅ）等“Ｌ−ドーパ残基を含む生体接合性類似ポリペ
プチド：合成、重合および接合性（Ｂｉｏａｄｈｅｓｉ
ｖｅ Ａｎａｌｏｇｕｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ
Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｌ−Ｄｏｐａ Ｒｅｓｉｄｕｅ
ｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅ
ｓ），”Ｐｏｌｙｍ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．，
１９８０、５９、ｐｐ．１１０−１１４〕。オリゴマー
化度は使用するジフェニルホスホロアジドの量、または
反応時間により制御できる。より高分子量のオリゴペプ
チドは水性溶媒に殆ど不溶であって、ＨＰＬＣで精製で
きないので、カラムクロマトグラフィーで精製するか、
あるいは混合物として直接使用する。ジスルフィド結合オリゴペプチドの化学合成 Ｃｙｓ含有ＡＭＰＰＰ、逆ペプチドおよびオリゴペプチ
ドは、前の節で議論した同一のサイズ限界でここに記載
した方法により合成できる。次いで、システインを選択
的に酸化してジスルフィドブリッジ含有システインとす
る。この際、Ｒ．Ｓ．ホッジズ（Ｈｏｄｇｅｓ）等の
“モデル合成ペプチドを用いたペプチド設計（Ｐｅｐｔ
ｉｄｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｄｅｌ Ｓｙ
ｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ），”Ｐｅｐｔｉｄ
ｅ Ｒｅｓ．，１９８８、１、ｐｐ．１９−３０に記載
の方法を利用する。典型的には、システイン含有ペプチ
ドの溶液をリン酸緩衝液（ｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ
７）（触媒量（０．００１〜２５％、好ましくは１．０
％）の銅（四塩、例えば塩化第二銅（０．００１〜０．
５Ｍ、好ましくは０．０５Ｍの燐酸モノナトリウム、１
０−５〜１０−４Ｍの塩化第二銅、０．０１〜１Ｍの、
好ましくは０．５ＭのＮａＣｌを含む）中で、室温にて
一夜攪拌する。次いで生成するオリゴペプチドを精製す
る。ＡＭＰＰＰの遺伝子的合成および精製 前に述べた如く、本発明によるＡＭＰＰＰ含有ペプチ
ド、逆ペプチドブリッジのあるもの、フラグメントおよ
びオリゴペプチドは、また宿主細胞中に適当な調節シグ
ナル例えば遺伝子配列に付加された遺伝子プロモータお
よび遺伝子ターミネータ配列をもつ１種以上のペプチド
をコードするデオキシリボヌクレオチドまたはＤＮＡ遺
伝子配列を挿入し、タンパク合成の生物的過程を通して
宿主細胞中でこれらペプチドをコードする遺伝子配列を
発現させることによっても調製し得る。この方法に用い
る宿主細胞は原核細胞（例えば、バクテリア細胞）また
は真核細胞（例えば、植物または動物細胞）起源のいず
れであってもよい。大規模生産のために、バクテリアま
たは酵母などの微生物宿主がこれら生物の発酵過程の進
歩状態のために使用できる。また、他の遺伝子発現系を
これらペプチドの製造のために使用でき、これは例えば
真菌（例えば、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒ
ａ）、培養ヒト細胞または昆虫細胞を含む。また、ＡＭ
ＰＰＰ含有ペプチドおよび特に本発明に記載したオリゴ
ペプチドの遺伝子工学的合成は特に有用である。既に述
べたように、あらゆるブリッジ含有分子を除き、約２〜
約１６ペプチドサブユニットを含むオリゴペプチドの製
造にしばしば有用である。一般に、本発明で明らかにし
たように、大きなオリゴペプチドの固層を基礎とする繰
返し化学合成には技術的な限界があり、単一の合成では
約１４０アミノ酸が実際上の限界である。前に述べたよ
うに、このサイズまでの化学的５誘導されたペプチドを
更に重合する化学的手段があるが、これらの化学的手段
はこのようにして重合されるペプチドサブユニットの組
成および数の正確な制御性に欠ける。従って、反復的化
学合成によって可能となる以上に長いオリゴペプチドを
生成する必要性があるが、多くの重合生成物は余りに大
きすぎるか、あるいは不適当なサイズであって、植物病
源体に対し有効であり得ない。更に、本発明により例示
される抗生物ペプチドは数１０、数１００あるいは数千
もの長いアミノ酸残基の架橋をもつペプチドを配合で
き、また遺伝子技術が規定されたサイズおよび組成の極
めて長いオリゴペプチド並びにオリゴペプチドの合成に
極めて適しているので、オリゴペプチドおよびモノマー
型抗生物ペプチドの生物学的製造が、本発明の範囲内で
有用な多量の抗生物ペプチドを得る手段として好まし
い。正確に規定された組成の大きなオリゴペプチドをコ
ードする完全合成遺伝子製造における進展した技術およ
び様々な生物学的機構によりかかるオリゴペプチドを安
価に製造する手段における技術的進歩は、抗生物ペプチ
ドの生物学的生産が未来におけるおよび低価値の作物種
におけるＡＭＰＰＰの生産などといったいくつかの例に
おけるより好ましい生産手段となり、また経済的に実施
し得る唯一の利用可能な方法であり得る。ＡＭＰＰＰを
コードする遺伝子は、例えば完全に化学的な合成手段で
調製でき、あるいはペプチドをコードする天然配列由来
の配列の一部または全部を含むことも可能である。完全
にデオキシリボヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチ
ドの化学的合成は溶液化学の応用を通して達成でき、あ
るいは好ましくは固体担体上で実施できる。オリゴヌク
レオチドのいくつかの合成化学が工夫されており、ホス
ホトリエステル、ホスファイト−トリエステルおよびホ
スホアミダイトケミストリーを含む。Ｍ．Ｈ．カルター
ズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ），“デオキシオリゴヌクレオ
チドの新規な化学的合成法（Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｆｏｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉ
ｎｇ Ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓ），”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮ
Ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，（Ｓ．Ｍ．ワイズマン（Ｗ
ｅｉｚｓｍａｎ）編、プラエガーパブリッシング社（Ｐ
ｒａｅｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），ＮＹ，１９８
３、ｐｐ．１−２２およびＫ．イタクラ（Ｉｔａｋｕｒ
ａ）等の“合成オリゴヌクレオチドの合成および利用
（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ ｓｙｎ
ｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓ），”Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８４、
５３、ｐｐ．３２３−３５６参照。Ｎ，Ｎ−ジメチルア
ミノホスホラミダイトまたはβ−シアノエチルジイソプ
ロピルアミノホスホラミダイトまたはデオキシリボヌク
レオシドモルホリノ−メトキシホスフィンを含むような
ホスホラミダイト合成化学が好ましい。というのは、成
長中のオリゴヌクレオチド鎖へのヌクレオチドのカップ
リング効率がよく、しかも使用する化学試薬の安定性が
よいからである。最も好ましいホスホラミダイト化学は
β−ジアノエチル−ジイソプロピルアミノ−ホスホラミ
ダイトを使用するものである。というのは、、匹敵する
中間体と比較して高い安定性をもち、またチオフェノー
ルなどの有害な試薬を使用しないからである。Ｓ．Ｌ．
ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）およびＭ．Ｈ．カル
ターズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ），“デオキシヌクレオシ
ドホスホラミダイト−デオキシポリヌクレオチド合成用
の新しい組のキー中間体（Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉ
ｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ−ａｎｅｗ
ｃｌａｓｓ ｏｆ ｋｅｙ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ
ｓ ｆｏｒｄｅｏｘｙｐｏｌｙｎｕｃｌｏｔｉｄｅ ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ），”Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅ
ｔｔ．，１９８１、２２、ｐｐ．１８５９−１８６２；
Ｌ．Ｔ．マクブライド（ＭｃＢｒｉｄｅ）およびＭ．
Ｈ．カルターズ、“デオキシオリゴヌクレオチドの合成
に有用ないくつかのデオキシヌクレオチドホスホラミダ
イトの研究（Ａｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ
ｓｅｖｅｒａｌ ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｔｅｓ ｕｓｅｆｕｌｆｏｒ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕ
ｃｌｅｏｔｉｄｅｓ），”ｉｂｉｄ．，１９８４、２
４、ｐｐ．２４５−２４８；Ｔ．ドルパー（Ｄｏｒｐｅ
ｒ）およびＥ．Ｌ．ウィナッカー（Ｗｅｎｕａｃｋｅ
ｒ），”オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成用のホ
スホラミダイト法の改良（Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ
ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｍｉｄｉｔｅ ｐｒ
ｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｅｌｅｏ
ｔｉｄｅｓ），”Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９
８３、１１、ｐｐ．２５７５−２５８４；およびＳ．
Ｐ．アダムズ（Ａｄａｍｓ）等、“２種のＤＮＡ５１−
マーの合成におけるヒンダードジアルキルアミノヌクレ
オシドホスファイト試薬（Ｈｉｎｄｅｒｅｄ ｄｉａｌ
ｋｙｌａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｓ ｐｈｏｓｐｈ
ｉｔｅ ｒｅａｇｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ ｏｆ ｔｗｏ ＤＮＡ ５１−ｍｅｒｓ），”
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．，１９８３、１０５、ｐ
ｐ．６６１−６６３参照。簡単にいえば、固体担体上の
ホスホラミダイト化学は固体材料、例えばガラス、シリ
カゲル、ポリアクリルアミド、セルロース、ポリスチレ
ン、ニトロセルロースおよびいくつかの他の一般に化学
的に不活性な材料に変性ヌクレオチドを付加することか
らなる。該ヌクレオチド塩基中のヌクレオチドホスフェ
ート基、およびあらゆる環外窒素原子は化学基で該担体
上で保護されており、その結果該オリゴヌクレオチド鎖
の線形延長中の望ましからぬ副反応が阻止される。この
ような付加は種々のリンカーまたはスペーサ部分を介し
て行うことができるが、好ましいリンカーは一般に長鎖
アルキルアミンである。これについてはＭ．Ｄ．マトゥ
シ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）およびＭ．Ｈ．カルターズの
Ｕ．Ｓ．Ｐ．４，４５８，０６６を参照のこと。付加さ
れたヌクレオチドは５′−糖位置において酸置換活性ジ
メトキシトリチル化学基で保護され、この基を例えばベ
ンゼンスルホン酸、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸
で除去して、カップリング用の遊離５′−ＯＨ基とし、
かくして追加のヌクレオチドの結合を開始する。この脱
保護または活性化工程で使用することが好ましい酸はジ
クロロ酢酸またはトリクロロ酢酸である。次いで、固体
担体に付加されたヌクレオチドと同様に保護されたホス
ホラミダイトモノマーヌクレオシドを弱酸の存在下で添
加して該５′−ＯＨ基の該ホスホラミダイト試薬への求
核攻撃を促進する。このカップリング工程にとって好ま
しい弱酸はテトラゾール、アミン塩酸塩および３−ニト
ロトリアゾールである。最も好ましい弱酸はテトラゾー
ルである。次に、該担体上のカップリングしなかったサ
イトを遊離ヒドロキシル基の無水酢酸でアシル化して遮
断または封止する。この遮断工程で好ましい補助試薬は
１−メチルイミダゾールである。天然のヌクレオチド間
ホスフェートジエステル結合は後に、該固体担体上で成
長しつつあるヌクレオチド鎖を柔和な酸化混合物で処理
することにより、各ヌクレオチド添加サイクルにおいて
発生する。この酸化工程はリン（ＩＩＩ）をより安定な
リン（Ｖ）酸化状態に転化し、かつあらゆる後の脱保護
工程または活性化処理において、酸種例えばジクロロ酢
酸またはトリクロロ酢酸によるヌクレオチド鎖の切断を
防止する。ヨウ素は酸素ドナーとしての水と共に酸化種
として使用される。好ましい補助試薬はテトラヒドロフ
ランおよびルチジンを包含する。該固体担体の無水アセ
トニトリルによる洗浄後、脱保護／カップリング／酸化
／遮断サイクルを必要な回数繰返して選択されたオリゴ
ヌクレオチドまたは複数のオリゴヌクレオチドを調製で
き、各時点において、適当な保護β−シアノエチルホス
ホラミダイトヌクレオシドを用いて、プリンまたはピリ
ミジン塩基を担持する選ばれたヌクレオチドを挿入す
る。このプリン塩基は、好ましくは該挿入されたヌクレ
オチド上のアデニンまたはグアニンであり、また該ピリ
ミジン塩基は好ましくはシトシンまたはチミンである。
オリゴヌクレオチドの化学合成の簡略さは研究室作業の
ための実際の案内の進展並びに市販の自動化されたＤＮ
Ａ合成装置の一般的利用へと導く。Ｍ．Ｈ．カルター
ズ、“遺伝子合成装置：ＤＮＡ化学およびその利用（Ｇ
ｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｍａｃｈｉｎｅｓ：ＤＮ
Ａ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ
ｓ），”Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５、２３０、ｐｐ．２
８１−２８５；およびＪ．Ｗ．エフカビッチ（Ｅｆｃａ
ｖｉｔｃｈ），“オリゴデオキシリボヌクレオチドの最
適化化学合成用の自動システム（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ
ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｎｉｚｅｄ
ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉ
ｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ），”
マクロモレキュラーシーケンシングアンドシンセシス、
セレクテッドメソッズアンドアプリケーションズ（Ｍａ
ｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａ
ｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）〔アラ
ン（Ａｌａｎ）Ｒ．リス（Ｌｉｓｓ）社、ＮＹ〕、１９
８８、ｐｐ．２２１−２３４参照。市販の装置はいくつ
かの製造もと、例えばデュポン社（ＤｕＰｏｎｔ Ｃｏ
ｍｐａｎｙ）（デラウェア、ウイルミントン）、ミリゲ
ン／バイオサーチ社（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａ
ｒｃｈ，Ｉｎｃ．（カリホルニア、サンラファエル）お
よびアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カリホルニア、フォスタシティ
ー）から入手できる。本発明で使用する装置はバイオサ
ーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）８７００またはアプライド
バイオシステムズの３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥＤＮＡ合成
装置であった。これら装置の動作および該装置と共に使
用するβ−シアノエチルホスホラミダイト化学サイクル
の詳細はバイオサーチ社のモデル８６００／８７００指
示マニュアルまたは該ＰＣＲ−ＭＡＴＥモデル３９１Ｄ
ＮＡ合成装置ユーザーズマニュアル（アプライドバイオ
システムズパートＮｏ．９００９３６、バージョン１．
００、レビジョンＡ、１９８５年５月）に記載されてい
る。オリゴヌクレオチドの最後のカップリングサイクル
は、５’末端ジメトキシトリチル基を残して又は離して
完結することができる。好ましくは、ジメトキシトリチ
ル基は、続いての完全な長さのオリゴヌクレオチドの精
製に便利であるため、残される。完成され、保護された
オリゴヌクレオチドは精製の前に脱保護し、固体の支持
体から開裂しなければならない。完成したオリゴヌクレ
オチドを有する固体支持体は、支持体樹脂からオリゴヌ
クレオチドを開裂するために、少なくとも１時間、新し
い濃水酸化アンモニウムで室温で処理される。その後、
固体支持体をより多い濃水酸化アンモニウムで洗浄し、
合わせた濃水酸化アンモニウムを、保護された塩基から
保護化学官能基を除去するために、シールされたバイア
ル中で、５５〜６０℃で少なくとも８時間インキュベー
トする。その後、サンプルを冷却し、減圧下で蒸発乾固
する。サンプルは、新しい濃水酸化アンモニウム又は少
なくとも９５容量％純度のエタノールから再蒸発させて
もよい。その後、最終的なサンプルは、凍結（乾燥）状
態で貯蔵することもでき、または滅菌蒸留水に再懸濁し
た後−２０℃で貯蔵することもできる。ＰＣＲ−Ｍａｔ
ｅ Ｍｏｄｅｌ ３９１ ｕｓｅｒ’ｓ ｍａｎｕａ
ｌ，ｓｕｐｒａ，ａｎｄ Ｍ．Ｈ．Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ
ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓｏｆ Ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓ ｂｙ ｔｈｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ
Ｍｅｔｈｏｄ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ １５４、（１９８７）、２８７−３１３参
照。上記の好ましい選択から引用される方法により製造
された任意の開裂された及び脱保護されたオリゴヌクレ
オチドは、当該技術分野で公知の１又はそれ以上のいく
つかの方法により精製されうる。これらの精製技術に
は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、高性能液体クロ
マトグラフィー及び疎水的相互作用クロマトグラフィー
が含まれるが、これらに限定されるものではない。その
ような好ましい方法の一つは、直立した１２％ポリアク
リルアミドスラブゲルによる、２０×４０×０．０８ｃ
ｍ、７Ｍ尿素、９０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、
９０ｍＭボレート、１−２ｍＭエチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）二ナトリウム中の、５’末端にジメトキシ
トリチル部分を欠くオリゴヌクレオチドのポリアクリル
アミドゲル電気泳動精製である。精製されるべき各オリ
ゴヌクレオチドの部分（０．３−３．０Ａ２６０単位）
は、減圧下で蒸発乾固され、少なくとも０．０１％のブ
ロモフェノールブルー及び少なくとも０．０１％のキシ
レンシアノールを含むホルムアミド：１ｍＭのＥＤＴＡ
二ナトリウム（９より大きい：１）中に再懸濁され、沸
騰水浴中で２〜３分間加熱され、氷スラリー中に即時に
置かれ、そして個々のウェル（幅が少なくとも６ｍｍ）
に置かれる。サンプルは、８０〜９０Ｗで、陽極に向か
って、ブロモフェノールブルーが少なくともポリアクリ
ルアミドゲルの２／３の位置に移動するまで電気泳動に
かけられる。その後、全長のオリゴヌクレオチドを、該
ポリアクリルアミドゲルを、一片のサランラップのよう
な柔軟な透明プラスチックラップに置き、これを、蛍光
インディケーター化合物を含む薄層クロマトグラフィー
板（例えばＳｉｌｉｃａ Ｇｅｌ Ｆ−２５４；Ｆｉｓ
ｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｉ
ｔｔｓ ｂｕｒｇｈ，ＰＡ）の最上部におき、該ポリア
クリルアミドゲルを短波長の紫外線照射下で調べること
により、可視化する。その後、全長バンド材料をポリア
クリルアミドゲル中で切り出し、種々の方法、例えば緩
衝液中のエレクトロエルーション又は単純な拡散により
ゲルから精製することができる。好ましい抽出方法は、
０．５ｍｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．５への
振盪しながらの拡散、及び続いてのフェノール：クロロ
ホルム（１；１，ｖ：ｖ）による抽出及びエタノール沈
殿である。その後、沈殿したオリゴヌクレオチドを適当
な容量（通常１０〜１０００μｌ）の適当な緩衝液、例
えば１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭの
ＥＤＴＡ二ナトリウムに、又は滅菌蒸留水に再懸濁し、
−２０℃で貯蔵することができる。“Ｐｕｒｉｆｉｃａ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ｕｓｉｎｇ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｐｏｌｙａｃｒｉ
ｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓ
ｉｓ”ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａ
ｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，（１９８９）
のユニット２．２１参照。さらに好ましい別の精製方法
であって、５’末端にジメトキシトリチル部分を有する
オリゴヌクレオチドの精製に非常に適するものは、逆相
ＨＰＬＣカラム上での高性能液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）である。そのような逆相ＨＰＬＣカラムに
は、種々のシリカ又は下記のような多くの業者から購入
しうる樹脂をベースとするポリマーを詰めることができ
る：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒ
ｄ，ＭＡ），Ｔｈｅ Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ（Ｓｏｕｔ
ｈｂｏｒｏ，ＭＡ），Ｒａｉｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ
ｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｂｕｒｎ，Ｍ
Ａ），Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｉｎｃ．（Ｐｈｉｌｌｉｐ
ｓｂｕｒｇ，ＮＪ），Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｓ Ｉｎｃ．（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ），又は
Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒ
ｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）。オリゴヌクレオチドは、載置
され、分画され、そして前記ＨＰＬＣカラムから例えば
いくつかの適当な非破壊（ｎｏｎ−ｄｅｓｔｒｕｃｔｉ
ｖｅ）緩衝液のいずれか中のアセトニトリル勾配により
溶離される。好ましいアセトニトリル勾配は、０．１Ｍ
のトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ７．０緩衝
液中、５％〜４０％の範囲、好ましくは５〜３０％の範
囲である。好ましくは逆相ＨＰＬＣカラムは、これに結
合した直鎖アルキル部分、例えば炭素原子数４、炭素原
子数８又は炭素原子数１８のアルキル鎖を含む。その
後、精製された全長オリゴヌクレオチドを含む適当なフ
ラクションを集め、減圧下で蒸発させ、３％（ｖ／ｖ）
の酢酸水溶液中に室温で１０〜３０分間で再懸濁させ
る。その後、脱トリチル化オリゴヌクレオチドをエタノ
ール沈殿させるか、又は他の適当な手段、例えばサイズ
排除クロマトグラフィーにより精製する。さもなけれ
ば、全長脱トリチル化オリゴヌクレオチドは、種々のタ
イプのカラム及び勾配材料を用いてＨＰＬＣにより精製
することもできる。Ｇ．Ｚｏｎ及びＪ．Ａ．Ｔｈｏｍｐ
ｓｏｎ，“Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｈｉｇｈ−ｐｅｒ
ｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇ
ｒａｐｈｙ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓ ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ，”ＢｉｏＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
１，（１９８６）、２２−３２参照。別のより好ましい
方法は、疎水的相互作用クロマトグラフィーによるオリ
ゴヌクレオチドの精製である。本発明の目的のためのこ
の精製技術は、常圧下で疎水樹脂による逆相クロマトグ
ラフィーの形態である。水酸化アンモニウム脱保護及び
開裂溶液中の粗生成物であるオリゴヌクレオチド混合物
は、適当な緩衝液、例えば１．０Ｍのトリエチルアンモ
ニウムアセテート、ｐＨ７．０中で平衡にした疎水性樹
脂に加えられる。その後、結合したオリゴヌクレオチド
を２％のトリフルオロ酢酸に１〜３分間暴露することに
より脱トリチル化され、その後、水中の１５〜４０％の
アセトニトリル中で回収される。その後、回収されたオ
リゴヌクレオチドは凍結乾燥され、上記のように適当な
緩衝液又は滅菌蒸留水中に再懸濁される。本発明の目的
である部分的又は完全な合成遺伝子を製造するのには、
１又はそれ以上の合成オリゴヌクレオチドが必要であろ
う。任意の適当なオリゴヌクレオチド及び／又は天然マ
ガイニン遺伝子のような天然遺伝子の部分もしくは全部
は、加熱、尿素もしくはホルムアミドのようなカオトロ
ピック剤との混合、又はアルカリ溶液への暴露のような
手段によるＤＮＡの変性により、１又はそれ以上のＡＭ
ＰＰＰをコードする遺伝子に集められうる。ホスフェー
ト部分は、所望により、それらを欠く任意のＤＮＡ又は
オリゴヌクレオチドに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
のような酵素を用いて酵素的に結合されうる。Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｒａ．のセクション３．１
０参照。本発明の範囲内の、追加の任意のＤＮＡの存在
下又は不存在下における遺伝子の製造において使用され
る任意のオリゴヌクレオチドは、その後、適当な手段、
例えば室温への徐冷又はカオトロピック剤を除去するた
めの透析により再結合又はアニーリングされる。これら
のアニーリングされたＤＮＡは、適当な酵素、例えばＴ
４ＤＮＡリガーゼで処理することにより共有結合されう
る。前記のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｓｕｐｒａ．
のセクション３．１４参照。必要な場合及び適当な場合
には、この手段により製造されたペプチドをコードする
遺伝子生成物を、製造者の仕様書による制限エンドヌク
レアーゼで処理することにより、又は当該技術分野で知
られた方法により、遺伝子調節ＤＮＡ配列に加えるため
に、製造することもできる。前記のＴ．Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，ｐｐ．１０４−１０６参照。上記の方法は、本発明
による大部分の又は全ての抗菌性ペプチド、例えばＲＡ
ＭＰＰ又はＲＡＭＰＰＰ及びオリゴペプチドをコードす
る遺伝子の製造のためにしうる。ペプチド及びオリゴペ
プチドをコードする遺伝子を製造するための別の方法を
使用することもできる。この方法には、個々のペプチド
サブユニット又は個々のサブユニットの群をコードする
アニーリングされたＤＮＡ、例えばブリッジ分子（ｂｒ
ｉｄｇｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）をコードする遺伝
子セグメントを製造することが含まれるであろう。関連
する個々のアニーリングされたＤＮＡの全てを結合する
ことから製造されうるコンポジット遺伝子がインターラ
プションなしに所望のペプチドをコードするかぎり、少
なくとも二つあるアニーリングされたＤＮＡは、各々よ
り小さいペプチドサブユニットの部分をコードすること
も可能である。アニーリングされたＤＮＡの末端は、異
なるＤＮＡ配列の末端の間のオーバーラッピングする相
補的な短いＤＮＡ配列の結合を可能にするように選択さ
れる。より後の工程で、適当なＤＮＡはアニーニングさ
れ、連結されて、ペプチド又はオリゴペプチドをコード
するより大きな遺伝子を形成する場合には、これらの結
合部位は、少なくとも一つのペプチドサブユニットのコ
ード領域を次のペプチドサブユニット又は関連するブリ
ッジング分子にインターラプションなしに維持する。例
えばオリゴペプチドをコードするより大きな遺伝子の種
々の部分をコードする二つ以上のＤＮＡセグメントは、
所望の最終的なオリゴペプチドのサイズ及び組成に依存
して、適当なＤＮＡコード配列を維持するような付着が
考慮されうる。より小さなＤＮＡセグメント上のオーバ
ーラッピング及び相補的末端の領域は、偶然起こる望ま
しくない二つ以上のＤＮＡセグメントの結合を妨げるよ
うに同等でないように選択されうる。これらのオーバー
ラッピング末端は、プリカーサーであるアニーリングさ
れたＤＮＡを、上記の遺伝子調節ＤＮＡ配列に追加され
るＤＮＡの製造において記載した制限エンドヌクレアー
ゼにより処理した生成物と同等でも同等でなくてもよ
い。本発明の範囲内のより大きなオリゴペプチドをコー
ドするより大きなＤＮＡ断片に結合される予定の上記の
アニーリングされたＤＮＡ断片は、いくつかの手段、例
えば変性方法の逆転の前の加熱又はアルカリ溶液への暴
露により穏やかにアニーリングすることにより結合され
うる。アニーリング工程は、好ましくは、工程中に実質
的に個々のアニーリングされたＤＮＡを変性しない。ア
ニーリングされたＤＮＡは、その後、適当な酵素、例え
ばＴ４ＤＮＡリガーゼで処理することにより共有結合さ
れうる。適当なＤＮＡセグメントは、同時に又はブロッ
クで互いに結合され、続いて少なくとも一つの追加の結
合工程が起こり、より大きなオリゴペプチドをコードす
る最終的なＤＮＡ断片が形成される。最終的なＤＮＡフ
ラグメントを得る前に、ＤＮＡセグメント結合のための
追加のサイクル又は工程が必要とされる場合は、連結の
中間段階で得られる結合されたＤＮＡセグメントは、標
準的な手段、例えばゲル電気泳動による精製、サイズ排
除クロマトグラフィー及び／又はエタノール沈殿により
精製されるべきである。前記のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ，ｓｕｐｒａ．の第２章参照。その後、より大きな
オリゴペプチドをコードする最終的なＤＮＡフラグメン
トに、上記の遺伝子調節ＤＮＡ配列を付加することもで
きる。定められた宿主細胞においてタンパク質として発
現することができるようにするために、ペプチドをコー
ドする遺伝子に付加される遺伝子調節シグナルは、宿主
細胞の生物機構により認識され、宿主細胞内のＤＮＡポ
リメラーゼによりＤＮＡ配列のメッセンジャーＲＮＡ配
列（ｍＲＮＡ）への転写を誘導するＤＮＡ配列である、
遺伝子プロモーター配列を含みうる。その後、このｍＲ
ＮＡは、宿主細胞内のリボソーム上でタンパク質生成物
に翻訳されることができなければならない。遺伝子プロ
モーター配列は、上記の転写及び翻訳の理論に適合する
限り、一部又は全部が、宿主細胞のものとは似ていない
細胞に見出されるプロモーター配列から誘導されうる。
例えば、グラム陽性菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂ
ｔｉｌｉｓからの増殖遺伝子（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ
ｇｅｎｅ）プロモーター配列は、グラム陰性菌であるＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるペプチド遺伝
子の発現に満足なものでありうる。１以上のＡＭＰＰＰ
の発現のためのＡＭＰＰＰ遺伝子に追加されうる第二の
遺伝子調節因子は、遺伝子ターミネーター又はポリアデ
ニル化配列である。このＤＮＡ配列は、さらに転写する
ことを阻害し及び停止させ、真核細胞の場合には１以上
のアデノシンヌクレオチドをｍＲＮＡの３’末端に直接
付加する情報を提供する遺伝情報を含む。遺伝子ターミ
ネーター配列は、宿主細胞のゲノム由来又は宿主細胞内
での転写を適当に終了させることが有効であることが知
られている非類似の細胞のゲノム由来のターミネーター
配列の一部又は全部を含む。そのような配列の例は、Ｓ
ａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｈｉｓ
ｏｐｅｒｏｎ ｒｈｏ−独立転写ターミネーター配列
でありうる（例えばＮ．Ｅ．Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａ
ｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ〔Ｆ．Ｃ．
Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｅｄ−ｉｎ−ｃｈｉｅｆ；Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ，１９８７〕、第２５章参照）又はＡｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔｉプ
ラスミド由来のオクトピンシンターゼターミネーター配
列（例えばＨ．ＤｅＧｒｅｖｅ等、“Ｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ Ｔｉ ｐｌａｓｍｉｄ−ｅｎ
ｃｏｄｅｄ ｏｃｔｏｐｉｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｇ
ｅｎｅ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１、
（１９８２）、４９９−５１１参照）。ペプチド発現遺
伝子又は遺伝子調節シグナルが付加された遺伝子は、好
ましくは、関連遺伝子によりコードされるＡＭＰＰＰを
含む１以上のペプチドを発現する目的のために原核生物
又は真核生物由来の宿主細胞に導入される。導入手段は
当該技術分野でよく記載されており、遺伝子発現が要求
されている宿主細胞のタイプに依存する。例えば、バク
テリア細胞の外部から供給されたＤＮＡ、例えばＥｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの細胞による形質転換は、
塩化カルシウム法により達成されうる。典型的には、遺
伝子調節シグナルが付加されたペプチド遺伝子は、形質
転換法の前に適当な形質転換ベクターに共有結合され
る。そのようなベクターは、Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ Ｓｕ
ｒｖｅｙ ｏｆ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ
Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ ｂｙ
Ｒ．Ｌ．Ｒｏｄｉｎｇｕｅｚ及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａ
ｒｄｔ（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ；１
９８８）に記載されている。Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ等、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｕｐｒａ，ｐ
ｐ．２４７−２５５。好適な宿主細胞中でこのような遺
伝子発現系で一旦発現されると、ペプチドは通常の手段
により抽出されてもよく、且つ／または精製されてもよ
く、部分的に精製された形態または実質的に精製された
形態で植物病原体に対して使用し得る。ペプチドを宿主
細胞から抽出する方法は、宿主細胞の熱及び／または酵
素による溶解、脂質溶媒または水性／有機ミセル溶液中
の可溶化、並びに宿主細胞をフレンチプレスにより押し
つけることによる細胞膜及び／または細胞壁の加圧断裂
を含む。宿主細胞としての細菌の場合に関する細胞溶解
に好ましい方法は、求められている生産の規模に依存す
る。大規模の生産に関して、細菌細胞の熱または加圧断
裂が好ましい。例えば、Ｈ．Ｈｅｌｌｅｂｕｓｔ，“Ｄ
ｉｆｆｅｒｅｎｔａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｓｔａ
ｂｉｌｉｚｅ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｕｓｉ
ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ７、（１９８９）、１６５−１６８を参照のこと。抽
出されたＡＭＰＰＰは、更に精製しないでそれらのその
ままの形態で使用されてもよく、またはサイズ排除クロ
マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、電気
泳動、アフィニティークロマトグラフィー等の如き方法
による細胞内容物の１回以上の分別の適用により部分的
または完全に精製されてもよい。その他の可能性は、ペ
プチドを暗号化するこれらの遺伝子を発現し、且つＡＭ
ＰＰＰをタンパク質生産物として発現するための宿主受
容体として全能植物細胞を使用することであり、それに
より植物細胞は稔性作物を再生し得る。この後の場合、
受容体植物は遺伝的に形質転換された植物またはトラン
スジェニック植物と称される。外来遺伝子を植物に導入
するのには、幾つかの既知の方法がある。選択の方法
は、主として、形質転換される作物の種類に依存する。
しかしながら、これらの方法の多くが本発明により使用
し得る。双子葉植物中へのＤＮＡの移入に特に有効であ
る一つの方法は、アグロバクテリウムの使用を伴う。こ
の方法では、関係する遺伝子（例えば、カリフラワーモ
ザイクウイルス３５Ｓ５’プロモーター領域及び３’Ｏ
ＣＳターミネーター領域を有するＡＭＰＰＰの遺伝子）
が選択遺伝子（例えば、トランスポゾンＴｎ５のネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）、
ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ等を暗
号化する遺伝子）で小さい組換えプラスミド中にスプラ
イシングされたＴ−ＤＮＡ領域の境界の間に挿入され
る。次いで組換えプラスミドが直接の形質転換または三
親交配によりアグロバクテリウム宿主に導入される。次
いで、関係する遺伝子を有するアグロバクテリウム株
が、細菌を２〜３日の期間にわたって植物飼料（例え
ば、葉盤）で同時培養することにより双子葉植物組織の
形質転換に使用される。形質転換された細胞は適当な薬
剤による選択により回収され、次いで植物が再生し得
る。Ｒ．Ｂ．Ｈｏｒｓｈら著、“Ａ Ｓｉｍｐｌｅ ａ
ｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｔｒａｎ
ｓｆｅｒｒｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔ
ｓ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７、１９８５、１２２９ １
２３１を参照のこと。植物細胞、特に更に扱い難い単子
葉作物の植物細胞の形質転換に使用されたその他の方法
は、化学的に誘導される移入（例えば、ポリエチレング
リコールによる；Ｈ．Ｌｏｒｚら著、“Ｇｅｎｅ ｔｒ
ａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｃｅｒｃａｌｃｅｌｌｓ ｍｅｄ
ｉａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｔｒａｎｓｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎ”，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１
９９、（１９８５）、１７８−１８２を参照のこと）、
バイオリスティックス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）（Ｗ．
Ｊ．Ｇｏｒｄｏｎ Ｋａｍｍら著、“Ｔｒａｎｓｆｏｒ
ｍａｔｉｏｎ ｏｆＭａｉｚｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ
Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｔｉｌｅ Ｔ
ｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ”，Ｔｈｅ Ｐｌａ
ｎｔ Ｃｅｌｌ，２、（１９９０）、６０３−６１
８）、マイクロインジェクション（Ｇ．Ｎｅｕｈａｕｓ
ら著、“Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒａｐｅｓｅｅｄ ｐ
ｌａｎｔｓｏｈｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｍｉｃｒｏｉｎｊ
ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ ｔｏ ｍｉｃｒｏ
ｓｐｏｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｅｍｂｒｙｏｉｄ
ｓ”，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７４、
（１９８７）、３０−３６）、及びその他（Ｉ．Ｐｏｔ
ｒｙｋｕｓ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９、（１
９９０）、５３５−５４２）を含む。Ｂａｓｃｏｍｂら
の上記の文献に記載されているように、天然に産出され
るタンパク質はアミノ末端またはＮ−末端に結合された
Ｍｅｔアミノ酸をしばしば含む。これらのメチオニンは
時々ホルミル化される（“（ｆ）Ｍｅｔ”と称され
る）。それ故、本明細書に開示されたタンパク質はまた
Ｎ−末端に付加されたメチオニンまたはＮ−ホルミル化
メチオニンを含んで生産されることがある（“Ｍｅｔ−
タンパク質と称される）。シグナルペプチド 病原体は通常細胞、特に植物組織を細胞の外部の場所か
ら攻撃するので、宿主植物細胞を保護することを目的と
するタンパク質は細胞から分泌されることを必要とする
可能性がある。これは、ターゲッティングペプチドとし
て文献に知られているペプチド配列（Ｇ．ｖｏｎ Ｈｅ
ｉｊｎｅ“Ｔｈｅ Ｓｉｇｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ”
Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．１１５、（１９９
０）、１９５−２０１：Ｓ．Ｆ．Ｎｏｔｈｗｅｈｒ及び
Ｊ．Ｉ．Ｇｏｒｄｏｎ著、“Ｔａｒｇｅｔｔｉｎｇ ｏ
ｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｆｕｋａｒ
ｙｏｔｉｃ Ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ Ｐａｔｈｗａｙ：Ｓ
ｉｇｎａｌ ＰｅｐｔｉｄｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅ／Ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ”Ｂｉｏａ
ｓｓａｙｓ，１２、（１９９０）４７９−４８４：並び
にＫ．Ｖｅｒｎｅｒ及びＧ．Ｓｃｈａｔｚ著、“Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ Ａｃｒｏｓｓ
Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４、（１
９８８）、１３０７−１３１３）をペプチドのＮ−末端
に付加することにより達成し得る。ターゲッティングペ
プチドまたはシグナルペプチドは、その他のペプチドま
たはタンパク質のＮ−末端に結合される場合に、そのペ
プチドまたはタンパク質を特定の細胞下の区画、好まし
くは細胞外の空間に向けるのに役だつものである。本発
明のターゲッティングペプチドまたはシグナルペプチド
の例は、ニンジンエクステンシンのペプチド（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２１）（Ｊ．Ｃｈｅｎ及びＪ．Ｅ．Ｖａｒ
ｎｅｒ著、“Ａｎ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａ
ｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ，Ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆａ Ｇｅｎｏｍｉ
ｃ Ｃｌｏｎｅ ｆｏｒ Ｃａｒｒｏｔ Ｅｘｔｅｎｓ
ｉｎ”Ｅｍｂｏ Ｊ．，４、（１９８５）２１４５−５
１）及びオオムギα−アラミラーゼのペプチド（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２２）（Ｊ．Ｃ．Ｒｏｇｅｒｓ及びＣ．
Ｍｉｌｌｉｍａｎ著、“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ Ｂａ
ｒｌｅｙ Ａｌｐｈａ−Ａｍｙｌａｓｅ ｃＤＮＡ Ｃ
ｌｏｎｅ”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８、（１９８
３）、８１６９−７４；Ｔ．Ｈ．Ｄ．Ｈｏ．ら著、“Ｒ
ｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ ｉｎ Ｂａｒｌｅｙ Ａｌｅｕｒｏｎｅ Ｌａｙ
ｅｒｓ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ
Ｐｌａｎｔ ＣｒｏｗｔｈＣｏｎｔｒｏｌ，Ａｌａｎ
Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）、３５−４９
頁；Ｃ．Ｒ．Ｐ．Ｋｎｏｘら著、“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｗｏ
Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ａｌｐｈａ−Ａｍｙｌａｓｅ Ｇ
ｅｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｂａｒｌｅｙ”，Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９８７）、９，３１７；並びに
Ｂ．Ｋｈｕｒｓｈｅｅｄ及びＪ．Ｃ．Ｒｏｇｅｒｓ著、
“Ｂａｒｌｅｙ Ａｌｐｈａ−Ａｍｙｌａｓｅ Ｇｅｎ
ｅ；Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ
ｏｆ Ｓｔｅａｄｙ−Ｓｔａｔｅ ｍＲＮＡ Ｌｅｖ
ｅｌｓ ｆｒｏｍ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｍｅｍｂｅ
ｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｗｏ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｆ
ａｍｉｌｌｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｃｄ ｉｎ Ａｌｅｕ
ｒｏｎｅ Ｃｅｌｌｓ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２６３（１９８８）、１８９５３−１８９６０）であ
る。ニンジンエクステンシンシグナルペプチドが本発明
に使用するのに好ましい。上記の文献に記載された理由
から、ターゲッティングペプチドは、通常、そのＮ−末
端に付加されたメチオニンまたはホルミル化メチオニン
を有する。本発明のペプチドまたはオリゴペプチド（そ
のＮ−末端に結合されたメチオニンまたはホルミル化メ
チオニンを含み、またはそれらを含まない）へのターゲ
ッティングペプチドの付加は、ペプチドの効力に影響す
べきではない。何となれば、ターゲッティングペプチド
は、通常、細胞外の空間への輸送中にプロテアーゼによ
りペプチドから開裂されるからである。ＡＭＰＰＰのＮ
−末端に付加されたシグナルペプチド配列を含む本発明
の範囲内のペプチドの例は、（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２
１）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．１）；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１）−（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）；
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１）−（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．２）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）−（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ．２）；（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１）−（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）
−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１）；及び（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．２１）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２）−（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．５）−［（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０）
−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）］３−（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．１）−（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）−（ＳＥＱＩ
Ｄ ＮＯ．１０）；（この場合、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ．５）に関してＸａａ１−Ｘａａ５はＧｌｙである）
である。上記のオリゴペプチドのシグナルペプチドが発
現及び細胞外の空間への分泌後に開裂される場合、放出
されたオリゴペプチドは微生物病原体による宿主植物の
侵入の際に有効である。ペプチド及びオリゴペプチドの用途 本発明により具体化された抗生物質ペプチドは、微生物
の増殖または生存を抑制することが所望される幾つかの
日常の状況で広い用途をもち得る。本発明者らは、植物
の微生物病原体により生じた作物の破壊の経済的な影響
を軽減することにより作物の収穫量を高めることに於け
るＡＭＰＰＰの適用に特に関心がある。しかしながら、
本発明のＡＭＰＰＰはまた微生物によりひき起こされる
ヒトまたは動物の病気の治療に於ける医薬品、貯蔵また
は輸送中の食品保存の目的のための食品添加物、家庭用
もしくは医療用の消毒剤、または化粧品、医薬品もしく
はその他の製品の防腐剤として有益であり得る。本発明
のＡＭＰＰまたはＡＭＰＰＰは、これらの状況のいずれ
か、または全てに於いて、それ自体で、またはヒト、動
物もしくは植物の微生物病原体に対して有効であるその
他の化学化合物もしくは製薬化合物と組み合わせて有益
であり得る。ペプチド及びオリゴペプチドの外部適用 本発明のペプチド及びオリゴペプチドの外部適用が、例
えば、病原体に対して植物を保護するのに使用される場
合、使用されるＡＭＰＰＰは１〜１０００μｇ／ｍｌの
ＡＭＰＰＰを含む液体溶液または懸濁液を生成するよう
に希釈されるか、またはダストとして適用されるように
希釈剤固体と混合されることが予想される。適用の正確
な性質は、標的とされる特別な病原体に一部依存する。
特定の作物及び病原体への適用の一般的な方法を採用す
るための詳細な方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒ Ｅｖ
ａｌｕａｔｉｎｇ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ Ｆｏｒ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｇｅｎ
ｓ，Ｋ．Ｄ．Ｈｉｃｋｅｙ編集、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉ
ｅｔｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ），１９８６に見られ
る。本発明のこの特徴により特に有益であると予想され
る適用の方法は、全体の植物またはその部分の断続的な
水性または非水性のスプレー、種子被覆、及び灌漑系
（例えば、温室ミストベンチ）中の混入を含む。その製
剤に添加し得るアジュバントは、可溶化を助けるための
薬剤、湿潤剤及び安定剤、またはマイクロカプセル化さ
れた製品を製造する薬剤を含む。その製剤は、高濃度の
無機塩、特に二価のカチオン、例えばＣａ＋＋、Ｍｇ
＋＋、またはＦｅ＋＋を含まないことが好ましい。ま
た、外部適用は、生存可能な形態の組換え微生物または
ＡＭＰＰＰを失活しない方法により生育し得ない形態に
変換された後の組換え微生物を使用し得る。生存可能な
組換え微生物がＡＭＰＰＰを送出するのに使用される場
合、それらが標的植物を集落形成する能力を有すること
が好ましい。培養植物細胞によるペプチドの植物毒性スクリーニング Ｂａｓｃｏｍｂらの上記の文献は、分離された植物葉緑
体を使用する抗菌ペプチドに関するスクリーニング技術
を開示していた。葉緑体に対するこれらの抗菌ペプチド
の効果は、植物組織中の特別なペプチドの存在及び可能
な発現と関連する潜在的な植物毒性の一般的な指示であ
った。また、Ｂａｓｃｏｍｂらの上記の文献は、最小の
レベルの植物毒性を有する抗菌ペプチドを使用すること
が望ましいことを開示していた。しかしながら、このス
クリーニング技術は植物毒性の指標として幾つかの利点
を有するが、それは葉緑体の収集及び使用を必要とする
点で不便である。更に、そのスクリーニング法は植物毒
性の一般的な指標としてのみ意図されるという事実のた
め、生じたデータは、ＡＭＰＰＰ ＲＡＭＰＰＰまたは
オリゴペプチドを使用しようとする特定の植物細胞また
は植物組織に対する毒性を必ずしも予測しない。詳しく
は、葉緑体に対する特別な抗菌ペプチドの植物毒性作用
は、葉緑体の特異な構造及び膜の化学的性質のために、
化学的に類似しない植物の原形質膜またはその他の細胞
下の細胞器官の膜に対する抗菌ペプチドの植物毒性の指
標では必ずしもないのである。本発明者らは、従来の植
物毒性スクリーニング法よりも更に有効である培養植物
細胞を使用する新規なスクリーニング法を発見した。何
となれば、それは分離された葉緑体の使用を必要としな
いからである。更に、本発明のスクリーニング技術は、
例えば、宿主細胞の膜の化学的性質に対する抗菌ペプチ
ドの植物毒性作用の更に正確な反映である。更に、本発
明により使用される代謝終点は、分離された葉緑体アッ
セイにより測定されるような酸素発生ではなく、酸素消
費である。それ故、種々の代謝経路に於ける種々の抗菌
ペプチドの植物毒性の影響に関するデータを得ること
が、本発明の使用により可能である。本発明のアッセイ
が植物細胞に関して説明されるが、その技術はその他の
型の細胞にも同様に適用し得ることが理解される。本発
明のこの特徴の別の利点は、特定の宿主植物細胞に関し
て特定の抗菌ペプチドの植物毒性作用を試験する能力で
ある。それ故、特別な抗菌ペプチドを発現し得る遺伝子
を含む特別な遺伝子型の遺伝子導入トウモロコシを生産
しようとする場合には、遺伝子操作の前にトウモロコシ
植物細胞に関してこのペプチドの植物毒性作用を試験す
ることが可能である。それ故、潜在的な宿主細胞及び／
または宿主組織と抗菌ペプチドの適合性が推定される。
植物細胞に関して、植物細胞または植物組織に対するペ
プチドの相対的な植物毒性の目安は、細胞懸濁液として
正しく維持された細胞培養物に対してペプチドを試験す
ることにより測定し得る。培養された全細胞懸濁液は、
細胞懸濁液を開始し、維持するための通常の方法、例え
ば、ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆＰｌａｎｔ Ｃｅ
ｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，１〜３巻、（マクミラン・パブ
リッシング社（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク、ＮＹ、１９８
３−８４）に説明されているような方法を使用して生成
し得る。植物毒性応答は、酸素消費に関する特別なペプ
チドの効果を観察することにより細胞系中で実証し得
る。特に、次第に増加する濃度のそのペプチドを測定数
の懸濁細胞でインキュベートすることが減少された酸素
消費をもたらすことが実証し得る場合には、用量応答関
係があらゆるペプチドに関して推定し得る。同様に、次
第に増加する数の培養全細胞による単一濃度のペプチド
のインキュベーションが酸素消費の総合の減少された抑
制をもたらすことが実証し得る場合には、容量応答関係
が所定のペプチドに関して推定し得る。キュベットアッ
セイが、これらの測定に一般に使用される。全細胞の酸
素消費の抑制率（％）を実際に試験するためにキュベッ
ト中に使用される溶液は、単に、ペプチドが添加される
水を含んでもよく、または、それはペプチドが添加され
る通常の溶液（その中で、細胞懸濁培養物が生育され
る）からなっていてもよい。これらの溶液は、蔗糖、グ
ルコース、フラクトース、キシロース及びアラビノース
の如き糖を含んでいてもよい。無機塩、例えば、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、
硫酸アンモニウム、ホウ酸、塩化カルシウム、硝酸カル
シウム、リン酸カルシウム、塩化コバルト、硫酸第二
銅、エチレンジアミンテトラ酢酸、塩化第二鉄、クエン
酸第二鉄、硫酸第二鉄、酒石酸第二鉄、硫酸第一鉄、硫
酸マグネシウム、塩化マンガン、硫酸マンガン、三酸化
モリブデン、モリブデン酸、塩化ニッケル、硫酸ニッケ
ル、塩化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、リ
ン酸カリウム、硫酸カリウム、硝酸ナトリウム、リン酸
ナトリウム、硫酸ナトリウム、硝酸亜鉛、及び硫酸亜鉛
のあらゆる組み合わせが含まれていてもよい。同様に、
有機物、例えば、活性炭、アデニンヘミスルフェート、
アミノ安息香酸、６−ベンジルアミノプリン、Ｄ−ビオ
チン、パントテン酸カルシウム、塩化コリン、ジメチル
アリルアミノプリン、葉酸、グリシン、インドール−３
−酢酸、ミオイノシトール、インドール−３−酪酸、キ
ネチン、α−ナフタレン酢酸、ニコチンアミド、ニコチ
ン酸、ペプトン、ピリドキシンＨＣｌ、リボフラビン、
チアミンＨＣｌ、ビタミンＡ、ビタミンＢ１２、及びビ
タミンＤのあらゆる組み合わせが含まれていてもよい。
上記の薬剤のいずれか、または全部の混合物が有益であ
り得る。含まれる場合、夫々の薬剤の濃度は一般に０〜
１モルの量で存在する。また、溶液ｐＨを４〜９の好ま
しい範囲に維持するために、緩衝剤が細胞溶液中に含ま
れていてもよい。これらの緩衝剤の例は、トリス（トリ
ス−〔ヒドロキシメチル〕アミノメタン）、ＭＥＳ（ｓ
−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸）、酢酸塩、及
びＨＥＰＥＳ（Ｎ−〔２−ヒドロキシエチル〕ピペラジ
ン−Ｎ−〔２−エタンスルホン酸〕）である。使用され
る場合、これらの緩衝剤は一般に約０．０１％〜約１０
％（ｗ／ｖ）の量で存在する。上記の植物毒性アッセイ
で試験される細胞懸濁液の全容積は１０μｌ〜１μｌの
範囲であり得る。本発明に有益な細胞の実際の量は、キ
ュベット当たりのごくわずかな数の細胞の少ない量か
ら、キュベットのサイズ及びマグネチックスターラによ
る細胞懸濁液の一定の攪拌の必要性により制限される多
い量までの範囲であってもよい。試験し得る細胞の最小
数は、記録できる量の酸素を消費する数である。この消
費は、当業界で利用できる種々の技術及び装置、例えば
ワーブルグ（Ｗａｒｂｕｒｇ）装置または、好ましく
は、酸素電極により監視し得る。“Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏ
ｆ ｔｈｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅａｎｄ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ Ｓ
ｉｍｐｌｅ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｐｈｏ
ｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｄ．Ｗａｌｋｅｒ，１９８
７，Ｈａｎｓａｔｅｃｈ Ｌｔｄ．，Ｋｉｎｇｓ Ｌｙ
ｎｎ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，英国を参照のこと。また、本発
明によれば、試験のために植物細胞原形質体を使用する
ことが可能である。本発明に使用される原形質体は、そ
の細胞壁が除去された植物細胞である。これは、リグナ
ーゼ、セルラーゼまたはその他の既知の酵素の使用によ
り酵素により行うことができ、または浸透圧衝撃と組み
合わせた組織スライシングの如き機械的手段により行う
ことができる。分離された原形質体の使用は、測定のた
めの試薬として原形質体を調製するのに必要とされる追
加の時間及び労力を除いて、本発明のスクリーニング技
術の利点の多くの実現を可能にする。更に、細胞壁と特
別な抗菌ペプチドとの間の潜在的な相互作用を測定する
能力の欠如がある。下記の実施例は、本発明の概念を更
に説明する目的のために示される。それらは、限定する
ことを目的としない。これらの実施例は、ＲＡＭＰＰＰ
及びオリゴペプチドを含む幾つかのペプチドに関するも
のである。便宜のため、これらのペプチドを、表１に同
定された化合物を表すのに使用される任意の数で指定し
た。
【表１】
【表２／】
【実施例】実施例１：ペプチドＮｏ．５の調製 ＡＢＩモデル４３０Ａペプチド合成装置を用い、ｔ−Ｂ
ｏｃ保護基、ＮＭＰ中のＤＣＣ／ＨＯＢＴ生成した活性
エステル並びに側鎖保護基としてＧｌｕ（ＯＢｚｌ）、
Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）およびＳｅｒ
（Ｂｚｌ）を使用してｔ−Ｂｏｃ−（Ｍａｇ２）−ＯＣ
Ｈ２ＰＡＭ樹脂を調製した。この合成は０．５ｍＭ（７
４０ｍｇ）ｔ−Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＣＨ２Ｐ
ＡＭ樹脂（置換度＝０．６８ｍＭ／ｇ）から開始し、該
樹脂を該装置により利用される標準的ＮＭＰ／ｔ−Ｂｏ
ｃ化学サイクルに従って反復的脱保護、中和およびカッ
プリング工程に付した。各カップリング工程の終了時点
で、該樹脂の試料をニンヒドリン監視のために採取（上
記のサリン（Ｓａｒｉｎ）等の文献参照）したところ、
各工程で９８．４％以上のカップリング効率を示した。
該樹脂の約２／３をＭａｇ２−ＯＨ（ペプチドＮｏ．１
１：実施例１３）および（Ｍａｇ２）−（Ｇｌｙ）５−
（Ｍａｇ２）−ＯＨ（ペプチド６：実施例２）の合成で
使用するために取り出した。次に、ｔ−Ｂｏｃ−（Ｍａ
ｇ２）−（Ｍａｇ２）−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂の合成を同
様な方法で完了したが、最後の１９アミノ酸の合成には
ダブルカップリングを利用した。ｔ−Ｂｏｃ−（Ｍａｇ
２）−（Ｍａｇ２）−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂の収量は０．
６９０ｇであった。該Ｎ−末端ｔ−Ｂｏｃ基はＴＦＡを
使用して該ペプチド合成により除去し、また該ペプチド
を次に脱保護し、かつ以下の低／高（ｌｏｗ／ｈｉｇ
ｈ）ＨＦ法を利用して該樹脂から開裂した。即ち、０．
３９ｇのペプチド−ＰＡＭ樹脂混合物を０℃にて２時
間、１．０ｍＬの無水ＨＦ、２．６ｍｌのＤＭＳおよび
０．４ｍｌのｐ−クレゾールを含む溶液と共に攪拌し
た。該ＨＦおよびＤＭＳを蒸発させた後、該ペプチド−
樹脂混合物を、−１０℃で３０分および０℃で３０分、
新たな７ｍｌのＨＦ、０．５ｍｌのアニソール、０．３
ｍｌのＤＭＳ、０．２ｍｌの１，２−エタンジチオール
および３．０ｍｇ２−メルカプトピリジンを含む溶液と
共に攪拌した。ＨＦおよび他の揮発分を蒸発させた後、
該樹脂をクロロホルムで膨潤し、この混合物を３回５ｍ
ｌのエーテルで洗浄し、３ｍｌのＢＭＥと共に３０分攪
拌し、３回３ｍｌの１：１ １５％酢酸／ＢＭＥでおよ
び１５ｍｌの０．１％ＴＦＡを含む５０％水性アセトニ
トリル溶液で１回抽出した。水性抽出液を併合し、１０
ｍｌのエーテルで３回抽出し、凍結乾燥して、１５２ｍ
ｇ（約６５％）のペプチド混合物を得た。この粗製ペプ
チドを約４ｍｌの１Ｎ酢酸（１％のＢＭＥを含む）に溶
解し、１Ｎ酢酸中の２．６×１０ｃｍのバイオラド（Ｂ
ｉｏ−Ｒａｄ）ＡＧｌＸ−８イオン交換カラム（アセテ
ート型）に通して、弗化物塩を除去し、該ペプチドを酢
酸塩形に転化した。ニンヒドリン監視（上記のサリン
（Ｓａｒｉｎ）等の文献参照）により検出された該ペプ
チド画分を併合し、凍結乾燥して１２２ｍｇのペプチド
を得た。次に、このペプチドを４０ｍｌの１０％重炭酸
アンモニウムに溶解し、室温にて、窒素雰囲気下で２４
時間攪拌した。この溶液を凍結乾燥し、得られた残渣を
繰り返し１％ＢＭＥを含む１Ｎの酢酸から凍結乾燥し
て、最終的に１９９ｍｇのペプチドを得た。最終的な精
製は、ペプチド（１０−１５ｍｇ）を２．２×２５ｃ
ｍ、１０μ、３００Åのビダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ−４
カラムに繰り返し注入し、６０分に渡りＡ中にＢを０％
−６０％の線形勾配で含む溶出液で溶出した。流量は
６．０ｍｌ／ｍｉｎであり、溶媒Ａは０．１％ＴＦＡで
あり、溶媒Ｂは０．０８％ＴＦＡのアセトニトリル溶液
であり、監視は２３５ｎｍのＵＶを使用して実施した。
恐らく該ペプチドのウンデカトリフルオロ酢酸塩形にあ
る、５１．７分に溶出される主ピークを集めた。これは
ＨＰＬＣにより純度９５％以上であることが示された。
構造をＦＡＢ−ＭＳにより確認した。ａｍｕでの理論値
（Ｍ＋Ｈ）＋は４９１７．３であり、実測値は４９１
７．８であった。実施例２：ペプチドＮｏ．６の調製 ｔ−Ｂｏｃ−（Ｍａｇ２）−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂（６８
０ｍｇ）を実施例１と同様にして調製し、残りのペプチ
ドは同様な手順で結合させたが、第２のＭａｇ２単位の
アミノ酸はダブルカップリング法を利用して付加した。
ｔ−Ｂｏｔ−（Ｍａｇ２）−（Ｇｌｙ）５−（Ｍａｇ
２）−ＯＣＨ２ＰＡＨ樹脂の収量は７３７ｍｇであっ
た。ｔ−Ｂｏｃ基の除去後、実施例１と同様の手順を利
用して５６３ｍｇの該ペプチドを脱保護および開裂する
と２０４ｍｇの粗製ペプチドが得られた。この物質を実
施例１と同様にイオン交換すると、１６８ｍｇのペプチ
ドが得られ、これは実施例１におけるように重炭酸アン
モニウム処理した後に２０５ｍｇのペプチドを与える。
最終的精製は実施例１と同様に分取ＨＰＬＣを利用して
実施したが、１０−２０ｍｇの注入および以下のプログ
ラムを使用した。即ち、６０分に渡りＡ中に２０％のＢ
を含む溶出液からＡ中に４０％のＢを含む溶出液への線
形勾配で溶出し、次いで２０分間Ａ中に４０％のＢを含
む溶出液で溶出した。恐らく該ペプチドのウンデカトリ
フルオロ酢酸塩形にある、６９．３分に溶出される主ピ
ークを集めた。これはＨＰＬＣにより純度８５％以上で
あることが示された。構造をＦＡＢ−ＭＳにより確認し
た。ａｍｕでの理論値（Ｍ＋Ｈ）＋は５２０２．６であ
り、実測値は５２０１．６であった。実施例３ ：ペプチドＮｏ．７の調製 ｔ−Ｂｏｃ−ＰＧＬ−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂を０．５ｍＭ
（６６１ｍｇ）のｔ−Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＨ２ＰＡＭ
樹脂（置換度＝０．７６ｍＭ／ｇ）から、実施例１の手
順を利用し、１１番目のアミノ酸以降はダブルカップリ
ングを利用して調製した。ＰＧＬ−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂
の収量は１．６１ｇであった。ｔ−Ｂｏｃ基の除去後、
この樹脂１．５９ｇの脱保護および開裂を、１８．０ｍ
ｌの無水ＨＦ、１．５ｍｌのアニソール、０．６ｍｌの
ＤＭＳ、０．３ｍｌの１．２−エタンジチオールおよび
３．０ｍｇの２−メルカプトピリジンを含有する溶液中
で、−１０℃にて３０分間および０℃にて３０分間攪拌
することにより実施した。０℃にて該ＨＦおよびＤＭＳ
を蒸発させた後に、該ペプチド／樹脂／スキャベンジャ
ー混合物を１５ｍｌの冷９９：１エーテル／ＢＭＥで３
回洗浄して、スキャベンジャーおよび他の副生成物を除
去した。得られた残渣を５ｍｌのＢＭＥと共に攪拌し、
次いで１０ｍｌの１５％酢酸／２％ＢＭＥで３回抽出し
た。該抽出物を併合し、続いて２０ｍｌのエーテルで２
回抽出した。次に、該酢酸層を凍結乾燥して、粗製ペプ
チド５５９ｍｇ（７１％）を得た。実施例１におけるよ
うにイオン交換し、かつ酢酸アンモニウムで処理した
後、最終的精製を実施例１における如く分取ＨＰＬＣに
より実施したが、４０分に渡るＡ中に２４％Ｂを含む溶
出液からＡ中に４４％Ｂを含む溶出液への勾配を使用し
た。恐らく該ペプチドのペンタトリフルオロ酢酸塩形に
ある、２７．１分に溶出される主ピークを集めた。これ
はＨＰＬＣにより純度９８％以上であることが示され
た。構造をＦＡＢ−ＭＳにより確認した。ａｍｕでの理
論値（Ｍ＋Ｈ）＋は１９７０．２であり、実測値は１９
７０．１であった。実施例４ ：ペプチドＮｏ．８の調製 ｔ−Ｂｏｃ−Ｒ−Ｍａｇ２−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂を０．
５ｍＭ（６５３ｍｇ）のｔ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＣＨ２
ＰＡＭ樹脂（置換度＝０．７７ｍＭ／ｇ）から、実施例
１の手順を利用して調製した。但し、ｔ−Ｂｏｃ−〔Ａ
ｌａ１５−Ｇｌｙ２３〕Ｒ−Ｍａｇ２−ＯＣＨ２ＰＡＭ
樹脂の調製後、該樹脂の約半分を、Ｒ−Ｍａｇ１−ＯＨ
（ペプチド＃１８）の合成で使用するために取り出し
た。ｔ−Ｂｏｃ−Ｒ−Ｍａｇ２−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂の
収量は１．１７ｇであった。ｔ−Ｂｏｃ基の除去後、こ
の樹脂の脱保護および開裂を、実施例３に記載の手順を
利用して実施して粗製ペプチド４７３ｍｇ（７６％）を
得た。実施例１に記載の如く該物質２００ｍｇをイオン
交換し、次いで重炭酸アンモニウム処理すると、１５８
ｍｇのペプチドが得られた。最終的精製を実施例１にお
ける如くＨＰＬＣにより実施したが、４０分に渡るＡ中
に２４％Ｂを含む溶出液からＡ中に４４％Ｂを含む溶出
液への勾配を使用した。恐らく該ペプチドのヘキサトリ
フルオロ酢酸塩形にある、２７．９分に溶出される主ピ
ークを集めた。これはＨＰＬＣにより純度９８％以上で
あることが示された。構造をＦＡＢ−ＭＳにより確認し
た。ａｍｕでの理論値（Ｍ＋Ｈ）＋は２４６７．４であ
り、実測値は２４６７．５であった。「Ｒ−Ｍａｇ２」
はマガイニン２のＲＡＭＰＰＰを表す。実施例５ ：ペプチドＮｏ．９の調製 ｔ−Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−（Ｍａｇ１）−（Ｍａｇ１）−Ｏ
ＣＨ２ＰＡＭ樹脂を０．５ｍＭ（７１４ｍｇ）のｔ−Ｂ
ｏｃ−Ｓｅｒ（ｂｚｌ）−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂（置換度
＝０．７１ｍＭ／ｇ）から、実施例１の手順を利用して
調製したが、第一のマガイニン１単位をもつ構築体以降
の該樹脂の約半分をＭａｇ１−ＯＨ（ペプチドＮｏ．
２）の調製で使用するために取り出し、かつアミノ酸の
残りはダブルカップリング法を利用して結合させた。ｔ
−Ｂｏｃ−Ｍｅｔ−（Ｍａｇ１）−（Ｍａｇ１）−ＯＣ
Ｈ２ＰＡＭ樹脂の収量は１．５０ｇであった。ｔ−Ｂｏ
ｃ基の除去後、この樹脂の脱保護および開裂を実施例１
の手順を利用して実施して、粗製ペプチド７９６ｍｇ
（８２％）を得た。実施例１におけるようにイオン交換
し、かつ重炭酸アンモニウムで処理した後、最終的精製
を実施例１における如くＨＰＬＣにより実施したが、６
０分に渡るＡ中に２７％Ｂを含む溶出液からＡ中に４７
％Ｂを含む溶出液への勾配を使用した。恐らく該ペプチ
ドのウンデカトリフルオロ酢酸塩形にある、４２．４分
に溶出される主ピークを集めた。これはＨＰＬＣにより
純度９７％以上であることが示された。構造をＦＡＢ−
ＭＳにより確認した。ａｍｕでの理論値（Ｍ＋Ｈ）＋は
４９３３．３であり、実測値は４９３１．９であった。実施例６ ：ペプチドＮｏ．１２の調製 ｔ−Ｂｏｃ−Ｍｅｔ〔Ａｒｇ７，Ｇｌｕ８，Ｐｒ
ｏ２３〕Ｍａｇ１−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂を０．６１ｍＭ
（７６３ｍ）のｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹
脂（置換度＝０．８０ｍＭ／ｇ）から、実施例５の手順
を利用して調製したが、該樹脂の約半分はフラグメント
ｔ−Ｂｏｃ−（９−２３）〔Ｐｒｏ２３〕Ｍａｇ１−Ｏ
ＣＨ２ＰＡＭ樹脂の合成後に除去した。合成が完了した
後、ｔ−Ｂｏｃ基を除去すると、１．３６６ｇのＭｅｔ
〔Ａｒｇ７，Ｇｌｕ８，Ｐｒｏ２３〕Ｍａｇ１−ＯＣＨ
２ＰＡＭ樹脂が得られた。この樹脂７１９ｍｇの脱保護
および開裂を実施例１の手順を利用して実施して、粗製
ペプチド２５ｍｇを得た。実施例１におけるようにイオ
ン交換した後、該ペプチドを実施例１の手順でＨＰＬＣ
で精製した。但し、４０分に渡るＡ中に２４％Ｂを含む
溶出液からＡ中に４４％Ｂを含む溶出液への勾配を使用
した。恐らく該ペプチドのヘキサトリフルオロ酢酸塩形
にある、３４．１分に溶出される主ピークを集めた。こ
れはＨＰＬＣにより純度９５％以上であることが示され
た。構造をＦＡＢ−ＭＳにより確認した。ａｍｕでの理
論値（Ｍ＋Ｈ）＋は２６１２．４であり、実測値は２６
１２．０であった。実施例７ ：ペプチドＮｏ．１３の調製 ｔ−Ｂｏｃ−〔Ａｒｇ７，Ｇｌｕ８，Ｐｒｏ２３〕Ｍａ
ｇ１−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂を０．６０６ｍＭ（０．７５
８ｇ）のｔ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂（置
換度＝０．８０ｍＭ／ｇ）から、実施例１の手順を利用
して調製した。この合成の完了時点において、該ペプチ
ド−樹脂の約２／３を除去し、実施例９、１０および１
１で使用するために残しておいた。残りの１／３をｔ−
Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（４−ＭｅＢｚｌ）とカップリング、Ｔ
ＦＡ脱保護に付して所定のＣｙｓ（４−ＭｅＢｚｌ）−
Ｐｒｏ２３−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂を得た。次いで、これ
を実施例１に記載の低／高ＨＦ法を利用して脱保護並び
に開裂して、２６０ｍｇ（７３％）のペプチドを得た。
このペプチドは実施例１に記載のように酢酸塩形状に転
化した。最終的ＨＰＬＣ精製は実施例１に記載の如く実
施したが６０分に渡るＡ中に２５％−４５％のＢを含む
線形勾配の溶出液を使用した。恐らく該ペプチドのヘキ
サトリフルオロ酢酸塩形にある、４９．１分に溶出され
る主ピークを集めた。これはＨＰＬＣにより純度９０％
以上であることが示された。構造をＦＡＢ−ＭＳにより
確認した。ａｍｕで表わした理論値（Ｍ＋Ｈ）＋は２５
８４．４であり、実測値は２５８３．９であった。実施例８ ：ペプチドＮｏ．１４の調製 このペプチドダイマーはペプチドＮｏ．１３の酸化（ホ
ッジス（Ｈｏｄｇｅｓ）等の上記の文献参照）により、
即ちペプチドＮｏ．１３（３．２ｘ１０−４Ｍ；１０ｍ
ｇ／ｍｌ）をＣｕ２＋を含む燐酸緩衝液（０．０５ＭＮ
ａＨ２ＰＯ４；１．６ｘ１０−５Ｍ ＣｕＣｌ２；０．
５ＭＮａＣｌ；ｐＨ＝７．０）に溶解した溶液を空気中
で一夜（１２−２０時間）室温の下で攪拌することによ
り調製した。次に、該濃縮した反応混合物をセファデッ
クスＧ−２５カラム（２．６ｘ２５ｃｍ）に通し、１０
％酢酸で溶出することによりこの溶液を脱塩した。最終
精製はペプチドＮｏ．１６につき上記した分取ＨＰＬＣ
により実施した。実施例９ ：ペプチドＮｏ．１５の調製 所定のペプチド−ＰＭＡ樹脂（１．０５ｇ）を、実施例
７で調製したｔ−Ｂｏｃ−〔Ａｒｇ７，Ｇｌｕ８，Ｐｒ
ｏ２３〕Ｍａｇ１−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂の約１／３か
ら、ダブルカップリング法および実施例１３記載の手順
を使用して調製した。ｔ−Ｂｏｃ基を除去した後、脱保
護および開裂を実施例１の手順を利用して実施して、粗
製ペプチド５６２ｍｇ（８４％）を得た。実施例１記載
の如くイオン交換およびＨＰＬＣ精製を実施した。但
し、６０分に及ぶ、Ａ中の４０％Ｂ含有溶出液からＡ中
に６０％Ｂを含む溶出液への濃度勾配を使用した。恐ら
く該ペプチドのウンデカトリフルオロ酢酸塩形にある、
４３．８分に溶出される主ピークを集めた。これはＨＰ
ＬＣにより純度９５％以上であることが示された。構造
はＦＡＢ−ＭＳにより確認した。実施例１０ ：ペプチドＮｏ．１６の調製 ｔ−Ｂｏｃ−Ｐ１−〔Ａｒｇ７，Ｇｌｕ８，Ｐｒ
ｏ２３〕Ｍａｇ１−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂（１．４０ｇ）
を、実施例７で調製したｔ−Ｂｏｃ−〔Ａｒｇ７，Ｇｌ
ｕ８，Ｐｒｏ２３〕Ｍａｇ１−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂の約
１／３から、ダブルカップリング法、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）
および実施例１記載の手順を使用して調製した。ｔ−Ｂ
ｏｃ基を除去した後、６８１ｍｇのペプチド−樹脂を、
実施例１に記載の手順（但し、該高ＨＦ溶液に３ｍｇの
スカトールをも添加した）に従って脱保護および開裂を
実施して、粗製ペプチド３４７ｍｇを得た。このペプチ
ドを実施例１記載の手順でイオン交換クロマトグラフィ
ーおよび重炭酸アンモニウム処理により精製した。４０
分に及ぶ、Ａ中に３０％Ｂを含む溶出液からＡ中に６５
％Ｂを含む溶出液までの濃度勾配を利用して、２．２ｍ
ｍＸ２５ｃｍ、３００Åのビダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ−
１８カラム上でのＨＰＬＣ（流量は１ｍｌ／ｍｉｎ）に
よりこの生成物の分析を実施した。この分析は、恐らく
該ペプチドのデデカトリフルオロ酢酸塩形にある主ピー
クが１９分に溶出されることを示した。構造はＦＡＢ−
ＭＳにより確認した。実施例１１ ：ペプチドＮｏ．１７の調製 実施例１記載の手順を使用してｔ−Ｂｏｃ−Ｍｅｔをダ
ブルカップリングして、実施例１０で調製した７４０ｍ
ｇのｔ−Ｂｏｃ−Ｐ１−〔Ａｒｇ７，Ｇｌｕ８，Ｐｒｏ
２３〕Ｍａｇ１−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂とした。ｔ−Ｂｏ
ｃ基を除去した後、実施例１０の手順で７４１ｍｇの該
ペプチド−樹脂を脱保護かつ開裂して３０５ｍｇ（６６
％）の粗製ペプチドを得た。該ペプチドの精製は実施例
１の手順で実施したが、６０分に及ぶ、Ａ中の３５％Ｂ
含有溶出液からＡ中に５５％Ｂを含む溶出液への濃度勾
配を使用した。恐らく該ペプチドのドデカトリフルオロ
酢酸塩形にある、５７．５分に溶出される主ピークを集
めた。これはＨＰＬＣにより純度９０％以上であること
が示された。構造はＦＡＢ−ＭＳにより確認した。実施例１２ ：ペプチドＮｏ．１８の調製 ｔ−Ｂｏｃ−Ｒ−Ｍａｇ１−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂（９３
０ｍｇ）を実施例４で調製したｔ−Ｂｏｃ−〔Ａｌａ
１５−Ｇｌｙ２３〕Ｒ−Ｍａｇ２−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂
の残りから、実施例１記載の手順で調製した。ｔ−Ｂｏ
ｃ基を除去した後、実施例１の手順で９２０ｍｇの該ペ
プチド−樹脂を脱保護かつ開裂して２９６ｍｇの粗製ペ
プチドを得た。該ペプチドの精製は実施例４の手順で実
施例したが、Ａ中の２０％Ｂ含有溶出液からＡ中に４０
％Ｂを含む溶出液への濃度勾配を利用した。恐らく該ペ
プチドのヘキサトリフルオロ酢酸塩形にある、３０．２
分に溶出される主ピークを集めた。これはＨＰＬＣによ
り純度９７％以上であることが示された。構造はＦＡＢ
−ＭＳにより確認した。実施例１３ ：ペプチドＮｏ．１１の調製 ｔ−Ｂｏｃ−Ｍｅｔ〔Ａｒｇ７，Ｇｌｕ８，Ｄｅｓ Ｓ
ｅｒ２３〕Ｍａｇ１−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂を０．６ｍＭ
（９２３ｍｇ）のｔ−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ｏ
ＣＨ２ＰＡＭ樹脂（置換度＝０．６５ｍＭ／ｇ）から、
Ａｒｇ（Ｍｔｓ）および実施例１の手順を利用して調製
したが、フラグメント〔Ｇｌｕ８−Ｌｙｓ２２，Ｄｅｓ
Ｓｅｒ２３〕Ｍａｇ１−ＯＣＨ２ＰＡＭ樹脂の合成
後、その約２／３を除去した。この合成の終了時点で、
ｔ−Ｂｏｃ基の除去後、６２２ｍｇの〔Ａｒｇ７，Ｇｌ
ｕ８，Ｄｅｓ Ｓｅｒ２３〕Ｍａｇ１−ＯＣＨ２ＰＡＭ
樹脂を得た。この物質５９３ｍｇを、実施例３記載の手
順を利用して脱保護および開裂し、２３７ｍｇ（７３
％）の粗製ペプチドを得た。実施例１記載のイオン交換
クロマトグラフィーおよび重炭酸アンモニウム処理後、
最終的精製を実施例１記載の手順に従ってＨＰＬＣによ
り実施したが、４０分に及ぶ、Ａ中の２５％Ｂ含有溶出
液からＡ中に４５％Ｂを含む溶出液への濃度勾配を使用
した。恐らく該ペプチドのヘキサトリフルオロ酢酸塩形
にある、３２．６分に溶出される主ピークを集めた。こ
れはＨＰＬＣにより純度９６％以上であることが示され
た。構造はＦＡＢ−ＭＳにより確認した。ａｍｕでの理
論値（Ｍ＋Ｈ）＋は２５１５．４であり、実測値は２５
１５．７であった。実施例１４ ：ペプチドＮｏ．１、２、３、４および１０
の調製 マガイニン２−ＯＨ（ペプチドＮｏ．１）およびマガイ
ニン２−ＯＨ（ペプチドＮｏ．２）はアプライドバイオ
システムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
Ｉｎｃ．：カリフォルニア州フォスターシティー）か
ら購入するか、バスコーム（Ｂａｓｃｏｍｂ）等の上記
の文献に記載の方法により製造した。〔Ｇｌｕ８〕Ｍａ
ｇ２−ＯＨ（ペプチドＮｏ．１０）はバスコーム（Ｂａ
ｓｃｏｍｂ）等の上記の文献に記載の如く調製した。セ
クロピン（Ｃｅｃｒｏｐｉｎ）Ａ−ＮＨ２（ペプチドＮ
ｏ．３）はカリフォルニア州、トーランスのスターバイ
オケミカルズ社（Ｓｔａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｓ，Ｉｎｃ．）からそのトリフルオロ酢酸塩として購入
した。セクロピンＰ１−ＯＨとしても知られるＰ１−Ｏ
Ｈ（ペプチドＮｏ．４）はカリフォルニア州、ベルモン
トのペニンシュララボラトリーズ社（Ｐｅｎｉｎｓｕｌ
ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｓ．）から購入し
た（カタログ＃６３００）。実施例１５ ：ペプチドＮｏ．１９の調製 ｔ−Ｂｏｃ−Ｓｅｒ−Ｍａｇ２を実施例１におけるよう
に調製したが、１１番目のアミノ酸以降はＤＭＦ中での
ＤＣＣ−促進対称無水物形成プロトコールおよびダブル
カップリング法を利用した。この樹脂８７５ｍｇを実施
例３と同様にして脱保護および開裂して、３６０ｍｇの
粗製ペプチドを得た。実施例１記載の方法を使用してイ
オン交換し、かつ重炭酸アンモニウム処理した後該ペプ
チドをＡ．クルウゥル（Ｃｕｌｗｅｌｌ）の上記の方法
を使用して、Ｎ−メチルメルカプトアセタミド（ＭＭ
Ａ）により還元した。得られた油状残渣の１０％酢酸／
１％ＢＭＥ溶液を１ｍｌ／ｍｉｎなる流量にて、２．６
Ｘ７０ｃｍのセファデックスＧ２５カラムに通し、２５
４ｎｍにて該流出液を監視することによりペプチド画分
を検出した。これら画分を併合し、凍結乾燥して殆ど定
量的収率でＭＭＡ遊離ペプチドを得た。最終的な精製は
実施例１の手順を利用してＨＰＬＣにより実施したが、
４０分に及ぶ、Ａ中の２２％Ｂ含有溶出液からＡ中に４
２％Ｂを含む溶出液への濃度勾配を使用した。恐らく該
ペプチドのヘキサトリフルオロ酢酸塩形にある、３１．
７分に溶出される主ピークを集めた。これはＨＰＬＣに
より純度９０％以上であることが示された。構造はアミ
ノ酸分析により確認した。実施例１６ ：抗真菌性バイオアッセイ 真菌を適当な培地（ここではポテトデキストロース寒天
プレート）中で数週間育成した。該育成期間の終了時点
で、該プレートに約５ｍｌの無菌蒸溜水を流して胞子を
収穫した。この胞子濃度を血球計を使用して測定し、こ
の胞子懸濁液を必要となるまで４℃にて無菌管内に保存
した。次いで、８２μｌのポテトデキストロースブロス
および３μｌの胞子懸濁液（全体で１０５〜１０７の範
囲内の胞子）をテストすべき各ＡＭＰＰＰについて、９
６ウエルのマイクロタイタプレートの１２ウエルに添加
した。単一の実験内に、各ＡＭＰＰＰに対して、１２ウ
エルからなる１〜４の同型培養セットを調製した。数例
において、１より大きな胞子濃度を使用して、標的胞子
の数の関数として或るＡＭＰＰＰの有効性を測定した。
各ＡＭＰＰＰの原液は濃度１ｍｇ／ｍｌで調製し、各ペ
プチド原液０〜１５μｌを該マイクロタイタプレートの
各ウエルに添加し、次いで十分な容量の水を添加して、
全ウエル容積を１００μｌとした。テストしたペプチド
は実施例１〜５、７、９、１０、１２、１４および１５
に記載の如く調製もしくは入手した。アッセイした典型
的なペプチドの体積は０、１、２、３、４、５、６、
７、８、９、１０および１５μｌであり、これらは０〜
１５０μｇ／ｍｌの範囲の最終ペプチド濃度に相当す
る。該マイクロタイタプレートをパラフィルムで封止
し、室温にて４８時間インキュベートした。４Ｘおよび
／または１０Ｘの対物レンズを使用して顕微鏡により該
真菌の成長を２４および４８時間後に観察した。胞子の
発芽量および真菌の成長を、＋および−系を使用して各
観測時間における定量的測定値として記録した。〔−〕
は発芽が生じなかったことを示し、〔＋〕は膨張した発
芽管を有する膨潤胞子を意味し、〔＋＋〕は粗い格子の
全体的な出現を伴う菌糸成長の初期を意味し、〔＋＋
＋〕は厚い不透明な網模様の全体的な出現を伴う高密度
の菌糸成長を意味する。次いで、各テストされたＡＭＰ
ＰＰのＭＣＩＣ値を記録した。ここで、ＭＣＩＣ値とは
胞子の発芽が生じないペプチドの最低の濃度（評価＝
〔−〕）として定義される。表２には、処理後２４時間
において、テストした２または３種の植物病原性真菌の
各々に対し、各ＡＭＰＰＰを使用した少なくとも３種の
同型培養物から算出した平均のＭＣＩＣ値（μｇ／ｍｌ
で表示）を掲載した。テストした植物病原性真菌はＰ３
フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）（野外で単離）、トリ
コデルマリーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓ
ｅｉ）（イリノイ州、ペオリアのＵＳＤＡ−ＡＲＳのＤ
ｒ．ジョンエリス（Ｊｏｈｎ Ｅｌｌｉｓ）から入
手）、セルコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）ｓｐ．
（デラウエア州、ニューワーク、デラウエア大学のＤ
ｒ．ジェームズホーク（Ｊａｍｅｓ Ｈａｗｋ）から入
手）およびヘルミントスポリウムカルボヌム（Ｈｅｌｍ
ｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｂｏｎｕｍ）であっ
た。
【表３／】
【表４／】テストした殆どのペプチドは低濃度（７０μ
ｇ／ｍｌ未満）で４種の異なる病原体の成長を阻害する
上で有効であった。該ペプチドの殆どは、真菌に対する
活性とほぼ同程度にバクテリアＥｃｃ ＳＲ３１９（以
下参照）に対しても活性であった。しかし、ペプチドＮ
ｏ．７、８、１５および１８はＥｃｃ ＳＲ３１９に対
するよりも一層真菌に対して高い活性を有していた。実施例１７ ：抗菌性バイオアッセイ エルウイニアカロトボラカロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ
ｃａｒｏｔｏｖｏｒａｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）菌株ＳＲ
３１９（Ｅｃｃ ＳＲ３１９）（ペンシルバニア州、フ
ィラデルフィアＵＳＤＡ−ＡＲＳのＤｒ．Ｃ．Ｈ．リア
オ（Ｌｉａｏ）から入手）をルリアベルタニ（Ｌｕｒｉ
ａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（“ＬＢ”））ブロス寒天プレート
上に塗布し、２８℃にて一夜育成した。２４時間後、該
寒天プレートから白金耳一杯分のＥｃｃ ＳＲ３１９を
取り出し、栓付きの無菌の１０ｍｌ試験管内のＬＢブロ
ス（溶液１ｌ当たり１０ｇのバクト−トリプトン、５ｇ
のバクトイースト抽出物、および１０ｇの塩化ナトリウ
ムを含み、オートクレーブ処理して滅菌）３ｍｌに添加
した。この培養物を一夜育成した後、ダイナテック（Ｄ
ｙｎａｔｅｃｈ）ＭＲ６００マイクロプレートリーダー
（バージニア州、アレクサンドリアのダイナテックラボ
ラトリーズ社（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．））を使用して６３０ｎｍにおける光
学密度を記録した。この一夜培養物の一部をルビアブロ
スで調整して６３０ｎｍにおける光学密度０．２を有す
る培養物を得た。この培養物約２５０μｌを栓付きの無
菌の１０ｍｌ試験管内のルビアブロス２２５０μｌに添
加し、この希薄培養物を振盪インキュベータで２８℃に
て三〜四時間、新たに育成した培養物の６３０ｎｍにお
ける光学密度が０．２となるまで育成した。この中対数
増殖期にある培養物の一部をルビアブロスで１０００倍
に希釈して、培養物１ｍｌ当たりコロニー形成単位約１
０５なるおよその濃度とした。この希薄培養物約８５μ
ｌを、単一の実験内の各ＡＭＰＰＰに対して調製された
１２ウエルからなる３種の同型培養セットを有する９６
ウエルをもつマイクロタイタープレートの各ウエルに添
加した。各ＡＭＰＰＰの原液は１ｍｇ／ｍｌの濃度で調
製し、各ペプチド原液１〜１５μｌを該マイクロタイタ
ープレートの各ウエルに添加し、次いで十分な量の水を
加えて全ウエル体積を１００μｌとした。アッセイした
典型的なペプチドの体積は０、１、２、３、４、５、
６、７、８、９、１０および１５μｌであり、これらは
０〜１５０μｇ／ｍｌの範囲の最終ペプチド濃度に相当
する。該マイクロタイタプレートをパラフィルムで封止
し、振盪台上で２８℃にて４４時間インキュベートし
た。各Ｅｃｃ ＳＲ３１９培養ウエルの光学密度を２０
時間後、次いで４４時間後に記録した。次に、最小完全
阻害濃度（ＭＣＩＣ）を、バクテリアの育成が観測され
なかった種々のペプチド濃度を各同型培養セットに対し
て測定した、表３には、各ＡＭＰＰＰについて実施した
少なくとも３回の同型培養実験から、処理の２０時間後
に観測した平均のＭＣＩＣ値（μｇ／ｍｌで表示）を掲
載した。テストしたＡＭＰＰＰは実施例１〜５、７、
９、１０、１２、１４および１５に記載のように調製も
しくは入手した。
【表５／】
【表６／】ペプチドＮｏ．７、８、１５及び１８を除
き、テストしたペプチドの殆ど全てがＥｃｃ ＳＲ３１
９の成長抑制において有効であった。先の４種のペプチ
ドは１ｍｌ当たりペプチド１５０μｇよりも高い濃度に
おいてさえＥｃｃ ＳＲ３１９に対して活性ではなかっ
た。ペプチドＮｏ．５、６、９及び１６は、１ｍｌ当た
り同じμｇの量でテストした場合に、元のモノマー（ペ
プチドＮｏ．１、２、４及び１２）の活性よりも少くと
も良好な活性を示した。実施例１８ ：植物毒性に対する酸素発生バイオアッセイ 酸素電極において使用する葉緑素の調製用の以下の方法
はグプタ（Ｇｕｐｔａ）等のＰｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．，１９８９，８９，ｐｐ．７３５−７６１に記載の
「葉緑素被膜−結合Ｍｇ＋２の測定アッセイとしてのク
ロロテトラサイクリン蛍光の発展と利用（Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｏｔｅ
ｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａ
ｓ ａＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ Ａｓｓａｙ ｏｆ Ｃ
ｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ−Ｂｏｕｎｄ
Ｍｇ＋２）」と題する論文に記載のものと同様であ
る。ホウレン草（スピナシアオレラセア（ｓｐｉｎａｃ
ｅａ ｏｌｅｒａｃｅａ）Ｌ．ｖａｒ．“メロディー
（Ｍｅｌｏｄｙ）”）を育成チャンバー内で１：１ピー
ト／ひる石注封混合物中で１０時間明所にて育成した。
このチャンバーの温度は該育成期間を通して日中は２１
℃に、また夜は１６℃に維持した。全ての植物は６〜８
週の育成後葉緑素の単離に利用した。葉緑素に富む画分
を得るために、約１２ｇの葉脈を除いたホウレン草の葉
を十分に洗浄し、表面を乾燥させた。次に、この葉を各
々約１／２インチ平方の小片に細断し、５０ｍｌの冷却
したホモジネーション用媒体（０．３３Ｍのソルビトー
ル、５０ｍＭのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）−ＮａＯＨ、ｐＨ
６．８、２ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、１ｍＭのＭｎＣｌ２
および１ｍＭのＭｇＣｌ２）を含む小さなブレンダージ
ャーに入れた。該組織をブレンダー中で高速で３秒の間
隔で２度混合した。得られたホモジネートを４層のチー
ズクロスおよび２層のミラクロス（ｍｉｒａｃｌｏｔ
ｈ；カリフォルニア州、ラジョラのベーリングダイアグ
ノスティックス（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｓ））を通して濾過し、これを２個の冷却した３０ｍ
ｌのガラス製遠心管に導いた。この濾過した溶液を、ベ
ックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）Ｊ２−２１Ｍ遠心機（ニュ
ージャージー州、ソマーセットのベックマンインストル
メンツ社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，
Ｉｎｃ．）内のスイングローター中で７５０ｇ（２，２
００ＲＰＭ）にて１．０分遠心処理した。次に、得られ
た上澄をデカンテーションし、０で攪拌してペレットを
穏やかに再懸濁させた。約１５ｍｌのホモジネート用媒
体を葉緑素の各試験管に添加し、次いで該葉緑素を３０
ｍｌのガラス製遠心管内の４０％パーコール勾配（６ｍ
ｌのＰｅｒｃｏｌｌ，９ｍｌのホモジネート用媒体およ
び０．０３ｇの牛血清アルブミン）上に層状にのせた。
これらの遠心管をベックマンＪ２−２１Ｍ遠心機内のス
イングローター中で２５００ｇ（４，０００ＲＰＭ）に
て４．０分遠心処理した。上澄を取り出し、生成ペレッ
トを少量のホモジネート用媒体（約５００μｌ）中に再
懸濁した。プラスチド濃度は、一般にクロロフィルを基
にして表示した。クロロフィルはアーノン（Ａｒｎｏ
ｎ）のＰｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９４９，２
４，ｐｐ．１−１５に記載の「単離クロロプラストにお
ける銅酵素、β−ブルガリス中のポリフェノールオキシ
ダーゼ（Ｃｏｐｐｅｒ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｉｓｏ
ｌａｔｅｄ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ，Ｐｏｌｙｐｈ
ｅｎｏｌ Ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎ Ｂｅｔａ Ｖｕｌｇ
ａｒｉｓ）」と題する文献中の方法により測定される。
約５０μｌのクロロプラスト原懸濁液を１０ｍｌの８０
％アセトンに添加し、この溶液を５分間暗所でインキュ
ベートし、次いでベックマンＧＰ遠心機で５００ｇ（１
６３０ＲＰＭ）にて５．０分間遠心処理した。このアセ
トン−クロロプラスト溶液の吸光度を６４５ｎｍ、６６
３ｎｍおよび７３０ｎｍで追跡した。次に、クロロフィ
ル濃度を１０Ｘ〔（６４５ｎｍにおける吸光度Ｘ２０．
２）＋（６６３ｎｍにおける吸光度Ｘ８．０２）−（７
３０ｎｍにおけるバックグラウンド）〕として計算し
た。これは、元の５０μｌのクロロプラストに対するμ
ｇで表したクロロフィルの量を与えた。このクロロプラ
ストの濃度を、次にホモジネート用媒体で調整し、５０
ｍｌの懸濁液が２６μｇのクロロフィルを含有するよう
にした。これらのクロロプラストは１−１／２〜２時間
に渡り活性であるにすぎないので、即座に使用した。酸
素電極（イングランド、ノーホーク、キングズリンのハ
ンザテックインストルメンツ（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）を使用して、単離されたク
ロロプラストの酸素発生を測定した。この方法の詳しい
議論についてはＤ．ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）の「光
合成の簡単な測定における酸素電極および蛍光プローブ
の利用（Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｏｘｙｇｅｎ
Ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎ
ｃｅ Ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｅａｓｕ
ｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ）」と題する上記の文献を参照のこと。飽和ＫＣｌ溶
液を該電極のウエルに入れ、１インチ平方の圧延紙また
はレンズ紙を、該紙がＫＣｌを吸収し、かつイオンブブ
リッジを形成するように該電極ウエルに設置した。表面
に触れないように注意して、１インチ平方のテフロン膜
を調製し、該浸漬紙を覆うように配置した。膜アプリケ
ータを使用して、Ｏリングを該電極の頂部上に配置し、
かくして紙と膜とが該電極を確実に横切るようにした。
ＣＢ−１Ｄ制御箱に通電して、該系を約１時間ウォーム
アップした後校正した。この系の温度は循環水浴で２０
℃に維持した。次いで、この系を空気で飽和した水中の
酸素濃度が２６７ｎＭ／ｍｌであると仮定して、脱イオ
ン水の激しく攪拌した洗浄ビンからの空気で飽和した水
を使用して校正した。ゲインスイッチを使用して、後に
出力をチャートレコーダのペンが最大チャート高さとな
るように設定した。該容器中の水から全ての空気を除去
し、かつ該チャートレコーダの０設定を実施するため
に、約２〜３ｍｇのナトリウムジチオナイトを添加し、
該ブロッタペンをグラフの底部分にまで移動するか否か
を観察した。線の傾きが不安定な場合には、該膜および
紙を取り外して該酸素電極の設定を再度行う。この酸素
電極を使用して植物毒性のバイオアッセイを実施するた
めに、該酸素電極容器に以下の成分を加えた。即ち、８
３０μｌのアッセイ媒体（２５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４を
添加したｐＨ７．６に調整したホモジネート用媒体）、
５０μｌの０．１Ｍの新鮮なＮａＨＣＯ３、２０μｌの
カタラーゼ（全体で４９．６単位／μｌ）および５０μ
ｌのクロロプラスト懸濁液（最後に添加）。次に、該電
極用の光源を点灯した。初期誘導期は平衡化されたクロ
ロプラスト系であるとした。この初期誘導期が１分以上
である場合には、クロロプラスト単離に使用した該植物
は不十分であると判定された。酸素発生性の実験におい
ては、定常的な酸素発生速度が３〜４分で達成された。
次いで、５０μｌのペプチド含有溶液をハミルトン（Ｈ
ａｍｉｌｔｏｎ）注射器を使用して添加した。酸素発生
速度はペプチド添加３分後に監視した。ペプチド添加後
のこれらの実験における酸素発生速度の低下は、該ペプ
チド添加前の該チャートレコーダ出力線の勾配と、該ペ
プチド添加後の設定点における該線の勾配と比較するこ
とにより決定した。得られた結果をクロロフィル含有量
に対して規格化した。というのは、実験間でクロロプラ
スト濃度に幾分差があったからである。これらの速度は
１時間当たり、クロロフィル１ｍｇ当たりの酸素のμＭ
として表した。最終結果を酸素発生の阻害率（％）で表
示した。該阻害率は、該ペプチド添加後の酸素発生速度
を、酸素発生の初期のコントロール速度で割り、１００
を掛け、更に１００％から得られた％を引くことにより
導かれる。表４には、最終濃度８μＭでペプチドに暴露
したクロロプラストに対して、いくつかのＡＭＰＰＰに
見られた結果をまとめた。該ペプチドは実施例１〜５、
７、９、１０、１２、１４および１５に記載の如くして
調製もしくは入手した。平均値および標準偏差を、各Ａ
ＭＰＰＰについて実施した８〜１０回の同型培養アッセ
イから算出した。コントロール酸素発生速度は７２−２
８３μＭ Ｏ２／クロロフィル時／ｍｇの範囲内であっ
た。結果における日々の変動を最小化するために各実験
では多数のペプチドの実験を実施した。
【表７／】
【表８／】種々のペプチドにより、広範囲に渡る酸素発
生の％阻害率が観測された。特にペプチドＮｏ．３、
５、６、９、１３、１５および１６は全て、該実験を実
施した各時点における酸素発生の１００％阻害を生じ
た。対照的に、ペプチドＮｏ．８、即ち逆マガイニン２
（ｒｅｖｅｒｓｅ Ｍａｇａｉｎｉｎ ２）は天然のマ
ガイニン２と比較して極めて低い植物毒性作用を示し
た。マガイニン２の配向の逆転は、抗真菌活性を維持す
るが、抗菌活性を失わせる（即ち、ペプチドＮｏ．１に
対して、ペプチドＮｏ．８の植物毒性を実質的に減じ
る）。本特許に包含される実施例に記載したように、こ
のベプチドと他のペプチドとの結合は協働的な抗真菌活
性および抗菌活性とを有するが単一のペプチド単独より
もずっと低い植物毒性を有する混合体を与えることがで
きた。実施例１９ ：全細胞植物毒性スクリーニング技術 トウモロコシＢＭＳ懸濁細胞による酸素消費を、抗生物
質ペプチドの相対的な植物毒性の指標として測定した。
ブラックメキシカンスイート（ＢＭＳ）細胞懸濁培養物
の維持は、２５ｍｌの該細胞培養物を、培養開始３日後
に栓付無菌２５０ｍｌ三角フラスコ中の２５ｍｌの新鮮
なＭＳＡ２Ｄ培地（ムラシゲ＆スクーグ（Ｍｕｒａｓｈ
ｉｇｅ ａｎｄ Ｓｋｏｏｇ）基本塩混合物、カタログ
Ｎｏ．Ｍ５５２４の４．４ｇボトル、１００ｍｇのｍｙ
ｏ−イノシトール１５０ｍｇのＬ−アスパラギン、３０
ｇのスクロース、２０ｍｌの０．１ｍｇ／ｍｌ２，４−
ジクロロフェノキシ酢酸原液および、２５ｍｇ／１００
ｍｌのパントテン酸カルシウムと、５０ｍｇ／１００ｍ
ｌのピリドキシンと、５０ｍｇ／１００ｍｌのニコチン
酸と、５０ｍｇ／１００ｍｌのチアミンと、２００ｍｇ
／１００ｍｌのグリシンとを含む１ｍｌのビタミン原液
（該成分を全て滅菌した蒸溜水１ｌに添加し、次いで２
５分１２１℃にてオートクレーブ処理して得られる））
に移すことにより行った。４日後に、該細胞培養物の１
２．５ｍｌを新鮮なＭＳＡ２Ｄ培地３５．５ｍｌに移し
た。移動管理期間を３〜４日に変えることにより、培養
物を連続的に維持した。この培養物を弱い光の下で室温
にて１２５ＲＰＭにて振盪した。酸素消費実験のため
に、細胞を新鮮な培地に移してから１日後に使用した、
細胞を滅菌した５０ｍｌの遠心管に注ぎ、重力により沈
降させた。使用済の培地を取り出して７．８ｍｌの新鮮
なＭＳＡ２Ｄ培地を該沈降細胞１ｇにつき添加した。こ
の細胞原液を連続的な通気のために振盪機に設置し、当
日に実施した全てのアッセイで使用した。酸素電極（イ
ングランド、ノーホーク、キングズリンのハンザテック
リミテッド（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ））
を腐食がないか否かについて検査した。次いで、飽和Ｋ
Ｃｌ溶液を清浄な電極ウエルに入れた。１インチ平方の
圧延紙またはレンズ紙を切り出し、該紙の端部がＫＣｌ
を吸収しイオンブリッジを形成するように該ウエル上に
配置した。表面に触れないように注意して１インチ平方
のテフロン膜を切り出し、浸漬した圧延紙上に設置し
た。膜アプリケータを使用して、Ｏリングを該電極の頂
部上に圧接し、かくして紙と膜とが該電極を確実に横切
るようにした。ＣＢ−１Ｄ制御箱（ハンザテックリミテ
ッド（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄ））に通電
して、該系を約１時間ウオームアップした後校正した。
このＣＢ−１Ｄ制御箱の出力を１Ｘに設定した。チャー
トレコーダをチャート速度３ｃｍ／ｍｉｎとなるように
その入力を０．０５Ｖに設定した。２０℃に維持した循
環水浴を該電極チャンバーに取りつけた。次いで、この
系全体を、蒸溜水を含む洗浄ビンを激しく攪拌して得た
空気で飽和した水を使用して校正した。ゲインスイッチ
を使用して、出力をチャートレコーダのペンが最大チャ
ート高さ（９００＝頂部）となるように設定した。空気
で飽和した水中の酸素濃度は２０℃にて２７６ｎＭ／ｍ
ｌであると仮定した。約２〜３ｍｇのナトリウムジチオ
ナイトを添加することにより、該容器中の水から全ての
空気を除去した。該チャートレコーダのペンをグラフの
底部分にまで移動することにより応答させた。線の傾き
が不安定な場合には、該膜および紙を取り外して該酸素
電極の設定を再度行う。１ｍｌのアッセイに対して、該
酸素電極容器に８８８μｌの水と６２．５μｌのＢＭＳ
原細胞懸濁液とを添加した。このアッセイで使用する細
胞の最終濃度は約８ｍｇ／ｍｌであった。該細胞による
酸素消費速度は該チャートレコーダで３分間追跡した。
次に、ペプチド５０μｌをハミルトン注射器を使用して
該容器に添加した。（ペプチド原液は５０μｌ中に所定
の濃度を放出するように調節した）。酸素消費はペプチ
ドの添加後５分にて追跡した。完全なテストに必要な時
間は８分であった。ペプチドの添加後酸素消費の抑止時
間は、ペプチド添加前のグラフ上の線の傾きを、ペプチ
ド添加後の設定点におけるグラフ上の線の傾きとを比較
することにより決定した。該ペプチドの添加後の酸素消
費速度を、酸素消費の初期コントロール速度で割り、次
いで１００を掛けた。次に、この％を１００％から差引
き、酸素消費の％阻害率として表された最終の結果を得
た。平均値および標準偏差を、各ＡＭＰＰＰを使用して
実施した４〜５個の同型培養アッセイから算出した。テ
ストしたＡＭＰＰＰは実施例１、４、および１４に記載
のようにして調製もしくは入手した。結果を表５に示
す。
【表９／】ペプチドＮｏ．１は、逆ペプチドＮｏ．８と
比較して、より高い酸素消費の阻害率を生じた。この結
果は、ペプチドＮｏ．１の配向の逆転がクロロプラスト
の酸素発生に及ぼす植物毒性を実質的に減じることを示
した前の実施例（実施例１８の表４を参照のこと）と一
致している。ペプチドＮｏ．２およびペプチドＮｏ．４
に対する結果は単離されたクロロプラストに及ぼす比較
的低い植物毒性作用（実施例１８の表４を参照）と比較
して、全細胞に及ぼすより大きな全体的な植物毒性が存
在することを示している。この結果は驚く程のことでは
ない。というのは、全細胞はより複雑であり、多数の代
謝経路を有し、該経路がペプチドに影響される可能性が
あるからである。ペプチドＮｏ．１のモノマーを含むオ
リゴペプチドであるペプチドＮｏ．５は該元のモノマー
と比較してそれほど違った植物毒性に及ぼす作用をもた
なかった。実施例２０ ：蛋白分解劣化に対する耐性の測定 ペプチドの細胞外植物プロテアーゼに対する感受性を測
定するために、およびこれらのプロテアーゼによるプロ
セッシングサイトを決定するために、ある系を設計し
て、トウモロコシ、タバコまたはジャガイモの葉から細
胞外流体を得、またこれらを種々のペプチドの安定性の
テストのために使用した。タバコの葉を脱イオン水で洗
浄した後、該葉から葉脈間部分を細断することにより細
胞外流体（ＥＣＦ）を得た。該セグメントを真空デシケ
ータ中で水に浸し、５〜１０分間真空を印加した。真空
を徐々に解除して、該葉を拭き取って乾燥し、４〜５片
を巻いて、５０ｍｌの使い捨て用の注射器バレル（スイ
ング遠心ローターに合うように切断されている）中に入
れた。この注射器バレルを５０ｍｌのネジキャップ式の
円錐形遠心管に入れ、６００ｘｇにて３０分間スイング
ローター内で遠心処理した。液体を回収し、微小遠心器
で１０分遠心処理した。上澄を−８０℃で保存し、後の
実験で使用した。ペプチドの細胞外植物プロテアーゼに
対する安定性をテストするために、１０μｇのペプチド
（１ｍｇ／ｍｌ）を、ｐＨ７．４の５０ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液中で１０％の細胞外液と共にインキュベー
トした。テストしたペプチドは実施例６、１３および１
４に記載の如く調製もしくは入手した。３７℃にて、
０、１５、３０、４５および６０分間インキュベートし
た後、該プロテアーゼをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を
添加して最終濃度１％（ｖ／ｖ）とすることにより不活
性化した。 ペプチドを、ヒューレットパッカード（Ｈ
ｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）ＨＰ１０９０高圧液体
クロマトグラフ（ペンシルバニア州、アボンダールのヒ
ューレツトパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒ
ｄ））上で０．１％ＴＦＡ中で５〜３５％アセトニトリ
ル勾配を使用し、３．５ｍｌ／ｍｉｎにて、２．１ｘ３
０ｍｍのＰＯＲＯＳ Ｒ／Ｈカラム（マサーチュセッツ
州、ケンブリッジのパースペクティブバイオシステムズ
（ＰｅｒＳｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））
上での逆相クロマトグラフィーにより分析した。ＥＣＦ
とのインキュベーション時間を増大すると、２つの初期
溶出ピークが親ピークから生成されることが観測され
る。表６の結果は親ピークの消失速度を示し、従って淡
白分解劣化に対する相対的な耐性を示す。該親のピーク
高さの減少速度が遅ければ遅い程、劣化の速度は遅いこ
とを示す。
【表１０／】実施例２１ ：Ｅ．コリ中で合成遺伝子を分泌および樹立
可能なペプチド遺伝子の構築 分泌可能な合成遺伝子を、普遍的な遺伝子コード、また
標的シグナルペプチド配列とは異なる該合成遺伝子の部
分に対しては、ゲンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）（ｃｆ．
Ｄ．Ｍ．バッシュ（Ｂａｓｈｅ）＆Ｊ．Ｐ．マスカレン
ハス（Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓ），Ｍａｉｚｅ Ｇｅ
ｎ．Ｃｏｏｐ．Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，１９８９，６
３，ｐｐ．４−５）における記載から収集したトウモロ
コシコドン利用表に基づいて設計した。この遺伝子はニ
ンジンエクステンシン遺伝子を含み、これは該細胞外空
間に対して該エクステンシンタンパクを標的とし（Ｊ．
チェン（Ｃｈｅｎ）およびＪ．Ｅ．バーナー（Ｖａｒｎ
ｅｒ）、ＥＭＢＯＪ．，１９８５，４，ＰＰ．２１４５
−２１５１）、ＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ認識サ
イトを含むＤＮＡ配列を介してペプチドＮｏ．１２、Ｍ
ｅｔ−（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．２０）をコードする配列に
結合されている。該ＮｃｏＩ認識サイトの存在はニンジ
ンエクステンシンシグナルペプチドとペプチドＮｏ．１
２との間にＡｌａ残基を付加する。該Ｍｅｔ−（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎｏ．２０）をコードする合成ＡＭＰＰＰ遺伝
子部分は、近接（ｆｌａｎｋｉｎｇ）の非等価なＮｃｏ
Ｉおよび植物遺伝子発現調節シグナルを含む任意のプラ
スミドベクターに有利に装入するめたのＰｓｔＩ認識配
列をもつように設計された。該合成ＡＭＰＰＰ遺伝子部
分は、モデル３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥ自動化オリゴヌク
レオチド合成装置（カリフォルニア州、フォスターシテ
ィーのアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））で化学的に合成された２個の
合成オリゴヌクレオチドから調製され、（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．２４）および（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２５）の
構造を有していた。これらの遺伝子部分は製造業者等の
指示に従って精製した。各精製したオリゴヌクレオチド
約５００ｎｇを９μｌ容量の溶液中で混合し、そこに１
μｌの１０Ｘリンカー／キナーゼ緩衝液を添加した
（Ｔ．マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等のＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐ．３９６；コールドス
プリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｄｒｙ）、コールド
スプリングハーバー、ＮＹ、１９８２を参照のこと）。
この混合物を１５分間８０℃に加熱し、次いで２００−
３００ｍｌの水中て徐々に室温まで冷却した。次に、こ
の混合物を更に６０分かけて、冷蔵庫にいれることによ
り４℃まで冷却した。アニール処理した合成ＡＭＰＰＰ
遺伝子がクローニングされ、かつ正確な配向で付加すべ
き植物遺伝子発現調節シグナルを含むプラスミドベクタ
を、該プラスミドＤＥＰＧＵＳＯ（エニモントアメリカ
社（ＥｎｉＭｏｎｔ ＡｍｅｒｉｃａＩｎｃ．）のＪ．
コッツィトルト（Ｃｏｚｚｉｔｏｒｔｏ）から入手）を
制限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩ（マサチューセッツ
州、ベバリーのニューイングランドバイオラブズ（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））で切断するこ
とにより調製した。このプラスミドＤＥＰＧＵＳＯは広
く利用されるプラスミドｐＵＣ１９（Ｃ．ヤニッシュー
ペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｏｎ）等、Ｇｅｎｅ，
１９８５，３３，ｐｐ．１０３−１１９）にクローニン
グされた種々のＤＮＡセグメントを含んでいる。これら
のＤＮＡインサートは、該ｐＵＣ１９ポリリンカー中の
ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ認識サイトから順に
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識サイトまで読むと、ＤＮＡの約５
６０塩基対のものであり、該ＤＮＡはカリフラワーモザ
イクウイルス（ストラスブルグ株）からの３５５の転写
開始サイトを包囲し、該サイトは主転写開始サイト、即
ちＸｂａＩに近接する合成ＤＮＡセグメントおよびＮｃ
ｏＩ認識サイトに関して＋１２９にあるＤｄｅＩ認識サ
イトで終端しており、また該ＤＮＡはニンジンのエクス
テンシン遺伝子の３２アミノ酸リーダーペプチド配列を
コードし（Ｊ．チェンおよびＪ．Ｅ．バーナーの上記文
献）、その後には追加Ａｌａ残基用のコドン、Ｅ．コリ
β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（Ｅ．Ｃ．３．２．
１．３１）用のＤＮＡコード配列、約５０塩基対のトラ
ンスポゾンＴｎ５由来のｎｐｔＩＩ遺伝子の非機能部
分、およびアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由
来のＴｉプラスミド（Ｈ．デグレーべ（Ｄｅ Ｇｒｏｖ
ｅ）等，Ｊ．ｏｆ Ｍｏｌ．Ａｐｐｌｉｅｎｄ Ｇｅ
ｎ．，１９８２，１，ｐｐ．４９９−５１１）からのＴ
−ＤＮＡのオクトパインシンターゼからのポリアデニル
化サイトを結合するＰｖｕＩＩフラグメント由来の約７
００塩基対のＤＮＡがある。ＤＥＰＧＵＳＯのＮｃｏＩ
およびＰｓｔＩ酵素による消化は該ＧＵＳ遺伝子を遊離
し、かつ親ベクタを生じ、該親ベクタ内では、植物細胞
中に分泌しようとするペプチドまたはタンパク融合生成
物として発現すべき適当な読み取り枠内に遺伝子を直接
クローニングできる。該プラスミドＤＥＰＧＵＳＯは３
７℃にて９０分間、４μｇのＤＮＡ、８ＵのＮｃｏＩ酵
素および２０ＵのＰｓｔＩ酵素を含む全体積１５μｌの
１ＸＫＧＢ緩衝液（Ｍ．マックレランド（ＭｃＣｌｅｌ
ｌａｎｄ）等，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１９８６、１６、ｐ．３６４）中で消化され、か
つ生成するＤＮＡフラグメントを１Ｘ ＴＡＥ緩衝液の
０．８％アガロースゲル上でゲル電気泳動することによ
り分離した（Ｔ．マニアティス等、上記文献、ｐ．１５
６）。大きなＤＮＡフラグメントをメスで切断し、１５
μｌの蒸留水中に該大きなＤＮＡフラグメントを再分散
する前に、ジーン・クリーン（Ｇｅｎｅ−Ｃｌｅａｎ；
Ｂｉｏｌ０１、ラジョラ、カリフォルニア州）で精製し
た。該大きなＤＮＡフラグメント４μｌ（即ち、約５０
０ｎｇのＤＮＡ）を、１Ｘリガーゼ緩衝液および６００
ＵＴ４ＤＮＡリガーゼ（マサーチュセッツ州、ビバリー
のニューイングランドバイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））を含む全体積２５μｌ中
で、アニールした合成ＡＭＰＰＰ遺伝子ＤＮＡ０、０．
５または１．５μｌと混合した。これらの混合物を１５
℃にて一夜インキュベートした。次に、各連結混合物５
μｌを１００μｌの受容能のあるＥ．コリ菌株ＤＨ５α
細胞（メリーランド州、ガイザースブルグのギブコＢＲ
Ｌ、ライフテクノロジーズ社（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）に添加
し、該形質転換混合物をそれぞれ氷上で４０分インキュ
ベートした。次いで、この混合物に４２℃にて６０秒熱
ショックを与え、氷上で２分間インキュベートし、次い
で５００μｌのＳＯＣ培地（Ｔ．マニアティス等，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（第２版），ｐ．Ａ．
２；コールドスプリングハーバーラボラトリー、コール
ドスプリングハーバー、ＮＹ，１９８９）を添加した
後、３７℃にて４５分間保存した。次に、この形質転換
した細胞を素早く遠沈させ、各細胞ペレートを５００μ
ｌのＬＢブロス（Ｔ．マニアティス等，上記文献、ｐ．
Ａ．１）中に再懸濁した。各形質転換細胞懸濁液の３種
の１００μｌ部分を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含有する新たなＬＢ寒天プレート上に設置し、該プレ
ートを３７℃にて一夜インキュベートした。適当なプラ
スミド構築体（この構築体をＤＥＰＭＹＰ３００と呼
ぶ）を含有する形質転換したＥ．コリクローンを、制限
酵素地図および５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る５ｍｌのＬＢブロス（Ｔ．マニアティス等，上記文
献、ｐｐ．１．２５−１．２８）中で３７℃にて一夜育
成した各コロニーからミニプレプ（ｍｉｎｉ−ｐｒｅ
ｐ）法により単離したプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配列決
定により同定した。植物発現ベクターＤＥＰＭＹＰ３０
０ＤＮＡは付随的な変更なしに、形質転換法、例えば標
的細胞中に直接形質転換ＤＮＡを装入するエレクトロポ
ーレーション、マイクロインジェクション、またはマイ
クロプロジェクタイル衝撃法などを使用して、植物形質
転換に利用できる。分化全能性の胚形成細胞のかかる形
質転換は再現性のある植物を与えることができる。上記
の如き直接形質転換法は、容易に形質転換されない作物
種、例えば単子葉栽培穀物の培養された胚形成細胞に対
して価値がある。実施例２２ ：合成ＡＭＰＰＰ Ｍｅｔ−（〔Ａｒｇ７，
Ｇｌｕ８，Ｐｒｏ２３〕マガイニン１）２ダイマー遺伝
子、該合成遺伝子のＥ．コリ中での樹立および該合成Ａ
ＭＰＰＰ遺伝子の制限発現 合成ＡＭＰＰＰ Ｍｅｔ−（〔Ａｒｇ７，Ｇｌｕ８，Ｐ
ｒｏ２３〕マガイニン１）２ダイマー遺伝子を、普遍的
遺伝子コードに基づきおよびグラム陰性バクテリアＥ．
コリ中での制限発現可能な市販品として入手できるバク
テリアプラスミドｐＫＫ２３３−２（ＬＫＢ／ファルマ
ーシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｉｎｃ．）、ニュージ
ャージー州、ピスカタウェイ）のポリリンカー領域に直
接装入するのに有利な近接の非等価なＮｃｏＩおよびＰ
ｓｔＩ認識配列をもつように設計した。該合成ＡＭＰＰ
Ｐダイマー遺伝子の制御発現は、Ｍｅｔ−（〔Ａｒ
ｇ７，Ｇｌｕ８，Ｐｒｏ２３〕マガイニン１）２の毒性
活性のために該宿主細胞の成長に及ぼす有害な影響を防
止するために望ましい。この合成遺伝子は、このペプチ
ドの発現を可能とする第一のコドンとしてのＡＴＧを
Ｅ．コリの適当な菌株に導入する。この合成遺伝子部分
は、モデル３９１ＰＣＲ−ＭＡＴＥ自動化オリゴヌクレ
オチド合成装置（カリフォルニア州、フォスターシティ
ーのアプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））上で化学的に合成された構造
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６）および（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎｏ．２７）を有する２種の合成オリゴヌクレオチドか
ら調製され、また製造業者の指示に従って精製されるで
あろう。精製した各オリゴヌクレオチド約１〜３μｇ
を、１μｌの１０Ｘリンカー・キナーゼ緩衝液を添加し
た９μｌの溶液内で混合した（Ｔ．マニアティス等，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐ．３９６；コー
ルドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリ
ングハーバー、ＮＹ，１９８２）。この混合物を８５℃
にて１５分間加熱し、次いで２００−３００ｍｌの水中
で３時間に渡り徐々に室温まで冷却した。次に、該混合
物を冷蔵庫に入れて４℃にて６０分間更に冷却した。プ
ラスミドｐＫＫ２３３−２の５μｇを、製造業者の指示
に従ってもしくは公知の方法で、全体積１５μｌ中で制
限酵素ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩ（マサーチュセッツ州、
ビバリーのニューイングランドバイオラブズ）で完全に
消化した。Ｔ．マニアティス等の上記文献、Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐｐ．９８−１０６参照。
次いで、２μｌの５Ｍ酢酸アンモニウムと７０μｌの１
００％エタノール（−２０℃）とを水性反応混合物に添
加し、該試料を１０分間−２０℃で保存した後、４℃に
て３０分間エッペンドルフの小型遠心機で遠心処理し
た。上澄を捨て、ペレットを真空下で３〜５分間乾燥し
た。次に、この乾燥したペレットを１０μｌの滅菌蒸留
水に再懸濁し、この全試料を、１Ｘ ＴＢＥ緩衝液（８
９ｍＭのＴｒｉｓ−ＯＨ、８９ｍＭの硼酸、ｐＨ８．
３、２．５ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ）中に１μｇ／ｍｌの
エチジウムブロミドを含む０．８％のアガロースゲル中
で電気泳動した。全長に渡り線状のｐＫＫ２３３−２プ
ラスミドＤＮＡを長波長ＵＶ光の照射下で可視化させ、
該線状ＤＮＡのバンドをレザーカミソリで該ゲルから切
り出した。精製した線状プラスミドＤＮＡを、製造業者
の指示に従って、あるいは同様な方法、例えばサイズ排
除クロマトグラフィーにより、ジーン・クリーン（Ｇｅ
ｎｅ−Ｃｌｅａｎ；カリフォルニア州、ラジョラのＢｉ
ｏｌ０１）を利用してこの試料から得た。Ｔ．マニアテ
ィス等の上記文献、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ，ｐｐ．４６４−４６７参照。線状ｐＫＫ２３３−２
プラスミドＤＮＡおよびアニールしたオリゴヌクレオチ
ドは、１６μｌのＤＮＡ水溶液を含む溶液中の少なくと
も０．５μｇのｐＫＫ２２３−２ＤＮＡを使用して１：
３−１：１０の範囲の比率で混合される。次いで、２μ
ｌの１０Ｘリガーゼ緩衝液（マサーチュセッツ州、ビバ
リーのニューイングランドバイオラブズ）および２μｌ
のＴ４ＤＮＡリガーゼ（マサーチュセッツ州、ビバリー
のニューイングランドバイオラブズ；４００Ｕ／μｌ）
を添加した。この連結反応混合物を１４〜１５℃にて一
夜インキュベートした。受容性のＥ．コリ菌株ＩＧ１０
９細胞（Ｉ．ゴールドバーグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）等の
「Ｅ．コリ中のコラーゲン−類似体−コード合成遺伝子
のクローニングおよび発現（Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｃｏｌｌａｇｅｎ−
ａｎａｌｏｇ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
ｇｅｎｅ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ）」と題する論文、Ｇ
ｅｎｅ，１９８９、８０、ｐｐ．３０５−３１４）を公
知の手段で調製した（Ｔ．マニアティス等、上記文献、
ｐｐ．２５０参照）。このＥ．コリ菌株を使用した。と
いうのは、これが菌株の維持中に該合成ＡＭＰＰＰ遺伝
子との相互遺伝子欠落を最小化するのに役立つ好ましい
遺伝的性質を有するからである。該連結反応混合物の２
μｌを氷上で１００μｌの受容性細胞と混合し、得られ
る混合物を氷上で３０〜６０分間放置した。次に、この
形質転換混合物を４２℃にて６０秒間加熱し、氷上で更
に２分間冷却し、次に５００μｌのＳＯＣ培地（Ｔ．マ
ニアティス等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（第
２版）、ｐ．Ａ．２；コールドスプリングハーバーラボ
ラトリー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ，１９８
９）を添加した後、３７℃にて４５分間保存した。次
に、この形質転換した細胞を遠沈させ、各細胞ペレット
を５００μｌのＬＢブロス（Ｔ．マニアティス等、上記
文献、ｐ．Ａ．１）中に再懸濁した。各形質転換細胞懸
濁液の３種の１００μｌ部分を、１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを含有する新たなＬＢ寒天プレート上に設置
し、該プレートを３７℃にて一夜インキュベートした。
適当なプラスミド構築体（この構築体をＤＥＰＭＹＰ３
００と呼ぶ）を含有する形質転換したＥ．コリクローン
を、制限酵素地図および５０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含有する５ｍｌのＬＢブロス（Ｔ．マニアティス等、
上記文献、ｐｐ．１．２５−１．２８）中で３７℃にて
一夜育成した各コロニーからミニプレプ（ｍｉｎｉ−ｐ
ｒｅｐ）法により単離したプラスミドＤＮＡのＤＮＡ配
列決定により同定した。該合成〔（ｆ）Ｍｅｔ−（〔Ａ
ｒｇ７，Ｇｌｕ８，Ｐｒｏ２３〕マガイニン１）２〕遺
伝子の制御発現は組み換えバクテリアクローンを３０〜
３７℃にて醗酵させ、２〜６０分間４２℃に該培養物の
温度を上昇することにより達成される。該培養物の温度
を次に３７℃にて３０〜９０分間低下して、該細胞を収
穫できた。このバクテリア細胞ペーストを次にフレンチ
プレスに通し、該〔（ｆ）Ｍｅｔ−（〔Ａｒｇ７，Ｇｌ
ｕ８，Ｐｒｏ２３〕マガイニン１）２〕タンパクを公知
の手段により精製できた。例えば、Ｆ．Ｍ．アンスベル
（Ａｎｓｕｂｅｌ）等編のカレントプロトコールズイン
Ｍｏｌ．Ｂｏｉｌ．の第１６章、ウィリーインターサイ
エンス、１９８８を参照のこと。また、〔（ｆ）Ｍｅｔ
−（〔Ａｒｇ７，Ｇｌｕ８，Ｐｒｏ２３〕マガイニン
１）２〕に富む該バクテリア細胞ペーストを、植物病原
体の感染またはコロニー形成の遅延もしくは排除の目的
で、一般に植物組織に直接ＡＭＰＰＰ遺伝子生成物また
はＡＭＰＰＰを放出させるために、本発明の範囲内にお
いて実施される方法の何れかにおいて利用できる。実施例２３ ：ＡＭＰＰＰ遺伝子含有植物発現カセットの
組み換えＴｉプラスミドへのサブクローニングおよびア
グロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）内での樹立 オクトパインシンターゼ転写ターミネータによりカリフ
ラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモータから該ＤＮＡ
領域を形成するＤＥＰＭＹＰ３００中に含まれる該植物
発現カセットを、多数の双子葉作物種の植物組織を形質
転換できるアグロバクテリウムツメファシエンス中の組
み換えＴｉプラスミドを樹立するという最終目的のため
に、非武装化（ｄｉｓａｒｍｅｄ）バイナリ−Ｔｉプラ
スミドにサブクローニングした。該植物発現遺伝子カセ
ットＤＥＰＭＹＰ３００中におけるコドンの利用を、ト
ウモロコシ植物中での発現に対して最適化したが、この
カセットにおけるコドン利用は、ＧＣＧソフトウェア解
析プログラムコドンフリーケンシー（ＣｏｄｏｎＦｒｅ
ｑｕｅｎｃｙ）（Ｊ．デベルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）等
のＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８４、
１２、ｐｐ．３８７−３９５を参照）を使用した検索に
より判断されるように、タバコ等のある種の双子葉植物
における発現にも利用できる。約１．３μｇのＤＥＰＭ
ＹＰ３００ＤＮＡを３７℃にて２時間２７ＵのＢａｍＨ
１制限酵素（ウイスコンシン州、マジソンのプロメガ社
（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））によ
り、１．２μｌの１０Ｘ ＢａｍＨ１緩衝液（ウイスコ
ンシン州、マジソンのプロメガ社）を含む全体積１２μ
ｌの溶液中で消化した。次に、消化したＤＮＡを１Ｘ
ＴＡＥ緩衝液（Ｔ．マニアティス等、上記文献、ｐ．１
５６）中の０．８％のアガロースゲル中で電気泳動し
た。小さなＤＮＡフラグメントをメスで切断し、製造業
者の指示に従ってジーン・クリーン（Ｇｅｎｅ−Ｃｌｅ
ａｎ；カリフォルニア州、ラジョラのＢｉｏｌ０１）で
精製し、次いで蒸留水１５μｌ中に大きなＤＮＡフラグ
メントを再懸濁した。非武装化したアグロバクテリウム
ツメファシエンスＴｉプラスミドｐＢｉｎ１９Ｂ（Ｄ．
トロリンジャー（Ｔｒｏｌｌｉｎｇｅｒ）、エニモント
アメリカ社（ＥｎｉＭｏｎｔ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎ
ｃ．）より入手）の約１．０ｍｇを、ＤＥＰＭＹＰ３０
０ＤＮＡの消化につき上記した如き条件下で制限酵素Ｂ
ａｍＨ１で同時に消化した。Ｉａｃポリリンカーの一部
の除去を除けば、このプラスミドｐＢｉｎ１９ＢはＴｉ
プラスミドｐＢｉｎ１９Ｂと同一であり（Ｍ．ベバン
（Ｂｅｖａｎ），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１９８４、１２、ｐｐ．８７１１−８７２１）、
該ポリリンカー部分は、それにもかかわらず該ポリリン
カーの固有のＢａｍＨ１およびＥｃｏＲ１制限エンドヌ
クレアーゼ認識配列を残している。該ＢａｍＨ１−切断
ｐＢｉｎ１９Ｂは、標準的方法（ｃｆ．Ｆ．Ｍ．アンス
ベル（Ａｎｓｕｂｅｌ）等編のカレントプロトコールズ
インＭｏｌ．Ｂｏｉｌ．の２．１．１章、ジョンウィリ
ー＆サンズ、ニューヨーク、ＮＹ，１９８９を参照）に
よりフェノール抽出され、エタノール沈殿され、その後
蒸留水１０μｌ中に再懸濁された。次いで、酵素連結反
応を、３Ｕ Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ウイスコンシン州、
マジソンのプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒ
ａｔｉｏｎ））および１Ｘリガーゼ緩衝液（最終濃度；
ウイスコンシン州、マジソンのプロメガ社（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を含む全体積１０μ
ｌの溶液中で、０．７μｌのＢａｍＨ１−切断ｐＢｉｎ
１９Ｂ ＤＮＡおよびＤＥＰＭＹＰ３００のより小さな
ＢａｍＨ１フラグメント３．０μｌについて実施した。
この連結試料を室温にて２時間インキュベートし、次い
で２．０μｌの該連結混合物を、氷上で、３５μｌの受
容性Ｅ．コリ菌株ＤＨ５αに添加した。この形質転換混
合物を氷上で４５分間維持し、次いで４２℃にて６０秒
間熱ショックを与え、かつ再度氷上で２分間冷却した。
後に、５００μｌのＳＯＣ培地（Ｔ．マニアティス等、
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（第２版），ｐ．
Ａ．２；コールドスプリングハーバーラボラトリー、コ
ールドスプリングハーバー、ＮＹ，１９８９）を添加し
た後、この混合物を３７℃にて４５分間保存した。各形
質転換細胞懸濁液の３種の１００μｌ部分を、５０μｇ
／ｍｌのカナマイシンを含有する新たなＬＢ寒天プレー
ト上に設置し、該プレートを３７℃にて一夜インキュベ
ートした。適当なプラスミド構築体（この構築体をＤＥ
ＰＭＹＰ３００／Ｂｉｎ１９Ｂと呼ぶ）を含有する形質
転換したＥ．コリクローンを、５０μｇ／ｍｌのカナマ
イシンを含有する５ｍｌのＬＢブロス（Ｔ．マニアティ
ス等、上記文献、ｐｐ．１．２５−１．２８）中で３７
℃にて一夜育成した各コロニーからミニプレプ（ｍｉｎ
ｉ−ｐｒｅｐ）法により単離したプラスミドＤＮＡのＤ
ＮＡの制限酵素地図により同定した。アグロバクテリウ
ムツメファシエンス菌株ＬＢＡ４４０４（Ｊ．ウィリス
（Ｗｉｌｌｉｓ）、エニモントアメリカ社より入手）の
培養物５．０ｍｌを、５００μｇ／ｍｌのストレプトマ
イシンを含むＹＥＢ培地（Ｇ．アン（Ａｎ）等の植物分
子生物学マニュアル（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ）、クルワーアカデミ
ック社（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉ
ｓｈｅｒｓ）、マサーチュセッツ州、ボストン、１９９
０を参照）中で一夜育成した。該菌株ＬＢＡ４４０４は
形質転換Ｔ ＤＮＡセグメントの欠落するＴｉプラスミ
ドを含む（Ａ．ヘケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）等、Ｎａｔｕ
ｒｅ，１９８３、３０３、ｐｐ．１７９−１８１）。次
いで、これらの細胞をＹＥＢ培地中で１００−倍に濃縮
し、ＤＥＰＭＹＰ３−／Ｂｉｎ１９Ｂ ＤＮＡの１〜２
μｇを氷上で２００μｌの受容性細胞と混合する。この
混合物を液体窒素中で５分間凍結し、次いで３７℃に５
分間暴露することにより熱ショックを与えた。次に、各
形質転換混合物に１．０μｌのＹＥＢ培地を添加し、か
つ該混合物を穏やかに振盪しつつ２９℃にて２．５時間
インキュベートした。次いで、この細胞を室温にて小型
遠心機で３０秒間（１２，５００ｒｐｍ）遠沈し、５０
０μｌのＹＥＢ培地に再懸濁し、３種の１００μｌの各
形質転換された細胞懸濁液部分を５００μｇ／ｍｌのス
トレプトマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシン
を含む新たなＹＥＢ寒天プレート上に置いた。これらの
プレートを３７℃にて一夜インキュベートした。適当な
プラスミド構築体を含む形質転換されたＡ．ツメファシ
エンスのクローンを、制限酵素地図および５００μｇ／
ｍｌのストレプトマイシンおよび５０μｇ／ｍｌのカナ
マイシンを含む５ｍｌのＹＥＢブロス（Ｇ．アンの上記
文献参照）中で２９℃にて一夜育成した個々のコロニー
からミニ−プレプ法により単離したプラスミドＤＮＡの
ＤＮＡ配列決定により同定した。ここで同定した類の組
み換えＡ．ツメファシエンスのクローンは、植物形質転
換の分野で公知の方法により、多数の作物種、主として
双子葉植物の形質転換に利用できる。実施例２４ ：合成ＡＭＰＰＰ遺伝子を担持する組み換え
Ｔｉプラスミドを含むＡ．ツメファシエンス菌株による
タバコの葉盤（ｉｅａｆ ｄｉｓｃ）の形質転換 Ａ．ツメファシエンス菌株の担持する組み換えＴｉプラ
スミドを使用した外来遺伝子によるタバコの形質転換は
双子葉植物に耕種学的に興味のある１または複数のマー
カー遺伝子を伝達するための一般的な方法となってい
る。非武装化した（即ち、非毒性の）Ｔｉプラスミドを
担持するＡ．ツメファシエンス菌株によるタバコ植物の
標準的な形質転換法は詳述されている。そのような有効
な方法の一つは、新たに切り取ったタバコ葉盤の形質転
換である。該プラスミドＤＥＰＭＹＰ３００／Ｂｉｎ１
９Ｂを担持するものとして実施例２３に記載の如く同定
されたＡ．ツメファシエンス菌株ＬＢＡ４４０４（Ａ．
ヘケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）等，Ｎａｔｕｒｅ，１９８
３、３０３、ｐｐ．１７９−１８１）の任意の単離体は
タバコ葉盤の形質転換に使用でき、該植物発現カセット
ＤＥＰＭＹＰ３００を担持するトランスジェニックタバ
コ植物の樹立に導く。実施例２３に記載の如く、この組
み換え発現カセット構築体は組み換えＴｉプラスミドを
Ａ．ツメファシエンス菌株ＬＢＡ４４０４中に樹立する
という最終的な目的のために、該非武装化したバイナリ
ーＴｉプラスミドｐＢｉｎ１９Ｂ中でサブクローニング
された。該菌株ＬＢＡ４４０４はタバコを包含する多数
の双子葉作物種の植物組織の形質転換を可能とする。組
み換えプラスミドＤＥＰＭＹＰ３００／Ｂｉｎ１９Ｂを
含むＡ．ツメファシエンス菌株ＬＢＡ４４０４によるタ
バコ葉盤の形質転換法は、Ｒ．Ｂ．ホルシュ（Ｈｏｒｓ
ｃｈ）等の植物分子生物学マニュアル（Ｐｌｎｔ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ）、ク
ルワーアカデミック社（ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、マサーチュセッツ州、ボス
トン、１９９０第５章第Ａ節）におけるｐ．Ａ５／３の
手順４から始まる「葉盤形質転換（Ｌｅａｆ Ｄｉｓｃ
Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」と題する文献に詳
細に記載されている。しかし、Ｒ．Ｂ．ホルシュ（Ｈｏ
ｒｓｃｈ）等の上記の文献のｐ．Ａ５／４における随意
の工程１３および１６は、ＤＥＰＭＹＰ３００／Ｂｉｎ
１９Ｂにより連続的に形質転換された数種の推定的トラ
ンスジェニックタバコ植物を樹立し、かつ該文献の工程
１６の例におけるように、該植物の存在を少なくとも１
種の独立の手段により確認するのに利用される。推定的
（ｐｕｔａｔｉｖｅ）トランスジェニックタバコ植物組
織中へのＴ ＤＮＡの確認における間接的な生化学的な
証拠は、アグロバクテリウムベクターｐＢｉｎ１９Ｂの
ＴＤＮＡ部分によりコードされるｎｐｔＩＩ遺伝子精製
物の酵素的検出によっても得ることができ、ここではブ
ロット法（Ｂ．ライス（Ｒｅｉｓｓ）等、Ｇｅｎｅ，１
９８４、３０、ｐｐ．２１１−２１８およびＡ．レイナ
ーツ（Ｒｅｙｎａｅｒｔｓ）等、植物分子生物学マニュ
アル（Ｐｌａｎｔ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
Ｍａｎｕａｌ），クルワーアカデミック社（Ｋｌｕｗ
ｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、マ
サーチュセッツ州、ボストン、１９９０第９章第Ａ節）
のｐｐ．Ａ９／７−８における、選択可能なおよびスク
リーニング可能なマーカー（Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ａ
ｎｄ Ｓｃｒｅｅｎａｂｌｅ Ｍａｒｌｅｒｓ）と題す
る論文）中で放射性標識されたＡＴＰおよび未標識のカ
ナマイシンを使用する。本例で記載した方法により生成
した推定的トランスジェニックタバコ植物中の該植物遺
伝子発現カセットＤＥＰＭＹＰ３００によりコードされ
るＡＭＰＰＰ融合遺伝子生成物の発現は、ノーザンハイ
ブリダイゼーション分析を介してこの植物発現カセット
により形成される特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）の検出により間接的に確認できる。全ＲＮＡは、
Ｔ．Ｃ．バーウォード（Ｖｅｒｗｏｅｒｄ）等のＲＮＡ
単離法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９
８９、１７、ｐ．２３６２）をスケールアップした方法
を使用して、タバコ葉盤形質転換開始後４〜８週の推定
的トランスジェニック植物から集めたタバコの葉の試料
の小部分から単離した。簡単に言えば、テストすべき各
植物から約１０ｇの葉の組織を洗浄し、細断して５０ｍ
ｌのベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）の遠心機に入れ、液
体窒素に入れ、そこで該植物組織を、ホモジナイズ用ド
リルバイトまたは場合により該管の底部の形状に一致す
るプラスチックアダプタを備えた３／８−インチのクラ
フツマン（ＣＲＡＦＴＳＭＡＮ）コードレスドリル（イ
リノイ州、シカゴのシアーズ、ローバック＆社（Ｓｅａ
ｒｓ，Ｒｏｅｂｕｃｋ ａｎｄＣｏ．））を使用して、
１〜２分間穏やかに粉砕した。約２５ｍｌの予備加温し
た（８０℃）抽出緩衝液（〔０．１ＭのＬｉＣｌ、０．
１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ＭのＮａ
２ＥＤＴＡ１．０％のドデシル硫酸ナトリウム〕：フェ
ノール＝１：１；使用の直前に混合）を各粉砕した組織
試料に加え、該試料を３０秒間攪拌した。約１２ｍｌの
２４：１クロロフォルム：イソアミルアルコールを各管
に添加し、該管を再度５〜３０秒間攪拌した。次に、該
管の内容物を、モデルＧＰ遠心機（ベックマンインスト
ルメンツ社（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
Ｉｎｃ．）、パロアルト、カリフォルニア州）で室温
にて最高速度で３０分間遠心処理し、各管の上部液体相
を捨てた。等量の４ＭＬｉＣｌと０．０３％のジエチル
ピロカーボネートとを各管に添加（約２０−２５ｍｌ）
し、該管を再度５〜３０秒間攪拌し、次いでこれらを４
℃にて一夜放置した。該管を翌日最高速度で、卓上遠心
機（ベックマンインストルメンツ社（Ｂｅｃｋｍａｎ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）、パロアルト、カ
リフォルニア州）で３０分間遠心し、得られた上澄を捨
てた。得られたペレットを１００％エタノール５〜１０
ｍｌで素早く濯ぎ、最高速度で、卓上遠心機にて５〜３
０分間再度遠心処理した。該エタノール上澄を各試料か
ら除去し、各ペレットを０．１％のジエチルピロカーボ
ネートと５μｌのＲＮアシン（ＲＮａｓｉｎ）阻害剤
（ウイスコンシン州、マジソンのプロメガ社（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））とで予備処理した
蒸留水５ｍｌに再懸濁した。ｐＨ５．５の３Ｍ酢酸ナト
リウム約５００μｌおよび２容の１００％エタノール
（−２０℃）とを各ＲＮＡ−含有溶液に添加し、全ての
試料を氷浴内で１．５−２時間保存した。次いで、該試
料を最高速度で、卓上遠心機にて３０分間遠心処理し
て、得られた上澄をすて、各ペレットを素早く１００％
エタノール（−２０℃）１〜５ｍｌで濯ぎ、該試料を同
一の条件下で再度遠心処理した。該上澄を再度捨て、各
ペレットを０．１％のジエチルピロカーボネート予備処
理した蒸留水５ｍｌに再懸濁した。各試料の濃度は１：
４００の希釈率で各試料を蒸留水で希釈したものについ
て、波長２３０、２４０、２６０、２８０および３２０
ｎｍにおける分光光度測定により決定した。光学密度比
１．３〜２．０の範囲のＡ２６０／Ａ２８０、１．０未
満のＡ２４０／Ａ２６０およびＡ２３０／Ａ２６０およ
び０．１５未満の範囲内のＡ３２０／Ａ２６０は許容で
きるものとされ、より好ましい値は１．５〜２．０の範
囲Ａ２６０／Ａ２８０、１．０未満のＡ２４０／Ａ
２６０およびＡ２３０／Ａ２６０および０．１０未満の
範囲内のＡ３２０／Ａ２６０であった。各試料約１１０
μｇを、標準的ノーザンハイブリダイゼーションブロッ
ト法（ｃｆ．Ｔ．マニアティス等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ（第２版），ｐｐ．７．３７−７．５
２；コールドスプリングハーバーラボラトリー、コール
ドスプリングハーバー、ＮＹ，１９８９）により変性ポ
リアクリルアミドゲル上での電気泳動にかけ、公知の技
術（Ｔ．マニアティス等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ（第２版）、上記文献、ｐｐ．７．４９−７．５
０）に従って０．２２μのナイロン膜（ＭＳＩマサーチ
ュセッツ州、ウエストボロ）に転写した。実施例２１に
記載したように全ＤＥＰＭＹＰ３００プラスミドＤＮＡ
を標準的なニックトランスレーションキット（ＢＲＬギ
ブコ（ＧＩＢＣＯ）、ライフテクノロジー社（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）メリーランド
州、ガイザースブルグ）を使用して、製造業者の指示に
従ってニックトランスレーションした。３２Ｐ−標識し
たプラスミドＤＮＡをセファデックスＧ−５０クロマト
グラフィー（Ｔ．マニアティス等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐ．４６４；コールドスプリングハ
ーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、Ｎ
Ｙ，１９８２）により精製した。この放射性標識したプ
ラスミドＤＮＡを、次に標準的な方法（Ｔ．マニアティ
ス等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（第２
版）、ｐ．７．５２；コールドスプリングハーバーラボ
ラトリー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ，１９８
９）により、ナイロン膜上でＲＮＡ試料にハイブリッド
化し、次いで該ナイロン膜を１ＸＳＳＣ（ｃｆ．Ｔ．マ
ニアティス等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
ｐ．４４７；コールドスプリングハーバーラボラトリ
ー、コールドスプリングハーバー、ＮＹ，１９８２）で
洗浄および１％のドデシル硫酸ナトリウムを含む０．１
ＸＳＳＣでの５８℃における１時間の追加の洗浄を行っ
た。次いで風乾したナイロン膜を、ＧＢＸ−２Ｘ−線フ
ィルム（イーストマンコダック（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏ
ｄａｋ），ロチェスター、ＮＹ）および１〜２枚のクロ
ネックス（Ｃｒｏｎｅｘ）増強スクリーン（デュポン社
（ＤｕＰｏｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウイルミ
ントン、ＤＥ）と共に１〜７日保存し、その後該Ｘ−線
フィルムを現像した。得られたオートラジオグラムは、
真のトランスジェニック植物から採取したこれらのＲＮ
Ａ試料に対して、約４００塩基のＲＮＡ転写を示した。実施例２５ ：抗生物ペプチドの相補混合物バイオアッセ
イ 本発明の範囲内にある抗生物ペプチドの好ましい相補混
合物は少なくとも一種の植物病原性真菌に対して比較的
活性な少なくとも一種の抗生物ペプチドおよび少なくと
も一種の植物病原性バクテリアに対して比較的活性な少
なくとも一種の第二の抗生物ペプチドを含む該ペプチド
の混合物である。これら２種のペプチドの組み合わせは
それぞれ他のペプチドの各活性を妨害することなく、植
物病原性バクテリアおよび植物病原性真菌両者の成長の
完全な阻害をもたらす。本実施例では、ペプチドＮｏ．
１（比較的抗真菌性である）とペプチドＮｏ．４（比較
的抗生物性である）とをテストした。これらのペプチド
は実施例１４に記載の如く調製もしくは入手した。これ
らペプチドを別々にまたは組み合わせて、実施例１６に
記載の如く抗真菌性バイオアッセイを実施した。テスト
すべき各ペプチドの原液はマイクロタイタプレートアッ
セイウエル内で調製し、かつ以下のような最終濃度とし
た。
【表１１／】各ペプチド原液４５μｌおよび滅菌した蒸
留水４５μｌを、単独でテストすべきペプチドに対して
真菌の胞子を含む単一のウエルに添加した。あらゆる可
能な組み合わせでテストすべきペプチドに対しては、選
択された濃度の一種のペプチド４５μｌを、単一のウエ
ル内の第二の選択された濃度のペプチドに添加した。該
マイクロタイタプレートをパラフィルムで封止し、室温
にて４８時間インキュベートした。真菌の成長を、４Ｘ
および／または１０Ｘ対物レンズを使用して顕微鏡によ
り２４および４８時間後に観察した。胞子の発芽量およ
び真菌の成長を、以下の如き＋および−系を使用して各
観察時間において定量的測定値として記録した。〔−〕
は発芽が全く起こらなかったことを示し、〔＋〕は膨ら
んだ発芽管を有する膨張胞子を意味し、〔＋＋〕は全体
としてルーズな格子の概観をもつ菌糸成長の開始を意味
し、〔＋＋＋〕は全体として厚い不透明な網状組織の概
観をもつ密な菌糸成長を意味する。次に、各ペプチドに
対するＭＣＩＣ値を記録した。このＭＣＩＣ値は胞子発
芽の生じない（ランク＝〔−〕）最低のペプチド濃度と
して定義される。以下の表７には、各ペプチドに対する
胞子発芽の程度を掲載したが、ここでペプチドＮｏ．１
（この混合物では、比較的抗真菌性のペプチドである）
の濃度がそのＭＣＩＣ値と等しい。表７は、また混合物
中の各ペプチドの濃度を同一にして、これらの抗生物質
ペプチドを組み合わせた効果をも示す。
【表１２／】これらのペプチドを別々に、あるいは組み
合わせて使用した抗生物質バイオアッセイは実施例１７
に記載の如く実施した。テストすべき各ペプチド原液約
７．５μｌおよび７．５μｌの水または第二のペプチド
の原液を各実験用の同形培養物に対する該マイクロタイ
タプレートの単一のウエルに添加した。テストしたペプ
チド希釈物は以下に示す最終ペプチド濃度に対応した。
【表１３／】該マイクロタイタプレートをパラフィルム
で封止し、振盪台上で２８℃にて４４時間までインキュ
ベートした。各ＥｃｃＳＲ３１９培養ウエルの光学密度
を２０および４４時間において記録した。次いで、最低
完全阻害濃度（ＭＣＩＣ）をペプチドＮｏ．１およびペ
プチドＮｏ．４単独に対して測定した。以下の表８に
は、各ペプチドに暴露されたバクテリアの該マイクロタ
イタプレート中の単一のウエル中でのバクテリアの成長
の％阻害率を示し、そこではペプチドＮｏ．４（この混
合物中では比較的抗生物性のペプチドである）の濃度が
そのＭＣＩＣ値に等しい。表８は、また混合物中の各ペ
プチドの濃度を単独の場合と同一にして、これらの抗生
物質ペプチドを組み合わせた効果をも示す。
【表１４／】表７および８にまとめた結果を比較する
と、ペプチドＮｏ．１に対して２０μｇ／ｍｌおよびペ
プチドＮｏ．４に対して５μｇ／ｍｌの濃度がこれら２
種のペプチドの相補混合物に要求される要件を満たすこ
とを理解でき、この組み合わせがバクテリアおよび真菌
の植物病原体両者の成長を効果的に遅延することがわか
る。本発明の原理、好ましい態様および操作の様式を本
明細書において記載してきた。しかし、保護さるべき本
発明はここに記載の特定の態様に限定しようとするもの
ではない。というのは、これら特定の態様は本発明を限
定するのではなく、むしろ例示的なものであるからであ
る。他の者にとっては、本発明の精神並びに範囲を逸脱
することなしに種々の変更並びに置換が可能である。 配列リスト （１）一般的情報 （ｉ）出願人：マペリ（Ｍａｐｅｌｌｉ）Ｐｈ．Ｄ，ク
ラウディオ（Ｃｌａｕｄｉｏ） デロバーティス（ＤＲｏｂｅｒｔｉｓ）、キャシー（Ｃ
ａｔｈｙ） スタール（Ｓｔａｈ１）、ジェリー（Ｊｅｒｒｙ） スワードロフ（Ｓｗｅｒｄｌｏｆｆ）Ｐｈ．Ｄ，ミカエ
ル（Ｍｉｃｈａｅｌ）Ｄ． ウイリアム（Ｗｉｌｌｉａｍ）Ｐｈ．Ｄ，ジョン（Ｊｏ
ｎ）Ｉ． エベレット（Ｅｖｅｒｅｔｔ）Ｐｈ．Ｄ，ニコラス（Ｎ
ｉｃｈｏｌａｓ）Ｐ． バスコーム（Ｂａｓｃｏｍｂ）Ｐｈ．Ｄ，ニューエル
（Ｎｅｗｅｌｌ） （ｉｉ） 発明の名称：特に植物病原体に対する保護用
の、逆抗生物ペプチド、抗生物オリゴペプチドおよび他
の抗生物組成物、およびその製造並びに使用法 （ｉｉｉ）配列数：２７ （ｉｖ） 通信用住所 （Ａ）受信人：レーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）、デービッド
（Ｄａｖｉｄ）、リッテンバーグ（Ｌｉｔｔｅｎｂｅｒ
ｇ）、クラムホルツ（Ｋｒｕｍｈｏｌｚ）＆メントリッ
ク（Ｍｅｎｔｌｉｋ） （Ｂ）ストリート：６００サウスアベニュ（Ｓｏｕｔｈ
Ａｖｅ．）、ウエストスート（Ｗｅｓｔ，Ｓｕｉｔ
ｅ）３００ （Ｃ）シティー：ウエストフィールド（Ｗｅｓｔｆｉｅ
ｌｄ） （Ｄ）州：ニュージャージー（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ） （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ジップコード（ＺＩＰ）：０７０９０ （ｖ）コンピュータ読みだし形式 （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣコンパーチブル （Ｃ）作動システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＮＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：パテンティンリリース（Ｐａｔｅ
ｎｔＩｎ Ｒｅｌｅａｓｅ）＃１．０、バージョン＃
１．２５ （ｖｉ）現出願日 （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人情報 （Ａ）名称：テシュナーＥｓｑ．，ミカエル（Ｍｉｃｈ
ａｅｌ）Ｈ （Ｂ）登録番号：３２，８６２ （Ｃ）書類番号：エニモント（Ｅｎｉｍｏｎｔ）３．０
−０４２ （ｉｘ）通信情報 （Ａ）電話番号：９０８−６５４−５０００ （Ｂ）ファックス番号：９０８−６５４−７８６６ （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に関する情報； （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：２３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
【化３／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：２３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２
【化４／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：２３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３
【化５／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：４アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４
【化６／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：５アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５
【化７／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：３１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６
【化８／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：２１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７
【化９／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：３７アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｉｘ）特徴 （Ａ）名称／キー名：変性−サイト（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ
−ｓｉｔｅ （Ｂ）位置：３７ （Ｄ）他の情報：注意＝Ｃ−末端アミノ酸はアミド形状
にある。 （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．８
【化１０／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：２３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９
【化１１／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：２３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０
【化１２／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：２３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１１
【化１３／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：２３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１２
【化１４／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：３１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３
【化１５／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：３７アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１４
【化１６／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：２１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１５
【化１７／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：１２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１６
【化１８／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：２１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７
【化１９／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：６アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１８
【化２０／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：１６アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１９
【化２１／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：２３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２０
【化２２／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：３２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２１
【化２３／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：２８アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２
【化２４／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：１５アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸． （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ペプチド （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２３
【化２５／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２４に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：８７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド型：一本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２４
【化２６／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２５に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：７９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド型：一本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２５
【化２７／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：１５６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド型：一本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２６
【化２８／】 （２）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２７に関する情報： （ｉ）配列特性 （Ａ）長さ：１４８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド型：一本鎖 （Ｄ）形状：線状 （ｉｉ）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｘｉ）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２７
【化２９／】
【図面の簡単な説明】
【図１】好ましいペプチド、ペプチドモノマー、及びブ
リッジ、ならびにオリゴヌクレオドを含む表であり、そ
の総ては慣用の一文字表記で示されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キャサリン ダガス デ ロバーツ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08512クランベリィ ウッド ミル ドラ イヴ 213 (72)発明者 ゲラルディン フランシス スタール アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08629トレントン リンデイル アベニュ ー 1006 (72)発明者 ニューエル フレッド バスコム アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08648ロウレンスヴィル ガロ コート ９ (72)発明者 マイケル デニス スウェドロフ アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08540プリンストン アルドゲート コー ト 14 (72)発明者 ジョン アイラ ウィリアムス アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08691ロヴィンスヴィル ダーベル ドラ イヴ 11 (72)発明者 ニコラス ポール エバレット アメリカ合衆国 ニュージャージー州 08534ペニングトン シティ バード ロ ード 292 ジェイ

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 少くとも一つの第一のペプチドモノマー
    及び少くとも一つの第二のペプチドモノマーを含む複数
    のペプチドサブユニットを含むオリゴペプチドであっ
    て、上記モノマーの夫々がＮ末端及びＣ末端を含み、上
    記少くとも一つの第一のペプチドモノマーはそのＣ末端
    で上記少くとも一つの第二のペプチドモノマーのＮ末端
    にペプチド結合により結合され、上記オリゴペプチドは
    少くとも一つの微生物病原体に対して活性であり、上記
    少くとも一つの第一のペプチドモノマー及び上記少くと
    も一つの第二のペプチドモノマーは少くとも一つの微生
    物病原体に対して活性であり、かつ上記少くとも一つの
    第一のペプチドモノマー及び少くとも一つの第二のペプ
    チドモノマーは同一であっても異っていてもよいオリゴ
    ペプチド。
  2. 【請求項２】 少くとも一つの第一のペプチドモノマー
    及び少くとも一つの第二のペプチドモノマーを含む複数
    のペプチドサブユニットを含むオリゴペプチドであっ
    て、上記ペプチドの夫々がＮ末端及びＣ末端を含み、上
    記少くとも一つの第一のペプチドモノマー及び上記少く
    とも一つの第二のペプチドモノマーはジスルフィド結合
    により結合され、上記オリゴペプチドは少くとも一つの
    微生物病原体に対して活性であり、上記少くとも一つの
    第一のペプチドモノマー及び上記少くとも一つの第二の
    ペプチドモノマーは少くとも一つの微生物病原体に対し
    て活性であり、かつ上記少くとも一つの第一のペプチド
    モノマー及び少くとも一つの第二のペプチドモノマーは
    同一であっても異っていてもよいオリゴペプチド。
  3. 【請求項３】 上記少くとも一つの第一のペプチドモノ
    マー及び上記少くとも一つの第二のペプチドモノマーが
    結合されているところの末端の少くとも一つにペプチド
    結合により結合されている少くとも一つの別のペプチド
    を更に含む請求項２記載のオリゴペプチド。
  4. 【請求項４】 少くとも一つのペプチドサブユニットを
    上記ジスルフィド結合から隔てる少くとも一つのブリッ
    ジを更に含む請求項２記載のオリゴペプチド。
  5. 【請求項５】 上記ペプチドモノマーの少くとも一つ
    が、そのＮ又はＣ末端以外でＣｙｓにより置換されてい
    る請求項２記載のオリゴペプチド。
  6. 【請求項６】 上記ペプチドモノマーの少くとも一つが
    その末端の一つにＣｙｓを有する請求項２記載のオリゴ
    ペプチド。
  7. 【請求項７】 少くとも一つの第一のペプチドモノマー
    及び少くとも一つの第二のペプチドモノマーを含む複数
    のペプチドサブユニットを含むオリゴペプチドであっ
    て、上記ペプチドモノマーの夫々がＮ末端及びＣ末端、
    及び少くとも一つのアミノ酸を含む一つのブリッジを含
    み、上記少くとも一つのブリッジはＮ末端及びＣ末端を
    含み、上記少くとも一つのブリッジのＮ末端は上記少く
    とも一つの第一のペプチドモノマーのＣ末端にペプチド
    結合により結合され、上記少くとも一つのブリッジのＣ
    末端は上記少くとも一つの第二のペプチドモノマーのＮ
    末端にペプチド結合により結合され、上記オリゴペプチ
    ドは少くとも一つの微生物病原体に対して活性であり、
    上記少くとも一つの第二のペプチドモノマー及び上記少
    くとも一つの第二のペプチドモノマーは少くとも一つの
    微生物病原体に対して活性であり、かつ上記少くとも一
    つの第一のペプチドモノマー及び少くとも一つの第二の
    ペプチドモノマーは同一であっても異っていてもよく、
    但し、上記オリゴペプチドがマガイニンＰｒｅ−ｐｒｏ
    蛋白質の構造を持たないオリゴペプチド。
  8. 【請求項８】 上記ペプチドサブユニットを上記ブリッ
    ジに結合するペプチド結合の少くとも一つを横切るジス
    ルフィド結合、又はブリッジをそれ自体に結合するジス
    ルフィド結合を更に含む請求項７記載のオリゴペプチ
    ド。
  9. 【請求項９】 上記少くとも一つのブリッジが約１〜約
    １００のアミノ酸を含む請求項７記載のオリゴペプチ
    ド。
  10. 【請求項１０】 上記少くとも一つのブリッジが約１〜
    約２０のアミノ酸を含む請求項８記載のオリゴペプチ
    ド。
  11. 【請求項１１】 上記ブリッジが、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａ
    ｓｎ，Ａｓｐ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉ
    ｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒ
    ｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，及びＶａｌの群
    から選ばれる単一アミノ酸である請求項１０記載のオリ
    ゴペプチド。
  12. 【請求項１２】 上記少くとも一つのブリッジが、Ａｌ
    ａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌ
    ｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈ
    ｅ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，及びＶａｌから
    選ばれる請求項１１記載のオリゴペプチド。
  13. 【請求項１３】 上記少くとも一つのブリッジが、Ａｌ
    ａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌ
    ｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅ
    ｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙ
    ｒ，及びＶａｌから成る群から選ばれた２〜５のアミノ
    酸を含む請求項１０記載のオリゴペプチド。
  14. 【請求項１４】 上記少くとも一つのブリッジが、Ａｌ
    ａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌ
    ｕ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈ
    ｒ，Ｔｙｒ，及びＶａｌから成る群から選ばれたアミノ
    酸より成る請求項１３記載のオリゴペプチド。
  15. 【請求項１５】 上記少くとも一つのブリッジが（ＳＥ
    Ｑ ＩＤ Ｎｏ．５）の構造を持ち、ここでＸａａ１〜
    Ｘａａ５は夫々、Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，Ｓｅｒ，Ａ
    ｒｇ，及びＰｒｏより成る群から選ばれたアミノ酸であ
    る請求項１４記載のオリゴペプチド。
  16. 【請求項１６】 Ｘａａ１〜Ｘａａ５が夫々Ｇｌｙであ
    る請求項１５記載のオリゴペプチド。
  17. 【請求項１７】 上記少くとも一つのブリッジがオメガ
    ループである請求項７記載のオリゴペプチド。
  18. 【請求項１８】 上記少くとも一つのブリッジがトラン
    スメンブラン蛋白質の細胞外ドメインである請求項７記
    載のオリゴペプチド。
  19. 【請求項１９】 上記少くとも一つのブリッジがベータ
    ターンである請求項７記載のオリゴペプチド。
  20. 【請求項２０】 上記ペプチドモノマーの少くとも一つ
    が、植物病原体に対して活性を抗菌性ペプチドである請
    求項１、２又は７記載のオリゴペプチド。
  21. 【請求項２１】 約２〜約１６のペプチドモノマーを含
    む請求項２０記載のオリゴペプチド。
  22. 【請求項２２】 上記少くとも一つの第一のペプチドモ
    ノマー及び上記少くとも一つの第二のペプチドモノマー
    が少くとも一つの植物病原体に対して活性な抗菌性ペプ
    チドであり、かつ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、（ＳＥ
    Ｑ ＩＤ Ｎｏ．２）、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）、
    （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７）、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
    ８）、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．９）、（ＳＥＱ ＩＤ
    Ｎｏ．１０）、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１３）、（ＳＥ
    Ｑ ＩＤ Ｎｏ．１５）、及び上記ペプチドの単一残基
    欠如誘導体、上記ペプチドの複数残基欠如誘導体、上記
    ペプチドの単一残基置換誘導体、上記ペプチドの複数残
    基置換誘導体、又は上記ペプチドの単一残基末端付加誘
    導体より成る群から選ばれた上記ペプチドの機能的誘導
    体より成る群から選ばれる請求項２１記載のオリゴペプ
    チド。
  23. 【請求項２３】 Ｃ末端アミドを更に含む請求項２２記
    載のオリゴペプチド。
  24. 【請求項２４】 上記少くとも一つの第１のペプチドモ
    ノマー及び上記少くとも一つの第二のベプチドモノマー
    の少くとも一つが、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）及び
    （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）より成る群から選ばれた構
    造を持つペプチドの複数残基置換誘導体であり、かつペ
    プチド構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）〔ここでＸａａ
    ５、Ｘａａ６、Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ１０、Ｘａ
    ａ１１、Ｘａａ１２、Ｘａａ１３、Ｘａａ１８、Ｘａａ
    １９、Ｘａａ２１、Ｘａａ２２、及びＸａａ２３は、互
    に同じでも異ってもよく、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ａ
    ｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌ
    ｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅ
    ｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ及びＶａｌから成る群から
    選ばれる〕を有する請求項２２記載のオリゴペプチド。
  25. 【請求項２５】 Ｘａａ５はＰｈｅ，Ｃｙｓ，Ｉｌｅ，
    Ｌｅｕ，Ｔｒｐ及びＶａｌから成る群から選ばれたアミ
    ノ酸であり、Ｘａａ６はＡｓｎ，Ｉｌｅ，Ｃｙｓ，及び
    Ｌｅｕより成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ
    ７は、Ｐｈｅ，Ａｌａ，Ｃｙｓ，Ｍｅｔ，Ｓｒｅ，Ｔｈ
    ｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｇｌｎ，Ｐｒｏ，Ｌｙｓ，Ａｓ
    ｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，及びＡｒｇから成る群か
    ら選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ８はＡｌａ，Ｃｙ
    ｓ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙ
    ｒ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｓ
    ｐ，及びＡｒｇより成る群から選ばれたアミノ酸であ
    り、Ｘａａ１０はＧｌｙ，Ｌｙｓ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖ
    ａｌ，Ａｌａ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｒ
    ｐ，Ｔｙｒ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉ
    ｓ，Ａｓｐ及びＡｒｇより成る群から選ばれたアミノ酸
    であり、Ｘａａ１１はＭｅｔ，Ｃｙｓ，Ｔｒｐ，Ｔｙ
    ｒ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，及びＡ
    ｒｇから成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ
    １２は、Ｐｈｅ，Ｃｙｓ，Ｉｌｅ，Ｔｒｐ，Ｌｅｕ及び
    Ｖａｌから成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ
    １３はＬｅｕ，Ｉｌｅ，Ｃｙｓ，Ｔｒｐ，Ｐｈｅ，Ｖａ
    ｌ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，及びＰｒｏから成る群から選ばれ
    たアミノ酸であり、Ｘａａ１８はＴｈｒ，Ｃｙｓ，Ｔｒ
    ｐ，Ｔｙｒ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｇｌ
    ｎ，Ｈｉｓ，Ｍｅｔ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，及びＰｒｏから
    成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１９はＣｙ
    ｓ，Ａｌａ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ
    及びＴｒｐから成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘ
    ａａ２１及びＸａａ２３は同じでも異ってもよく、Ａｒ
    ｇ，Ａｓｐ，Ｃｙｓ，Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｇｌ
    ｎ，Ｔｙｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｍｅｔ，Ｓｅｒ，Ａｌ
    ａ，Ｐｈｅ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，及びＰｒｏより
    成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ２２はＣｙ
    ｓ，Ａｒｇ，Ａｓｐ，Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｌｙ
    ｓ，Ｇｌｎ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｍｅｔ，Ａｓｎ，Ａｌ
    ａ，Ｐｒｏ，ｓｅｒ，及びＴｈｒより成る群から選ばれ
    たアミノ酸である請求項２４記載のオリゴペプチド。
  26. 【請求項２６】 植物病原体に対して活性な上記抗菌性
    ペプチドが、少くとも一つの植物プロテアーゼによる減
    成に抵抗性である請求項２４記載のオリゴペプチド。
  27. 【請求項２７】 Ｘａａ７、Ｘａａ８、Ｘａａ２１、Ｘ
    ａａ２２及びＸａａ２３より選ばれた基の少くとも一つ
    が置換されている請求項２６記載のオリゴペプチド。
  28. 【請求項２８】 Ｘａａ７がＰｈｅ，Ａｌａ，Ｈｉｓ，
    Ｌｙｓ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，Ｓｒｅ，及びＡｒｇより成る
    群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ８がＴｈｒ，Ａ
    ｓｐ，Ｈｉｓ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，及びＧｌｕより成る群
    から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ２１がＡｒｇ，Ｌ
    ｙｓ，Ｈｉｓ，Ｇｌｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｔｈｒ，Ａｌ
    ａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｐｈｅ，Ｇｌｕ，Ａｓ
    ｐ，及びＭｅｔより成る群から選ばれたアミノ酸であ
    り、Ｘａａ２２がＡｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｈｉｓ，Ｇ
    ｌｎ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，Ｃｙ
    ｓ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｇｌｕ，Ａｓｐ，及びＭｅｔより
    或る群から選ばれたアミノ酸であり、そしてＸａａ２３
    がＳｅｒ，Ｐｒｏ，Ｌｅｕ，Ｃｙｓ，Ｖａｌ，Ｉｌｅ及
    びＴｒｐより成る群から選ばれたアミノ酸である請求項
    ２７記載のオリゴペプチド。
  29. 【請求項２９】 上記少くとも一つの第一のペプチド及
    び上記少くとも一つの第二のペプチドが、（ＳＥＱ Ｉ
    Ｄ Ｎｏ．１）、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）、（ＳＥ
    Ｑ ＩＤ Ｎｏ．７）、及び（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
    ６）より成る群及びその機能的誘導体から選ばれる請求
    項２２記載のオリゴペプチド。
  30. 【請求項３０】 （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）にペプチ
    ド結合された（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）、（ＳＥＱ
    ＩＤ Ｎｏ．６）にペプチド結合された（ＳＥＱ ＩＤ
    Ｎｏ．３）、ブリッジに結合された（ＳＥＱ ＩＤ
    Ｎｏ．６）ペプチド、但しここでブリッジもまた（ＳＥ
    Ｑ ＩＤ Ｎｏ．３）にペプチド結合されている、又は
    ブリッジにペプチド結合された（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
    ３）、但しここでブリッジもまた（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．６）にベプチド結合されている、及びこれらの機能
    的誘導体より成る群から選ばれた構造を持つ請求項２４
    記載のオゴペプチド。
  31. 【請求項３１】 上記オリゴペプチドのＮ末端に結合さ
    れたシグナルペプチドを更に含む請求項２０記載のオリ
    ゴペプチド。
  32. 【請求項３２】 上記オリゴペプチドのＮ末端に結合さ
    れたシグナルペプチドを更に含む請求項２２記載のオリ
    ゴペプチド。
  33. 【請求項３３】 （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７）のアミノ
    酸構造を持つペプチド及びその機能的誘導体を含む組成
    物。
  34. 【請求項３４】 （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、（ＳＥ
    Ｑ ＩＤ Ｎｏ．９）、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１
    ０）、（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３）、及び（ＳＥＱ Ｉ
    Ｄ Ｎｏ．２）、より成る群から選ばれたアミノ酸構造
    をペプチドの単一残基置換誘導体を含み、上記ペプチド
    は単一のＣｙｓで置換されているか、又はそのＮまたは
    Ｃ末端の一方に付属する単一Ｃｙｓを有するところの組
    成物。
  35. 【請求項３５】 少くとも一つの微生物病原体に対して
    活性な抗菌性反転ペプチドであるペプチドを含む組成
    物。
  36. 【請求項３６】 少くとも一つの微生物病原体に対して
    活性な上記抗菌性反転ペプチドが、少くとも一つの微生
    物性植物病原体に対して活性である請求項３５記載の組
    成物。
  37. 【請求項３７】 上記ペプチドが（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．９）及びその機能的誘導体のアミノ酸構造を持つ請
    求項３６記載の組成物。
  38. 【請求項３８】 上記ペプチドが（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．１０）及びその機能的誘導体のアミノ酸配列を有す
    る請求項３６記載の組成物。
  39. 【請求項３９】 上記ペプチドが（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．１１）のアミノ酸構造を有し、ここでＸａａ１、Ｘ
    ａａ２、Ｘａａ３、Ｘａａ５、Ｘａａ６、Ｘａａ１１、
    Ｘａａ１２、Ｘａａ１３、Ｘａａ１４、Ｘａａ１６、Ｘ
    ａａ１７、Ｘａａ１８、及びＸａａ１９は同じでも異っ
    てもよく、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，
    Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌ
    ｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒ
    ｐ，Ｔｙｒ，及びＶａｌより成る群から選ばれる請求項
    ３６記載の組成物。
  40. 【請求項４０】 上記ペプチドが（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．１１）のアミノ酸構造を持ち、ここでＸａａ１及び
    Ｘａａ３は同じでも異ってもよく、Ａｒｇ，Ａｓｐ，Ｃ
    ｙｓ，Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，Ｌｙｓ，Ｇｌｎ，Ｔｙｒ，Ｔｈ
    ｒ，Ｔｒｐ，Ｍｅｔ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｐｈｅ，Ｖａ
    ｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，及びＰｒｏより成る群から選ばれ
    たアミノ酸であり、Ｘａａ２はＡｒｇ，Ａｓｐ，Ｃｙ
    ｓ，Ｈｉｓ，Ｇｌｕ，Ｓｅｒ，Ｇｌｙ，Ｌｙｓ，Ｇｌ
    ｎ，Ｔｙｒ，Ｍｅｔ，Ａｓｎ，Ａｌａ，Ｐｒｏ，及びＴ
    ｈｒより成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ５
    はＡｌａ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，Ｇｌｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，
    Ｍｅｔ，及びＴｒｐより成る群から選ばれたアミノ酸で
    あり、Ｘａａ６はＴｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ａｓｐ，Ｇ
    ｌｕ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ｍｅｔ，Ａｌ
    ａ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ，及びＧｌｙより成る群から選ばれ
    たアミノ酸であり、Ｘａａ１１はＬｅｕ，Ｉｌｅ，Ｃｙ
    ｓ，Ｐｒｏ，Ｔｒｐ，Ｐｈｅ，Ｖａｌ，Ａｌａ，及びＧ
    ｌｙより成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ
    １２はＰｈｅ，Ｉｌｅ，Ｔｒｐ，Ｌｅｕ，Ｃｙｓ，及び
    Ｖａｌより成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ
    １３はＭｅｔ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｌｙ
    ｓ，Ｈｉｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，及びＡｒｇより成る群か
    ら選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１４はＧｌｙ，Ｌｅ
    ｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ａｌａ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ，Ｃｙ
    ｓ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｇｌｎ，Ｌｙ
    ｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，及びＡｒｇより
    成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１６はＡｌ
    ａ，Ｍｅｔ，Ｔｈｒ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙ
    ｒ，Ｇｌｎ，Ｌｙｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓ
    ｐ，及びＡｒｇより成る群から選ばれたアミノ酸であ
    り、Ｘａａ１７はＰｈｅ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ，Ｃ
    ｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｇｌｎ，Ｌｙ
    ｓ，Ａｓｎ，Ｇｌｕ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，及びＡｒｇより
    成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１８はＡｓ
    ｎ，Ｉｌｅ，Ｃｙｓ，Ｐｒｏ及びＬｅｕより成る群から
    選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１９はＰｈｅ，Ｃｙ
    ｓ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｔｒｐ及びＶａｌより成る群から
    選ばれたアミノ酸である請求項３９記載の組成物。
  41. 【請求項４１】 ペプチド結合によりＮ末端に結合され
    た単一アミノ酸である単一残基Ｎ末端付加を更に含む請
    求項４０記載の組成物。
  42. 【請求項４２】 上記ペプチドが（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．１２）のアミノ酸配列を有し、ここでＸａａ１はＳ
    ｅｒ，Ｃｙｓ及びＰｒｏより成る群から選ばれたアミノ
    酸であり、Ｘａａ２はＣｙｓ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ
    及びＡｓｎより成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘ
    ａａ６はＣｙｓ，Ｇｌｙ及びＡｌａより成る群から選ば
    れたアミノ酸であり、Ｘａａ１１はＣｙｓ，Ｇｌｙ及び
    Ａｌａより成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ
    １４はＣｙｓ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ａｒｇ及びＬｙｓより
    成る群から選ばれたアミノ酸であり、Ｘａａ１６はＣｙ
    ｓ，Ｓｅｒ，Ａｌａ，Ｇｌｕ及びＴｈｒより成る群から
    選ばれたアミノ酸であり、そしてＸａａ１７はＣｙｓ，
    Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ及びＰｈｅより成る群から選ば
    れたアミノ酸である請求項３６記載の組成物。
  43. 【請求項４３】 上記ペプチドが（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．１３）及びその機能的誘導体のアミノ酸配列を持つ
    請求項３６記載の組成物。
  44. 【請求項４４】 上記ペプチドが（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．１４）及びその機能的誘導体のアミノ酸配列を持つ
    請求項３６記載の組成物。
  45. 【請求項４５】 上記ペプチドが（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．１５）及びその機能的誘導体のアミノ酸配列を持つ
    請求項３６記載の組成物。
  46. 【請求項４６】 そのＮ末端に結合されたシグナルペプ
    チドを更に含む請求項３４又は３６〜４５のいずれか１
    項記載の組成物。
  47. 【請求項４７】 一つの群の病原体に対して比較的活性
    であり、他の群の病原体に対して比較的低活性な少くと
    も一つの第一の抗類性ペプチド、及び上記少くとも一つ
    の第一の抗菌性ペプチドが比較的不活性であるところの
    病原体の群に対して比較的活性であり、かつ上記少くと
    も一つの第一の抗菌性ペプチドが比較的活性であるとこ
    ろの病原体の群に対して比較的不活性である少くとも一
    つの第二の抗菌性ペプチドを含む抗菌性組成物。
  48. 【請求項４８】 上記少くとも一つの第一の抗菌性ペプ
    チド及び上記少くとも一つの第二の抗菌性ペプチドが植
    物病原体に対して活性である請求項４７記載の抗菌性組
    成物。
  49. 【請求項４９】 上記少くとも一つの第一の抗菌性ペプ
    チドが植物病原性バクテリアに対して比較的活性であ
    り、かつ植物病原性真菌に対して比較的不活性であり、
    上記少くとも一つの第二の抗菌性ペプチドが植物病原性
    真菌に対して比較的活性であり、かつ植物病原性バクテ
    リアに対して比較的不活性である請求項４８記載の抗菌
    性組成物。
  50. 【請求項５０】 上記少くとも一つの第一の抗菌性ペプ
    チドが（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６）；（ＳＥＱ ＩＤ
    Ｎｏ．３）ここでＸａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅ
    ｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０
    はＬｙｓ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、
    Ｘａａ１３はＡｌａ、Ｘａａ１８はＡｌａ、Ｘａａ１９
    はＩｌｅ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、Ｘａａ２２はＡｓｎ、
    そしてＸａａ２３はＳｅｒである；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．３）ここでＸａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅｕ、
    Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０はＬ
    ｙｓ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、Ｘａ
    ａ１３はＡｌａ、Ｘａａ１８はＡｌａ、Ｘａａ１９はＩ
    ｌｅ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、Ｘａａ２２はＡｓｎ、そし
    てＸａａ２３はＳｅｒであり、かつＮ末端Ｇｌｙに結合
    されたＭｅｔペプチドを有する；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．２）にペプチド結合された（ＳＥＱ ＩＤＮｏ．
    ２）；（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５）にペプチド結合され
    た（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）；ここでＸａａ１〜Ｘａ
    ａ５は構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）の他のペプチド
    に同じく結合されているＧｌｙである；（ＳＥＱ ＩＤ
    Ｎｏ．３）ここでＸａａ５はＰｈｅ、Ｘａａ６はＬｅ
    ｕ、Ｘａａ７はＨｉｓ、Ｘａａ８はＳｅｒ、Ｘａａ１０
    はＬｙｓ、Ｘａａ１１はＬｙｓ、Ｘａａ１２はＰｈｅ、
    Ｘａａ１３はＡｌａ、Ｘａａ１８はＡｌａ、Ｘａａ１９
    はＩｌｅ、Ｘａａ２１はＭｅｔ、Ｘａａ２２はＡｓｎそ
    してＸａａ２３はＳｅｒであるより成る群から選ばれる
    請求項４９記載の抗菌性組成物。
  51. 【請求項５１】 上記少くとも一つの第二の抗菌性ペプ
    チドが（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、（ＳＥＱ ＩＤ
    Ｎｏ．２）、Ｎ末端Ｇｌｙにペプチド結合されたＭｅｔ
    を持つ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）、位置２１のＭｅｔ
    が酸化されている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）、位置２
    １のＭｅｔが除去されている（ＳＥＱＩＤ Ｎｏ．
    １）、Ｎ末端Ｇｌｙが除去され、かつ位置２のＩｌｅが
    Ｍｅｔで置き代えられている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
    ２）、位置１０のＬｙｓがＨｉｓで置き代えられている
    （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）、位置１１のＬｙｓがＨｉ
    ｓで置き代えられている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）、
    位置１０及び１１のＬｙｓが夫々Ｈｉｓ及びＨｉｓで置
    き代えられている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）、位置８
    のＳｅｒがＴｈｒで置き代えられている（ＳＥＱ ＩＤ
    Ｎｏ．２）、位置８のＳｅｒがＡｌａで置き代えられ
    ている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）、位置８のＳｅｒが
    Ｇｌｕで置き代えられている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
    ２）、位置７のＨｉｓがＰｈｅで置き代えられている
    （ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）、夫々位置２２及び２３の
    Ａｓｎ及びＳｅｒが除去されている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
    ｏ．２）、位置１０のＧｌｙがＨｉｓで置き代えられて
    いる（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、Ｎ末端Ｇｌｙが除去
    されている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）、Ｎ末端Ｇｌｙ
    及び位置２のＩｌｅが除去されている（ＳＥＱ ＩＤ
    Ｎｏ．２）、Ｎ末端Ｇｌｙ及び位置２のＩｌｅが除去さ
    れている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、Ｎ末端Ｇｌｙが
    除去されている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、Ｎ末端Ｇ
    ｌｙにペプチド結合されたＭｅｔを有する（ＳＥＱ Ｉ
    Ｄ Ｎｏ．１）、Ｃ末端Ｓｅｒが除去されている（ＳＥ
    Ｑ ＩＤ Ｎｏ．１）、Ｃ末端Ｓｅｒ及び位置２２のＬ
    ｙｓが除去されている（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、位
    置２２のＬｙｓがＧｌｙで置き代えられている（ＳＥＱ
    ＩＤ Ｎｏ．２）、Ｃ末端Ｓｅｒが除去され、位置７
    のＨｉｓがＡｒｇで置き代えられ、位置８のＳｅｒがＧ
    ｌｕで置き代えられ、かつＮ末端Ｇｌｙにペプチド結合
    されたＭｅｔを有する（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）、及
    び位置７のＨｉｓがＡｒｇで置き代えられ、位置８のＳ
    ｅｒがＧｌｕで置き代えられ、位置２３のＳｅｒがＰｒ
    ｏで置き代えられ、かつＮ末端Ｇｌｙにペプチド結合さ
    れたＭｅｔを有する（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）より成
    る群から選択される請求項４３記載の抗菌性組成物。
  52. 【請求項５２】 少くとも一つの微生物病原体に対して
    活性な少くとも一つの抗菌性ペプチドを用意する工程、
    但し、上記抗菌性ペプチドは、少くとも一つの微生物病
    原体に対して活性な抗菌性反転ペプチド、オリゴペプチ
    ド、Ｐ１、ＰＧＬｃ、セクロピンＡ、上記抗菌性ペプチ
    ドの機能的誘導体又はこれらの混合物より成る群から選
    ばれ、上記少くとも一つの抗菌性ペプチドは少くとも一
    つの微生物病原体を阻止するのに有効な量で用意される
    こと；及び上記少くとも一つの微生物病原体を上記少く
    とも一つの抗菌性ペプチドと接触させる工程を含む、微
    生物病原体を阻止する方法。
  53. 【請求項５３】 上記少くとも一つの抗菌性ペプチド
    が、少くとも一つの微生物性植物病原体に対して活性で
    ある請求項５２記載の方法。
  54. 【請求項５４】 上記少くとも一つの抗菌性ペプチド
    が、植物組織の少くとも一表面に局処的施与により与え
    られる請求項５３の方法。
  55. 【請求項５５】 上記少くとも一つの抗菌性ペプチドが
    トランスジェニック植物における発現により用意される
    請求項５３の方法。
  56. 【請求項５６】 上記少くとも一つの抗菌性ペプチド
    が、トランスジェニック植物における発現、及び引続い
    ての植物細胞間の細胞外空間への輸送により用意される
    請求項５３記載の方法。
  57. 【請求項５７】 抗菌性ペプチドの相対的毒性を測定す
    るために抗菌性ペプチドをスクリーニングする方法にお
    いて、少くとも一つの抗菌性ペプチドと、培養された全
    体細胞を含む溶液とも混合すること、及び上記培養され
    た全体細胞による酵素消費の変化を測定することの工程
    を含む方法。
  58. 【請求項５８】 上記培養された全体細胞が植物細胞で
    ある請求項５７記載の方法。
  59. 【請求項５９】 上記植物細胞がプロトプラストである
    請求項５８記載の方法。
  60. 【請求項６０】 アミノ酸構造（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．
    ３）を持つペプチド又はその機能的誘導体を含み、該ペ
    プチドはそのＮ末端にペプチド結合で結合されたシグナ
    ルペプチドを有し、但し上記ペプチドが（ＳＥＱ ＩＤ
    Ｎｏ．１）又は（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２）の構造を
    持たない組成物。
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