JPH05256850A

JPH05256850A - 抗原測定用試薬及び抗原の定量法

Info

Publication number: JPH05256850A
Application number: JP5799592A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Ito; 伊藤　　博; Hiromi Iijima; 裕已飯嶋; Hirosato Okazaki; 宏悟岡崎; Mitsuo Yamaki; 光男山木
Original assignee: Hitachi Chemical Co Ltd
Current assignee: Showa Denko Materials Co Ltd
Priority date: 1992-03-16
Filing date: 1992-03-16
Publication date: 1993-10-08

Abstract

(57)【要約】【構成】測定しようとする抗原と免疫学的反応を生ず
る卵黄抗体を感作した不溶性担体粒子を含有してなる抗
原測定用試薬、並びに該不溶性担体粒子と、測定試料中
の抗原を反応させ、その反応の度合から測定しようとす
る抗原の量を求めることを特徴とする抗原の定量法。【効果】測定精度に優れ、非特異反応が少なく、抗原
過剰現象による測定値の低下が少ない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗原測定用試薬及び抗
原の定量法に関する。更に詳しくは、卵黄抗体と抗原と
の抗原抗体反応を利用し抗原を定量する試薬及び方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、医療分野において、免疫の診断の
ため、検体中の微量物質、特に抗体及び／又は抗原を迅
速、簡便にしかも精度よく定量することが非常に重要と
なってきた。このため抗体又は抗原などを不溶性担体粒
子に支持（感作）し、これと抗原又は抗体を反応させて
体液成分中の抗原又は抗体の存在を検査する、免疫血清
学的検査が広く利用されている。従来は、不溶性担体粒
子に感作する抗体として主に免疫したヤギ、ウサギ又は
ヒツジ等の血清から得られるポリクローナル抗体が用い
られたり、免疫したマウスの脾臓から得られた抗体を培
養したモノクローナル抗体が用いられている。

【０００３】測定方法としては抗体が感作されたラテッ
クス粒子（感作ラテックス）と検体とをガラス板上で混
合し、検体中の抗原と抗原抗体反応を起こさせ、この凝
集状態を肉眼で観察することにより検体中の抗原を半定
量的に測定する方法がとられていた。また、抗体を感作
したラテックス粒子を使用し、ラテックスと検体中の抗
原との反応凝集物を光学的に測定する方法が提案されて
いる（特公昭５８−１１５７５号公報、特公昭６２−４
３１３８号公報、特公昭６２−５５１０３号公報等）。
この方法により、最近では、自動分析装置を用いて抗原
又は抗体を定量的に測定することも行われるようになっ
てきている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記の方法は、免疫学
的測定において通常行われるラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）やエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）と比較
し、簡便迅速な測定方法であるが抗体を多量に使用する
ため高価であり、また直接抗原抗体反応の凝集の度合を
見るため抗原抗体反応以外の非特異的反応が起こりやす
かつたり、抗原過剰現象による測定値の低下が起こりや
すい等の問題点がある。ここで通常用いられている抗体
はヤギ、ウサギ、ヒツジ等の動物血清又はマウスの脾臓
等から入手し用いているためさらに高価となっている。
また、これらの動物から産生される抗体自身が人血清中
の成分等と非特異反応を起こしやすいことも知られてお
り、この非特異反応を無くすために抗体を酵素分解した
り、免疫反応の前に非特異反応を起こす物質をブロック
する等の工夫が考案されているほどである（特公昭６３
−３８６６８号公報、特公昭６１−９４２号公報）。こ
れらの方法によれば、ある程度の非特異反応は防止でき
るがまだ完全ではなく、更に酵素による前処理及びカラ
ムクロマトグラフィーなどの複雑な工程が必要になるな
どの問題がある。

【０００５】一方、動物血清から得られる抗体を感作し
たラテックス試薬を用いた免疫学的測定方法は、抗原過
剰現象による測定値の低下を起こし易すい。従って、ラ
テックスに感作した抗体とは別に、検体中の抗原に特異
的に反応し得るフリーの抗体を反応系に加えて、抗原抗
体反応を行う等（特公平３−３１２２７号公報等）によ
り、抗原過剰現象による測定値の低下を少なくする等の
工夫も行われている。かくして、本発明の目的は、以上
のような問題点を解決した免疫反応による簡便迅速で良
好な精度が得られる抗原の定量法を提供することにあ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、測定
しようとする抗原と免疫学的反応を生ずる卵黄抗体を感
作した不溶性担体粒子を含有してなる抗原測定用試薬、
並びに測定しようとする抗原と免疫学的反応を生ずる卵
黄抗体を感作した不溶性担体粒子と、測定試料中の抗原
を反応させ、その反応の度合から測定しようとする抗原
量を求めることを特徴とする抗原の定量法に関する。本
発明において、不溶性担体粒子としては、ポリスチレ
ン、スチレン−ブタジエン共重合体のような有機高分子
のラテックスやシリカ、アルミナのような無機酸化物及
び金コロイドのような金属等が用いられる。その平均粒
径は、０．０５〜１．０μｍの範囲が好ましい。担体の
粒径が大きすぎると免疫学的反応前の試薬自体の光学的
強度が高すぎて測定が困難となりやすく、小さすぎると
感度が低くなる傾向にある。また、これらの不溶性担体
粒子の媒体としては、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、
トリス緩衝液、グッド緩衝液等を使用するのが好まし
い。

【０００７】本発明において、不溶性担体粒子に感作す
る、測定しようとする抗原と免疫学的反応を生ずる卵黄
抗体は、測定しようとする抗原をニワトリ、七面鳥、ア
ヒル等の鳥類に免疫し、その卵から調製することができ
る。しかし、飼育のしやすさ等に起因する免疫のしやす
さや産する卵の量等に起因する経済効率などから、免疫
に使用する鳥類は、ニワトリが好ましい。ここで、卵か
ら卵黄抗体の調製方法は通常行われている方法でよい。
すなわち、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッ
ド（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ）４６巻、
６３〜６８頁、１９８１年及びイムノロジカル・コミュ
ニケーション（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｏｍｍｕｎ．）９
巻、４９５頁、１９８０年等の文献に記載された方法で
よく、また、特開昭６３−２１５６６９号公報や特開昭
６４−３８０９８号公報に記載された方法でよい。な
お、これらの方法に限定されるものではない。

【０００８】卵黄抗体を不溶性担体粒子上に感作する方
法としては、通常行われているように、物理的に吸着さ
せてもよいし、化学的に結合させてもよいし、両者を併
用してもよい。感作する抗体の量は不溶性担体粒子の粒
径により大きく異なるが、測定範囲を広くするため、通
常は感作できる最大量で感作するのが好ましい。しか
し、測定範囲が問題にならない場合は飽和量よりも少な
い量で感作することができる。不溶性担体粒子に抗体を
感作した後は、通常、不溶性担体粒子表面上の未感作部
分をアルブミン、グロブリン、カゼイン、ゼラチン等で
被覆するが、飽和量感作した場合には不必要なこともあ
る。

【０００９】感作された不溶性担体粒子は、抗原測定用
試薬とされ、免疫学的反応時まで媒体分散液として保持
されるが、その際は、媒体中に０．０１〜１．０重量％
の濃度になるように分散しておくのが保存の面で好まし
く、一般的に使用しやすい。またこの媒体中に適宜、牛
血清アルブミン、ＮａＣｌ等を溶解させてもよい。ま
た、感作された不溶性担体粒子は、免疫学的反応時に
は、媒体中に適宜の濃度で分散され、使用されるが光学
的強度測定の容易さから濃度が０．５重量％以下になる
ようにして使用されるのが好ましく、感作量の点から
０．００１重量％以上が好ましい。この際には、前記媒
体中、必要に応じて牛血清アルブミン、ＮａＣｌ等を溶
解した液（希釈液）を液量調整のために使用してもよ
い。

【００１０】本発明において免疫学的反応の反応性を調
節するため、反応を抑制する物質や反応を促進する物質
が使用できる。使用される反応を抑制する物質として
は、トリアルキルアミン、その塩類、第４級アンモニウ
ム塩及び糖類等が使用できる。トリアルキルアミンとし
てはトリエチルアミン等、トリアルキルアミンの塩類と
してはトリエチルアミンの塩酸塩等、第４級アンモニウ
ム塩としては塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコ
リン、臭化アセチルコリン、塩酸ベタイン等、糖類とし
てはショ糖等がある。これらの化合物は一種又は二種以
上使用される。反応を抑制する物質は緩衝液に溶解し不
溶性担体粒子分散液（試薬）と別に試料と混合しても良
いし、上記の不溶性担体粒子の分散液（試薬）中に溶解
させてもよいし、分散液の液量調整用の希釈液中に溶解
し使用時に分散液と混合して用いてもよい。また、感作
した抗体と試料中の抗原との反応性が低い場合には、こ
のような反応を抑制する物質を入れることなく測定を行
うことができる。該緩衝液としては、リン酸緩衝液、グ
リシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等を使用す
るのが好ましい。また、この媒体中に適宜、牛血清アル
ブミン、ＮａＣｌ等を溶解させてもよい。

【００１１】反応を促進する物質としては、ポリエチレ
ングリコール等が用いられ、ポリエチレングリコールの
平均分子量としては１，０００以上のものが好ましい。
分子量が大きくなると反応の促進効果が大きくなるの
が、小さすぎると効果が小さい。ポリエチレングリコー
ルは最終反応液中の濃度で５．０重量％以下で存在させ
るのが好ましい。ポリエチレングリコールの濃度が高く
なりすぎると感作された不溶性担体の非特異的な凝集が
起こりやすくなり、少なすぎると反応促進の効果が小さ
い。しかし、抗原と抗体の種類により十分反応が起こり
やすく反応促進剤を添加する必要がないことがある。反
応を促進する物質は緩衝液中に溶解されるのが好まし
い。

【００１２】測定しようとする抗原は、鳥類に免疫して
抗体が得られるものであれば良く、特に制限されない。
具体的には、微生物、即ちバクテリア、ウイルス、原虫
及び菌類等に由来する物又は動物に由来する蛋白質、脂
質、ホルモン及び酵素等がある。測定試料はこれらの抗
原を含んだもの又は含む疑いのあるものであるが、疾病
の診断には主に血液等が用いられる。血液は何も処理し
ない全血、血球またはフィブリン成分等を除いた血漿や
血清が主に用いられる。

【００１３】測定方法としては、抗体感作ラテックスと
測定試料を反応キュベット中で混合して反応させ、生成
する反応凝集物の度合いを光学的強度の測定により求め
る方法を使用することができる。この方法を自動分析装
置で行うことも当然可能である。ここで、本発明でいう
光学的強度とは、吸光度又は散乱光強度を意味する。測
定波長は、４００〜１，２００ｎｍの範囲から適宜選択
するのが好ましい。測定波長が１，２００ｎｍを越える
と、感度が低下する傾向にあり、測定波長が４００ｎｍ
以下では媒体分散液自体の光学的強度が大きくなり、測
定範囲が狭くなる。測定は１波長で行っても良いし、２
波長で行ってもよい。測定波長を２波長（主波長及び副
波長）に設定した場合、セルの汚れや迷光及び電気的ノ
イズ等による測定値の変動が少なくなり、測定精度が向
上する。２波長で行う場合も測定波長は４００〜１，２
００ｎｍの範囲から選択される２波長が好ましく、特に
選択される２波長の差は１００〜５００ｎｍの範囲にあ
るのが好ましい。２波長の差が１００ｎｍ以下だと感度
が低くなり、５００ｎｍを越えると２波長の効果が出に
くくなる。また、感度の面から、散乱光強度より、吸光
度を測定するのが好ましい。光学的強度の測定は、反応
開始後の光学的強度の変化量又は変化速度を、１回又は
２回以上の点での測定により求めることができる。

【００１４】

【実施例】次に、実施例によって、本発明を詳細に説明
する。以下、％は重量％を意味する。実施例１１）抗体の作成特開昭６４−３８０９８号公報に記載される方法に従
い、ニワトリをヒト−Ｃ反応性蛋白で免疫し、その卵か
ら抗ＣＲＰ卵黄抗体を取り出し精製した。２）試薬の調製ａ）ラテックス液（卵黄抗体含有試薬）上記方法により作成した卵黄抗体を０．１Ｍグリシン緩
衝液（ｐＨ８．０、０．１ＭＮａＣｌ含有）に１ｍｇ
／ｍｌの濃度になるように溶解した。この抗体溶液と平
均粒径約０．１２μｍポリスチレンラテックス粒子を
０．５％分散した０．１Ｍグリシン酸緩衝液（ｐＨ８．
０、０．１ＭＮａＣｌ含有）を１：１で混合し３７
℃、２時間反応させ抗体を吸着した。１５，０００ｒ．
ｐ．ｍ．で２０分遠心分離し上清を取り除いた後、沈殿
物を０．１ＭＮａＣｌ及び１．０％牛血清アルブミン
を含有する０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．０）２．
５倍量で再分散し、冷蔵で一晩保存することによりラテ
ックス粒子の未吸着部分をブロッキングし、ラテックス
液を得た。除去した上清の吸光度からこの感作ラテック
ス液には抗体が０．６ｍｇ／ｍｌの割合で感作されてい
ることを確認した。ｂ）緩衝液３．０％ポリエチレングリコール（平均分子量７，５０
０）、０．１５ＭＮａＣｌ及び１．０％牛血清アルブ
ミンを含有する０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ８．０）
を調製し、緩衝液とした。３）測定方法測定試料３μｌと緩衝液２５０μｌを反応キュベットに
分注し撹拌した後、３７℃で５分間加温する。次に、ラ
テックス試液２５０μｌを添加し撹拌後、１分と５分の
５７０ｎｍにおける吸光度差を求める。上記本発明品の
対照品は、抗ＣＲＰ卵黄抗体の代わりに抗ＣＲＰヤギ抗
体を感作したラテックス試薬を用い、上記と同様に操作
する方法とした。４）実測結果測定試料として生理食塩水及び既知濃度のＣＲＰ標準品
（３．０ｍｇ／ｍｌ）を測定し検量線を作成した。この
検量線を用い、ＣＲＰ陽性血清（約２ｍｇ／ｍｌ）の希
釈系列１０系列を測定し直線性を見た。図１のように本
発明品の測定値は検量線上の値を示したのに対し、対照
品は検量線より低い値を示した。従って、本発明品は低
値領域での測定精度に優れた測定法であることが示され
た。

【００１５】実施例２上記方法で製造した本発明品と対照品の同時再現性の比
較を行った。３種類の血清を繰り返し１０回ずつ測定
し、再現性を比較した結果、表１のようであった。本発
明品は同時再現性が対照品に比較し良く、精度的に優れ
ていることが裏付けられた。

【００１６】

【表１】

【００１７】実施例３上記方法で製造した本発明品と対照品を用いて高濃度の
ＣＲＰ検体（約８０ｍｇ／ｄｌ）を測定し、抗原過剰現
象による測定値の低下の比較を行った。図２のように本
発明品は約１０ｍｇ／ｄｌ以上で頭打ちになり、測定値
は低下することなくほぼ一定であった。これに対し、対
照品は約４０ｍｇ／ｄｌ以上で抗原過剰現象による測定
値の低下を示し、約８０ｍｇ／ｄｌで測定値は５ｍｇ／
ｄｌ付近まで低下してしまった。このように本発明の方
法は抗原過剰現象による測定値の低下が起こりにくいこ
とがわかる。

【００１８】実施例４非特異反応の最大の原因物質であるリウマチ因子（Ｒ
Ｆ）の影響を見ることにより、本発明品の特異性を確認
した。すなわち、上記方法で製造した本発明品と対照品
を用いて高濃度ＲＦの検体の希釈系列を測定しＲＦの影
響をみた。図３のように対照品はＲＦの影響を受けたの
に対し、本発明品はＲＦの影響をほとんど受けなかっ
た。

【００１９】実施例５上記方法で製造した本発明品と対照品の相関を検討し
た。人血清４１検体について本発明品と対照品で同時測
定を行い両試薬間の相関を見た。図４に示すように相関
係数０．９７４と良好な相関であった。

【００２０】

【発明の効果】以上のように、卵黄抗体を用いる本発明
は、通常の抗体を用いる方法に比べ、測定精度に優れ、
非特異反応が少なく、抗原過剰現象による測定値の低下
の少ない簡便迅速な抗原の定量法である。更に、本発明
法に用いる試薬は、抗体の全処理等の複雑な操作を必要
とせず、安価で簡便に作成することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明品及び対照品を用いて、ＣＲＰ陽性血清
を測定した際の希釈系列と測定された濃度の低値領域に
おける関係を示すグラフである。

【図２】本発明品及び対照品を用いて、高濃度ＣＲＰ検
体を測定した際の希釈系列と測定された濃度の関係を示
すグラフである。

【図３】本発明品及び対照品を用いて、リウマチ因子の
影響を測定した際の、リウマチ因子の濃度と測定された
濃度の関係を示すグラフである。

【図４】本発明品と対照品の相関を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山木光男茨城県日立市東町四丁目13番１号日立化成工業株式会社医薬品研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】測定しようとする抗原と免疫学的反応を
生ずる卵黄抗体を感作した不溶性担体粒子を含有してな
る抗原測定用試薬。
【請求項２】不溶性担体粒子がポリスチレンラテック
ス粒子である請求項１記載の抗原測定用試薬。
【請求項３】さらにトリアルキルアミン、その塩類、
第４級アンモニウム塩及び糖類から選択される少なくと
も１種を含有してなる請求項１又は２記載の抗原測定用
試薬。
【請求項４】さらにポリエチレングリコールを含有し
てなる請求項１、２又は３記載の抗原測定用試薬。
【請求項５】測定しようとする抗原と免疫学的反応を
生ずる卵黄抗体を感作した不溶性担体粒子と、測定試料
中の抗原を反応させ、その反応の度合から測定しようと
する抗原の量を求めることを特徴とする抗原の定量法。
【請求項６】不溶性担体粒子としてポリスチレンラテ
ックス粒子を用いる請求項５記載の抗原の定量法。
【請求項７】不溶性担体粒子として金属又は無機酸化
物を用いる請求項５記載の抗原の定量法。
【請求項８】卵黄抗体を感作した不溶性担体粒子と抗
原との反応により生じる凝集の度合を光学的強度から求
める請求項５、６又は７記載の抗原の定量法。
【請求項９】光学的強度が吸光度である請求項８記載
の抗原の定量法。
【請求項１０】２波長の光の吸光度を測定する請求項
９記載の抗原の定量法。
【請求項１１】卵黄抗体が、測定しようとする抗原を
免疫したニワトリの産する卵の卵黄中から得られるもの
である請求項５〜１０のいずれかに記載の抗原の定量
法。
【請求項１２】測定試料が人血液成分である請求項５
〜１１のいずれかに記載の抗原の定量法。
【請求項１３】抗原が人蛋白質である請求項５〜１２
のいずれかに記載の抗原の定量法。