JPH05255394A - バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド受容体およびそれをコードするｄｎａ - Google Patents
バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド受容体およびそれをコードするｄｎａInfo
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 脳ー腸管ペプチドホルモンの一員であるバソ
アクティブ・インテスティナル・ポリペプチド（ＶＩ
Ｐ）をコードするｃＤＮＡをクローニングし、そのヌク
レオチド配列を決定した。このＤＮＡは４２９アミノ酸
からなるペプチドをコードする。該ＤＮＡを含有するプ
ラスミドｐＶ１９で形質転換されたＣＯＰ細胞の膜には
125Ｉ標識ＶＩＰが特異的に結合し、該プラスミドで形
質転換されたＣＯＳＧｓ１細胞ではＶＩＰ刺激によるｃ
ＡＭＰ産生が増大した。 【効果】 本発明のＶＩＰ受容体をコードするＤＮＡを
利用してＶＩＰおよび近縁のホルモンの分子レベルでの
機能および制御機構を解明することが可能となり、さら
に、該ＤＮＡで形質転換された微生物を培養することに
より大量にＶＩＰ受容体ペプチドを製造し、研究、診断
および治療に用いることができる。
アクティブ・インテスティナル・ポリペプチド（ＶＩ
Ｐ）をコードするｃＤＮＡをクローニングし、そのヌク
レオチド配列を決定した。このＤＮＡは４２９アミノ酸
からなるペプチドをコードする。該ＤＮＡを含有するプ
ラスミドｐＶ１９で形質転換されたＣＯＰ細胞の膜には
125Ｉ標識ＶＩＰが特異的に結合し、該プラスミドで形
質転換されたＣＯＳＧｓ１細胞ではＶＩＰ刺激によるｃ
ＡＭＰ産生が増大した。 【効果】 本発明のＶＩＰ受容体をコードするＤＮＡを
利用してＶＩＰおよび近縁のホルモンの分子レベルでの
機能および制御機構を解明することが可能となり、さら
に、該ＤＮＡで形質転換された微生物を培養することに
より大量にＶＩＰ受容体ペプチドを製造し、研究、診断
および治療に用いることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ラット由来の新規なバ
ソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド受容体
および該受容体をコードするＤＮＡに関する。
ソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド受容体
および該受容体をコードするＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来技術】バソアクティブ・インテスティナル・ポリ
ペプチド（以下、ＶＩＰと略称する）は、消化管ホルモ
ンの１つであり、２８アミノ酸残基からなる。ＶＩＰは
他の消化管ホルモンであるガストリン、ＣＣＫ、グルカ
ゴン等と同様に脳−神経系にも存在しており、脳ー腸管
ペプチドホルモンの一員として、様々な生理作用に関与
していると考えられている。例えば、消化管や血管の平
滑筋の弛緩、小腸分泌の促進、電解物質分泌の促進等の
消化管への作用、並びに、大脳皮質でのグリコーゲン分
解、網膜ガングリオン細胞および交感神経芽細胞の死と
分化の調節、並びに脳および他の神経系のニューロン伝
達物質としての作用のあることが知られている。ＶＩＰ
はまた、消化管、脳神経系の外、肝臓や肺等の組織を含
めて広範囲に分布していることも分かっているが、作用
には不明な点が多く残されている。また、肝臓に発生し
たＶＩＰ産生腫瘍が水様性下痢症候群の病因とされてお
り、疾病との関係も興味深い。
ペプチド（以下、ＶＩＰと略称する）は、消化管ホルモ
ンの１つであり、２８アミノ酸残基からなる。ＶＩＰは
他の消化管ホルモンであるガストリン、ＣＣＫ、グルカ
ゴン等と同様に脳−神経系にも存在しており、脳ー腸管
ペプチドホルモンの一員として、様々な生理作用に関与
していると考えられている。例えば、消化管や血管の平
滑筋の弛緩、小腸分泌の促進、電解物質分泌の促進等の
消化管への作用、並びに、大脳皮質でのグリコーゲン分
解、網膜ガングリオン細胞および交感神経芽細胞の死と
分化の調節、並びに脳および他の神経系のニューロン伝
達物質としての作用のあることが知られている。ＶＩＰ
はまた、消化管、脳神経系の外、肝臓や肺等の組織を含
めて広範囲に分布していることも分かっているが、作用
には不明な点が多く残されている。また、肝臓に発生し
たＶＩＰ産生腫瘍が水様性下痢症候群の病因とされてお
り、疾病との関係も興味深い。
【０００３】ＶＩＰは他のホルモンと同様、細胞の受容
体を介して作用を発揮する。従って、その受容体の構造
や性質を明らかすることは、ＶＩＰの生理作用の解明お
よびＶＩＰ関連疾患の治療法の開発に寄与すると考えら
れる。従来、ＶＩＰ受容体について、１）ＶＩＰの細胞
内ｃＡＭＰ蓄積刺激作用を伝達することから、アデニレ
ートシクラーゼ−刺激Ｇプロテイン（Ｇｓ）のαサブユ
ニットに結合している；２）ＶＩＰとセクレチン／グル
カゴン群の消化管ホルモン群のペプチドとが類似するこ
とから、受容体相互も構造上類似する、ということが指
摘されていた。最近、ＶＩＰと結合する２つの異なるポ
リペプチド（分子量５３，０００および１８，０００）
がブタ肝臓［クーヴィノウら（Couvineau et. al.）
Ｊ．Biol.Chem. 265, 1336-13390 (1990)］およびモル
モット肺［ブルッガーら（Bruggeret al.) J.Biol.Che
m. 27, 18358ー18362 (1991)］から単離されたが、正確
な情報は得られていない。また、ＶＩＰ受容体が神経伝
達において果す役割も未解明である。
体を介して作用を発揮する。従って、その受容体の構造
や性質を明らかすることは、ＶＩＰの生理作用の解明お
よびＶＩＰ関連疾患の治療法の開発に寄与すると考えら
れる。従来、ＶＩＰ受容体について、１）ＶＩＰの細胞
内ｃＡＭＰ蓄積刺激作用を伝達することから、アデニレ
ートシクラーゼ−刺激Ｇプロテイン（Ｇｓ）のαサブユ
ニットに結合している；２）ＶＩＰとセクレチン／グル
カゴン群の消化管ホルモン群のペプチドとが類似するこ
とから、受容体相互も構造上類似する、ということが指
摘されていた。最近、ＶＩＰと結合する２つの異なるポ
リペプチド（分子量５３，０００および１８，０００）
がブタ肝臓［クーヴィノウら（Couvineau et. al.）
Ｊ．Biol.Chem. 265, 1336-13390 (1990)］およびモル
モット肺［ブルッガーら（Bruggeret al.) J.Biol.Che
m. 27, 18358ー18362 (1991)］から単離されたが、正確
な情報は得られていない。また、ＶＩＰ受容体が神経伝
達において果す役割も未解明である。
【０００４】本発明者らは、先にラットセクレチン受容
体をコードするＤＮＡのクローニングに成功し、それが
７つの膜貫通領域を有するペプチドであることを開示し
た［石原等（Ishihara et al.） EMBO J., 1635-1641
(1991); 特願平第３−１６３９４６号］。他方、スリー
ドハランら［(Sreedharan et al.）Proc.Natl.Acad.Sc
i. USA, 88:4986-4990 (1991)］は、ヒトｃＤＮＡクロ
ンーンＧＰＲＮ１が７個の膜貫通領域を有するＶＩＰ受
容体をコードしていると主張した。
体をコードするＤＮＡのクローニングに成功し、それが
７つの膜貫通領域を有するペプチドであることを開示し
た［石原等（Ishihara et al.） EMBO J., 1635-1641
(1991); 特願平第３−１６３９４６号］。他方、スリー
ドハランら［(Sreedharan et al.）Proc.Natl.Acad.Sc
i. USA, 88:4986-4990 (1991)］は、ヒトｃＤＮＡクロ
ンーンＧＰＲＮ１が７個の膜貫通領域を有するＶＩＰ受
容体をコードしていると主張した。
【発明が解決すべき課題】上記のように、ＶＩＰの作用
機構を理解し、種々の分野で有効に利用するためにはＶ
ＩＰ−受容体相互作用を解明することが必須である。そ
のためには、ＶＩＰ受容体を単離し、該ポリペプチドの
アミノ酸配列を決定し、それをコードするＤＮＡのヌク
レオチド配列を決定することが必要である。
機構を理解し、種々の分野で有効に利用するためにはＶ
ＩＰ−受容体相互作用を解明することが必須である。そ
のためには、ＶＩＰ受容体を単離し、該ポリペプチドの
アミノ酸配列を決定し、それをコードするＤＮＡのヌク
レオチド配列を決定することが必要である。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らはラットの様
々な組織について検索し、肺細胞が最も多くＶＩＰ受容
体を生産することを見い出した。次いで、ラット肺細胞
のｃＤＮＡライブラリーを構築し、該ライブラリーから
新規なＶＩＰ受容体をコードするｃＤＮＡを単離、クロ
ーニングし、そのヌクレオチド配列、並びにＶＩＰ受容
体のアミノ酸配列を推定し、構造ならびに特性を分析し
た。このＤＮＡのヌクレオチド配列の上流側は図１に、
下流側は図２に示されている。また、図１および２には
推定のアミノ酸配列も併記されている。このＤＮＡでＣ
ＯＰ細胞を形質転換し、形質転換された細胞を培養する
と、得られた形質転換体はＶＩＰ受容体活性を有するポ
リペプチドを産生した。即ち、本発明の新規なラットＶ
ＩＰ受容体をコードするＤＮＡで形質転換されたＣＯＰ
細胞の細胞膜は125Ｉ標識ＶＩＰと特異的に結合した。
また、ラットＧｓタンパク質αサブユニットを大量発現
するＣＯＳＧｓ１細胞を本発明のＶＩＰ受容体をコード
するＤＮＡで形質転換し、得られた細胞においては、Ｖ
ＩＰによるｃＡＭＰ産生刺激作用の結果、ｃＡＭＰ蓄積
量の増大が観察された。これらの事実は、本発明のｃＤ
ＮＡがラットＶＩＰ受容体をコードしていることを証明
するものである。
々な組織について検索し、肺細胞が最も多くＶＩＰ受容
体を生産することを見い出した。次いで、ラット肺細胞
のｃＤＮＡライブラリーを構築し、該ライブラリーから
新規なＶＩＰ受容体をコードするｃＤＮＡを単離、クロ
ーニングし、そのヌクレオチド配列、並びにＶＩＰ受容
体のアミノ酸配列を推定し、構造ならびに特性を分析し
た。このＤＮＡのヌクレオチド配列の上流側は図１に、
下流側は図２に示されている。また、図１および２には
推定のアミノ酸配列も併記されている。このＤＮＡでＣ
ＯＰ細胞を形質転換し、形質転換された細胞を培養する
と、得られた形質転換体はＶＩＰ受容体活性を有するポ
リペプチドを産生した。即ち、本発明の新規なラットＶ
ＩＰ受容体をコードするＤＮＡで形質転換されたＣＯＰ
細胞の細胞膜は125Ｉ標識ＶＩＰと特異的に結合した。
また、ラットＧｓタンパク質αサブユニットを大量発現
するＣＯＳＧｓ１細胞を本発明のＶＩＰ受容体をコード
するＤＮＡで形質転換し、得られた細胞においては、Ｖ
ＩＰによるｃＡＭＰ産生刺激作用の結果、ｃＡＭＰ蓄積
量の増大が観察された。これらの事実は、本発明のｃＤ
ＮＡがラットＶＩＰ受容体をコードしていることを証明
するものである。
【０００６】従って、本発明は、図１および図２で示さ
れる新規なラット由来のＶＩＰ受容体を提供するもので
ある。また本発明は、上記のラット由来ＶＩＰ受容体を
コードするＤＮＡを提供するものである。
れる新規なラット由来のＶＩＰ受容体を提供するもので
ある。また本発明は、上記のラット由来ＶＩＰ受容体を
コードするＤＮＡを提供するものである。
【０００７】ラットＶＩＰ受容体のクローニングは常法
に従って行われた。ＶＩＰ受容体を高発現するヒトＨＴ
２９細胞の誘導体であるヒト結腸腺がんＷiＤr 細胞株
［ラブルセら（Laburthe et al.）、Proc.Natl.Acad.Sc
i. USA. 75:2772-2775 (1978)］から得たｍＲＮＡの逆
転写によって調製したｃＤＮＡライブラリーをセクレチ
ン受容体ｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングして
９個の陽性クローンを得た。これら陽性クローンの１つ
（ｐＷＶ２）を用いてラットの各種組織のノーザンハイ
ブリダイゼーションを行うことにより、該クローンとハ
イブリダイゼーション（ハイブリッド形成）する５．５
kbのｍＲＮＡを多量に発現している組織を検索し、肺が
このｍＲＮＡを最も多く発現していることを見い出し
た。
に従って行われた。ＶＩＰ受容体を高発現するヒトＨＴ
２９細胞の誘導体であるヒト結腸腺がんＷiＤr 細胞株
［ラブルセら（Laburthe et al.）、Proc.Natl.Acad.Sc
i. USA. 75:2772-2775 (1978)］から得たｍＲＮＡの逆
転写によって調製したｃＤＮＡライブラリーをセクレチ
ン受容体ｃＤＮＡをプローブとしてスクリーニングして
９個の陽性クローンを得た。これら陽性クローンの１つ
（ｐＷＶ２）を用いてラットの各種組織のノーザンハイ
ブリダイゼーションを行うことにより、該クローンとハ
イブリダイゼーション（ハイブリッド形成）する５．５
kbのｍＲＮＡを多量に発現している組織を検索し、肺が
このｍＲＮＡを最も多く発現していることを見い出し
た。
【０００８】次いで、ラット肺ｃＤＮＡライブラリーを
石原等の方法（特願平３−１６３９４６号）に従い、Ｃ
ＤＭ８ベクターを用いて構築し、これを、ｐＷＶ２クロ
ーンをプローブとしてスクリーニングした。２２個の陽
性クローンを得、各クローンでＣＯＳ細胞をトランスフ
ェクション（形質転換）した。形質転換細胞と125ＩＶ
ＩＰとの結合能力を調べ、互いに重なりあう５つの陽性
クローンを得た。その内最長のｃＤＮＡクローン（ｐＶ
１９）を単離し、塩基配列を決定し、その構造を検討し
た。
石原等の方法（特願平３−１６３９４６号）に従い、Ｃ
ＤＭ８ベクターを用いて構築し、これを、ｐＷＶ２クロ
ーンをプローブとしてスクリーニングした。２２個の陽
性クローンを得、各クローンでＣＯＳ細胞をトランスフ
ェクション（形質転換）した。形質転換細胞と125ＩＶ
ＩＰとの結合能力を調べ、互いに重なりあう５つの陽性
クローンを得た。その内最長のｃＤＮＡクローン（ｐＶ
１９）を単離し、塩基配列を決定し、その構造を検討し
た。
【０００９】ｐＶ１９クローンのヌクレオチド配列およ
び推定のアミノ酸配列を図１および図２に示す。配列は
４５９アミノ酸からなるタンパク質をコードするオープ
ンリーディングフレームを有するが、ＮＨ2末端の３０
個のアミノ酸はシグナル配列である［フォン・ハイネ
（von Heijne）Nucl.Acid.Res. 14: 4683-4690 (198
6)］。従って、成熟ＶＩＰ受容体は４２９アミノ酸から
なり、分子量計算値は４８，９４６となる。この値はプ
ロボウらが125Ｉ−ＶＩＰを用いる交差反応によって求
めた分子量、５５kDaとよく一致する［（Provow et a
l., Endcrinol. 120:2442-2452 (1987)］。両者の差異
（６kDa）はＮ−グリコシル化部位（Asn-X-Ser/Thr)に
おけるグリコシル化に起因すると考えられる。このＶＩ
Ｐ受容体をコードするＤＮＡを組み込んだＥscherichia
coli. pＶ１９は受託番号、微工研菌寄第１２７４３号
の下、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている。（受託日：平成４年２月４日）
び推定のアミノ酸配列を図１および図２に示す。配列は
４５９アミノ酸からなるタンパク質をコードするオープ
ンリーディングフレームを有するが、ＮＨ2末端の３０
個のアミノ酸はシグナル配列である［フォン・ハイネ
（von Heijne）Nucl.Acid.Res. 14: 4683-4690 (198
6)］。従って、成熟ＶＩＰ受容体は４２９アミノ酸から
なり、分子量計算値は４８，９４６となる。この値はプ
ロボウらが125Ｉ−ＶＩＰを用いる交差反応によって求
めた分子量、５５kDaとよく一致する［（Provow et a
l., Endcrinol. 120:2442-2452 (1987)］。両者の差異
（６kDa）はＮ−グリコシル化部位（Asn-X-Ser/Thr)に
おけるグリコシル化に起因すると考えられる。このＶＩ
Ｐ受容体をコードするＤＮＡを組み込んだＥscherichia
coli. pＶ１９は受託番号、微工研菌寄第１２７４３号
の下、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託されている。（受託日：平成４年２月４日）
【００１０】本発明のＶＩＰ受容体は他のＧタンパク連
結型受容体と同様に７つの膜貫通領域を有する。このＶ
ＩＰ受容体を他のＧタンパク連結型受容体と比較し、ラ
ットセクレチン受容体、ブタカルシトニン受容体、およ
びフクロネズミの副甲状腺ホルモン受容体(ＰＴＨ−Ｐ
ＴＨｒＨ）と、それぞれ４８％、３３％および３９％の
相同性を示すことが分かった（図９参照）。しかしＶＩ
Ｐ受容体をコードすると推定されるヒトＧＰＲＮ１ｃＤ
ＮＡをも含む、他のＧタンパク連結型受容体ファミリー
のペプチドと本発明ＶＩＰ受容体ＤＮＡとの間には、相
同性は殆ど認められなかった。
結型受容体と同様に７つの膜貫通領域を有する。このＶ
ＩＰ受容体を他のＧタンパク連結型受容体と比較し、ラ
ットセクレチン受容体、ブタカルシトニン受容体、およ
びフクロネズミの副甲状腺ホルモン受容体(ＰＴＨ−Ｐ
ＴＨｒＨ）と、それぞれ４８％、３３％および３９％の
相同性を示すことが分かった（図９参照）。しかしＶＩ
Ｐ受容体をコードすると推定されるヒトＧＰＲＮ１ｃＤ
ＮＡをも含む、他のＧタンパク連結型受容体ファミリー
のペプチドと本発明ＶＩＰ受容体ＤＮＡとの間には、相
同性は殆ど認められなかった。
【００１１】本発明のＶＩＰ受容体をコードするプラス
ミドｐＶ１９でマウスＣＯＰ細胞をトランスフェクショ
ンし、培養することにより得られた形質転換細胞の膜画
分（組換えＶＩＰ受容体）は、125ＩＶＩＰと有意に結
合した。この結合部位をスキャッチャード分析で求める
と、解離定数１７３ｐＭと２１．０ｎＭの２つの結合部
位が明らかになった（図３ａ）。高親和性および低親和
性の結合部位のタンパク質濃度はそれぞれ４．１および
５３pmol／mgであった。組換えＶＩＰ受容体のこれらの
解離定数はラット肺の膜画分（天然ＶＩＰ受容体）の値
と近似している（図３ｂ、レローら（Leroux et al.）E
ndocrinol. 114: 1506-1512 (1984))。
ミドｐＶ１９でマウスＣＯＰ細胞をトランスフェクショ
ンし、培養することにより得られた形質転換細胞の膜画
分（組換えＶＩＰ受容体）は、125ＩＶＩＰと有意に結
合した。この結合部位をスキャッチャード分析で求める
と、解離定数１７３ｐＭと２１．０ｎＭの２つの結合部
位が明らかになった（図３ａ）。高親和性および低親和
性の結合部位のタンパク質濃度はそれぞれ４．１および
５３pmol／mgであった。組換えＶＩＰ受容体のこれらの
解離定数はラット肺の膜画分（天然ＶＩＰ受容体）の値
と近似している（図３ｂ、レローら（Leroux et al.）E
ndocrinol. 114: 1506-1512 (1984))。
【００１２】また、125Ｉ−ＶＩＰと、ｐＶ１９で形質
転換されたＣＯＰ細胞の膜との結合に対する他のペプチ
ドホルモンの競合作用は、ＶＩＰ（ＩＣ50＝３．０ｎ
Ｍ）よりもＰＡＣＡＰ−３８（ＩＣ50＝１．０ｎＭ）お
よびＰＡＣＡＰ−２７（ＩＣ50＝２．５ｎＭ）で大き
く、これらの親和性の強さを示している（図４）。Ｈel
oderminおよびＰＨＭはＩＣ50６．０ｎＭで125Ｉ−ＶＩ
Ｐの膜結合を阻害したが、セクレチンやグルカゴンの阻
害作用は小さいか殆ど無いことが認められた。これらは
ラット肺の天然ＶＩＰ受容体での結果（図５）と一致し
ている。
転換されたＣＯＰ細胞の膜との結合に対する他のペプチ
ドホルモンの競合作用は、ＶＩＰ（ＩＣ50＝３．０ｎ
Ｍ）よりもＰＡＣＡＰ−３８（ＩＣ50＝１．０ｎＭ）お
よびＰＡＣＡＰ−２７（ＩＣ50＝２．５ｎＭ）で大き
く、これらの親和性の強さを示している（図４）。Ｈel
oderminおよびＰＨＭはＩＣ50６．０ｎＭで125Ｉ−ＶＩ
Ｐの膜結合を阻害したが、セクレチンやグルカゴンの阻
害作用は小さいか殆ど無いことが認められた。これらは
ラット肺の天然ＶＩＰ受容体での結果（図５）と一致し
ている。
【００１３】ラットＧｓタンパクαサブユニットを高発
現するＣＯＳＧｓ１細胞をプラスミドｐＶ１９でトラン
スフェクションして得られた細胞はＶＩＰ刺激下でｃＡ
ＭＰを多量に生産した（４００pmol／１０5形質転換
体）（図６）。しかし、ＣＤＭ８ベクターで形質転換さ
れた細胞はＶＩＰ刺激下でのｃＡＭＰ生産を示さなかっ
た。これは本発明の組換えＶＩＰ受容体がシグナル伝達
作用を有することを示すものである。ＰＡＣＡＰ−３８
およびＰＡＣＡＰ−２７のｃＡＭＰ生産刺激効果はＶＩ
Ｐよりも少し大きいが、ＨeloderminおよびＰＨＭのそ
れはＶＩＰよりも小さい。またセクレチンが、ＶＩＰと
同等の作用を発揮するには後者の約３０倍存在すること
が必要であり、グルカゴンはｃＡＭＰ産生を刺激しなか
った。これらの結果は上記の125ＩＶＩＰー受容体結合
に対する各ペプチドホルモンの競合作用の結果を反映し
ている。
現するＣＯＳＧｓ１細胞をプラスミドｐＶ１９でトラン
スフェクションして得られた細胞はＶＩＰ刺激下でｃＡ
ＭＰを多量に生産した（４００pmol／１０5形質転換
体）（図６）。しかし、ＣＤＭ８ベクターで形質転換さ
れた細胞はＶＩＰ刺激下でのｃＡＭＰ生産を示さなかっ
た。これは本発明の組換えＶＩＰ受容体がシグナル伝達
作用を有することを示すものである。ＰＡＣＡＰ−３８
およびＰＡＣＡＰ−２７のｃＡＭＰ生産刺激効果はＶＩ
Ｐよりも少し大きいが、ＨeloderminおよびＰＨＭのそ
れはＶＩＰよりも小さい。またセクレチンが、ＶＩＰと
同等の作用を発揮するには後者の約３０倍存在すること
が必要であり、グルカゴンはｃＡＭＰ産生を刺激しなか
った。これらの結果は上記の125ＩＶＩＰー受容体結合
に対する各ペプチドホルモンの競合作用の結果を反映し
ている。
【００１４】種々のラット組織から得たｐｏｌｙ（Ａ）
ＲＮＡとｐＶ１９を用いるノーザンハイブリダイゼーシ
ョンにより、５．５kbＶＩＰ受容体ｍＲＮＡは、肺に最
も多く、次いで、肝臓および腸に存在することが分かっ
た。さらに弱い発現は胸腺および脳に認められた。しか
し、心臓、腎臓、脾臓、膵臓、胃および副腎には認めら
れなかった（図７）。成熟ラットの脳全域に発現を認め
たが、大脳皮質および海馬におけるシグナルは脳の他の
部分のそれよりも強かった（図８）。脳でのＶＩＰ受容
体の存在を、標識化アンチセンスＲＮＡを用いる系中
（in situ)ハイブリッド形成によって調べた。その結
果、シグナルは大脳皮質、海馬および嗅球の僧帽細胞層
で優勢であり、皮質下領域および小脳皮質では広範囲に
及ぶが弱いことが分かった。非標識アンチセンスＲＮＡ
を１００倍過剰加えるとシグナルが消失することから、
その特異性が示された。さらに、大脳皮質のエマルジョ
ン浸漬切片を用いる明視野での顕微鏡観察により、ＶＩ
Ｐ受容体ｍＲＮＡはニューロンに局在することが明らか
になった。
ＲＮＡとｐＶ１９を用いるノーザンハイブリダイゼーシ
ョンにより、５．５kbＶＩＰ受容体ｍＲＮＡは、肺に最
も多く、次いで、肝臓および腸に存在することが分かっ
た。さらに弱い発現は胸腺および脳に認められた。しか
し、心臓、腎臓、脾臓、膵臓、胃および副腎には認めら
れなかった（図７）。成熟ラットの脳全域に発現を認め
たが、大脳皮質および海馬におけるシグナルは脳の他の
部分のそれよりも強かった（図８）。脳でのＶＩＰ受容
体の存在を、標識化アンチセンスＲＮＡを用いる系中
（in situ)ハイブリッド形成によって調べた。その結
果、シグナルは大脳皮質、海馬および嗅球の僧帽細胞層
で優勢であり、皮質下領域および小脳皮質では広範囲に
及ぶが弱いことが分かった。非標識アンチセンスＲＮＡ
を１００倍過剰加えるとシグナルが消失することから、
その特異性が示された。さらに、大脳皮質のエマルジョ
ン浸漬切片を用いる明視野での顕微鏡観察により、ＶＩ
Ｐ受容体ｍＲＮＡはニューロンに局在することが明らか
になった。
【００１５】このように、本発明により、ＶＩＰ受容体
をコードするｃＤＮＡがクローニングされ、その性質が
明らかにされた結果、ＶＩＰおよび近縁のホルモンの分
子レベルでの機能および制御機構の解明に役立つことが
予想される。また、ＶＩＰ受容体をコードするｃＤＮＡ
がクローニングされ、ヌクレオチド配列が明らかになっ
たので、適当な宿主系内で組換えＶＩＰ受容体を発現す
る発現ベクターを構築することは当業者にとって通常の
技術範囲である。次いで、構築した発現ベクターで宿主
細胞を形質転換し、得られた形質転換体をＶＩＰ受容体
をコードするＤＮＡの発現に適した条件下で培養するこ
とにより、組換えＶＩＰ受容体を製造することができ
る。このようにして得られた組換えＶＩＰ受容体は、Ｖ
ＩＰ並びに近縁のホルモンの作用機構の研究および臨床
面等、様々な分野で有用である。
をコードするｃＤＮＡがクローニングされ、その性質が
明らかにされた結果、ＶＩＰおよび近縁のホルモンの分
子レベルでの機能および制御機構の解明に役立つことが
予想される。また、ＶＩＰ受容体をコードするｃＤＮＡ
がクローニングされ、ヌクレオチド配列が明らかになっ
たので、適当な宿主系内で組換えＶＩＰ受容体を発現す
る発現ベクターを構築することは当業者にとって通常の
技術範囲である。次いで、構築した発現ベクターで宿主
細胞を形質転換し、得られた形質転換体をＶＩＰ受容体
をコードするＤＮＡの発現に適した条件下で培養するこ
とにより、組換えＶＩＰ受容体を製造することができ
る。このようにして得られた組換えＶＩＰ受容体は、Ｖ
ＩＰ並びに近縁のホルモンの作用機構の研究および臨床
面等、様々な分野で有用である。
【００１６】当業者ならば、図１および図２に記載のＶ
ＩＰ受容体をコードするcＤＮＡのヌクレオチド配列
に、ヌクレオチドの挿入、置換または欠失を行うことに
より、天然のＶＩＰ受容体と同様の機能を有する誘導体
を導くことができるということを理解するであろう。従
って、そのようにして導かれるＤＮＡも本発明の範囲に
包含されるものである。
ＩＰ受容体をコードするcＤＮＡのヌクレオチド配列
に、ヌクレオチドの挿入、置換または欠失を行うことに
より、天然のＶＩＰ受容体と同様の機能を有する誘導体
を導くことができるということを理解するであろう。従
って、そのようにして導かれるＤＮＡも本発明の範囲に
包含されるものである。
【００１７】本発明のＶＩＰ受容体をコードするＤＮＡ
を含有する発現ベクターは当業者既知の方法で構築する
ことができる。ＶＩＰ受容体ＤＮＡの発現に適したベク
ターは、該ＤＮＡの挿入部位の直ぐ上流に転写開始のた
めのプロモーターを有するものであろう。適当なプロモ
ーターも当該技術分野で既知であり、宿主細胞内での機
能特性に応じて選択することができる。例えば、Ｔ７ポ
リメラーゼのプロモーター、β−ガラクトシダーゼなど
の細菌プロモーターを用いて、細菌内でＶＩＰ受容体を
発現させることができる。
を含有する発現ベクターは当業者既知の方法で構築する
ことができる。ＶＩＰ受容体ＤＮＡの発現に適したベク
ターは、該ＤＮＡの挿入部位の直ぐ上流に転写開始のた
めのプロモーターを有するものであろう。適当なプロモ
ーターも当該技術分野で既知であり、宿主細胞内での機
能特性に応じて選択することができる。例えば、Ｔ７ポ
リメラーゼのプロモーター、β−ガラクトシダーゼなど
の細菌プロモーターを用いて、細菌内でＶＩＰ受容体を
発現させることができる。
【００１８】培養動物細胞でＶＩＰ受容体を発現させる
には、その発現ベクター中に薬物耐性マーカーのような
選択可能マーカーが存在することが望ましい。特に望ま
しいマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を挙げるこ
とができる。あるいは、ＶＩＰ受容体をコードするＤＮ
Ａを含有する発現ベクターと別個の抗生物質等の薬物耐
性をコードするプラスミドを用いて同時に形質転換して
もよい。
には、その発現ベクター中に薬物耐性マーカーのような
選択可能マーカーが存在することが望ましい。特に望ま
しいマーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子を挙げるこ
とができる。あるいは、ＶＩＰ受容体をコードするＤＮ
Ａを含有する発現ベクターと別個の抗生物質等の薬物耐
性をコードするプラスミドを用いて同時に形質転換して
もよい。
【００１９】発現ベクターを構築するには本発明のＶＩ
Ｐ受容体をコードするＤＮＡを適当なベクターに挿入す
る。適当なベクターは、プロモーター、polyＡシグナ
ル、選択マーカーその他の条件を考慮し、当該技術分野
で既知のものから選択する。本発明のcＤＮＡを挿入
し、培養細胞に導入してこのcＤＮＡを発現する目的に
用いることができるＤＮＡベクターとして、例えばＣＭ
Ｖのプロモーターを用いたＣＤＭ８、ヒトペプチド鎖延
長因子１αのプロモーターを用いたpＥＦ−ＢＯＳ、Ｓ
Ｖ４０のプロモーターを用いたpＫＣＲ、ウシパピロー
マウィルス・ベクター等を挙げることができる。
Ｐ受容体をコードするＤＮＡを適当なベクターに挿入す
る。適当なベクターは、プロモーター、polyＡシグナ
ル、選択マーカーその他の条件を考慮し、当該技術分野
で既知のものから選択する。本発明のcＤＮＡを挿入
し、培養細胞に導入してこのcＤＮＡを発現する目的に
用いることができるＤＮＡベクターとして、例えばＣＭ
Ｖのプロモーターを用いたＣＤＭ８、ヒトペプチド鎖延
長因子１αのプロモーターを用いたpＥＦ−ＢＯＳ、Ｓ
Ｖ４０のプロモーターを用いたpＫＣＲ、ウシパピロー
マウィルス・ベクター等を挙げることができる。
【００２０】本発明のラットＶＩＰ受容体の発現に用い
得る培養細胞は複製可能で図１および２記載のＤＮＡを
発現し得るものであればよい。例えば、大腸菌のような
原核性微生物、Ｓ.セレビシエのような真核性微生物、
さらには哺乳類細胞が用いられる。組織培養細胞にはト
リ、または哺乳類細胞、例えばネズミ、ラットおよびサ
ル細胞が含まれる。適当な宿主細胞−ベクターシステム
の選択および使用方法等は、当業者に既知であり、それ
らの内から本発明のＶＩＰ受容体をコードするcＤＮＡ
の発現に適した系を任意に選択することができる。以下
に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、こ
れらの実施例は本発明を制限するものではない。
得る培養細胞は複製可能で図１および２記載のＤＮＡを
発現し得るものであればよい。例えば、大腸菌のような
原核性微生物、Ｓ.セレビシエのような真核性微生物、
さらには哺乳類細胞が用いられる。組織培養細胞にはト
リ、または哺乳類細胞、例えばネズミ、ラットおよびサ
ル細胞が含まれる。適当な宿主細胞−ベクターシステム
の選択および使用方法等は、当業者に既知であり、それ
らの内から本発明のＶＩＰ受容体をコードするcＤＮＡ
の発現に適した系を任意に選択することができる。以下
に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明するが、こ
れらの実施例は本発明を制限するものではない。
【００２１】
【実施例】以下の実施例における出発物質であるＷiＤr
細胞株（ＪＣＲＢ ０２２４）はＪＣＲＢ細胞バンクよ
り得、非必須アミノ酸と１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；
Hyclone）を補充した最小イーグル培地で培養した。マ
ウスＣＯＰ細胞［チンダールら（Tyndall et al., Nuc
l.Aciod. Res. 9:6231-6250 (1981)］はカメン（Kamen)
博士から譲り受け、１０％ＦＣＳを含有するダルベッコ
の改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ブタセク
レチンは既述の方法で合成し、精製した（石原等、前
掲）。プラークまたはコロニーハイブリダイゼーション
は、高ストリンジェンシー［サムブルックら（Sambrook
et al.）Molecular Cloning（1989)］、または低スト
リンジェンシー［フクナガら（Fukunaga et al.）Proc.
Natl.Acad.Sci. USA 87: 8702-8706 (1991）］条件下で
行われた。ヒトＶＩＰ、ＰＨＭ、ＰＡＣＡＰ−３８およ
びＰＡＣＡＰ−２７はペプチド研究所（大阪）から、he
loderminはPeninsula Laboratories, Inc. (Belmont)か
らそれぞれ購入した。125Ｉ標識ＶＩＰ（比活性＝２２
００Ｃｉ／mmol）はＤupont/New England Nuclearから
購入した。
細胞株（ＪＣＲＢ ０２２４）はＪＣＲＢ細胞バンクよ
り得、非必須アミノ酸と１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；
Hyclone）を補充した最小イーグル培地で培養した。マ
ウスＣＯＰ細胞［チンダールら（Tyndall et al., Nuc
l.Aciod. Res. 9:6231-6250 (1981)］はカメン（Kamen)
博士から譲り受け、１０％ＦＣＳを含有するダルベッコ
の改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ブタセク
レチンは既述の方法で合成し、精製した（石原等、前
掲）。プラークまたはコロニーハイブリダイゼーション
は、高ストリンジェンシー［サムブルックら（Sambrook
et al.）Molecular Cloning（1989)］、または低スト
リンジェンシー［フクナガら（Fukunaga et al.）Proc.
Natl.Acad.Sci. USA 87: 8702-8706 (1991）］条件下で
行われた。ヒトＶＩＰ、ＰＨＭ、ＰＡＣＡＰ−３８およ
びＰＡＣＡＰ−２７はペプチド研究所（大阪）から、he
loderminはPeninsula Laboratories, Inc. (Belmont)か
らそれぞれ購入した。125Ｉ標識ＶＩＰ（比活性＝２２
００Ｃｉ／mmol）はＤupont/New England Nuclearから
購入した。
【００２２】実施例１ ラットＶＩＰ受容体ｃＤＮＡの
クローニング １．ラット肺ｃＤＮＡライブラリーの構築 ＷiＤr 細胞株からtotalＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡを得
た。当業者既知の方法によって該ｍＲＮＡから既述（石
原等、前掲）の方法に従い、ランダム・ヘキサマーでプ
ライムすることによりｃＤＮＡを合成した。ＥcoＲＩア
ダプターの付加の後、アガロースゲルから１.４キロ塩
基対（kb）以上のｃＤＮＡを回収し、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼでりん酸化してラムダｇｔ１１ベクター
（Stratagene）に結合（ライゲーション）させた。これ
を用いて、大腸菌（Esherichia coli)Ｙ１０９０ｒでｃ
ＤＮＡライブラリー（１.５ｘ１０6組換えクローン）を
構築した。他方、セクレチン受容体ｃＤＮＡを鋳型に適
当なプライマーを用いてＰＣＲ法によってプローブを調
製し、ランダムプライマー法で32Ｐ標識した。このプロ
ーブを用いて上記のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングすることによって９個の陽性クローン（ｐＷＶ１〜
９）を単離した。
クローニング １．ラット肺ｃＤＮＡライブラリーの構築 ＷiＤr 細胞株からtotalＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡを得
た。当業者既知の方法によって該ｍＲＮＡから既述（石
原等、前掲）の方法に従い、ランダム・ヘキサマーでプ
ライムすることによりｃＤＮＡを合成した。ＥcoＲＩア
ダプターの付加の後、アガロースゲルから１.４キロ塩
基対（kb）以上のｃＤＮＡを回収し、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼでりん酸化してラムダｇｔ１１ベクター
（Stratagene）に結合（ライゲーション）させた。これ
を用いて、大腸菌（Esherichia coli)Ｙ１０９０ｒでｃ
ＤＮＡライブラリー（１.５ｘ１０6組換えクローン）を
構築した。他方、セクレチン受容体ｃＤＮＡを鋳型に適
当なプライマーを用いてＰＣＲ法によってプローブを調
製し、ランダムプライマー法で32Ｐ標識した。このプロ
ーブを用いて上記のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニ
ングすることによって９個の陽性クローン（ｐＷＶ１〜
９）を単離した。
【００２３】Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Pharmacia)とα
−35Ｓ−ｄＡＴＰαＳ（Amersham)を用い、ジデオキシ
ヌクレオチド・チェーン・ターミネーション法でこれら
ＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を決定した。得られ
たヌクレオチド配列は、いずれもラットセクレチン受容
体ｃＤＮＡに相同な配列を有するが、介在配列や、欠失
をも有することが示された。
−35Ｓ−ｄＡＴＰαＳ（Amersham)を用い、ジデオキシ
ヌクレオチド・チェーン・ターミネーション法でこれら
ＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を決定した。得られ
たヌクレオチド配列は、いずれもラットセクレチン受容
体ｃＤＮＡに相同な配列を有するが、介在配列や、欠失
をも有することが示された。
【００２４】次いで、ｃＤＮＡクローンを用いるノーザ
ンハイブリダイゼーションでラットの各種組織における
ＶＩＰ受容体ｍＲＮＡの存在を調べ、肺がｃＤＮＡクロ
ーン（ｐＷＶ２）とハイブリッド形成する５．５kbｍＲ
ＮＡを最も高発現することを見い出した。石原等（前
掲）の方法に従い、ＣＤＭ８ベクターを用いてラット肺
ｃＤＮＡライブラリーを構築した。即ち、サムブルック
ら（前掲）の方法でtotalＲＮＡを調製し、oligo(dT)-
セルロースカラムクロマトグラフィーを用いてpoly(A)
ＲＮＡを選択した。ランダムヘキサマーオリゴヌクレオ
チド（pdＮ6)でプライムされた２本鎖ｃＤＮＡを、ＡＭ
Ｖ逆転写酵素ではなくＭ−ＭＬＶＲＮaseＨ-逆転写酵素
（ＢＲＬ）を用いる外は文献記載の方法と同様にして合
成した[フクナガら（Fukunaga et al.） Cell 61, 341-
350（1990）。ＢstＸＩアダプターを加えた後、１.０kb
以上のｃＤＮＡをアガロースゲルから回収しＢstＸＩ消
化ＣＤＭ８ベクター［シードら(Seed et al.） Nature
329： 840-842(1987)］に結合させ、Ｅ．coli ＭＣ１０
６１／ｐ３細胞に電気穿孔法で導入した。
ンハイブリダイゼーションでラットの各種組織における
ＶＩＰ受容体ｍＲＮＡの存在を調べ、肺がｃＤＮＡクロ
ーン（ｐＷＶ２）とハイブリッド形成する５．５kbｍＲ
ＮＡを最も高発現することを見い出した。石原等（前
掲）の方法に従い、ＣＤＭ８ベクターを用いてラット肺
ｃＤＮＡライブラリーを構築した。即ち、サムブルック
ら（前掲）の方法でtotalＲＮＡを調製し、oligo(dT)-
セルロースカラムクロマトグラフィーを用いてpoly(A)
ＲＮＡを選択した。ランダムヘキサマーオリゴヌクレオ
チド（pdＮ6)でプライムされた２本鎖ｃＤＮＡを、ＡＭ
Ｖ逆転写酵素ではなくＭ−ＭＬＶＲＮaseＨ-逆転写酵素
（ＢＲＬ）を用いる外は文献記載の方法と同様にして合
成した[フクナガら（Fukunaga et al.） Cell 61, 341-
350（1990）。ＢstＸＩアダプターを加えた後、１.０kb
以上のｃＤＮＡをアガロースゲルから回収しＢstＸＩ消
化ＣＤＭ８ベクター［シードら(Seed et al.） Nature
329： 840-842(1987)］に結合させ、Ｅ．coli ＭＣ１０
６１／ｐ３細胞に電気穿孔法で導入した。
【００２５】２．ラット肺ＶＩＰ受容体をコードするｃ
ＤＮＡのクローニング 次いで、ｐＷＶ２クローンからプローブを前記と同様に
して調製し、１．で得た５ｘ１０5クローンのｃＤＮＡ
ライブラリーを低ストリンジェンシー条件下でスクリー
ニングすることにより２２個の陽性クローンを得た。各
クローンから得たプラスミドＤＮＡをＣＯＳ細胞にＤＥ
ＡＥデキストラン法で導入した。形質転換細胞と125Ｉ
ＶＩＰとの結合能力に基づいて、互いに重なりあう５つ
の陽性クローンを得た。その内最長のｃＤＮＡクローン
（ｐＶ１９）を単離し、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Phar
macia)とα−35Ｓ−ｄＡＴＰαＳ（Amersham)を用い、
ジデオキシヌクレオチド・チェーン・ターミネーション
法でＤＮＡの配列を決定した。以下に、該ＤＮＡのヌク
レオチド配列を示す。
ＤＮＡのクローニング 次いで、ｐＷＶ２クローンからプローブを前記と同様に
して調製し、１．で得た５ｘ１０5クローンのｃＤＮＡ
ライブラリーを低ストリンジェンシー条件下でスクリー
ニングすることにより２２個の陽性クローンを得た。各
クローンから得たプラスミドＤＮＡをＣＯＳ細胞にＤＥ
ＡＥデキストラン法で導入した。形質転換細胞と125Ｉ
ＶＩＰとの結合能力に基づいて、互いに重なりあう５つ
の陽性クローンを得た。その内最長のｃＤＮＡクローン
（ｐＶ１９）を単離し、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Phar
macia)とα−35Ｓ−ｄＡＴＰαＳ（Amersham)を用い、
ジデオキシヌクレオチド・チェーン・ターミネーション
法でＤＮＡの配列を決定した。以下に、該ＤＮＡのヌク
レオチド配列を示す。
【化１】 このヌクレオチド配列によりコードされ得るアミノ酸配
列を以下に示す。
列を以下に示す。
【化２】
【００２６】上記の、ｐＶ１９クローンのヌクレオチド
配列および推定のアミノ酸配列の対応関係を図１および
図２に示す。このヌクレオチド配列は４５９アミノ酸か
らなるタンパク質をコードするオープンリーディングフ
レームを有するが、ＮＨ2末端の３０アミノ酸はシグナ
ル配列であり、成熟ＶＩＰ受容体は４２９アミノ酸から
なる。配列式の上下の数字はそれぞれ、アミノ酸および
ヌクレオチド番号を表す。アミノ酸配列は成熟ＶＩＰ受
容体のＮ末端アミノ酸（Ａla）を１として表し、シグナ
ルペプチドは負の番号で表した。７個の推定の膜貫通セ
グメントには下線を、Ｎ−グリコシル化部位（Asn-X-Se
r/Thr)には星印を施した。最初の細胞外ドメインにおけ
るシステイン残基（□で囲まれた残基）はＶＩＰ受容体
とセクレチン受容体で保存されている（図９参照）。
配列および推定のアミノ酸配列の対応関係を図１および
図２に示す。このヌクレオチド配列は４５９アミノ酸か
らなるタンパク質をコードするオープンリーディングフ
レームを有するが、ＮＨ2末端の３０アミノ酸はシグナ
ル配列であり、成熟ＶＩＰ受容体は４２９アミノ酸から
なる。配列式の上下の数字はそれぞれ、アミノ酸および
ヌクレオチド番号を表す。アミノ酸配列は成熟ＶＩＰ受
容体のＮ末端アミノ酸（Ａla）を１として表し、シグナ
ルペプチドは負の番号で表した。７個の推定の膜貫通セ
グメントには下線を、Ｎ−グリコシル化部位（Asn-X-Se
r/Thr)には星印を施した。最初の細胞外ドメインにおけ
るシステイン残基（□で囲まれた残基）はＶＩＰ受容体
とセクレチン受容体で保存されている（図９参照）。
【００２７】図９はラットＶＩＰ受容体、ブタカルシト
ニン受容体（Calcitonin R)、フクロネズミ副甲状腺ホ
ルモン受容体（ＰＴＨ−ＰＴＨＰγＲ）およびセクレチ
ン受容体（Secretin Ｒ）のアミノ酸配列の比較であ
り、配列の適正化のために適宜、空白が設けられてい
る。３残基以上が同一の箇所は箱で囲み、膜貫通領域に
は線を、推定のＧｓ活性化部位には２重線をそれぞれ施
した。ＶＩＰ受容体はラットセクレチン受容体、ブタカ
ルシトニン受容体、およびフクロネズミの副甲状腺ホル
モン受容体（ＰＴＨ−ＰＴＨγＨ Ｒ）と、４８％、３
３％および３９％の相同性を示した。
ニン受容体（Calcitonin R)、フクロネズミ副甲状腺ホ
ルモン受容体（ＰＴＨ−ＰＴＨＰγＲ）およびセクレチ
ン受容体（Secretin Ｒ）のアミノ酸配列の比較であ
り、配列の適正化のために適宜、空白が設けられてい
る。３残基以上が同一の箇所は箱で囲み、膜貫通領域に
は線を、推定のＧｓ活性化部位には２重線をそれぞれ施
した。ＶＩＰ受容体はラットセクレチン受容体、ブタカ
ルシトニン受容体、およびフクロネズミの副甲状腺ホル
モン受容体（ＰＴＨ−ＰＴＨγＨ Ｒ）と、４８％、３
３％および３９％の相同性を示した。
【００２８】実施例２ クローン化ＶＩＰ受容体の特性 １.ＶＩＰへの結合活性 本発明のＶＩＰ受容体をコードするＤＮＡで形質転換さ
れた細胞により産生された組換えラッットＶＩＰ受容
体、またはラット肺膜画分の天然ＶＩＰ受容体に対する
125ＩＶＩＰの結合活性を調べた。 １）ラット肺膜画分の調製 実質上、プロボウら［Provow et al. Endocrinol. 120:
2442-2452 (1987)］の方法に従って、ラット肺膜画分
を調製した。雄性ウイスター種ラットをエーテル麻酔
し、断頭して氷冷りん酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）３０ml
で心臓灌流した。白化した肺を破砕し、破砕組織に、湿
重量１ｇあたり２０mlの２５mＭ Ｈepes(ｐＨ７．
４）、２５０mＭショ糖、５mＭ ＭgＣl2、１mＭ フェ
ニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を加え、
Polytron homogenizerでホモジェネートした。ホモジェ
ネートをglass-teflon homogenizerで再度ホモジェネー
トした後、医用ガーゼでろ過し３０、０００ｘｇで１０
分間遠心した。沈殿を２５mＭＨepes (ｐＨ７．４）、
５mＭ ＭgＣl2および１mＭＰＭＳＦ含有バッファーに
懸濁した。遠心後、ペレットを１mＭＥＧＴＡを含有す
る同じバッファーに１０ml／組織湿重量の割合で再度懸
濁し、天然ＶＩＰ受容体を含む膜画分試料とした。
れた細胞により産生された組換えラッットＶＩＰ受容
体、またはラット肺膜画分の天然ＶＩＰ受容体に対する
125ＩＶＩＰの結合活性を調べた。 １）ラット肺膜画分の調製 実質上、プロボウら［Provow et al. Endocrinol. 120:
2442-2452 (1987)］の方法に従って、ラット肺膜画分
を調製した。雄性ウイスター種ラットをエーテル麻酔
し、断頭して氷冷りん酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）３０ml
で心臓灌流した。白化した肺を破砕し、破砕組織に、湿
重量１ｇあたり２０mlの２５mＭ Ｈepes(ｐＨ７．
４）、２５０mＭショ糖、５mＭ ＭgＣl2、１mＭ フェ
ニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を加え、
Polytron homogenizerでホモジェネートした。ホモジェ
ネートをglass-teflon homogenizerで再度ホモジェネー
トした後、医用ガーゼでろ過し３０、０００ｘｇで１０
分間遠心した。沈殿を２５mＭＨepes (ｐＨ７．４）、
５mＭ ＭgＣl2および１mＭＰＭＳＦ含有バッファーに
懸濁した。遠心後、ペレットを１mＭＥＧＴＡを含有す
る同じバッファーに１０ml／組織湿重量の割合で再度懸
濁し、天然ＶＩＰ受容体を含む膜画分試料とした。
【００２９】２）形質転換細胞の細胞膜の調製 １５cmのプレートで培養したＣＯＰ細胞をＤＥＡＥデキ
ストラン法により、プラスミドｐＶ１９またはＣＤＭ８
プラスミドでトランスフェクション（形質転換）した。
形質転換されたＣＯＰ細胞から、石原等（前掲）の方法
で粗細胞膜画分を調製し、組換えＶＩＰ受容体を含む試
料とした。
ストラン法により、プラスミドｐＶ１９またはＣＤＭ８
プラスミドでトランスフェクション（形質転換）した。
形質転換されたＣＯＰ細胞から、石原等（前掲）の方法
で粗細胞膜画分を調製し、組換えＶＩＰ受容体を含む試
料とした。
【００３０】３）ＶＩＰとの結合分析 １）または２）で調製した膜画分試料１０μgを種々の
濃度の125ＩＶＩＰ（比活性＝２２００Ｃｉ／mmol）と
共に２５mＭ Ｈepes（ｐＨ７．４）、５mＭ ＭgＣ
l2、１mＭ ＥＧＴＡ，５０mＭ ＮaＣl、１０mg／mlＢ
ＳＡ，２mg／mlバシトラシン、０.１mＭ（ｐ−アミジノ
フェニル）メタンスルホニル・フルオリド塩酸塩および
０．１mg／mlのロイペプチンを含有する溶液１００μl
中で３７℃において２時間インキュベーションした。１
４，０００ｘｇで３分間遠心して反応を停止した。ペレ
ットを氷冷ＢＳＡ１mlに懸濁し、懸濁液をあらかじめ
０.３％ポリエチレンイミンに浸漬しておいたＷhatman
ＧＦ／Ｃフィルターでろ過した。ろ紙上の放射能をガン
マ−カウンターで測定した。125ＩＶＩＰの膜への非特
異的な結合を測定するために大過剰の非標識ＶＩＰ（５
μＭ）を分析混合物に混入し、全結合から差し引いて特
異的な結合を算出した。結果をＭacLigand Ｐrogram
［ムンソンら（Munson et al. Anal.Biocnem. 107: 220
-239 (1980)］に従いスキャッチャード分析に付した。
結果を図３ａおよびｂに示す。ＶＩＰはプラスミドｐＶ
１９で形質転換された細胞の細胞膜画分と有意に結合し
たが、ＣＤＭ８プラスミドで形質転換された細胞のそれ
とは結合しなかった。
濃度の125ＩＶＩＰ（比活性＝２２００Ｃｉ／mmol）と
共に２５mＭ Ｈepes（ｐＨ７．４）、５mＭ ＭgＣ
l2、１mＭ ＥＧＴＡ，５０mＭ ＮaＣl、１０mg／mlＢ
ＳＡ，２mg／mlバシトラシン、０.１mＭ（ｐ−アミジノ
フェニル）メタンスルホニル・フルオリド塩酸塩および
０．１mg／mlのロイペプチンを含有する溶液１００μl
中で３７℃において２時間インキュベーションした。１
４，０００ｘｇで３分間遠心して反応を停止した。ペレ
ットを氷冷ＢＳＡ１mlに懸濁し、懸濁液をあらかじめ
０.３％ポリエチレンイミンに浸漬しておいたＷhatman
ＧＦ／Ｃフィルターでろ過した。ろ紙上の放射能をガン
マ−カウンターで測定した。125ＩＶＩＰの膜への非特
異的な結合を測定するために大過剰の非標識ＶＩＰ（５
μＭ）を分析混合物に混入し、全結合から差し引いて特
異的な結合を算出した。結果をＭacLigand Ｐrogram
［ムンソンら（Munson et al. Anal.Biocnem. 107: 220
-239 (1980)］に従いスキャッチャード分析に付した。
結果を図３ａおよびｂに示す。ＶＩＰはプラスミドｐＶ
１９で形質転換された細胞の細胞膜画分と有意に結合し
たが、ＣＤＭ８プラスミドで形質転換された細胞のそれ
とは結合しなかった。
【００３１】図３ａはＶＩＰ受容体ｃＤＮＡで形質転換
されたＣＯＰ細胞の細胞膜画分と125ＩＶＩＰとの結
合、図３ｂはラット肺の膜画分と125ＩＶＩＰとの結合
を示す。形質転換細胞からの膜画分は解離定数１７３ｐ
Ｍと２１．０ｎＭの２つの結合部位を有することが明ら
かになった。高親和性および低親和性の結合部位のタン
パク質濃度ははそれぞれ４．１および５３pmol／mgであ
った。組換えＶＩＰ受容体のこれらの解離定数はラット
肺の膜画分の値に近似している（図３ｂ)。 ４）グルカゴン／セクレチン類ホルモンの競合作用 非標識ヒトＶＩＰ（白四角）、ＰＡＣＡＰ−３８（黒
丸）、helodermin（黒四角）、ＰＡＣＡＰ−２７（白
丸）、ＰＨＭ（白三角）、セクレチン（黒三角）および
グルカゴン（＋）の存在下、組換えＶＩＰ受容体（ｐＶ
１９で形質転換されたＣＯＰ細胞の細胞膜）または天然
ＶＩＰ受容体（ラット肺膜画分）と125ＩＶＩＰとの結
合を上記と３）と同様にして測定し、競合作用を調べ
た。結果を図４および５に示す。
されたＣＯＰ細胞の細胞膜画分と125ＩＶＩＰとの結
合、図３ｂはラット肺の膜画分と125ＩＶＩＰとの結合
を示す。形質転換細胞からの膜画分は解離定数１７３ｐ
Ｍと２１．０ｎＭの２つの結合部位を有することが明ら
かになった。高親和性および低親和性の結合部位のタン
パク質濃度ははそれぞれ４．１および５３pmol／mgであ
った。組換えＶＩＰ受容体のこれらの解離定数はラット
肺の膜画分の値に近似している（図３ｂ)。 ４）グルカゴン／セクレチン類ホルモンの競合作用 非標識ヒトＶＩＰ（白四角）、ＰＡＣＡＰ−３８（黒
丸）、helodermin（黒四角）、ＰＡＣＡＰ−２７（白
丸）、ＰＨＭ（白三角）、セクレチン（黒三角）および
グルカゴン（＋）の存在下、組換えＶＩＰ受容体（ｐＶ
１９で形質転換されたＣＯＰ細胞の細胞膜）または天然
ＶＩＰ受容体（ラット肺膜画分）と125ＩＶＩＰとの結
合を上記と３）と同様にして測定し、競合作用を調べ
た。結果を図４および５に示す。
【００３２】図４はＶＩＰ受容体ｃＤＮＡで形質転換さ
れたＣＯＰ細胞の膜と125ＩＶＩＰとの結合に対する置
換反応を、図５はラット肺から得た膜と125ＩＶＩＰと
の結合に対する置換反応を示す。図から、125Ｉ−ＶＩ
Ｐと膜との結合に対する置換作用は、ＰＡＣＡＰ−３８
（ＩＣ50＝１．０ｎＭ）およびＰＡＣＡＰ−２７（ＩＣ
50＝２．５ｎＭ）でＶＩＰ（ＩＣ50＝３．０ｎＭ）より
も大きい（図４）ことが分かる。heloderminおよびＰＨ
ＭはＩＣ50＝６．０ｎＭで125Ｉ−ＶＩＰの膜結合を阻
害した。しかし、セクレチンやグルカゴンの阻害作用は
小さいか殆ど無いことが認められた。これらはラット肺
の天然ＶＩＰ受容体での結果（図５）と一致した。ＶＩ
Ｐとセクレチンとの高度の相同性にかかわらず、セクレ
チンのＶＩＰ受容体への親和性が低いことは、結合に関
与する部位がこれらの両受容体で相違することを示唆す
るものである。これは、リガンド結合に関与すると予測
されるシステイン豊富領域の保存性が低いことからも予
測される（図９参照）。
れたＣＯＰ細胞の膜と125ＩＶＩＰとの結合に対する置
換反応を、図５はラット肺から得た膜と125ＩＶＩＰと
の結合に対する置換反応を示す。図から、125Ｉ−ＶＩ
Ｐと膜との結合に対する置換作用は、ＰＡＣＡＰ−３８
（ＩＣ50＝１．０ｎＭ）およびＰＡＣＡＰ−２７（ＩＣ
50＝２．５ｎＭ）でＶＩＰ（ＩＣ50＝３．０ｎＭ）より
も大きい（図４）ことが分かる。heloderminおよびＰＨ
ＭはＩＣ50＝６．０ｎＭで125Ｉ−ＶＩＰの膜結合を阻
害した。しかし、セクレチンやグルカゴンの阻害作用は
小さいか殆ど無いことが認められた。これらはラット肺
の天然ＶＩＰ受容体での結果（図５）と一致した。ＶＩ
Ｐとセクレチンとの高度の相同性にかかわらず、セクレ
チンのＶＩＰ受容体への親和性が低いことは、結合に関
与する部位がこれらの両受容体で相違することを示唆す
るものである。これは、リガンド結合に関与すると予測
されるシステイン豊富領域の保存性が低いことからも予
測される（図９参照）。
【００３３】２．クローン化ＶＩＰ受容体による、ＶＩ
Ｐのアデニレートシクラーゼ活性刺激作用の伝達 細胞内ｃＡＭＰ濃度の測定はゾウら［Ｚhou et al., Na
ture 347:76-80 (1990)］の方法に従って行われた。ラ
ットＧｓタンパクαサブユニットを高発現するＣＯＳＧ
ｓ１細胞を、ＶＩＰ受容体ｃＤＮＡで形質転換し、得ら
れた細胞内でのｃＡＭＰ発現のＶＩＰによる刺激作用を
調べた。結果を図６に示す。
Ｐのアデニレートシクラーゼ活性刺激作用の伝達 細胞内ｃＡＭＰ濃度の測定はゾウら［Ｚhou et al., Na
ture 347:76-80 (1990)］の方法に従って行われた。ラ
ットＧｓタンパクαサブユニットを高発現するＣＯＳＧ
ｓ１細胞を、ＶＩＰ受容体ｃＤＮＡで形質転換し、得ら
れた細胞内でのｃＡＭＰ発現のＶＩＰによる刺激作用を
調べた。結果を図６に示す。
【００３４】ＤＥＡＥデキストラン法でＣＯＳＧｓ１細
胞をＶＩＰ受容体発現プラスミドｐＶ１９でトランスフ
ェクションした。グリセリンショックの２４時間後、細
胞を６ウエルのマイクロタイタープレートに分配し培地
中で３７℃、４８時間培養した。細胞をインキュベーシ
ョンバッファー（１mg／mlＢＳＡおよび０.５mＭ １ー
メチルー３ーイソブチルキサンチンを含有するＤＭＥ
Ｍ）で２回洗浄した後、様々な濃度のペプチドホルモ
ン：ＶＩＰ（白四角）、ＰＡＣＡＰ−３８（黒丸）、he
lodermin（黒四角）、ＰＡＣＡＰ−２７（白丸）、ＰＨ
Ｍ（白三角）、セクレチン（黒三角）、およびグルカゴ
ン（＋）を含有するインキュベーションバッファー中で
３７℃、４５分間インキュベーションした。バッファー
を吸引除去した後エタノール１mlを加えて反応を停止
し、１.５mlのエッペンドルフ管に入れた。１４，００
０ｘｇで３分間遠心したのち上清を乾燥しｃＡＭＰ濃度
をＡmersham社のｃＡＭＰアッセイシステムを用いて測
定した。対照（Ｘ）として、ＣＤＭ８ベクターを用いて
ＣＯＳＧｓ１細胞を１０μＭＶＩＰで処置した。図６か
ら分かるように、プラスミドｐＶ１９でトランスフェク
ションして得られた細胞はＶＩＰ刺激下でｃＡＭＰを多
量に生産した（４００pmol／１０5形質転換体）。しか
し、ＣＤＭ８ベクターで形質転換された細胞はＶＩＰ刺
激下でのｃＡＭＰ生産を示さなかった。ＰＡＣＡＰ−３
８およびＰＡＣＡＰ−２７のｃＡＭＰ生産刺激効果はＶ
ＩＰよりも少し大きいが、ＨeloderminおよびＰＨＭの
それはＶＩＰよりも小さい。またセクレチンが、ＶＩＰ
と同等の作用を発揮するには後者の約３０倍存在するこ
とが必要であり、各々の受容体の構造上の相違が示唆さ
れた。また、グルカゴンはｃＡＭＰ産生を刺激しなかっ
た。
胞をＶＩＰ受容体発現プラスミドｐＶ１９でトランスフ
ェクションした。グリセリンショックの２４時間後、細
胞を６ウエルのマイクロタイタープレートに分配し培地
中で３７℃、４８時間培養した。細胞をインキュベーシ
ョンバッファー（１mg／mlＢＳＡおよび０.５mＭ １ー
メチルー３ーイソブチルキサンチンを含有するＤＭＥ
Ｍ）で２回洗浄した後、様々な濃度のペプチドホルモ
ン：ＶＩＰ（白四角）、ＰＡＣＡＰ−３８（黒丸）、he
lodermin（黒四角）、ＰＡＣＡＰ−２７（白丸）、ＰＨ
Ｍ（白三角）、セクレチン（黒三角）、およびグルカゴ
ン（＋）を含有するインキュベーションバッファー中で
３７℃、４５分間インキュベーションした。バッファー
を吸引除去した後エタノール１mlを加えて反応を停止
し、１.５mlのエッペンドルフ管に入れた。１４，００
０ｘｇで３分間遠心したのち上清を乾燥しｃＡＭＰ濃度
をＡmersham社のｃＡＭＰアッセイシステムを用いて測
定した。対照（Ｘ）として、ＣＤＭ８ベクターを用いて
ＣＯＳＧｓ１細胞を１０μＭＶＩＰで処置した。図６か
ら分かるように、プラスミドｐＶ１９でトランスフェク
ションして得られた細胞はＶＩＰ刺激下でｃＡＭＰを多
量に生産した（４００pmol／１０5形質転換体）。しか
し、ＣＤＭ８ベクターで形質転換された細胞はＶＩＰ刺
激下でのｃＡＭＰ生産を示さなかった。ＰＡＣＡＰ−３
８およびＰＡＣＡＰ−２７のｃＡＭＰ生産刺激効果はＶ
ＩＰよりも少し大きいが、ＨeloderminおよびＰＨＭの
それはＶＩＰよりも小さい。またセクレチンが、ＶＩＰ
と同等の作用を発揮するには後者の約３０倍存在するこ
とが必要であり、各々の受容体の構造上の相違が示唆さ
れた。また、グルカゴンはｃＡＭＰ産生を刺激しなかっ
た。
【００３５】実験例 ノーザンハイブリダイゼーション 実施例２でラット肺由来のＶＩＰ受容体をコードするこ
とが示されたプラスミドｐＶ１９を用いてＶＩＰ受容体
の生体内での分布を調べた。ラットの様々な組織からグ
アニジンチオシアネート／酸フェノール法［チョモシジ
ンスキーら（Chomczynski et al.）Anal.Biochem. 162:
156-159 (1987)］でtotal ＲＮＡを得、oligo(dT)30 L
atex （宝酒造）を用いてpoly（Ａ）ＲＮＡを回収し
た。poly（Ａ）ＲＮＡを６．６％ホルムアルデヒド含有
１．５％アガロースゲル上、約２μg/レーンで電気泳動
し、ナイロンメンブラン（Ｓchleicher &Shuell)上に移
した。ハイブリダイゼーションの温度が４２℃であり、
洗浄を、０．１ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、５０
℃で２回行うことを除き、サムブルックらの方法（Ｓam
brook et al, 1989、前掲)に従い、ハイブリッド形成を
行った。ｐＶ１９のＰstＩ断片（ヌクレオチド番号２４
９−１２９１）をランダムプライマー法で32Ｐ標識した
ものをプローブＤＮＡとして用いた。
とが示されたプラスミドｐＶ１９を用いてＶＩＰ受容体
の生体内での分布を調べた。ラットの様々な組織からグ
アニジンチオシアネート／酸フェノール法［チョモシジ
ンスキーら（Chomczynski et al.）Anal.Biochem. 162:
156-159 (1987)］でtotal ＲＮＡを得、oligo(dT)30 L
atex （宝酒造）を用いてpoly（Ａ）ＲＮＡを回収し
た。poly（Ａ）ＲＮＡを６．６％ホルムアルデヒド含有
１．５％アガロースゲル上、約２μg/レーンで電気泳動
し、ナイロンメンブラン（Ｓchleicher &Shuell)上に移
した。ハイブリダイゼーションの温度が４２℃であり、
洗浄を、０．１ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、５０
℃で２回行うことを除き、サムブルックらの方法（Ｓam
brook et al, 1989、前掲)に従い、ハイブリッド形成を
行った。ｐＶ１９のＰstＩ断片（ヌクレオチド番号２４
９−１２９１）をランダムプライマー法で32Ｐ標識した
ものをプローブＤＮＡとして用いた。
【００３６】フィルターをＸ線フィルムに２４時間（組
織由来の試料、図７）または７日間（脳由来の試料、図
８）暴露した。図７から、５．５kbＶＩＰ受容体ｍＲＮ
Ａは、肺に最も多く、次いで、肝臓および腸に存在して
いることが分かる。さらに弱い発現は胸腺および脳に認
められる。しかし、心臓、腎臓、脾臓、膵臓、胃および
副腎には認められない。図８から、成熟ラットの脳全域
に発現が認められるが、大脳皮質および海馬におけるシ
グナルは脳の他の部分のそれよりも強いことが分かる。
さらに、肺、肝臓および結腸の場合には、５．５kbＶＩ
Ｐ受容体ｍＲＮＡバンドは単一であるが脳および小腸の
場合には、さらに２．４および１．３kbの小さいバンド
も観察された。
織由来の試料、図７）または７日間（脳由来の試料、図
８）暴露した。図７から、５．５kbＶＩＰ受容体ｍＲＮ
Ａは、肺に最も多く、次いで、肝臓および腸に存在して
いることが分かる。さらに弱い発現は胸腺および脳に認
められる。しかし、心臓、腎臓、脾臓、膵臓、胃および
副腎には認められない。図８から、成熟ラットの脳全域
に発現が認められるが、大脳皮質および海馬におけるシ
グナルは脳の他の部分のそれよりも強いことが分かる。
さらに、肺、肝臓および結腸の場合には、５．５kbＶＩ
Ｐ受容体ｍＲＮＡバンドは単一であるが脳および小腸の
場合には、さらに２．４および１．３kbの小さいバンド
も観察された。
【００３７】脳でのＶＩＰ受容体の存在を、標識したア
ンチセンスＲＮＡを用いる系中（insitu)ハイブリッド
形成［マスら（Masu et al.）Nature 349: 760-765 (19
91)］によって調べた。成熟雄性ラットの脳切片（厚さ
１０μm）をクリオスタット上で切断し、ポリ−Ｌ−リ
ジン被覆したスライドに溶かしながら吸着させ、４％ホ
ルムアルデヒドで固定化し、０．１Ｍトリエタノールア
ミンバッファー（ｐＨ８.０）中０.２５％無水酢酸でア
セチル化した。ｐＶ１９の１.３kbＳacＩ断片をｐBlues
cript KS+にサブクローンし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
とα−35Ｓ−ＣＴＰを用いてインビトロで転写し、35Ｓ
標識ＲＮＡを調製した。標識化ＲＮＡ産物（比活性２ｘ
１０9cpm/μg)を０.１Ｍ ＮＨＣＯ3（ｐＨ１０．０）
中で６０℃で５０分間インキュベーションすることによ
り断片化し、２〜３ｘ１０5cpm/μlの濃度でプローブと
して用いた。
ンチセンスＲＮＡを用いる系中（insitu)ハイブリッド
形成［マスら（Masu et al.）Nature 349: 760-765 (19
91)］によって調べた。成熟雄性ラットの脳切片（厚さ
１０μm）をクリオスタット上で切断し、ポリ−Ｌ−リ
ジン被覆したスライドに溶かしながら吸着させ、４％ホ
ルムアルデヒドで固定化し、０．１Ｍトリエタノールア
ミンバッファー（ｐＨ８.０）中０.２５％無水酢酸でア
セチル化した。ｐＶ１９の１.３kbＳacＩ断片をｐBlues
cript KS+にサブクローンし、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
とα−35Ｓ−ＣＴＰを用いてインビトロで転写し、35Ｓ
標識ＲＮＡを調製した。標識化ＲＮＡ産物（比活性２ｘ
１０9cpm/μg)を０.１Ｍ ＮＨＣＯ3（ｐＨ１０．０）
中で６０℃で５０分間インキュベーションすることによ
り断片化し、２〜３ｘ１０5cpm/μlの濃度でプローブと
して用いた。
【００３８】ハイブリッド形成はハイブリダイゼーショ
ンバッファー（５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキス
トラン、１００ｍＭ ＤＴＴ、１ｘDenhardt's溶液、
０.２％ＳＤＳ、２ｘＳＳＣ、１０mＭ Ｔris−ＨＣl、
pＨ７.５、２５０μg/mlｔＲＮＡ、および５００μg/ml
ニシン精子ＤＮＡ）中、５５℃で５時間行った。１０m
Ｍβ−メルカプトエタノール含有２ｘＳＳＣ中で２回洗
浄した後、スライドを２０μg/mlＲＮaseＡで３７℃で
３０分間処理し、１０mＭβ−メルカプトエタノール含
有０．１ｘＳＳＣで６０℃で１時間洗浄し、Hyperfilm
βマックス（Amersham)に２週間暴露した。プローブＲ
ＮＡの非特異的結合を検討するために、ハイブリダイゼ
ーションバッファーに１００倍過剰の非標識ｃＤＮＡを
含ませた。エマルジョンオートラジオグラフィーのため
に、スライドを蒸留水で１：１希釈したＮＴＢ２エマル
ジョン（Kodak)に浸け、６週間暴露した。現像後、脳切
片をクレシルバイオレットでカウンター染色した。
ンバッファー（５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキス
トラン、１００ｍＭ ＤＴＴ、１ｘDenhardt's溶液、
０.２％ＳＤＳ、２ｘＳＳＣ、１０mＭ Ｔris−ＨＣl、
pＨ７.５、２５０μg/mlｔＲＮＡ、および５００μg/ml
ニシン精子ＤＮＡ）中、５５℃で５時間行った。１０m
Ｍβ−メルカプトエタノール含有２ｘＳＳＣ中で２回洗
浄した後、スライドを２０μg/mlＲＮaseＡで３７℃で
３０分間処理し、１０mＭβ−メルカプトエタノール含
有０．１ｘＳＳＣで６０℃で１時間洗浄し、Hyperfilm
βマックス（Amersham)に２週間暴露した。プローブＲ
ＮＡの非特異的結合を検討するために、ハイブリダイゼ
ーションバッファーに１００倍過剰の非標識ｃＤＮＡを
含ませた。エマルジョンオートラジオグラフィーのため
に、スライドを蒸留水で１：１希釈したＮＴＢ２エマル
ジョン（Kodak)に浸け、６週間暴露した。現像後、脳切
片をクレシルバイオレットでカウンター染色した。
【００３９】ハイブリッド形成シグナルは大脳皮質、海
馬および嗅球の僧帽細胞層に優勢であり、皮質下領域お
よび小脳皮質では広範であるが弱かった。このシグナル
はまた、非標識アンチセンスＲＮＡを１００倍過剰加え
ると消失した。さらに、大脳皮質のエマルジョン浸漬切
片を用いるbright-field photomicrographにより、ＶＩ
Ｐ受容体ｍＲＮＡはニューロンに局在することが示され
た。
馬および嗅球の僧帽細胞層に優勢であり、皮質下領域お
よび小脳皮質では広範であるが弱かった。このシグナル
はまた、非標識アンチセンスＲＮＡを１００倍過剰加え
ると消失した。さらに、大脳皮質のエマルジョン浸漬切
片を用いるbright-field photomicrographにより、ＶＩ
Ｐ受容体ｍＲＮＡはニューロンに局在することが示され
た。
【００４０】
【発明の効果】 本発明のＶＩＰ受容体をコードするＤ
ＮＡを用いてＶＩＰおよび近縁のホルモンの分子レベル
での機能および制御機構を解明することが可能となっ
た。また、該ＤＮＡで形質転換された微生物を培養する
ことにより大量にＶＩＰ受容体ペプチドを製造し、研
究、診断および治療に用いることができる。
ＮＡを用いてＶＩＰおよび近縁のホルモンの分子レベル
での機能および制御機構を解明することが可能となっ
た。また、該ＤＮＡで形質転換された微生物を培養する
ことにより大量にＶＩＰ受容体ペプチドを製造し、研
究、診断および治療に用いることができる。
【図１】 ラットＶＩＰ受容体をコードするＤＮＡのヌ
クレオチド配列の上流側半分および推定のアミノ酸配
列。
クレオチド配列の上流側半分および推定のアミノ酸配
列。
【図２】 ラットＶＩＰ受容体をコードするＤＮＡのヌ
クレオチド配列の下流側半分および推定のアミノ酸配
列。
クレオチド配列の下流側半分および推定のアミノ酸配
列。
【図３】 図１および図２で示されるＤＮＡを含有する
プラスミドｐＶ１９でトランスフェクションされたＣＯ
Ｐ細胞の細胞膜（ａ）、およびラット肺細胞膜（ｂ）と
ＶＩＰとの親和性を表すグラフ。
プラスミドｐＶ１９でトランスフェクションされたＣＯ
Ｐ細胞の細胞膜（ａ）、およびラット肺細胞膜（ｂ）と
ＶＩＰとの親和性を表すグラフ。
【図４】 ｐＶ１９で形質転換されたＣＯＰ細胞の細胞
膜と125ＩＶＩＰとの結合に対する他のホルモンの拮抗
作用を表すグラフ。
膜と125ＩＶＩＰとの結合に対する他のホルモンの拮抗
作用を表すグラフ。
【図５】 ラット肺の細胞膜から調製した膜画分と125
ＩＶＩＰとの結合に対する他のホルモンの拮抗作用を表
すグラフ。
ＩＶＩＰとの結合に対する他のホルモンの拮抗作用を表
すグラフ。
【図６】 種々のホルモンの存在下での、ラットＶＩＰ
受容体を発現するＣＯＳＧｓ１細胞におけるｃＡＭＰ蓄
積を表すグラフ。
受容体を発現するＣＯＳＧｓ１細胞におけるｃＡＭＰ蓄
積を表すグラフ。
【図７】 ラット組織のＶＩＰ受容体ＲＮＡのノーザン
ハイブリダイゼーションによる分析結果の模写図。
ハイブリダイゼーションによる分析結果の模写図。
【図８】 ラット脳のＶＩＰ受容体ＲＮＡのノーザンハ
イブリダイゼーションによる分析結果の模写図。
イブリダイゼーションによる分析結果の模写図。
【図９】 ラットＶＩＰ受容体、ブタカルシトニン受容
体、フクロネズミ副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨ−Ｐ
ＴＨＰγＲ）およびセクレチン受容体のアミノ酸配列の
比較図。
体、フクロネズミ副甲状腺ホルモン受容体（ＰＴＨ−Ｐ
ＴＨＰγＲ）およびセクレチン受容体のアミノ酸配列の
比較図。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＣＬ 8314−4Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】 ラット由来のバソアクティブ・インテス
ティナル・ポリペプチド受容体。 - 【請求項２】 図１および図２に記載のアミノ酸配列で
示される請求項１のバソアクティブ・インテスティナル
・ポリペプチド受容体。 - 【請求項３】 図１および図２に記載のアミノ酸配列で
示されるバソアクティブ・インテスティナル・ポリペプ
チド受容体をコードするＤＮＡ。 - 【請求項４】 図１および図２に記載のヌクレオチド配
列で示される請求項３のＤＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4026607A JPH05255394A (ja) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド受容体およびそれをコードするｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4026607A JPH05255394A (ja) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド受容体およびそれをコードするｄｎａ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05255394A true JPH05255394A (ja) | 1993-10-05 |
Family
ID=12198192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4026607A Pending JPH05255394A (ja) | 1992-02-13 | 1992-02-13 | バソアクティブ・インテスティナル・ポリペプチド受容体およびそれをコードするｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05255394A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995006724A1 (en) * | 1993-09-01 | 1995-03-09 | Medical Research Council | Vip2 (vasoactive intestinal polypeptide) receptor |
-
1992
- 1992-02-13 JP JP4026607A patent/JPH05255394A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995006724A1 (en) * | 1993-09-01 | 1995-03-09 | Medical Research Council | Vip2 (vasoactive intestinal polypeptide) receptor |
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