JP2003530821A

JP2003530821A - メラニン凝集ホルモン受容体

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Publication number: JP2003530821A
Application number: JP2001511161A
Authority: JP
Inventors: ハワード，アンドリユー・デイー
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1999-07-14
Filing date: 2000-07-10
Publication date: 2003-10-21
Also published as: WO2001005947A1; CA2378917A1; EP1200560A4; US7198910B1; EP1200560A1

Abstract

(57)【要約】本出願は、２つの異なる形態のヒトＭＣＨ受容体：（１）ＭＣＨ−Ｒ２および（２）ＭＣＨ−Ｒ３を主題とする。そのようなＭＣＨ受容体は、患者に有益な影響を及ぼす標的となり、ＭＣＨ受容体の活性または発現をモジュレーションする化合物のスクリーニングを促進する。得られうる有益な効果は、食欲の増加、食欲の減少およびストレスの軽減を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、メラニン凝集ホルモン受容体、該メラニン凝集ホルモン受容体にお
いて活性な化合物に関するスクリーニング方法、および有益な効果を達成するた
めのそのような化合物の使用方法に関する。

【０００２】（発明の背景）本明細書中に引用する参考文献は本発明の先行技術であると認めるものではな
い。

【０００３】視床下部に存在する神経ペプチドは、体重の制御の媒介において主要な役割を
果たしている（Ｆｌｉｅｒら，１９９８．Ｃｅｌｌ，９２，４３７−４４０）。
メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）は、より大きなプレプロホルモン前駆体（これ
はまた、神経ペプチドＮＥＩおよびＮＧＥをコードする）の一部として視床下部
で合成される１９アミノ酸の環状神経ペプチドである（Ｎａｈｏｎら，１９９０
．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４，６３２−６３７）。ＭＣＨは最初はサケ
下垂体において同定された。魚類では、ＭＣＨはメラニン凝集に影響を及ぼして
、皮膚色素沈着に影響を及ぼす。また、マスおよびウナギでは、ＭＣＨは、スト
レスにより誘導される又はＣＲＦにより刺激されるＡＣＴＨ放出に関与している
ことが示されている（Ｋａｗａｕｃｈｉら，１９８３．Ｎａｔｕｒｅ３０５，
３２１−３２３）。

【０００４】ヒトでは、脳内で発現されるＭＣＨをコードする２つの遺伝子が同定されてい
る（Ｂｒｅｔｏｎら，１９９３．Ｍｏｌ．ＢｒａｉｎＲｅｓ．１８，２９７−
３１０）。哺乳類では、ＭＣＨは、主に、不活性帯（ｚｏｎａｉｎｅｒｔｉａ
）および外側視床下部の核周囲部細胞体を含む摂食制御に関与する視床下部のニ
ューロン細胞体に局在化されている（Ｋｎｉｇｇｅら，１９９６．Ｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ１７，１０６３−１０７３）。

【０００５】薬理学的および遺伝的証拠は、ＭＣＨの作用の主要様態が摂食を促進するもの
（食欲増進）であると示唆している。ＭＣＨｍＲＮＡは、絶食マウスおよびラ
ットにおいて、およびｏｂ／ｏｂマウスにおいて（Ｑｕら，１９９６Ｎａｔｕ
ｒｅ３８０，２４３−２４７）、および神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）遺伝子が標
的化破壊されたマウスにおいて（Ｅｒｉｃｋｓｏｎら，１９９６．Ｎａｔｕｒｅ３８１，４１５−４１８）、アップレギュレーションされる。ＭＣＨの中枢注
入（ＩＣＶ）は摂食を刺激し、ＭＣＨは、αメラニン細胞刺激ホルモン（αＭＳ
Ｈ）で認められる食欲不振（ｈｙｐｏｐｈａｇｉｃ）効果に拮抗する（Ｑｕら，
１９９６Ｎａｔｕｒｅ３８０，２４３−２４７）。ＭＣＨ欠損マウスは痩せ
て食欲不振であり、増加した代謝率を有する（Ｓｈｉｍａｄａら，１９９８．Ｎ
ａｔｕｒｅ３９６，６７０−６７３）。

【０００６】ＭＣＨの作用は摂食のモジュレーションに限定されるものではない。なぜなら
、視床下部−下垂体−軸に対する効果が報告されているからである（Ｎａｈｏｎ
，１９９４．ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖ．ｉｎＮｅｕｒｏｂｉｏｌ．８，２２
１−２６２）。ＭＣＨは、視床下部からのＣＲＦの及び下垂体からのＡＣＴＨの
ストレス誘導性放出をモジュレーションしうるため、ＭＣＨはストレスに対する
身体応答に関与している可能性がある。また、ＭＣＨ神経系は、生殖または母性
機能に関与している可能性がある。

【０００７】（発明の概要）本出願は、２つの異なる形態のヒトＭＣＨ受容体：（１）ＭＣＨ−Ｒ２および
（２）ＭＣＨ−Ｒ３を主題とする。そのようなＭＣＨ受容体は、患者に有益な影
響を及ぼす標的となり、ＭＣＨ受容体の活性または発現をモジュレーションする
化合物のスクリーニングを促進する。得られうる有益な効果は、食欲の増加、食
欲の減少およびストレスの軽減を含む。

【０００８】該ＭＣＨ受容体は、ＭＣＨが結合すると細胞内シグナルを伝達するＧタンパク
質共役受容体である。ＭＣＨ−Ｒ１、より短い長さのＭＣＨ−Ｒ２誘導体および
ＭＣＨ−３がＧ_ｉタンパク質と共役する能力については、後記実施例３で説明す
る。

【０００９】ＭＣＨ−Ｒ１、ＭＣＨ−Ｒ２およびＭＣＨ−Ｒ３は構造的に関連したポリペプ
チドであり、細胞外アミノ末端における追加的なアミノ酸の存在により異なる。
ＭＣＨ−Ｒ２は、ＭＣＨ−Ｒ１と比較して、そのアミノ末端に追加的な６４アミ
ノ酸を有する。ＭＣＨ−Ｒ３は、ＭＣＨＲ−２と比較して、そのアミノ末端に追
加的な５アミノ酸を有し、ＭＣＨＲ−１と比較して、そのアミノ末端に追加的な
６９アミノ酸を有する。ＭＣＨ−Ｒ１、ＭＣＨ−Ｒ２およびＭＣＨ−Ｒ３の核酸
およびアミノ酸配列を、配列番号１、２、３、４、５および６に示す（後記実施
例１を参照されたい）。ＭＣＨ−Ｒ１と比較した場合にＭＣＨ−Ｒ３中に存在す
る追加的な核酸およびアミノ酸領域を、配列番号７および８に示す。

【００１０】ＭＣＨ受容体活性を測定するアッセイでは、ＭＣＨ−Ｒ３またはＭＣＨ−Ｒ２
を使用することができる。ＭＣＨ−Ｒ３は、該ｃＤＮＡ中に最初のインフレーム
のＡＴＧ開始コドンを有するため、天然に存在するＭＣＨ受容体であると考えら
れており、一方、ＭＣＨ−Ｒ１およびＭＣＨ−Ｒ２は、ＭＣＨ−Ｒ３の、より短
い長さの変型であるらしい。ＭＣＨ−Ｒ２は、ＡＴＧ開始部位の５’側に最良の
リボソーム開始配列を有し、９ヌクレオチド中の５ヌクレオチドが最適配列：Ｇ
ＣＣＧＣＣ（ＡまたはＧ）ＣＣＡＴＧ（配列番号１０）にマッチし、このた
め、ＭＣＨ−Ｒ２がＭＣＨ受容体の最高発現形態となりうるのであろう。

【００１１】したがって、本発明の第１の態様では、配列番号８の少なくとも５個の連続的
アミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含んでなる精製された核酸を記載する
。好ましい実施形態においては、該ヌクレオチド配列は、配列番号８の少なくと
も９、少なくとも１８、少なくとも２７または少なくとも３６個の連続的アミノ
酸をコードし、該ヌクレオチド配列は配列番号８のアミノ酸１〜５をコードし、
該核酸は、配列番号２７の少なくとも約１８、少なくとも２７または少なくとも
５４個の連続的ヌクレオチドを含み、該核酸は、配列番号３、配列番号４、配列
番号５、配列番号６または配列番号９のヌクレオチド配列を含む又はそれらより
なる。

【００１２】「精製された核酸」は、サンプルまたは調製物中の全核酸の少なくとも５％に
相当する。好ましい実施形態においては、精製された核酸は、サンプルまたは調
製物中の全核酸の少なくとも約５０％、少なくとも約７０％および少なくとも約
９５％に相当する。「精製された核酸」への言及は、該核酸がいずれかの精製を
受けていることを必要とするものではなく、例えば、精製されていない化学合成
された核酸を含みうる。

【００１３】本発明のもう１つの態様においては、配列番号８の少なくとも５個の連続的ア
ミノ酸を含むポリペプチドを発現しうる発現ベクターを記載する。該発現ベクタ
ーは、適当な宿主内に存在する場合に該ポリペプチドが転写され翻訳されうるよ
う該ポリペプチドをコードする核酸に機能的に共役した１以上の調節要素を提供
する。好ましくは、該発現ベクターは、該ポリペプチドをコードする核酸に転写
的に共役した外因性プロモーターを含有する。

【００１４】好ましい実施形態においては、該発現ベクターは、配列番号８の少なくとも９
、少なくとも１８、少なくとも２７または少なくとも３６個の連続的アミノ酸を
コードする核酸を含み、該発現ベクターは、配列番号８のアミノ酸１〜５をコー
ドする核酸を含み、該発現ベクターは、配列番号７の少なくとも約１８、少なく
とも２７または少なくとも５４個の連続的ヌクレオチドを含み、該発現ベクター
は、配列番号３、配列番号５または配列番号９のヌクレオチド配列を含み、該発
現ベクターは、配列番号４または配列番号６を含む又はそれよりなるポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を含む。

【００１５】本発明のもう１つの態様においては、配列番号８の少なくとも５個の連続的ア
ミノ酸を含むポリペプチドをコードする発現ベクターを含む組換え細胞を記載す
る。該ポリペプチドは、該組換え細胞内に存在する場合に該ベクターから発現さ
れうる。

【００１６】本発明のもう１つの態様においては、ＭＣＨ受容体ポリペプチドをコードする
核酸を含む発現ベクターを含有する組換え細胞を、該ＭＣＨ受容体ポリペプチド
の発現に適した条件下で培養する工程を含む、ＭＣＨ受容体ポリペプチドの製造
方法を記載する。好ましくは、発現されたＭＣＨ受容体ポリペプチドを精製する
。

【００１７】本発明のもう１つの態様においては、２０個の連続的ヌクレオチドの領域を含
む精製された核酸であって、該領域中に存在する少なくとも１６個のヌクレオチ
ドが配列番号７またはその相補体中に存在する２０個の連続的ヌクレオチドの相
補的領域にハイブリダイズすることを特徴とする核酸を記載する。好ましい実施
形態においては、該核酸は２０個の連続的ヌクレオチドの領域を含み、該領域中
に存在する少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９および２０個のヌ
クレオチドが、配列番号７またはその相補体中に存在する２０個の連続的ヌクレ
オチドの相補的領域にハイブリダイズする。

【００１８】本発明のもう１つの態様においては、配列番号８の少なくとも約９個の連続的
アミノ酸をコードするアミノ酸配列を含んでなり、付随タンパク質を実質的に含
有しないポリペプチドを記載する。好ましい実施形態においては、該ポリペプチ
ドは、配列番号８の少なくとも１８、少なくとも２７または少なくとも３６個の
連続的アミノ酸を含み、該ポリペプチドは、配列番号４または配列番号６のアミ
ノ酸配列を含む又はそれよりなる。

【００１９】「付随タンパク質を実質的に含有しない」は、該ポリペプチドが、ＭＣＨ受容
体を発現する生きた哺乳類細胞において通常見出される他の細胞膜タンパク質か
ら少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なく
とも約９５％フリーである（すなわち、かかる割合分は該タンパク質を含有しな
い）ことを意味する。

【００２０】本発明のもう１つの態様においては、ＭＣＨ受容体に結合しうる化合物に関す
るスクリーニング方法を記載する。該方法は、（ａ）ＭＣＨ−Ｒ２、ＭＣＨ−Ｒ
３またはその断片を含むポリペプチドを組換え核酸から発現させ（ただし、該断
片は配列番号８の少なくとも９個の連続的アミノ酸を含む）、（ｂ）１以上の試
験化合物を含む試験調製物を該ポリペプチドに加え、（ｃ）該ポリペプチドへの
該試験調製物の結合能を測定することを含む。

【００２１】異なる実施形態においては、工程（ｂ）および（ｃ）をインビトロで行う；全
細胞を使用して工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を行う；該ポリペプチドを発現
ベクターから発現させる；該ポリペプチドが配列番号６のアミノ酸配列を含む又
はそれよりなる；前記工程（ｂ）が標識ＭＣＨの存在を更に含むように該方法を
行う；工程（ｃ）において、該ポリペプチドへの該標識ＭＣＨの結合を該試験調
製物が阻害する能力を測定する。

【００２２】本発明のもう１つの態様においては、ＭＣＨ受容体活性をモジュレーションし
うる化合物に関するスクリーニング方法を記載する。該方法は、（ａ）ＭＣＨ−
Ｒ２またはＭＣＨ−Ｒ３のアミノ酸配列を含む又はそれよりなるＭＣＨ受容体を
コードする組換え核酸を発現する細胞系を、１以上の試験化合物を含む試験調製
物と接触させ、（ｂ）該受容体の活性に対する該試験調製物の効果を測定するこ
とを含む。

【００２３】好ましい実施形態においては、該ＭＣＨ受容体は、配列番号４または配列番号
６のアミノ酸配列を含む又はそれよりなり、該方法はＭＣＨ受容体アゴニストの
存在を更に含む。

【００２４】本発明のもう１つの態様においては、配列番号７中の核酸領域を標的化しＭＣ
Ｈ受容体発現を減少させる手段の有効量を患者に投与する工程を含んでなる、食
欲の抑制方法を記載する。そのような「手段」は、本明細書に記載の物質および
構造体ならびにそれらの等価体により提供される。好ましい手段は、アンチセン
ス核酸および酵素性核酸である。「配列番号７中の核酸領域を標的化（する）」
は、ＭＣＨ受容体活性を減少させる手段が、配列番号７のセグメントに実質的に
相補的な領域を含有していて、それが生理的条件下で該標的にハイブリダイズす
ることを示す。

【００２５】本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例を含む本明細書に記載の更なる
説明から明らかである。記載している実施例では、本発明の実施に有用な種々の
成分および方法を例示している。該実施例は本発明を限定するものではない。こ
の開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を同定し
使用することが可能である。

【００２６】（発明の詳細な記載）本出願では、天然ＭＣＨ受容体であると考えられる、ＭＣＨ−Ｒ１の、より長
い変型（ＭＣＨ−Ｒ３）、および若干短いその変型（ＭＣＨ−Ｒ２）を記載する
。ＭＣＨ−Ｒ２およびＭＣＨ−Ｒ３は、受容体のクローニングの標的、受容体の
同定の標的、抗体産生の標的および受容体のモジュレーションの標的となること
を含む種々の異なる用途を有する。さらなる用途には、ＭＣＨ受容体活性を試験
調製物がモジュレーションする能力を判定するためのアッセイにおいて及び遺伝
子治療において使用されることが含まれる。

【００２７】ＭＣＨ−Ｒ１に対応する核酸およびアミノ酸配列は、ソマトスタチン様受容体
（ＳＬＣ−１）をコードするものとして当技術分野において特徴づけられている
。例えば、ヒトおよびラットＳＬＣ−１は、Ｌａｋａｙｅら，１９９８．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡＣＴＡ１４０１：２１６−
２２０（これが本発明の先行技術であると認めるものではない）に記載されてい
る。また、ヒトソマトスタチン様受容体として特徴づけられている受容体は、国
際公開ＷＯ９６／１８６５１およびＫｏｌａｋｏｗｓｋｉら，１９９６．ＦＥ
ＢＳＬｅｔｔｅｒｓ３９８，２５３−２５８において言及されており、見掛
けスプライス変異体は、欧州公開ＥＰ０８４８０６０Ａ２および国際公
開ＷＯ９９／２８４９２（これが本発明の先行技術であると認めるものではな
い）において言及されている。

【００２８】生理学的な正しい受容体を発現するクローンは、ヒトＭＣＨ受容体の有用なア
ゴニストまたはアンタゴニストの発見を促進する。これとは対照的に、生理学的
に正しくないＭＥＴ開始コドンを有する受容体を発現するクローンの使用は、改
変受容体タンパク質の使用につながり、その使用は、ＭＣＨ受容体活性をモジュ
レーションしうる化合物の発見をそれほど予見しえないであろう。

【００２９】該ＭＣＨ受容体は、患者において種々の有益な効果をもたらす標的を提供する
。好ましくは、ＭＣＨ受容体活性は、体重減少、体重増加、癌（例えば、結腸癌
または乳癌）の治療、痛みの軽減、糖尿病の治療、ストレスの軽減または性機能
不全の１以上を達成するようにモジュレーションされる。

【００３０】ＭＣＨ受容体活性のモジュレーションは、該ＭＣＨ受容体における応答を惹起
することにより又はＭＣＨ受容体のアゴニストまたはアンタゴニストにより惹起
される応答を改変することにより達成されうる。ＭＣＨ受容体活性をモジュレー
ションする化合物には、アゴニスト、アンタゴニストおよびアロステリックモジ
ュレーターが含まれる。一般に、ＭＣＨ受容体のアンタゴニストおよびアロステ
リックモジュレーターは活性に負の影響を及ぼし、体重減少の達成、癌（例えば
、結腸癌または乳癌）の治療、痛みの軽減、ストレスの軽減および／または性機
能不全の治療に使用され、ＭＣＨ受容体のアゴニストおよびアロステリックモジ
ュレーターは活性に正の影響を及ぼし、体重増加をもたらすために使用される。

【００３１】好ましくは、ＭＣＨ受容体活性は、患者において体重減少を達成するために又
は糖尿病を治療するためにモジュレーションされる。糖尿病は、例えば、糖耐性
の増強またはインスリン抵抗性の減弱の一方または両方を達成するようＭＣＨ受
容体活性をモジュレーションすることにより治療されうる。

【００３２】過剰な体重は、高血圧、糖尿病、ジスリピデミアス（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉ
ａｓ）、心臓血管疾患、胆石、骨関節症および或る形態の癌を含む種々の疾患の
寄与因子である。体重を減少させることは、例えば、そのような疾患の可能性を
減少させるために及びそのような疾患の治療の一部として用いることができる。
体重の減少は、例えば、食欲の減少、代謝率の増加、脂肪摂取の減少または炭水
化物に対する渇望の減少の効果の１以上が得られるようＭＣＨ受容体活性をモジ
ュレーションすることにより達成されうる。

【００３３】体重の増加、体重の維持または食欲の増加を促進することは、体重の減少を伴
う疾患または障害を有する又は治療を受けている患者に特に有用である。体重の
減少を伴う疾患または障害の具体例には、食欲不振、過食症、癌悪液質、エイズ
、衰弱、悪液質、および虚弱な老人における衰弱が含まれる。体重の減少を伴う
治療の具体例には、化学療法、放射線療法、一時的または永久的な固定、および
透析が含まれる。

【００３４】ＭＣＨ受容体核酸本出願に記載している指針を用いて、哺乳類起源などの種々の起源に由来する
ＭＣＨ受容体または人工的に製造されたＭＣＨ受容体を得ることができる。ＭＣ
Ｈ受容体核酸の同定および単離は、好ましくは、ＭＣＨ−Ｒ３核酸情報を用いて
行う。そのような核酸情報を用いて、完全長受容体の入手を容易にすることがで
きる。

【００３５】関連ペプチドをコードする核酸の入手は、縮重プローブおよびプライマーのセ
ットを使用して及びハイブリダイゼーション条件の適切な選択により促進される
。縮重プローブおよびプライマーのセットは、遺伝暗号の縮重を考慮して製造す
る。ハイブリダイゼーション条件の調節は、類似配列を有する核酸に対するハイ
ブリダイゼーションを可能にするプローブまたはプライマーの特異性を制御する
のに有用である。

【００３６】ハイブリダイゼーション検出およびＰＣＲクローニングに用いる技術は当技術
分野でよく知られている。核酸検出技術は、例えば、Ｓａｍｂｏｏｋら，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第
２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅ
ｓｓ，１９８９に記載されている。ＰＣＲクローニング技術は、例えば、Ｗｈｉ
ｔｅ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ｖｏｌｕ
ｍｅ６７，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，１９９７に記載されている。

【００３７】ＭＣＨ受容体のプローブおよびプライマーは、例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤ
ＮＡを含有する核酸ライブラリーをスクリーニングするために使用することがで
きる。そのようなライブラリーは商業的に入手可能であり、例えばＡｕｓｕｂｅ
ｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏ
ｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ，１９８７−１９９８などに記載の技術を用い
て製造することができる。プローブハイブリダイゼーションの検出は、検出可能
な標識の使用により促進される。

【００３８】特定の起源から得たＭＣＨ受容体から出発して、ＭＣＨ受容体活性を有する誘
導体を製造することができる。そのような誘導体には、アミノ酸の置換、付加お
よび欠失を有するポリペプチドが含まれる。そのような変化は、ＭＣＨ結合ドメ
イン以外の部位に及び該三次構造を改変しない様態で施されるべきである。アミ
ノ酸は、それらのＲ基の構造に基づいて、いくつかの型に分類される。特定のグ
ループ内の異なるアミノ酸での置換、例えば、ロイシンからバリンへの置換、リ
シンからアルギニンへの置換、およびグルタミンからアスパラギンへの置換は、
該ポリペプチドの機能の変化を引き起こさないであろう。

【００３９】特定のＭＣＨ受容体アミノ酸配列および遺伝暗号の公知縮重から、多数の異な
るコード化核酸配列を得ることができる。遺伝暗号の縮重は、ほとんどすべての
アミノ酸が、異なる組合せのヌクレオチドトリプレットによりコードされるため
に生じる。特定のアミノ酸への特定のコドンの翻訳は当技術分野でよく知られて
いる（例えば、ＬｅｗｉｎＧＥＮＥＳＩＶ，ｐ．１１９，ＯｘｆｏｒｄＵ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）。

【００４０】化学的および生化学的技術を用いて、所望の配列を有する核酸を合成すること
ができる。そのような技術の具体例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒ
ｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉ
ｌｅｙ，１９８７−１９９８、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌ
ｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８
９に記載されている。

【００４１】生化学的合成技術は、核酸複製条件の使用を含む。好ましくは、そのような技
術は、ＭＣＨ受容体核酸を含有するプラスミドおよび和合性宿主細胞の使用を含
む。適当な技術の具体例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏ
ｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ，１
９８７−１９９８、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９に記載さ
れている。

【００４２】特定の起源から得た核酸は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃ
ｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ，
１９８７−１９９８、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏ
ｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９に記載
されている技術などの種々の技術を用いて改変することができる。

【００４３】組換え発現ＭＣＨ受容体ポリペプチド、例えばＭＣＨ受容体、ＭＣＨ受容体断片、および
ＭＣＨ受容体またはＭＣＨ受容体断片を含有するポリペプチドは、適当な宿主を
使用してインビボで又は翻訳系を使用してインビトロで、組換え核酸から発現さ
せることができる。組換え的に発現されたＭＣＨ受容体ポリペプチドは、好まし
くは、ＭＣＨ受容体に結合し該受容体の活性をモジュレーションする化合物に関
してスクリーニングするためのアッセイで使用する。

【００４４】核酸の発現のための技術は当技術分野でよく知られており、異なるＭＣＨ受容
体ポリペプチドをコードする異なる核酸に適用されうる。核酸の発現のための技
術の具体例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ，１９８７−１９
９８、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ
ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａ
ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。

【００４５】好ましくは、発現は、発現ベクターを使用して宿主細胞内で達成される。発現
ベクターは、適切な転写およびプロセシングのための調節要素と共に所望のポリ
ペプチドをコードする核酸を含有する。一般に、存在する調節要素には、転写プ
ロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、および所望により存在する
オペレーターが含まれる。もう１つの好ましい要素は、真核細胞内でのプロセシ
ングをもたらすポリアデニル化シグナルである。発現ベクターの具体例としては
、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計されたプラス
ミドおよびウイルスが挙げられる。

【００４６】好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞内での自律複製のための複製起点
、選択マーカー、一定数の有用な制限酵素部位、および高いコピー数の潜在性を
含有する。

【００４７】当業者は、種々の宿主において適当なレベルのＭＣＨ受容体ポリペプチドの発
現をもたらす発現ベクターを容易に同定することが可能である。種々の哺乳類発
現ベクターが当技術分野でよく知られており、それらには、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２
−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７
１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４
）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３
７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（Ａ
ＴＣＣ３７４６０）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびラムダＺＤ３
５（ＡＴＣＣ３７５６５）が含まれる。種々の細菌発現ベクターが当技術分野
でよく知られており、それらには、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ラムダｇ
ｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）お
よびｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。種々の真菌細胞発現
ベクターが当技術分野でよく知られており、それらには、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）が含まれる。種々の昆虫細胞発現ベクターが当技術分野でよく知られており、
それらには、ＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。

【００４８】組換え宿主細胞は原核性または真核性でありうる。組換え宿主細胞の具体例に
は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌；酵母などの真菌細胞；ヒト、ウシ、ブ
タ、サルおよびげっ歯類などの哺乳類細胞；およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓ
ｏｐｈｉｌａ）およびカイコに由来する細胞系などの昆虫細胞が含まれる。商業
的に入手可能な哺乳類細胞系には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ．ｓｕｐ−）（ＡＴＣＣＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣＣＣＬ１．２）、２９３（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ８６）、ＣＶ−１
（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、Ｃ
ＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ
６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲ
Ｌ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）およびＭＲＣ−
５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）が含まれる。

【００４９】発現ベクターは、標準的な技術を用いて宿主細胞内に導入することができる。
そのような技術の具体例には、形質転換、トランスフェクション、リポフェクシ
ョン、プロトプラスト融合、およびエレクトロポレーションが含まれる。

【００５０】ＭＣＨ受容体核酸は、発現ベクターを使用することなく、例えば合成ｍＲＮＡ
または天然ｍＲＮＡを使用して、細胞内で発現させることができる。また、ｍＲ
ＮＡは、コムギ胚抽出物、網状赤血球抽出物などの種々の無細胞系内で、または
細胞に基づく系（例えば、カエル卵母細胞）内で発現されうる。細胞に基づく系
内へのｍＲＮＡの導入は、例えば、マイクロインジェクションにより行うことが
できる。

【００５１】ＭＣＨ−Ｒ３プローブＭＣＨ−Ｒ３のための検出プローブは、好ましくは、配列番号７の核酸領域を
標的化する領域を含有する。該標的化領域は、配列番号７またはその相補体中に
存在する２０個の連続的ヌクレオチドの相補的領域にハイブリダイズ（例えば、
Ａ−ＴおよびＧ−Ｃハイブリダイゼーション）する少なくとも１６個のヌクレオ
チドを有する。そのようなプローブは、例えば特異性の増強または別の目的（例
えば、レポーター配列または捕捉配列）に用いるための、該標的化領域以外の追
加的な核酸を含有しうる。

【００５２】ＭＣＨ受容体に対するプローブは、適当なハイブリダイゼーション条件下でＭ
ＣＨ受容体標的核酸に特異的にハイブリダイズしうる（すなわち、１以上の非標
的核酸分子から標的核酸を識別しうる）。ハイブリダイゼーションは、該プロー
ブまたはプライマーまたはＭＣＨ受容体核酸上に存在する相補的ヌクレオチド塩
基を介して生じる。２つの分子が安定なハイブリッドの形成のために十分に強力
な相互作用を有するかどうかは、ハイブリダイゼーション条件によって決まる。

【００５３】プローブは、核酸またはその誘導体（例えば、修飾核酸およびペプチド核酸）
から構成される。修飾核酸には、１以上の改変された糖基、改変されたヌクレオ
チド間連結、および／または改変されたヌクレオチドプリンもしくはピリミジン
塩基を有する核酸が含まれる。プローブハイブリダイゼーションの検出は、検出
可能な標識の使用により促進される。検出可能な標識の具体例には、発光標識、
酵素標識および放射能標識が含まれる。修飾核酸を記載している参考文献には、
ＷＯ９８／０２５８２、米国特許第５，８５９，２２１号および米国特許第５
，８５２，１８８号（それらのそれぞれを参照により本明細書に組み入れること
とする）が含まれる。

【００５４】互いにハイブリダイズする２つの分子間の相互作用の程度は、生じたハイブリ
ッドのＴｍにより表される。Ｔｍが高ければ高いほど、その相互作用は強力であ
り、そのハイブリッドは安定である。Ｔｍは、当技術分野でよく知られた多数の
要因、例えば、相補性の程度、存在する相補的塩基のタイプ（例えば、Ａ−Ｔハ
イブリダイゼーションなのかＧ−Ｃハイブリダイゼーションなのか）、および核
酸バックボーンの構造に影響される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版
，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ
，１９８９）。

【００５５】特定の組合せのハイブリダイゼーションアッセイ条件下で用いる温度よりハイ
ブリッドのＴｍのほうが高い場合に、安定なハイブリッドが形成される。関連配
列の同定が可能となるよう、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件
を調節することにより、プローブの特異性の程度は様々となりうる。ストリンジ
ェンシー条件の具体例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎ
ｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，第２版，ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９に記載さ
れている。

【００５６】高いストリンジェンシー条件の一例は以下のとおりである。ＤＮＡを含有する
フィルターのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５×デンハルト液お
よび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むバッファー中、６５℃で２時間
〜一晩行なう。１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０^６ｃ
ｐｍの^３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中、フ
ィルターを６５℃で１２〜４８時間ハイブリダイズさせる。２×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳを含有する溶液中、３７℃で１時間、フィルターの洗浄を行なう。こ
の後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０℃で４５分間の洗浄を行ない
、ついでオートラジオグラフィーに付す。高いストリンジェンシーの条件を用い
る他の方法は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、５０％ホルムアミド中
、４２℃で１２〜４８時間行なうハイブリダイゼーション工程、または０．２×
ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、６５℃で３０〜６０分間行なう洗浄工程を含む
であろう。

【００５７】ＭＣＨ−Ｒ２／ＭＣＨ−Ｒ３抗体ＭＣＨ−Ｒ２またはＭＣＨ−Ｒ３ポリペプチドを認識する抗体は、配列番号８
のポリペプチドまたはその断片を免疫原として使用して製造することができる。
免疫原として使用する配列番号８のポリペプチドの断片は、少なくとも９アミノ
酸長であるべきである。ＭＣＨ−Ｒ３に対する抗体は、例えば、ＭＣＨ−Ｒ３ポ
リペプチドを同定し単離するために使用することができる。抗体を製造し使用す
るための技術の具体例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌ
ｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ；ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ，１９
８７−１９９８，Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＡＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，１９８８、およびＫｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−
４９７（１９７５）に記載されている。

【００５８】ＭＣＨ受容体結合アッセイＭＣＨ−Ｒ２、ＭＣＨ−Ｒ３およびそれらの断片は、ＭＣＨ受容体に結合しう
る化合物をスクリーニングするための結合アッセイにおいて使用することができ
る。標識化合物の使用および／または標識ＭＣＨリガンドの使用を含む種々のタ
イプのアッセイ様式を用いることができる。

【００５９】ＭＣＨ受容体の結合に関与する個々のアミノ酸配列は、標識ＭＣＨおよび種々
の受容体断片を使用することにより容易に同定することができる。結合領域を狭
めるために試験する断片を選択するためには、種々の方法を用いることができる
。そのような方法の具体例には、Ｎ末端から始まる約１５アミノ酸長の連続的断
片の試験およびより長い断片の試験が含まれる。より長い断片を試験する場合に
は、ＭＣＨ結合領域を更に詳しく位置決定するために、ＭＣＨに結合する断片を
細分することができる。結合研究に使用する断片は、組換え核酸技術を用いて得
ることができる。

【００６０】ＭＣＨ受容体に結合しうるＭＣＨリガンドは、ＭＣＨの構造とＭＣＨ受容体へ
のＭＣＨ誘導体の結合能とに基づいて容易に設計することができる。ＭＣＨリガ
ンドであるらしい種々のポリペプチドの具体例が、米国特許第５，８４９，７０
８号（それを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。

【００６１】ＭＣＨリガンドに対する種々のタイプの標識を用いることができる。そのよう
な標識の具体例には、放射能標識、発光分子、ハプテンおよび酵素基質が含まれ
る。特定の標識が結合を阻害する能力は、その特定の標識で標識されたＭＣＨが
［^１２５Ｉ］−ＭＣＨの結合に対して競合する能力を比較することにより容易に
測定することができる。

【００６２】結合アッセイは、個々の化合物を使用して又は種々の数の化合物を含有する調
製物を使用して行うことができる。ＭＣＨ受容体に対する結合能を有する種々の
数の化合物を含有する調製物は、ＭＣＨ受容体に結合する化合物を同定するため
に試験されうる、より小さな化合物群に分類することができる。本発明の実施形
態においては、少なくとも１０個の化合物を含有する試験調製物を結合アッセイ
において使用する。

【００６３】結合アッセイは、種々の環境中に存在する組換え的に産生されたＭＣＨ受容体
ポリペプチドを使用して行うことができる。そのような環境には、例えば、組換
え核酸から発現されたＭＣＨ受容体ポリペプチドを含有する細胞抽出物および精
製された細胞抽出物が含まれ、また、例えば、種々の環境中に導入される組換え
手段により産生された精製されたＭＣＨ受容体ポリペプチドの使用が含まれる。

【００６４】ＭＣＨ受容体活性化合物に関するスクリーニングＭＣＨ受容体活性化合物に関するスクリーニングは、組換え的に発現されたＭ
ＣＨ−Ｒ２、ＭＣＨ−Ｒ３を使用することにより又はＧタンパク質に機能的に共
役したその断片を含有するキメラ受容体を使用することにより促進される。その
ような組換え的に発現されたＭＣＨ受容体ポリペプチドの使用はいくつかの利点
（例えば、一定の細胞系内で該受容体を発現しうること）を与え、そのため、Ｍ
ＣＨ受容体活性化合物に対する応答を、他の受容体に対する応答から、より容易
に識別することができる。例えば、ＭＣＨ受容体は、該受容体を通常は発現しな
いＨＥＫ２９３、ＣＯＳ７およびＣＨＯなどの細胞系内で発現ベクターによ
り発現されることが可能であり、この場合、該発現ベクターの不存在下またはＭ
ＣＨ受容体をコードしない発現ベクターの存在下の同じ細胞系を対照として使用
することができる。

【００６５】ＭＣＨ受容体活性化合物に関するスクリーニングは、該アッセイにおいてＭＣ
Ｈリガンドを使用することにより促進される。スクリーニングアッセイにおいて
ＭＣＨリガンドを使用すると、ＭＣＨ受容体活性が得られる。そのような活性に
対する試験化合物の効果を測定して、例えば、アロステリックモジュレーターお
よびアンタゴニストを同定することができる。また、そのようなアッセイを用い
てアゴニストを同定することができる。

【００６６】ＭＣＨ受容体活性は、ＭＣＨ受容体の細胞内コンホメーションの変化、Ｇタン
パク質活性および／または細胞内メッセンジャーの検出などの種々の技術を用い
て測定することができる。Ｇタンパク質活性はＧｉおよびＧｓを含む。Ｇｉ活性
は、当技術分野でよく知られた技術、例えば、黒色素胞アッセイ、ｃＡＭＰ産生
を測定するアッセイ、ｃＡＭＰの蓄積の阻害、および^３５Ｓ−ＧＴＰの結合を用
いて測定することができる。ｃＡＭＰは、ラジオイムノアッセイなどの種々の技
術を用いて及びｃＡＭＰ応答遺伝子レポータータンパク質により間接的に測定す
ることができる。

【００６７】ＭＣＨ受容体活性は、例えば、ホスホリパーゼＣシグナル伝達経路を測定する
アッセイにより測定することができる。該ホスホリパーゼＣシグナル伝達経路の
活性は、細胞内Ｃａ^２＋を測定する技術などの標準的な技術を用いて測定するこ
とができる。Ｃａ^２＋を測定するために用いることができる当技術分野でよく知
られた技術の具体例には、Ｆｕｒａ−２などの色素の使用、およびＣａ^２＋生物
発光感受性レポータータンパク質、例えばエクオリンの使用が含まれる。Ｇタン
パク質活性を測定するためにエクオリンを使用する細胞系の一例として、ＨＥＫ
２９３／ａｅｑ１７が挙げられる（Ｂｕｔｔｏｎら，１９９３．ＣｅｌｌＣａ
ｌｃｉｕｍ１４，６６３−６７１、およびＦｅｉｇｈｎｅｒら，１９９９．Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２８４：２１８４−２１８８；それらの両方を参照により本明細
書に組み入れることとする）。

【００６８】他のＧタンパク質由来のポリペプチドに機能的に共役した１以上のＭＣＨ受容
体領域を含有するキメラ受容体も、活性を測定するために使用することができる
。キメラＭＣＨ受容体は、Ｎ末端細胞外ドメイン；膜貫通領域、細胞外ループ領
域および細胞内ループ領域から構成される膜貫通ドメイン；および細胞内カルボ
キシ末端ドメインを含有する。

【００６９】Ｇタンパク質共役の特異性は細胞内ドメインにより決定される。特定のＧタン
パク質（例えば、Ｇｑタンパク質またはＧｉタンパク質）に機能的に共役させる
ために、キメラＧタンパク質共役受容体を製造することができる。そのようなシ
グナル交換は、ＧｑまたはＧｉの活性を測定を測定することにより受容体活性の
検出を可能にする。キメラ受容体を製造しＧタンパク質共役応答を測定するため
の技術は、例えば、国際出願ＷＯ９７／０５２５２および米国特許第５，２６
４，５６５号（それらの両方を参照により本明細書に組み入れることとする）。

【００７０】機能的アッセイは、個々の化合物を使用して又は種々の化合物を含有する調製
物を使用して行うことができる。１以上の化合物がＭＣＨ受容体またはキメラ受
容体の活性に影響を及ぼす種々の化合物を含有する調製物は、ＭＣＨ受容体の活
性に影響を及ぼす化合物を同定するための、より小さな化合物群に分類すること
ができる。本発明の実施形態においては、少なくとも１０個の化合物を含有する
試験調製物を機能的アッセイにおいて使用する。

【００７１】機能的アッセイは、種々の環境中に存在する組換え的に産生されたＭＣＨ受容
体ポリペプチドまたはキメラ受容体ポリペプチドを使用して行うことができる。
そのような環境には、例えば、組換え核酸から発現されたＭＣＨ受容体ポリペプ
チドを含有する細胞抽出物および精製された細胞抽出物が含まれ、また、例えば
、種々の環境中に導入される組換え手段により産生された精製されたＭＣＨ受容
体ポリペプチドの使用が含まれる。

【００７２】好ましくは、組換え的に発現されたＭＣＨ受容体ポリペプチドを発現ベクター
から発現させる。より好ましくは、組換え的に発現されたＭＣＨ受容体ポリペプ
チドは、配列番号４または６に示すアミノ酸配列を含む又はそれよりなる。

【００７３】ＭＣＨ受容体発現のモジュレーションＭＣＨ受容体活性を増強または減弱させるための手段として、ＭＣＨ受容体発
現を改変することができる。そのような改変は、ＭＣＨ受容体核酸の活性を阻害
してＭＣＨ受容体発現を減少させること、およびＭＣＨ受容体核酸を供給してＭ
ＣＨ受容体活性を増強することを含む。

【００７４】ＭＣＨ受容体核酸の活性の阻害ＭＣＨ受容体核酸の活性は、ＭＣＨ受容体核酸を認識し該核酸が転写または翻
訳される能力に影響を及ぼす核酸を使用して阻害することができる。ＭＣＨ受容
体核酸の活性の阻害は、例えば、モデル系において食欲およびストレスを検討す
る標的確認研究において並びに食欲またはストレスを抑制するために用いること
ができる。

【００７５】ＭＣＨ受容体の翻訳を阻害するための好ましい標的はｍＲＮＡである。ｍＲＮ
Ａがタンパク質に翻訳される能力は、アンチセンス核酸、酵素性核酸などの化合
物により影響されうる。

【００７６】アンチセンス核酸は、標的ｍＲＮＡの一領域にハイブリダイズしうる。該アン
チセンス核酸の構造に応じて、種々のメカニズム、例えば、翻訳開始の阻止、ｍ
ＲＮＡのプロセシングの妨害、ハイブリッド拘束（ａｒｒｅｓｔ）およびＲＮア
ーゼＨ活性によるｍＲＮＡの分解により、アンチセンス活性が生じうる。

【００７７】酵素性核酸は、別の核酸分子を認識し分解しうる。好ましい酵素性核酸はリボ
ザイムである。

【００７８】アンチセンス核酸およびリボザイムの一般的構造ならびにそのような分子の運
搬方法は、当技術分野でよく知られている。アンチセンス効果を達成するために
は、修飾および未修飾核酸を使用することができる。種々のタイプの修飾が、Ｒ
ＮアーゼＨによる切断性などの或るアンチセンス活性に影響を及ぼし、核酸安定
性に影響を及ぼしうる。種々のアンチセンス分子およびリボザイムならびにその
ような分子の使用を記載している参考文献の具体例は、米国特許第５，８４９，
９０２号、第５，８５９，２２１号および第５，８５２，１８８号（それらのそ
れぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。

【００７９】一般的な医薬投与に関する指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍ
ａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９０、ならびにＭｏｄｅｒｎＰｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃｓ第２版，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０に記載されている。核酸は、インビトロ、
インビボまたはエクスビボ技術を用いて、種々の環境中に存在する細胞内に導入
することができる。

【００８０】ＭＣＨ受容体発現の増強ＭＣＨ受容体をコードする核酸を使用して、例えば、食欲の増進をもたらした
り、ＭＣＨ受容体発現に影響を及ぼす化合物に関してスクリーニングするための
試験系（例えば、トランスジェニック動物）を作製することができる。核酸を、
種々の環境中に存在する細胞内に導入し、該細胞内で発現させることができる。
一般的な医薬投与に関する指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒ
ｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ第１８版（前掲）、およびＭｏｄｅ
ｒｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ第２版（前掲）に記載されている。遺伝子
治療に有用な技術の具体例は、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＦｒｏｍＢａｓｉｃＭｅｃｈａｎｉｓｍｓｔｏ
ＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｕｌｉｋａｓ編，Ｇｅｎｅ
ＴｈｅｒａｐｙＰｒｅｓｓ，１９９８（それを参照により本明細書に組み入
れることとする）に例示されている。

【００８１】ＭＣＨ受容体活性のモジュレーション本出願を１つの指針として用いて、ＭＣＨ受容体活性をモジュレーションしう
る化合物を得、それを用いて患者において有益な効果を達成することができる。
そのような効果は、例えば、ＭＣＨ受容体において活性な化合物を使用して食欲
を改変したり又はストレスを軽減することにより達成することができる。

【００８２】食欲の改変は、過少体重の患者の体重を増加させたり又は過多体重の患者の体
重を減少させるのに特に有用である。また、例えば、家畜を、体重が増加するよ
うに処理することができる。過少体重の患者には、「正常」な体重範囲またはボ
ディ・マス指数（「ＢＭＩ」）の下限の約１０％未満、２０％未満および３０％
未満の体重を有する患者が含まれる。過多体重の患者には、「正常」な体重範囲
またはＢＭＩの上限の約１０％以上、２０％以上、３０％以上または５０％以上
の体重を有する患者が含まれる。「正常」な体重範囲は当技術分野でよく知られ
ており、患者の年齢、身長、体型などの要因が考慮される。

【００８３】ＢＭＩは身長／体重比の尺度である。それは、体重（ｋｇ）を身長（ｍ）の２
乗で割って計算することにより求められる。ＢＭＩの「正常」範囲は１９〜２２
である。

【００８４】好ましくは、非タンパク質ＭＣＨ受容体アンタゴニストを使用して、ＭＣＨ受
容体活性を改変する。そのようなアンタゴニストは、好ましくは、１以上のアリ
ールまたはヘテロアリールを含み約１５０〜９００の分子量を有する有機化合物
である。

【００８５】ＭＣＨ受容体アンタゴニストには、ＭＣＨ受容体結合部位に結合する化合物、
および他の部位に結合する化合物が含まれる。そのような化合物は、本明細書に
記載の技術を用いて同定することができる。好ましくは、ＭＣＨ受容体アンタゴ
ニストは、インビトロＭＣＨ結合アッセイを用いた場合に［^１２５Ｉ］−ＭＣＨ
の少なくとも約０．００１倍のアフィニティーで結合し、あるいはインビトロＭ
ＣＨ結合アッセイまたは黒色素胞アッセイ（例えば、ＭＣＨ−Ｒ３および０．１
Ｎ酢酸中で１５０ｎＭの濃度のＭＣＨを使用するもの）により測定された少なく
とも５μＭのＩＣ_５０を有する。追加的な実施形態においては、該アンタゴニス
トは、インビトロＭＣＨ結合アッセイを用いた場合に［^１２５Ｉ］−ＭＣＨの少
なくとも０．０１倍もしくは少なくとも０．１倍または［^１２５Ｉ］−ＭＣＨの
０．１倍〜０．０５倍で結合し、該ＭＣＨ受容体アンタゴニストは少なくとも５
００ｎＭのＩＣ_５０を有する。

【００８６】ＭＣＨ受容体をモジュレーションする化合物はキットで提供されうる。そのよ
うなキットは、典型的には、投与形態（投与剤形）中に活性化合物を含有する。
投与形態は、一定の間隔（例えば、１日１〜６回）で１日以上にわたり患者に投
与された場合に有益な効果が得られうるよう十分な量の活性化合物を含有する。

【００８７】好ましいキットは、投与形態として提供されたＭＣＨ受容体アンタゴニストを
含有し、該アンタゴニストは、インビトロＭＣＨ結合アッセイを用いた場合に［^１２５Ｉ］−ＭＣＨの少なくとも０．００１倍のアフィニティーで結合し、ある
いは少なくとも約５μＭのＩＣ_５０を有する。より好ましくは、該キットは、体
重の減少（例えば、肥満または体重過多の場合）またはストレスの軽減のための
該投与形態の使用、および一定期間にわたり摂取する投与形態の量を示す説明書
を含有する。

【００８８】治療用途のための投与一般的な医薬投与に関する指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍ
ａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９０、ならびにＭｏｄｅｒｎＰｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃｓ第２版，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０（それらの両方を参照により本明細書に組
み入れることとする）に記載されている。

【００８９】適当な官能基を有する、ＭＣＨ受容体において活性な化合物は、酸または塩基
塩として製造することができる。医薬上許容される塩（水溶性、油溶性または分
散性産物の形態）には、例えば無機もしくは有機酸または塩基から形成される通
常の無毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。そのような塩の具体例に
は、酸付加塩、例えば酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩
、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショ
ウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグル
コン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン
酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、
臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、
マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸
塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（ｐａｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、ペルオキソ硫酸
塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩
、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩；
および塩基塩、例えばアンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えばナトリウムおよ
びカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えばカルシウムおよびマグネシウム塩、
有機塩基との塩、例えばジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミ
ン、およびアミノ酸（例えばアルギニンおよびリシン）との塩が含まれる。

【００９０】ＭＣＨ受容体活性化合物は、経口、鼻腔内、注射、経皮および経粘液を含む種
々の経路を用いて投与することができる。懸濁剤として経口的に投与される有効
成分は、医薬製剤化の分野でよく知られた技術に従い製造することが可能であり
、増量のための微晶質セルロース、懸濁化剤としてのアルギン酸またはアルギン
酸ナトリウム、増粘剤としてのメチルセルロースおよび甘味剤／香味剤を含有し
うる。即時放出錠剤としては、これらの組成物は、微晶質セルロース、リン酸二
カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよびラクトース、および／
または他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤および滑沢剤を含有しうる
。

【００９１】鼻エアゾールまたは吸入により投与する場合の組成物は、医薬製剤化の分野で
よく知られた技術に従い製造することが可能であり、ベンジルアルコールまたは
他の適当な保存剤、バイオアベイラビリティを増加させるための吸収促進剤、フ
ルオロカーボンおよび／または他の安定化もしくは分散剤を使用して、食塩水中
の液剤として製造することができる。

【００９２】また、該化合物は、静脈内（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内、皮下、局
所（閉塞の存在下または不存在下）または筋肉内形態で投与することが可能であ
り、それらのすべてにおいては、医薬分野の当業者によく知られた形態を使用す
ることができる。注射により投与する場合、注射用の液剤または懸濁剤は、適当
な無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒、例えばマンニトール、１，
３−ブタンジオール、水、リンガー液または等張塩化ナトリウム溶液、または適
当な分散または湿潤および懸濁化剤、例えば無菌で無刺激の不揮発性油、例えば
合成モノ−またはジグリセリドおよび脂肪酸、例えばオレイン酸を使用して製剤
化することができる。

【００９３】坐剤の形態で直腸に投与する場合の組成物は、常温では固体であるが直腸腔内
では融解および／または溶解して該薬物を放出する適当な無刺激性賦形剤（例え
ば、カカオ脂、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコール）と該薬
物とを混合することにより製造することができる。

【００９４】本発明の治療用途のための適当な投与計画は、患者の年齢、体重、性別および
医学的状態；治療すべき状態の重症度；投与経路；患者の腎および肝機能；およ
び使用する個々の化合物を含む当技術分野でよく知られた要因を考慮して選択さ
れる。医薬組成物を含む医薬投与のための指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ第１８版（前掲）、
およびＭｏｄｅｒｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ第２版（前掲）に記載され
ている。

【００９５】毒性を伴うことなく効力を与える範囲内の薬物濃度を最適かつ厳密に得るため
には、標的部位に対する該薬物のアベイラビリティの速度論に基づく計画を要す
る。これは、薬物の分布、平衡および消失の考察を含む。患者に対する１日量は
、０．０１〜１，０００ｍｇ／成人患者／日と予想される。

【００９６】（実施例）本発明の種々の特徴および利点を更に例示するために、以下に実施例を記載す
る。また、実施例では、本発明の実施のための有用な方法を例示する。これらの
実施例は本発明を限定するものではない。

【００９７】実施例１：ＭＣＨ受容体関連配列ヒトＭＣＨ受容体関連配列を以下に示す。

【００９８】

【化１】

【００９９】

【化２】

【０１００】

【化３】

【０１０１】

【化４】

【０１０２】

【化５】

【０１０３】

【化６】

【０１０４】

【化７】

【０１０５】

【化８】

【０１０６】

【化９】

【０１０７】実施例２：Ｇタンパク質共役受容体の活性化の測定のための黒色素胞アッセイＳＬＣ−１ｍＲＮＡを合成してＳＬＣ−１受容体の過剰発現を招くように設
計されたベクター（すなわち、ｐｃＤＮＡ３−ｈＳＬＣ−１）、空ベクター（ｐ
ｃＤＮＡ）および対照受容体をコードするプラスミド（すなわち、ｐｃＤＮＡ１
ａｍｐ−ＣＢ２およびｐｃＤＮＡ３−トロンボキサンＡ２）のいずれかで、黒色
素胞をトランスフェクトした。プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ）を使用して、この構築物でトランスフェクトされた細胞内で組換えＳ
ＬＣ−１ｍＲＮＡおよびタンパク質を発現させた。非翻訳５’および３’配列
を有さないＳＬＣ−１ｃＤＮＡのコード配列（配列番号１）を、平滑末端連結
により、ｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲＶ部位内にサブクローニングした。該ＳＬＣ−
１ｃＤＮＡインサートは、ｐｃＤＮＡ−ｈＳＬＣ−１から、ＫｐｎＩおよびＸ
ｂａＩでの該プラスミドの制限消化により切り出されうる。該ＳＬＣ−１インサ
ートのアミノ末端コード末端を、ｐｃＤＮＡ３中に含有されるサイトメガロウイ
ルスプロモーターの近位にクローニングした。該ＳＬＣ−１インサートのカルボ
キシ末端コード配列を、ｐｃＤＮＡ３中のウシ成長ホルモンポリアデニル化シグ
ナル配列の近位にクローニングした。

【０１０８】アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）黒色素胞および繊維芽
細胞の培養を、既に記載されているとおりに行った（Ｄａｎｉｏｌｏｓら，１９
９２．ＰｉｇｍｅｎｔＣｅｌｌＲｅｓ．３，３８−４３；およびＬｅｒｎｅ
ｒ，１９９４．ＴｒｅｎｄｓＮｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．１７，１４２−１４６）
。簡単に説明すると、黒色素胞を、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）繊維芽細胞馴
らし培地内で培養した。該繊維芽細胞馴らし培地は、２０％熱不活性化ウシ胎
仔血清（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎ
ｔ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００単位／ｍｌペニシリン
および２ｍＭグルタミンで補足された７０％Ｌ−１５培地（Ｓｉｇｍａ）（
ｐＨ７．３）中、２５℃でツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）繊維芽細胞を培養する
ことにより調製した。培養中の繊維芽細胞からの培地を集め、０．２ミクロンの
フィルターに通過させ（繊維芽細胞馴らし培地と称される）、それを使用して、
黒色素胞を２７℃で培養した。ＢＴＸＥＣＭ６００エレクトロポレーター（Ｇ
ｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用するエレク
トロポレーションにより、プラスミドＤＮＡを黒色素胞内に一過性にトランスフ
ェクトした。

【０１０９】細胞の収穫の前に１時間、新鮮な繊維芽細胞馴らし培地の存在下、黒色素胞を
インキュベートした。トリプシン処理（０．２５％トリプシン、ＪＨＲＢｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）、およびそれに続く繊維芽細胞馴らし
培地での該トリプシンの不活性化により、黒色素胞単層を解離させた。

【０１１０】該細胞を、４℃、２００×ｇで５分間の遠心分離により集めた。細胞を繊維芽
細胞馴らし培地中で１回洗浄し、遠心分離し（２００×ｇ、５分間、４℃）、氷
冷７０％ＰＢＳ（ｐＨ７．０）に５×１０^６細胞／ｍｌで再懸濁させた。ＰＢ
Ｓ中の細胞の４００μｌのアリコートを、２μｇのｐｃＤＮＡ３−ｈＳＬＣ−１
プラスミドＤＮＡ、それぞれ２μｇの２つの内部対照ＧＰＣＲ（ｐｃＤＮＡ１ａ
ｍｐ−カンナビノイド２およびｐｃＤＮＡ３−トロンボキサンＡ２；Ｓｌｉｐｉ
ｔｚら，１９９５．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８，３５２−３６１）およ
び１８μｇのｐｃＤＮＡ３．１プラスミドベクターＤＮＡを含有する予め冷却さ
れた１．５ｍｌチューブに、４０μｌの総容積中に合計２４μｇのＤＮＡとなる
ように加えた。サンプルを、７分ごとに混合しながら氷上で２０分間インキュベ
ートした。

【０１１１】細胞およびＤＮＡ混合物を、予め冷却された０．２ｍｍギャップ・エレクト
ロポレーション・キュベット（ＢＴＸ）に移し、以下の設定を用いてエレクトロ
ポレーションした：３２５マイクロファラドの容量、４５０ボルトの電圧および
７２０オームの抵抗。エレクトロポレーションの直後に、細胞を繊維芽細胞馴ら
し培地と混合し、平底９６ウェルマイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）上にプ
レーティングした。均一なトランスフェクション効率が保証されるよう、プレー
ティングの前に、複数のキュベットからのエレクトロポレーション体を一緒にプ
ールした。

【０１１２】トランスフェクションの翌日、該培地を新鮮な繊維芽細胞馴らし培地と交換し
、２７℃で１〜３日間インキュベートした後、受容体の発現に関してアッセイし
た。リガンド刺激を行った日に、培地を吸引除去し、１５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐ
Ｈ７．３）を含有する７０％Ｌ−１５培地で細胞を洗浄した。

【０１１３】黒色素胞内で色素分散を引き起こすＧｓ／Ｇｑ共役、または色素凝集を引き起
こすＧｉ共役を調べるために、アッセイを別々の２つの部分に分けた。Ｇｓ／Ｇ
ｑ共役応答については、以下のとおりにアッセイを行った。細胞を、１５ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を含有する１００μｌの７０％Ｌ−１５培地中、室
温の暗所中で１時間インキュベートし、ついでメラトニン（２ｎＭの最終濃度）
の存在下、室温の暗所中で１時間インキュベートして、色素凝集を誘導した。リ
ガンドを加える前に、６００ｎｍでの初期吸光度値を、Ｂｉｏ−ＴｅｘＥｌｘ
８００Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅリーダー（ＥＳＢＥＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を
使用して測定した。リガンド（小分子非ペプチドに関してはＤＭＳＯ中で１００
ｎＭの最終濃度、またはペプチド分子に関しては０．１Ｎ酢酸中で１５０ｎＭ
の最終濃度）をウェルに加え、混合し、室温の暗所中で１時間インキュベートし
、ついで６００ｎｍでの最終吸光度を測定した。

【０１１４】Ｇｉ共役応答については、９６ウェルマイクロタイタープレート中にプレーテ
ィングされた細胞単層を、２％繊維芽細胞馴らし培地、２ｍＭグルタミン、
１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００単位／ｍｌペニシリンおよび
１５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を含有する１００μｌ／ウェルの７０％
Ｌ−１５培地の存在下、室温の暗所中で１５分間インキュベートして、該細胞が
分散するように予め準備した。６００ｎｍでの初期吸光度値を測定し、ついでリ
ガンドを加えた。室温の暗所中で１．５時間のインキュベーション後、最終吸光
度を測定した。吸光度値を透過値に変換して、式：１−Ｔｆ／Ｔｉ（式中、Ｔｉ
＝６００ｎｍでの初期透過およびＴｆ＝６００ｎｍでの最終透過）を用いて色素
分散を定量した。

【０１１５】実施例３：ＭＣＨ−Ｒ１受容体の活性ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）黒色素胞系（Ｄａｎｉｏｌｏｓら，１９９２，
ＰｉｇｍｅｎｔＣｅｌｌＲｅｓ．３，３８−４３）は、細胞内第二メッセン
ジャー分子の変化に応答した細胞内色素顆粒の分散および凝集に基づくものであ
る。黒色素胞内で異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｌｙ）発現した組換えＧｓ／
Ｇｑ共役受容体のアゴニスト活性化は、色素分散を招く。逆に、黒色素胞内で異
種発現した組換えＧｉ共役受容体のアゴニスト活性化は、色素凝集を招く。該黒
色素胞色素の変化は、特異的受容体活性化のレベルとの用量依存的相関を示し、
未活性化細胞とアゴニスト活性化細胞との間の６００ｎｍでの吸光度の変化によ
り定量されうる（Ｄａｎｉｏｌｏｓら，１９９２，ＰｉｇｍｅｎｔＣｅｌｌ
Ｒｅｓ．３，３８−４３）。

【０１１６】「ＳＬＣ−１」、カンナビノイド２およびトロンボキサンＡ２受容体を発現す
るプラスミドＤＮＡで一過性にトランスフェクトされた黒色素胞を９６ウェルマ
イクロタイタープレート上にプレーティングした。前記の前処理条件の後、細胞
を、２０２種の既知小分子およびペプチド（ＭＣＨを含む）の集合体の存在下で
１時間インキュベートした。該試験リガンド集合体は、１００ｎＭの最終濃度の
８０種の小分子（各ウェル中には異なる試験分子）、１５０ｎＭの最終濃度の８
０種のペプチド、ならびにそれぞれ５００および１０００ｎＭの最終濃度の４２
種の小分子およびペプチドを含んでいた。

【０１１７】色素凝集応答（Ｇｉ共役応答）は、該ペプチドプレートから以下の５種のペプ
チド（１５０ｎＭの最終濃度）で検出した：トロンビン、ＭＣＨ、バロシン、Ｒ
ＡＮＴＥＳおよびＣＧＲＰ（カンナビノイド受容体アゴニストＨＵ２１０により
活性化された陽性カンナビノイド２受容体対照の３３％〜６６％の範囲の応答を
有する）。このアッセイにおけるバックグラウンド凝集応答は、該陽性対照カン
ナビノイド２受容体応答の０〜２５％の範囲である。トロンビンに関して認めら
れた応答は、空（非受容体）トランスフェクト化黒色素胞において検出され、該
内因性黒色素胞トロンビン受容体の活性化を表す。他の対照は、メラトニンに対
する陽性凝集応答、内因性ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）受容体の刺激、および
ＰＢＳ、酢酸またはＤＭＳＯビヒクル対照に対する凝集応答の欠如（該陽性カン
ナビノイド２受容体陽性対照値のそれぞれ１５％、１１％および３％）を含む。

【０１１８】実施例４：ＭＣＨ受容体結合アッセイ該ＭＣＨ受容体結合アッセイは、ＭＣＨ−Ｒ２発現プラスミド（哺乳類発現ベ
クターｐｃＤＮＡ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に
配置された配列番号５の完全長オープンリーディングフレーム）またはＭＣＨ−
Ｒ２発現プラスミド（ＭＣＨ−Ｒ発現プラスミドを与えるよう哺乳類発現ベクタ
ーｐｃＤＮＡ−３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に配置
された配列番号３の完全長オープンリーディングフレーム）でトランスフェクト
された細胞上で行うことができる。哺乳類細胞ＨＥＫ−２９３またはＣＯＳ−７
を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ；Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌ
ｓｏｎ，Ｐ．１９９３，Ｆｏｃｕｓ１５：７３）を使用してベクターでトラン
スフェクトする。トランスフェクションは、８μｇのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ
ｅおよび３２μｇのＭＣＨ−ＲプラスミドＤＮＡを使用して、６０ｍｍディッシ
ュ中、８０％コンフルエント細胞（約４×１０^５細胞）上で行う。

【０１１９】ＭＣＨ−Ｒ発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３またはＣＯ
Ｓ−７細胞から調製した粗製膜を使用して、［^１２５Ｉ］−ＭＣＨの結合を測定
する。ＣＯＳ−７またはＨＥＫ−２９３トランスフェクト体からの粗製細胞膜は
、トランスフェクションの４８時間後に氷上で調製する。各６０ｍｍディッシュ
を３ｍｌのＰＢＳで２回、１ｍｌのホモジナイゼーションバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］，５ｍＭＭｇＣｌ_２，２．５ｍＭＥＤＴ
Ａ，３０μｇ／ｍｌバシトラシン，１μＭホスホルアミドン，０．２％Ｂ
ＳＡ）で１回洗浄する。０．５ｍｌのホモジナイゼーションバッファーを各ディ
ッシュに加え、細胞を擦り取り、ついでＰｏｌｙｔｒｏｎ装置（Ｂｒｉｎｋｍａ
ｎｎ，Ｓｙｏｓｓｅｔ，ＮＹ；設定４で１０秒間の３回のバースト）を使用して
ホモジナイズする。ついで該ホモジネートを、０℃、１１，０００×ｇで２０分
間遠心分離し、得られた粗製膜ペレット（主に細胞膜および核を含有する）を、
０．０６％ＢＳＡ（０．１ｍｌ／６０ｍｍディッシュ）で補足されたホモジナ
イゼーションバッファーに再懸濁させ、氷上に維持する。

【０１２０】０．１ｍｌの膜懸濁液、１０μｌの［^１２５Ｉ］−ＭＣＨ（０．０５〜１ｎＭ
；比活性は約２０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、１０μｌの競合化合物および３８０〜
３９０μｌのホモジナイゼーションバッファーを含有する０．５ｍｌの総容積中
、２０℃で１時間、結合反応を行う。０．５％ポリエチレンイミンで１時間予
備処理されたＧＦ／Ｃフィルターでの高速真空濾過（Ｂｒａｎｄｅｌ４８ウェ
ル・セルハーベスター）により、結合放射性リガンドを分離する。該膜懸濁液を
該フィルターにアプライした後、該フィルターを、それぞれ３ｍｌの氷冷５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１０ｍＭＭｇＣｌ_２、２．５ｍＭＥ
ＤＴＡおよび０．０１５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３回洗浄し、該フィル
ター上の結合放射能をガンマカウントにより定量する。特異的結合（合計の＞９
０％）は、総結合と非特異的結合（１００ｎＭ未標識ＭＣＨの存在下で行った
もの）との差と定義される。

【０１２１】他の実施形態は特許請求の範囲に含まれる。いくつかの実施形態を示し説明し
てきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾が施されう
る。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 9/00 ４Ｃ０８４ 9/00 9/12 ４Ｃ０８６ 9/12 15/00 ４Ｈ０４５ 15/00 19/02 19/02 25/18 25/18 29/00 29/00 31/18 31/18 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 14/72 Ｃ０７Ｋ 14/72 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/02 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 5/00 ＡＦターム(参考） 2G045 AA35 BB10 BB14 BB29 BB50 CB01 DA13 FA29 FB02 FB08 GC10 4B024 AA01 AA11 BA63 CA02 DA02 DA03 EA04 GA13 HA11 HA17 4B063 QA05 QQ21 QQ41 QQ61 QQ89 QR48 QR56 QR77 QR80 QS31 QX07 4B064 AG20 CA10 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA58X AA72X AA90X AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 BA05 BD50 CA24 CA44 CA46 4C084 AA13 NA14 ZA082 ZA182 ZA402 ZA422 ZA702 ZA752 ZA812 ZA962 ZB262 ZB332 ZC022 ZC352 ZC422 ZC552 4C086 AA01 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA08 ZA18 ZA40 ZA42 ZA70 ZA75 ZA81 ZA96 ZB26 ZB33 ZC02 ZC35 ZC42 ZC55 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 EA20 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号８の少なくとも５個の連続的アミノ酸をコードする
ヌクレオチド配列を含んでなる精製された核酸。
【請求項２】該ヌクレオチド配列が配列番号８のアミノ酸１〜５をコード
する、請求項１記載の核酸。
【請求項３】該ヌクレオチド配列が配列番号８の少なくとも９個の連続的
アミノ酸をコードする、請求項１記載の核酸。
【請求項４】該核酸が配列番号７の少なくとも約１８個の連続的ヌクレオ
チドを含む、請求項１記載の核酸。
【請求項５】該核酸が配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項１記
載の核酸。
【請求項６】該ヌクレオチド配列が配列番号４のアミノ酸配列をコードす
る、請求項１記載の核酸。
【請求項７】該核酸が配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項１記
載の核酸。
【請求項８】該ヌクレオチド配列が配列番号６のアミノ酸配列をコードす
る、請求項１記載の核酸。
【請求項９】配列番号８の少なくとも５個の連続的アミノ酸を含むポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクター。
【請求項１０】該ヌクレオチド配列が外因性プロモーターに機能的に共役
している、請求項９記載の発現ベクター。
【請求項１１】該ヌクレオチド配列が配列番号８の少なくとも９個の連続
的アミノ酸をコードする、請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１２】該発現ベクターが配列番号３のヌクレオチド配列を含む、
請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１３】該ヌクレオチド配列が配列番号４のアミノ酸配列をコード
する、請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１４】該発現ベクターが配列番号５のヌクレオチド配列を含む、
請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１５】該ヌクレオチド配列が配列番号６のアミノ酸配列をコード
する、請求項１０記載の発現ベクター。
【請求項１６】請求項９記載の発現ベクターを含んでなる組換え細胞。
【請求項１７】ＭＣＨ受容体ポリペプチドの製造方法であって、請求項１
６記載の組換え細胞を、該ポリペプチドが該発現ベクターから発現される条件下
で培養する工程を含んでなる製造方法。
【請求項１８】２０個の連続的ヌクレオチドの領域を含んでなる精製され
た核酸であって、該領域中に存在する少なくとも１６個のヌクレオチドが、配列
番号７またはその相補体中に存在する２０個の連続的ヌクレオチドの相補的領域
にハイブリダイズすることを特徴とする核酸。
【請求項１９】配列番号８の少なくとも約９個の連続的アミノ酸をコード
するアミノ酸配列を含んでなり、付随タンパク質を実質的に含有しないポリペプ
チド。
【請求項２０】該ポリペプチドが配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求
項１９記載のポリペプチド。
【請求項２１】該ポリペプチドが配列番号６のヌクレオチド配列を含む、
請求項１９記載のポリペプチド。
【請求項２２】ＭＣＨ受容体に結合しうる化合物に関するスクリーニング
方法であって、（ａ）配列番号４、配列番号６またはそれらの断片のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドを組換え核酸から発現させ（ただし、該断片は配列番号８の少なくとも
約９個の連続的アミノ酸を含む）、（ｂ）１以上の試験化合物を含む試験調製物を該ポリペプチドに加え、（ｃ）該ポリペプチドへの該試験調製物の結合能を測定する工程を含んでなる
方法。
【請求項２３】前記工程（ｂ）および（ｃ）をインビトロで行う、請求項
２２記載の方法。
【請求項２４】全細胞を使用して前記工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を
行う、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】該ポリペプチドを発現ベクターから発現させる、請求項２
２記載の方法。
【請求項２６】該ポリペプチドが配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求
項２５記載の方法。
【請求項２７】前記工程（ｂ）が標識ＭＣＨの存在を更に含み、前記工程
（ｃ）において、該ポリペプチドへの該標識ＭＣＨの結合を該試験調製物が阻害
する能力を測定する、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】ＭＣＨ受容体活性をモジュレーションしうる化合物に関す
るスクリーニング方法であって、（ａ）配列番号４または６のアミノ酸配列を含むＭＣＨ受容体をコードする組
換え核酸を発現する細胞系を、１以上の試験化合物を含む試験調製物と接触させ
、（ｂ）該受容体の活性に対する該試験調製物の効果を測定する工程を含んでな
る方法。
【請求項２９】該ＭＣＨ受容体が配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求
項２８記載の方法。
【請求項３０】該ＭＣＨ受容体が配列番号６のアミノ酸配列よりなる、請
求項２８記載の方法。
【請求項３１】該方法がＭＣＨ受容体アゴニストの存在を更に含む、請求
項３０記載の方法。
【請求項３２】配列番号７中の核酸領域を標的化しＭＣＨ受容体発現を減
少させる手段の有効量を患者に投与する工程を含んでなる、食欲の抑制方法。
【請求項３３】該手段が酵素性核酸またはアンチセンス核酸である、請求
項３２記載の方法。