JPH05186502A - 抗ウイルス活性を有する重合体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】抗ウイルス活性を有する重合体を製造する方法
を提供する。 【構成】特定の構造を有するオリゴサッカリド又は多糖
類から出発して、酸化により、特定の数のカルボニル基
を有する重合体を得、酸化されたオリゴサッカリド又は
多糖類のカルボニル基を、水又は水と水混和性溶剤との
混合物中で、特定の温度、時間及びpH条件下で、脂肪族
アミノスルホネートのごとき，アミノ基とスルホン酸基
とを有する分子のアミノ基とを反応させて、スルホン酸
基を有する重合体を得、これを慣用の方法で精製する。
得られた硫酸化重合体は抗ウイルス活性を有し、毒性及
び抗凝固剤活性が低いか又は毒性を有しておらず、ヒト
及び動物の局部的なあるいは全体的な抗ウイルス治療用
に使用する医薬の調製に使用される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は特定の温度、pH及び時間
条件下での多糖類の制御された酸化及びアミノ基とスル
ホン酸基を有する分子との化学反応を行うことにより重
合体を得る方法に関する；かく得られた重合体は抗ウイ
ルス活性を有するので、適当なガレン製剤の形でヒト及
び動物の医療に使用し得る。

【０００２】

【従来の技術及び解決すべき課題】硫酸化(sulfated)多
糖類、カラジーナン、硫酸化デキストラン、多硫酸化(p
olysulfated)ペントサン及びフコイジンの、実験動物に
おける生体外及び生体内での抗ウイルス活性は文献の記
載されている(M.Baba 等,Antimic.Ag.Chemother.32,174
2,1988参照）。特殊な空間的分布を伴った、硫酸化基の
炭酸化構造(carbonated structure)上での分布により、
抗ウイルス活性を示す化合物が得られることも示されて
いる; しかしながら、今日まで、生体内投与した場合の
上記化合物の活性とヒトに使用し得る投与方法は示され
ていない(E.de Clercq,Trends inPharmacol.Soc.,11,19
8,1990参照）。この活性の欠如は、基本的には、不適切
な生物的利用性(bioavailability) と凝固時間及び毒性
の増大のごとき好ましくない副作用に起因するものであ
る。このことは使用した試料が大きな分子寸法を有する
こと、硫酸化オリゴサッカリド/ 多糖類の抗凝固性及び
使用した硫酸化法の結果として生じたピリジン基又は第
四アミノ誘導体の存在によって説明し得る。

【０００３】従って、抗凝固剤活性(anticoagulant pro
perty)をしめすことなしに抗ウイルス活性を示すかつそ
の生物的利用性がより良好であるか又は最近の新しい製
剤技術(galenic technique) によって改善し得る、硫酸
化オリゴサッカリド/ 多糖類から誘導された硫酸化オリ
ゴサッカリドを得るため、及び、活性及び生物的利用性
に影響を与えるか又は生成物の毒性を増大させるピリジ
ンのごとき分子の付加を生ずることのない新しい硫酸化
技術を開発するために種々の研究が行われた。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明の方法はオリゴサ
ッカリド/ 多糖類から誘導された、抗ウイルス活性を有
する重合体又はオリゴマーを得るを目的とする；本発明
の方法によれば、抗ウイルス活性を有する重合体又はオ
リゴマーを得るための既知の方法と比較して利点が提供
される；そして、本発明の方法で得られる活性生成物
は、抗凝固剤活性が非常に低いか又は抗凝固剤活性を示
さず、毒性が非常に低いか又は毒性を示さず、有毒不純
物又は付加生成物(addition product)を含有していな
い；そして本発明の方法によれば適当なガレン製剤中で
使用した場合に、適当な生物的利用性を増大させるのに
十分な分子寸法のオリゴマーを得ることができる。

【０００５】本発明の方法の一般的な説明 本発明の方法は、オリゴサッカリド/ 多糖類を制御され
た条件下で酸化して、存在するカルボニル基の数を増大
させ、ついでこのカルボニル基と、アミノ基とスルホン
酸基を有する分子のアミノ基とを反応させて、スルホン
酸基を提供するかつ抗ウイルス活性を有する重合体を得
ることからなる。

【０００６】本発明の方法を実施するための原料は、任
意のオリゴサッカリド/ 多糖類であり得る( 以下におい
ては、これを分子 1と称する）。( 天然供給源からの抽
出及び精製、化学的合成等により) 分子 1を調製した
後、第 1工程においては、適当な溶剤、例えば、脱イオ
ン水、脱イオン水中のNaClの0.9%溶液又は脱イオン水中
にジメチルスルホキシドを5 〜50% の濃度で含有する溶
液中に、分子 1をその最終濃度が0.1 〜20g/l になるよ
うに懸濁又は溶解させついで500 〜5000ドルトンの膜を
通して限外濾過を繰り返すことにより洗浄しついで元の
容量になるまで溶剤を添加する。洗浄後、懸濁液又は溶
液を元の容量の1/10になるまで濃縮しついで凍結乾燥し
た。

【０００７】第 2工程( 酸化工程) においては、1 〜10
0nM の濃度を有するかつ7.0 〜9.0のpHを有する可溶性
のアルカリ金属又はアルカリ土金属過沃素酸塩の溶液中
に、分子 1をその量が0.1 〜10g/l になるように懸濁又
は溶解させる。得られた懸濁液又は溶液を静止状態で又
は穏やかに攪拌しながら、14〜35℃の温度で1 〜10日
間、暗所に放置する。上記の期間が経過した後、懸濁液
又は溶液を4 〜20℃の温度で12〜48時間、水に対して透
析しついで凍結乾燥する。

【０００８】第 3工程( 縮合工程）においては、第 2工
程で酸化した分子 1を適当な覆い付き容器内で適当な溶
剤、例えば、水、0.9%塩化ナトリウム水溶液又はジメチ
ルスルホキシドを5 〜20% の濃度で含有するジメチルス
ルホキシド水溶液中に、分子1の量が0.1 〜10g/l にな
るように懸濁又は溶解させる。アミノ基とスルホン酸基
を有する分子( 以下においては、分子 2と称する）を適
当な溶剤に懸濁又は溶解させついで得られた懸濁液又は
溶液のpHを1.5 〜8.5 に調整したのち、攪拌しながら、
前記で調製した分子 1の懸濁液又は溶液に、分子 1のカ
ルボニル基の数と分子 2のアミノ基の数の比率が1/10〜
2/1 になるのに十分な量で添加する。上記の分子 2は天
然産物から得られるか又は合成によって得ることができ
る。上記で調製した反応混合物を、攪拌しながら、分子
2の濃度が一定になるか又は零になるまで85〜110 ℃の
温度で保持する。

【０００９】最終の第 4工程( 精製工程）においては、
上記反応混合物中に存在する硫酸化重合体(sulfonated
product)をゲル濾過、限外濾過、透析、溶剤による沈殿
等のごとき慣用の方法で精製する。

【００１０】

【実施例】実施例 １ 工程 １ Pharmacia Fine Chemicals社製のデキストラン(Dextra
n) T-40, 40dkの平均分子量を有する1,6-α- グルカン
を原料として使用した。この化合物 1g を最終濃度が1
〜10g/l になるように脱イオン水に溶解しついで濃度が
元の容量の1/5 〜1/20の最終容量に到達するまで、1000
−ドルトンの膜を通して限外濾過した; 元の容量になる
まで水を添加しついで前記と同様の濃度になるまで限外
濾過を繰り返した。この操作を更に2 回繰り返した。最
後に、元の容量の1/5 〜1/20になるまで濃縮しついで凍
結乾燥した。

【００１１】工程 ２ 多糖類を最終濃度が 0.5〜4g/lになるように10〜50mMの
NaIO_４に溶解しついで室温で5 〜7 日間、静止状態で放
置した。酸化の程度は吸光度が223nm に低下することに
より監視した。酸化された多糖類を流水に対して24時間
透析して過剰の過沃素酸塩を除去しついで凍結乾燥し
た。

【００１２】工程 ３ 工程 2で得られた凍結乾燥製品を適当な蓋付き容器内で
最終濃度が0.5 〜4g/lになるように水に溶解しついで溶
液のpHを6.5 〜8.5 に調整した；pH6.5 〜8.5に調整し
たシステイン酸の水溶液を5 〜10g/l の濃度になるよう
に添加した；システイン酸は、反応混合物中においてシ
ステイン酸のモル比が酸化されたた多糖類のアルデヒド
基の数に対して0.5 〜2.0 になるような量で添加した。
システイン酸が完全に消費されるか又はその濃度が変化
しなくなるまで、反応混合物を95〜100 ℃で放置した；
反応混合物中に存在するシステイン酸の量はアミノ酸自
動分析器によって測定した。

【００１３】工程 ４ 反応混合物を流水に対して48時間透析しついで凍結乾燥
した。

【００１４】書く得られた生成物は8 〜60Kdの分子量を
有する褐色の水溶性の粉末であり次の元素分析値を有す
る： O 49 ±9 % ;C33±6 % ; S 10±2 %;H 5 ±1 %; N
4±1 % ；この生成物は生物学的活性について次の特性
を示す：この生成物は以下に述べる条件下で、10及び15
0 μg ml^-1の細胞培地(cellular culture)中の濃度にお
いて、生体外で、HeLa細胞に対するヘルペス シンプレ
ックス（Herpes Simplex)1ウイルスの細胞変性効果を阻
止し得る。B.Aralcoonｋｉｓａｉ等, Antiviral Res.,
4,231,1984 及び M.E.Gonzalez 等,Antimic.Ag.Chemoth
er.,31,1388,1987 の記載に基づく抗ウイルス効果の分
析条件は下記の通りである：−細胞及びウイルス：ヘル
ペス シンプレックス型ウイルス(KOS) を、10% のウシ
胎児血清(FCS) を補充したかつ1ml 当り、10,000IUのペ
ニシリンと50mgのストレプトマイシンとを含有するダル
ベッコ変性イーグル媒地(DulbeccoModified Eagle Medi
um)(DMEM)中のベロ細胞(Vero cell) 内で生長させた。
ウイルスの濃度はベロ細胞上でのプラーク試験(plaque
test) によって測定した：プラーク試験：細胞をプラー
ク60内に集合(confluence)するまで単一層内で生長させ
ついで0.5%のFCS を補充した燐酸緩衝溶液(PBS) 中の10
倍逓減稀釈(seriadas)のウイルス0.5ml と共にインキュ
ベートした。37℃で1 時間の吸収の後、接種物(inoculu
m)を取り出しついで0.6%の寒天と2%のFCS を含有する5
mlのDMEMの層を載せた。単一層を6%のCO_２を含有する加
湿空気中で37℃で数日間、細胞変性効果が出現するまで
インキュベートした。この効果が出現した後、上層(ove
rlay) を除去し、細胞の単一層をチオクロル酢酸(TCA)
を使用して5%まで沈殿させついで溶菌プラーク(lysis p
laque)を数えた；細胞変性効果の評価：HSVIと共にDMEM
中で生長させたHeLa細胞の単一層を低い感染率で（0.0
〜0.4 のプラーク形成単位(PFU)),0〜200 μg/mlの範囲
で濃度を低下させた生成物の存在下で感染させた。37℃
で48時間インキュベーションを行った後、細胞変性効果
−感染したか否か−を位相差顕微鏡の下で細胞内で検討
した。

【００１５】−雄SDラットに30mg/kg の投与量で静脈内
投与した前記生成物はヘパリン酸ナトリウム(sodium he
parinate) が完全に凝固を阻止する凝固時間内と条件下
で変化を示さなかった。上記の条件下では外部毒性の出
現はみとめられなかった。

【００１６】実施例 ２ 工程 １ 原料として、P.Ruperez 等,Trans.Br.Mycol.
Soc.,80,313,l983に指示されているごとき、Penicilliu
m erythromelisからの1.6-β- グルカン多糖類を使用
し、これを実施例１の工程１と同様の方法で洗浄した。

【００１７】工程2,3 及び4 においては実施例１と同様
の方法をおこなった。

【００１８】かく得られた生成物は明褐色の水溶性粉末
であり、生体外で、それぞれ、10〜150 及び20〜200 μ
g/mlの培地内濃度において、脳心筋症及び水胞性口内炎
のウイルスの細胞変性効果を阻止することができた。こ
の生成物は実施例１で述べた条件下で抗凝固剤活性を示
さず、かかる条件下で外部毒性の出現をしめさなかっ
た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アントニオ・エフ．グエレロ・ゴメツ−パ モ スペイン国．９・デイ・28007・マドリツ ド．ピイエル．ド・ロス・レイス・マゴ ス．13 (72)発明者 ルイス・カラスコ・ラマス スペイン国．28049・マドリツド．フアク ルタツド・ド・シエンシアス・ユニヴエル シダツド・オートノマ（番地その他表示な し) (72)発明者 マ・イエス・アルメラ・アルメンダリツ スペイン国．１・シイ・28760・トレス・ カントス・マドリツド．セクトル・ピント レス．38 (72)発明者 ジユアン・アントニオ・レアル・オイエダ スペイン国．２・イツクダ・マドリツド. アブタ・アルフオンソ・13．103 (72)発明者 カルメン・グエレロ・ベニト スペイン国．２・ビイ・ラ・グランヤ・ ド・サン・イルデフオンソ．40100・セゴ ビア．ウルブ．エル・パルク．ブロツク. 12

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 第 1工程において、特定の量のオリゴサ
   ッカリド/ 多糖類( 以下にいおては分子(1) と称する)
   を適当な溶剤中に懸濁又は溶解させた懸濁液又は溶液を
   調製しついで適当な膜を使用して限外濾過を反復するこ
   とにより、上記懸濁液又は溶液中に存在し得る阻害物質
   を除去し；第 2工程において、制御された条件下で分子
   (1) を酸化して、十分な数のカルボニル基を形成させつ
   いで慣用の化学的な手段により酸化剤を除去し；第 3工
   程において、酸化された分子(1) と、アミノ基とスルホ
   ン酸基とを有する分子( 以下においては、分子(2) と称
   する) とを、特定のpHを有するかつ適当な量の媒体中に
   懸濁又は溶解させた懸濁液又は溶液からなる反応混合物
   を適当な容器内で調製しついでこの反応混合物を特定の
   温度に加熱しそして分子(2) の濃度が特定の水準に低下
   するまでこの温度に保持し; ついで最後の第 4工程にい
   おて、前記の工程で得られたスルホン化重合体を慣用の
   方法で精製すること; を特徴とする抗ウイルス活性を有
   する重合体の製造方法。
2. 【請求項２】 分子(1) は、モノサッカリドが 1-2,1-4
   又は1-6 結合している任意のオリゴサッカリド/ 多糖
   類である、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 酸化工程においては、ジオール内炭素−
   炭素結合の開裂により、隣接するジオールをアルデヒド
   カルボニルに転化させ; この工程は、好ましくは、酸化
   剤として、アルカリ又はアルカリ土金属の過沃素酸塩を
   使用して行い; 過沃素酸塩の濃度は、隣接するジオール
   の最少 20%を酸化するような濃度であり;酸化反応は 7.
   0〜 9.0のpHにおいて、14〜35℃の温度で行い; この反
   応は隣接するジオールの20% が酸化される前又は隣接す
   るジオールの90% が酸化された後にも停止してはなら
   ず; そしてかく得られた、酸化重合体を、慣用の化学的
   な方法例えば透析により精製して酸化剤を除去する、請
   求項に記載の方法。
4. 【請求項４】 分子(2) は、そのアミノ基がカルボニル
   基と反応してシッフ塩基を形成することができ、しかも
   この反応によりスルホン酸基が除去されることのないよ
   うな分子、例えばタウリン又はシステイン酸のごとき脂
   肪族アミノスルホン酸である、請求項に記載の方法。
5. 【請求項５】 酸化された分子(1) と分子(2) との反応
   は 1.5〜 8.0のpHで生起させ; 前記第 3工程の反応で添
   加される、酸化された分子(1) の量は 0.1〜10g/l であ
   り、上記反応で添加される分子(2) の量は、分子(1) の
   カルボニル基/ 分子(2) のアミノ基の比率が1/10〜2/1
   になるような量であり; 上記の反応の反応温度は85〜11
   0 ℃であり; そしてこの反応は分子(2) の濃度が一定に
   なるか又は零になるまで継続する、請求項に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 前記反応で得られたかつ反応混合物中に
   存在する、スルホン酸基を有する重合体を、ゲル濾過、
   限外濾過、透析、溶剤を使用する沈殿のごとき通常の化
   学的方法で精製して、反応剤を除去する。請求項に記載
   の方法。
7. 【請求項７】 スルホン酸基を有する重合体は抗ウイル
   ス活性を示し、凝固性及び毒性が低いか又はこれらの性
   質を示さず、従って、ヒト及び獣医用の医薬に使用し得
   るものである、請求項に記載の方法。