JPH05137573A - メタロプロテア−ゼの分離精製方法 - Google Patents
メタロプロテア−ゼの分離精製方法Info
- Publication number
- JPH05137573A JPH05137573A JP32837991A JP32837991A JPH05137573A JP H05137573 A JPH05137573 A JP H05137573A JP 32837991 A JP32837991 A JP 32837991A JP 32837991 A JP32837991 A JP 32837991A JP H05137573 A JPH05137573 A JP H05137573A
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- Japan
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- metaprotease
- bacillus subtilis
- enzyme
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】層間パターンを合わせるための光学的なアライ
メントが可能になる金属配線層の平坦化方法を提供す
る。 【構成】半導体ウェハー上に金属配線膜を生成した後に
熱線を照射することにより、配線材料を加熱して流動化
させることによって平坦化する際に、ウェハー上に予め
形成されているアライメントマーク用凹凸パターン領域
５上を避けて熱線を照射し、上記凹凸パターン領域上を
除いて金属配線膜を平坦化することを特徴とする。
メントが可能になる金属配線層の平坦化方法を提供す
る。 【構成】半導体ウェハー上に金属配線膜を生成した後に
熱線を照射することにより、配線材料を加熱して流動化
させることによって平坦化する際に、ウェハー上に予め
形成されているアライメントマーク用凹凸パターン領域
５上を避けて熱線を照射し、上記凹凸パターン領域上を
除いて金属配線膜を平坦化することを特徴とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明はメタロプロテア−ゼを
分離精製する方法に関し、更に詳しくは、枯草菌から産
生されるサ−モリシン様酵素を分離精製に関するもので
ある。この酵素は工業的に製造されている有用な酵素で
あり、洗剤、食品製造、化粧品などの広範囲な分野で使
用されている。
分離精製する方法に関し、更に詳しくは、枯草菌から産
生されるサ−モリシン様酵素を分離精製に関するもので
ある。この酵素は工業的に製造されている有用な酵素で
あり、洗剤、食品製造、化粧品などの広範囲な分野で使
用されている。
【０００２】
【従来の技術】近年、有用な生理活性物質などを見出だ
す目的で、又は遺伝子組換え技術により目的蛋白質を製
造する目的で、微生物菌体を培養する機会が増加してい
る。
す目的で、又は遺伝子組換え技術により目的蛋白質を製
造する目的で、微生物菌体を培養する機会が増加してい
る。
【０００３】枯草菌により菌体外に産生されるプロテア
−ゼとしては、ズブチリシンに代表される活性中心にセ
リン残基を持つセリンプロテア−ゼまたはアルカリ性プ
ロテア−ゼと呼ばれるものと、活性中心にセリン残基を
持たないメタロプロテア−ゼである中性プロテア−ゼに
大別される。
−ゼとしては、ズブチリシンに代表される活性中心にセ
リン残基を持つセリンプロテア−ゼまたはアルカリ性プ
ロテア−ゼと呼ばれるものと、活性中心にセリン残基を
持たないメタロプロテア−ゼである中性プロテア−ゼに
大別される。
【０００４】特にメタロプロテア−ゼ関しては、ペプチ
ド或いはタンパク基質への作用に際し、巨大、疎水性ア
ミノ酸残基のイミノ基側を特異的に開裂するZn−プロテ
ア−ゼが微生物界に広く分布しており、その代表例とし
てサ−モリシンが挙げられる。その他、毒蛇の毒液或い
は哺乳動物にもその存在が知られている。メタプロテア
−ゼ活性測定は、通常、カゼイン消化法で測定する。合
成基質としてはCbz-Gly-Leu-NH2 或いは Fur-Gly-Leu-N
H 2 を使用し、前者はニンヒドリン法で、後者は345nm
での吸光度の減少により測定する方法が採用されてい
る。
ド或いはタンパク基質への作用に際し、巨大、疎水性ア
ミノ酸残基のイミノ基側を特異的に開裂するZn−プロテ
ア−ゼが微生物界に広く分布しており、その代表例とし
てサ−モリシンが挙げられる。その他、毒蛇の毒液或い
は哺乳動物にもその存在が知られている。メタプロテア
−ゼ活性測定は、通常、カゼイン消化法で測定する。合
成基質としてはCbz-Gly-Leu-NH2 或いは Fur-Gly-Leu-N
H 2 を使用し、前者はニンヒドリン法で、後者は345nm
での吸光度の減少により測定する方法が採用されてい
る。
【０００５】そのプロテア−ゼの精製法としては、培養
液から有機溶媒や硫酸アンモニウムなどによる分画後、
第１段にイオン交換セルロ−スあるいは同セファロ−ス
を用いて、その後引き続いてサイズ排除クロマトグラフ
ィ−を行い純化している。また以下のカラムを用いたア
フィニティ−カラムクロマトグラフィ−も行なわれてい
る。 Sepharoyl-Caproyl-Gly-Leu,Agarose-triethylene
tetraminyl-succiniyl-triehylenetetraminyl-Ac-D-Ph
e,Cbz-Phe-DL-Leu-triehylenetetraminyl-succinyl-tri
ethylenetetraminyl-Sepharose,Sepharose - ε-aminoc
aproyl-D-Phe-OMe,2-(N-hydroxy-carboxamido)-3-pheny
lpropanoyl-Ala-Gly-Affi-Gel-101( 略語Acはacetyl, O
Me はMethyl ester).。
液から有機溶媒や硫酸アンモニウムなどによる分画後、
第１段にイオン交換セルロ−スあるいは同セファロ−ス
を用いて、その後引き続いてサイズ排除クロマトグラフ
ィ−を行い純化している。また以下のカラムを用いたア
フィニティ−カラムクロマトグラフィ−も行なわれてい
る。 Sepharoyl-Caproyl-Gly-Leu,Agarose-triethylene
tetraminyl-succiniyl-triehylenetetraminyl-Ac-D-Ph
e,Cbz-Phe-DL-Leu-triehylenetetraminyl-succinyl-tri
ethylenetetraminyl-Sepharose,Sepharose - ε-aminoc
aproyl-D-Phe-OMe,2-(N-hydroxy-carboxamido)-3-pheny
lpropanoyl-Ala-Gly-Affi-Gel-101( 略語Acはacetyl, O
Me はMethyl ester).。
【０００６】しかしながら前述したイオン交換体とサイ
ズ排除の組み合わせのクロマトグラフィ−の方法は、極
めてポピュラ−な手法であるが、脱塩工程や良好な分離
能を得るためサイズ排除クロマトグラフィ−では試料の
供給量に限界がある。また一方、アフィニティ−クロマ
トグラフィ−では、複雑な生体成分混合物から目的物を
分離・精製、変性した試料から未変性のものを分離、大
量の夾雑物中から少量の生体物質を取り出すなどメリッ
トがあるが高価であり工業用酵素の精製には不向きであ
る。
ズ排除の組み合わせのクロマトグラフィ−の方法は、極
めてポピュラ−な手法であるが、脱塩工程や良好な分離
能を得るためサイズ排除クロマトグラフィ−では試料の
供給量に限界がある。また一方、アフィニティ−クロマ
トグラフィ−では、複雑な生体成分混合物から目的物を
分離・精製、変性した試料から未変性のものを分離、大
量の夾雑物中から少量の生体物質を取り出すなどメリッ
トがあるが高価であり工業用酵素の精製には不向きであ
る。
【０００７】従って、活性の回収率が高く、分離が一段
階で達成され、大幅な時間の節約が出来るような分離法
が望まれる。
階で達成され、大幅な時間の節約が出来るような分離法
が望まれる。
【０００８】
【本発明が解決しようとする課題】前項で示したように
メタロプロテア−ゼの分離精製は、多くのものが知られ
ている。枯草菌から産生されるメタロプロテア−ゼは、
培養終了後、遠心分離や膜処理など、既知の方法にて菌
体とメタロプロテア−ゼを含む上清を分離する。その
後、その上清へ、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムな
どを加えて塩析したり、エタノ−ルやアセトンなどの有
機溶媒を加えて沈殿せしめ、目的とするメタロプロテア
−ゼを粗酵素品として得ている。現在、工業的に使用さ
れている酵素純度は、ほとんどの物がこの段階のもので
ある。しかしながら、これら混合物の中には目的酵素の
活性を阻害する物質や、目的酵素が共存する別な酵素に
分解されたり、副反応を引き起こしたりする。そのため
酵素の純化が必要である。前述した方法では、時間の掛
かる分離や従来では困難もしくは不可能なものもあり、
また優れた分離方法でも高価なものになってしまい改良
の余地がある。
メタロプロテア−ゼの分離精製は、多くのものが知られ
ている。枯草菌から産生されるメタロプロテア−ゼは、
培養終了後、遠心分離や膜処理など、既知の方法にて菌
体とメタロプロテア−ゼを含む上清を分離する。その
後、その上清へ、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムな
どを加えて塩析したり、エタノ−ルやアセトンなどの有
機溶媒を加えて沈殿せしめ、目的とするメタロプロテア
−ゼを粗酵素品として得ている。現在、工業的に使用さ
れている酵素純度は、ほとんどの物がこの段階のもので
ある。しかしながら、これら混合物の中には目的酵素の
活性を阻害する物質や、目的酵素が共存する別な酵素に
分解されたり、副反応を引き起こしたりする。そのため
酵素の純化が必要である。前述した方法では、時間の掛
かる分離や従来では困難もしくは不可能なものもあり、
また優れた分離方法でも高価なものになってしまい改良
の余地がある。
【０００９】本発明の目的はこの様な事を顧みて、メタ
ロプロテア−ゼの分離精製を迅速に行え、しかも安価な
手法を提供するものである。
ロプロテア−ゼの分離精製を迅速に行え、しかも安価な
手法を提供するものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明によるメタロプロ
テア−ゼの分離精製方法は、枯草菌属由来のメタロプロ
テア−ゼを含有する酵素液を疎水性吸着担体によって処
理するものである。メタロプロテア−ゼは、この疎水ク
ロマトグラフィ−処理の吸着画分を採取することにより
得られる。
テア−ゼの分離精製方法は、枯草菌属由来のメタロプロ
テア−ゼを含有する酵素液を疎水性吸着担体によって処
理するものである。メタロプロテア−ゼは、この疎水ク
ロマトグラフィ−処理の吸着画分を採取することにより
得られる。
【００１１】この発明の方法を実施するに際しては、先
ず枯草菌属由来のメタロプロテア−ゼを含有する酵素液
を調製する。この酵素溶液は、例えば特願昭６２−２５
３７１９号、特願昭６３−１９２３８７に記載されてい
るように、枯草菌属に属する株を培養し、培養終了後、
遠心分離、濾過などで菌体を除去し、必要に応じて限外
濾過濃縮、硫安塩析などの処理を行うことにより得るこ
とができる。この際にメタロプロテア−ゼが含む金属の
種類や酵素自信の大きさには制限は無い。
ず枯草菌属由来のメタロプロテア−ゼを含有する酵素液
を調製する。この酵素溶液は、例えば特願昭６２−２５
３７１９号、特願昭６３−１９２３８７に記載されてい
るように、枯草菌属に属する株を培養し、培養終了後、
遠心分離、濾過などで菌体を除去し、必要に応じて限外
濾過濃縮、硫安塩析などの処理を行うことにより得るこ
とができる。この際にメタロプロテア−ゼが含む金属の
種類や酵素自信の大きさには制限は無い。
【００１２】次いでこの酵素溶液を疎水性担体を用いる
疎水クロマトグラフィ−によって処理する。疎水性吸着
担体としては、例えば東ソ−（株）製 ブチル−トヨパ
−ル６５０、フェニル−トヨパ−ル６５０、エ−テル−
トヨパ−ル６５０が好ましく使用出来る。疎水クロマト
グラフィ−操作は、通常のこの種クロマトグラフィ−操
作と同様に、疎水性担体をカラムに充填し、このカラム
に酵素溶液を通液すればよい。吸着に関しては、沈殿を
生じさせない程度の硫酸アンモニウムは結合能を高める
ので、硫酸アンモニウムにより塩析させた物質を適当な
緩衝液に溶解させればよい。また溶出については、有機
溶媒、界面活性剤あるいはカオトロピックイオンの濃度
を上げることにより酵素が溶出されやすくなる。また硫
酸アンモニウム濃度を下げることも酵素の溶出に効果的
である。
疎水クロマトグラフィ−によって処理する。疎水性吸着
担体としては、例えば東ソ−（株）製 ブチル−トヨパ
−ル６５０、フェニル−トヨパ−ル６５０、エ−テル−
トヨパ−ル６５０が好ましく使用出来る。疎水クロマト
グラフィ−操作は、通常のこの種クロマトグラフィ−操
作と同様に、疎水性担体をカラムに充填し、このカラム
に酵素溶液を通液すればよい。吸着に関しては、沈殿を
生じさせない程度の硫酸アンモニウムは結合能を高める
ので、硫酸アンモニウムにより塩析させた物質を適当な
緩衝液に溶解させればよい。また溶出については、有機
溶媒、界面活性剤あるいはカオトロピックイオンの濃度
を上げることにより酵素が溶出されやすくなる。また硫
酸アンモニウム濃度を下げることも酵素の溶出に効果的
である。
【００１３】他に、疎水性担体を用いる処理方法には該
酵素溶液中に直接疎水姓担体を添加し濾過する方法（バ
ッチ法）もあるが、どちらの処理方法を採用しても構わ
ない。
酵素溶液中に直接疎水姓担体を添加し濾過する方法（バ
ッチ法）もあるが、どちらの処理方法を採用しても構わ
ない。
【００１４】かくして得られるメタロプロテア−ゼは、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で純度が高く、分子量約
３、５０００のバンドが明確である。さらに実質的な用
途展開に於いても支障をきたさない。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で純度が高く、分子量約
３、５０００のバンドが明確である。さらに実質的な用
途展開に於いても支障をきたさない。
【００１５】
【実施例】以下に実施例を挙げて、この発明の方法を更
に詳述するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定され
るものではない。
に詳述するが、本発明はこれらの実施例にのみ限定され
るものではない。
【００１６】実施例１ ［ＭＴ−２／ｐＭＫ９の培養］ （１）組換え枯草菌ＭＴ−２／ｐＭＫ９の単一コロニ−
を、５μｇ／ミリリットルのカナマイシンを含む５ミリ
リットルのＬＢ培地で３７℃にて１６時間培養したの
ち、５μｇ／ミリリットルのカナマイシンを含む５００
ミリリットルＬＢ培地に植菌し４０℃、１６時間培養し
た。
を、５μｇ／ミリリットルのカナマイシンを含む５ミリ
リットルのＬＢ培地で３７℃にて１６時間培養したの
ち、５μｇ／ミリリットルのカナマイシンを含む５００
ミリリットルＬＢ培地に植菌し４０℃、１６時間培養し
た。
【００１７】［遠心分離］ （２）培養液を遠心力９０００×ｇにて１０分間遠心し
菌体を除去し、上清に６０％飽和になるように硫安を加
えて４℃で一晩静置した。その後、塩析物を遠心力９０
００×ｇで１５分間処理し集めた。
菌体を除去し、上清に６０％飽和になるように硫安を加
えて４℃で一晩静置した。その後、塩析物を遠心力９０
００×ｇで１５分間処理し集めた。
【００１８】［疎水性担体処理］ 試料調製 （３）遠心操作で得られた塩析物１ｇ（湿重量）を２０
ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸−
１０ｍＭ塩化カルシウム 緩衝液（ｐＨ９．０）５ミリ
リットルへ溶解し、不溶物を０．４５μｍのフィルタ−
で除去しカラムへ載せる試料を調製した。
ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸−
１０ｍＭ塩化カルシウム 緩衝液（ｐＨ９．０）５ミリ
リットルへ溶解し、不溶物を０．４５μｍのフィルタ−
で除去しカラムへ載せる試料を調製した。
【００１９】［疎水クロマトグラフィ−］ （４）（ａ）疎水性担体 ブチル−トヨパ−ル ６５０
Ｍ（東ソ−社製）を充填したカラムに上記（３）で得ら
れた酵素液５ミリリットルを通液し、次いで２０ｍＭト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸−１０ｍ
Ｍ塩化カルシウム緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて溶出を
行った。 （ｂ）別法 遠心分離で得られた塩析物１ｇ（湿重量）
を１０％硫酸アンモニウム含む２０ｍＭ酢酸カルシウム
緩衝液（ｐＨ ７．０，１０ミリリットル）へ溶解させ
不溶物を遠心分離操作（１００００ｘｇ，１０分）で除
去した。この溶液をブチル−トヨパ−ル ６５０Ｍ（東
ソ−社製）を充填したカラムに掛け、以下に示す溶出液
（Ａ〜Ｄ）を用いて段階的に洗浄・溶出した。
Ｍ（東ソ−社製）を充填したカラムに上記（３）で得ら
れた酵素液５ミリリットルを通液し、次いで２０ｍＭト
リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸−１０ｍ
Ｍ塩化カルシウム緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて溶出を
行った。 （ｂ）別法 遠心分離で得られた塩析物１ｇ（湿重量）
を１０％硫酸アンモニウム含む２０ｍＭ酢酸カルシウム
緩衝液（ｐＨ ７．０，１０ミリリットル）へ溶解させ
不溶物を遠心分離操作（１００００ｘｇ，１０分）で除
去した。この溶液をブチル−トヨパ−ル ６５０Ｍ（東
ソ−社製）を充填したカラムに掛け、以下に示す溶出液
（Ａ〜Ｄ）を用いて段階的に洗浄・溶出した。
【００２０】Ａ：２０％ 飽和硫酸アンモニウム含有
２０ｍＭ 酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ ７．０） Ｂ：２０ｍＭ 酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ ７．０） Ｃ：５％ アセトニトリル含有 ２０ｍＭ 酢酸カルシ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０） Ｄ：１０％ アセトニトリル含有 ２０ｍＭ 酢酸カル
シウム緩衝液（ｐＨ ７．０） ［ＳＤＳ−ゲル電気泳動］ （５）トリクロロ酢酸沈殿法により調製した蛋白質試料
をサンプル緩衝液に溶解し、１００℃、３分間加温する
ことにより変性させた。蛋白量約２０μｇを１２．５％
ＳＤＳ−アクリルアミドゲルにアプライし、トリス−グ
リシン緩衝液で泳動した。分子量マ−カ−としては、フ
ァルマシア社の低分子量マ−カ−を用いた。ＣＢＢ染色
後、酢酸−メタノ−ル溶液で脱色し蛋白質をバンドとし
て検出した。
２０ｍＭ 酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ ７．０） Ｂ：２０ｍＭ 酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ ７．０） Ｃ：５％ アセトニトリル含有 ２０ｍＭ 酢酸カルシ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０） Ｄ：１０％ アセトニトリル含有 ２０ｍＭ 酢酸カル
シウム緩衝液（ｐＨ ７．０） ［ＳＤＳ−ゲル電気泳動］ （５）トリクロロ酢酸沈殿法により調製した蛋白質試料
をサンプル緩衝液に溶解し、１００℃、３分間加温する
ことにより変性させた。蛋白量約２０μｇを１２．５％
ＳＤＳ−アクリルアミドゲルにアプライし、トリス−グ
リシン緩衝液で泳動した。分子量マ−カ−としては、フ
ァルマシア社の低分子量マ−カ−を用いた。ＣＢＢ染色
後、酢酸−メタノ−ル溶液で脱色し蛋白質をバンドとし
て検出した。
【００２１】尚、酵素の活性測定は、原則として萩原の
方法に従い、図１にクロマトのプロファイルを示し、図
２にＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示した。
方法に従い、図１にクロマトのプロファイルを示し、図
２にＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示した。
【００２２】図１の縦軸は２８０ｎｍの吸光度、横軸は
フラクションの数で、酵素の活性フラクションは１０〜
１６に存在する。
フラクションの数で、酵素の活性フラクションは１０〜
１６に存在する。
【００２３】図２から明らかな様に、本発明により、メ
タロプロテア−ゼの分離精製が可能となる。
タロプロテア−ゼの分離精製が可能となる。
【００２４】
【発明の効果】本発明の方法により，枯草菌より産生さ
れるメタロプロテア−ゼを一段の精製工程で純化可能で
あり、しかも操作も簡便で大量に処理する出来る。
れるメタロプロテア−ゼを一段の精製工程で純化可能で
あり、しかも操作も簡便で大量に処理する出来る。
【図１】本発明で得られたメタロプロテア−ゼのクロマ
トのプロファイルを示す。
トのプロファイルを示す。
【図２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果を示す。図中
に於いて、数字は分子量を示し、 Ａ：分子量マ−カ− Ｂ：培養上清 Ｃ：未吸着画分 Ｄ：吸着画分のピ−ク Ｅ：吸着画分のプ−ル を示す。
に於いて、数字は分子量を示し、 Ａ：分子量マ−カ− Ｂ：培養上清 Ｃ：未吸着画分 Ｄ：吸着画分のピ−ク Ｅ：吸着画分のプ−ル を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】少なくとも枯草菌により産生され、培養液
中より回収されるメタロプロテア−ゼを疎水性吸着担体
を用いて、処理し吸着画分を採取することを特徴とする
メタロプロテア−ゼの分離精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32837991A JPH05137573A (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | メタロプロテア−ゼの分離精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32837991A JPH05137573A (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | メタロプロテア−ゼの分離精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05137573A true JPH05137573A (ja) | 1993-06-01 |
Family
ID=18209595
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32837991A Pending JPH05137573A (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | メタロプロテア−ゼの分離精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05137573A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002036727A1 (en) * | 2000-01-14 | 2002-05-10 | The Procter & Gamble Company | A detergent composition comprising a metallo protease and calcium ion |
-
1991
- 1991-11-18 JP JP32837991A patent/JPH05137573A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002036727A1 (en) * | 2000-01-14 | 2002-05-10 | The Procter & Gamble Company | A detergent composition comprising a metallo protease and calcium ion |
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