JPH0491798A

JPH0491798A - マグネシウムおよびカルシウムの各定量用試薬組成物

Info

Publication number: JPH0491798A
Application number: JP20561890A
Authority: JP
Inventors: Hikomasa Nakamura; 中村　彦政; Sachiko Kamiyama; 上山　幸子; Yoji Marui; 丸井　洋二
Original assignee: SEROTETSUKU KK
Current assignee: SEROTETSUKU KK
Priority date: 1990-08-02
Filing date: 1990-08-02
Publication date: 1992-03-25

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】皮来上二■朋立団本発明は、検体中のマグネシウムまたはカルシラムを定
量するためのマグネシウムまたはカルシウム定量用試薬
組成物に関する。

の　′とその口　占現在、臨床検査の分野において、各種の体液や尿中のマ
グネシウムやカルシウム量が検査されている。

マグネシウム量についてみれば、慢性腎不全脱水、アジ
フン病などの高マグネシウム血症や慢性腎疾患、急性膵
炎などの低マグネシウム血症の診断に、体液中のマグネ
シウム濃度が測定されている。また、カルシウム量につ
いてみれば、原発性副甲状腺機能先進症、悪性腫瘍など
の高カルシウム血症や腎不全、骨軟化症などの低カルシ
ウム血症の診断に、体液中のカルシウム濃度が測定され
ている。

従来、検体中のマグネシウムの定量法としては以下の方
法が知られている。■原子吸光度法、■炎光光度法、■
キシリジルブルー法、■ヘキソナーゼとグルコース−６
−リン酸脱水素酵素を用いる酵素法（特開昭６１−１２
４３９８号）、■グリセロールキナーゼとグリセロリン
酸を用いる酵素法（Ｃ１ｉｎ。

ｃｈｅｗ、、　３２（４）　６２９（１９８６））　、
■グリセロールキナーゼとグリ七ロリン酸オキシダーゼ
を用いる酵素法（特開昭６４−３０５９７号）。

しかしながら、■、■はマグネシウムを正確に定量でき
る基準法といえるが、機器が高価であり、機器の操作も
煩雑で時間がかかる上に熟練を要す。

■は現在臨床検査において利用されている測定法である
が、マグネシウムに対する特異性が低く、測定値がハラ
ツク傾向にあり、また、キシリジルブルー自体の色原体
が機器ライン（多連弁、チューブ、反応セル）に付着し
て機器に悪影響を与えるケースもある。■は■に比べて
マグネシウムに対する特異性は高いが、検体液中の塩素
イオンや夾雑物の影響を受けるため、検体が尿の場合希
釈操作を必要とする。■は検体中の夾雑物の影響を受け
にくい方法といえるが、グリセロールキナーゼのマグネ
シウムに対する親和性が大きいため、マグネシウム濃度
が低い検体にしか定量できない。

■はキレート剤の存在下に酵素反応に付す点では本発明
と同様であるが、基本的にはグリセロールキナーゼを用
いる■と同じ欠点があるといえる。

他方、検体中のカルシウムの定量法としては以下の方法
が知られている。■原子吸光度法、■電極法、■ｏ−Ｃ
ＰＣ法（オルトクレゾールフタレインコンブレキフン法
）、■オリゴ１ｍ導体と共役酵素グルコアミラーゼ、α
−グルコシダーゼ、アミラーゼを用いる酵素法（臨床化
学、νｏｌ　１８．　１（１９８９）　）、■レシチン
、ホスホリパーゼＤおよびコリンオキシダーゼを用いる
酵素法（特開昭６２１９５２９７号）。

しかしながら、■、■はカルシウムを比較的正確に定量
できるが、機器が高価な上、その操作も煩雑である。■
は簡単な比色計で定量可能であるという理由から普及し
ているが、発色色原体が不安定であることおよび他の２
価金属と反応するという大きな欠点がある。■は検体液
中の塩素イオンによる影響を受け、試薬ブランク反応が
大きく（試薬組成物自体で反応する）、測定値に誤差を
生じる。さらに、色原体の吸収波長が低波長のため、検
体液中からの色素の影響を受ける。■は■と同様に検体
液中の他の金属の影響を受け、試薬ブランク反応が大き
く、測定値に誤差を生しる。

が”　しよ゛と　る本発明は、上述したような従来の技術にみられる問題点
に鑑み、鋭意検討を重ねた結果発明されたものである。

すなわち、本発明者等は、検体中のマグネシウムまたは
カルシウムがたとえ高濃度であっても定量することが可
能であり、検体中の他の金属や夾雑物による影響がほと
んどなく、しかも、短時間にマグネシウムまたはカルシ
ウム量を正確に測定し得ることを見い出した。これらの
知見に基づき、本発明は通常の臨床検査に十分供し得る
マグネシウムおよびカルシウムの各定量用試薬組成物を
痔供しようとするものである。

光朋（１１戊本発明の詳細な説明する前に、アデノシンニリン酸をＩ
ＡＴＰＪ　、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸をｒＮＡＤＰ’ｌ、還元型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチドリン酸をｒ　ＮＡＤＰＨＪ、グリ
コールエーテルジアミン四酢酸をｒ　ＧＥＤＴＡ　Ｊ、
トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン四酢酸をｒ
ＣｙＤＴＡ　Ｊ　、とそれぞれ以下に略すると、本発明
は（１）グルコン酸、ＡＴＰ　、、！ＩＡ叶゛、キレート
剤、グルコン酸キナーゼおよび６−ホスホグルコン酸脱
水素酵素からなるマグネシウム定量用試薬組成物、（２
）上記キレート剤としてＧＥＤＴＡを選択したマグネシ
ウム定量用試薬組成物、および（３）グルコン酸、ＧＥＤＴＡ　、グルコン酸キナーゼ
および６−ホスホグルコン酸脱水素酵素を緩衝剤と混合
したＡ液と、＾ＴＰおよびＮＡＤＰ’″を水に溶解した
Ｂ液とからなるマグネシウム定量用試薬組成物、ならび
に（４）グルコン酸、ＡＴＰ　、　ＮＡＤＰ“、キレート
剤、グルコン酸キナーゼおよび６−ホスホグルコン酸脱
水素酵素からなるカルシウム定量用試薬組成物、（５）
上記キレート剤としてＣＶＤＴＡを選択したカルシウム
定量用試薬組成物、および（６）　　グルコン酸、ＣＶＤＴＡ　、グルコン酸キナ
ーゼおよび６−ホスホグルコン酸脱水素酵素を緩衝剤と
混合したＡ液と、ＡＴＰおよびＮＡＤＰ”を水に溶解し
たＢ液とからなるカルシウム定量用試薬組成物にある。

本発明における酵素反応は次の式で表わされる。

（式中のＡＴＰ−Ｍ２′″およびＡＤＰ−阿１は、それ
ぞれアデノシンニリン酸およびアデノシンニリン酸に検
体中のマグネシウムイオンまたはカルシウムイオンが結
合していることを示す）金属を補助因子とする酵素の反応系にキレート剤を存在
させると、金属に対する酵素とキレート剤との競合反応
が一応想定されるが、−船釣には金属がキレート剤に捕
捉されて酵素反応が進行しないものと予測される。しか
し、グルコン酸キナーゼによる上式の反応系にキレート
剤を添加した場合、マグネシウムイオンまたはカルシウ
ムイオンを補助因子とする上式の酵素反応が特異的に進
行することが、本発明により解明された。そして、キレ
ート剤としてＧＥＤＴＡを選択したときは、マグネシウ
ム以外の金属が優先的にキレート化され、またＣｙＤＴ
Ａを選択したときは、カルシウム以外の金属が優先的に
キレート化され、マグネシウム量またはカルシウム量に
比例してグルコン酸キナーゼによる上式の酵素反応が進
行する。しかも、本発明によれば、検体中のマグネシウ
ムまたはカルシウムが高濃度であっても夾雑物の影響が
ほとんどなく、短時間のうちに検体中のマグネシウム量
またはカルシウム量を正確に測定できることも判明した
。

以下に、本発明の構成を詳細に説明する。

本発明に供される検体はマグネシウムまたはカルシウム
のいずれか１つを含有していれば特に制限はない。好ま
しくは血清、尿などの生体試料であり、検体の前処理は
特に必要としない。

マグネシウムまたはカルシウムの定量用試薬組成物の一
成分であるグルコン酸キナーゼとしては、豚の腎組織な
どの動物由来のもの、ニジエリシアコリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　、シュードモナス（Ｐｓｅ
ｕｄ。

ｍｏｎａｓ）属、アエロバクタリμ遼動」尺σ属などの
微生物由来のものがあげられる。入手の容易さから、精
製された市販品（例えば、ベーリンガーマンハイム社よ
り市販されているニジエリシア　コリ由来のもの）が好
ましい。

６−ホスホグルコン酸脱水素酵素としては、動物肝、ヒ
ト赤血球などの動物由来のもの、ニューロスポラ　クラ
サＮｅｕｒｏｓ　ｏｒａ　　ｃｒａｓｓａ）、ストレプ
トコッカス　ファエ力リス−７μ逗■ロ駈並Ｕ＝）　、
　１ｊｆｔ−（例えばカンディダ　°７．１ルス）など
の微生物由来のものがあげられる。入手の容易性から、
精製された市数品（例えば、オリエンタル酵母工業より
市販されごいる酵刊山来のもの）が好まし、い。

キレ−１・剤とし、では、ｉｉｉ述したＧＥＤＴＡ　、
　Ｃｙｌ）ＴＡの他に、エチし・ンジ７ミン四酢酸、２
ニトリｒ］ニー酎酸、ジエチレントリアミニ／　、’、
’ｆｊ酉酸、トリフＩ、チレ゛２．・テトラミン六酢酸
などがあげられる。この・−）ち、マグネシラＪ、また
は１・５ルシウム以久の金属と−ｔトド剖との反応性か
ら、検体中のマグ不シウｊ、を定量４゛る場合は計１）
ＴＡを選択４るごとが２また検体中のカッ１バ／ウムを
定量する場合はＣｖＤＴＡを選択することが特Ｃ，二好
〕（以、い。

本発明にがかる−・グネシウＪ、また力ルシウム定量用
試薬組成物・を構成する酵素の使用蓋ば、グルコン酸キ
ナ−１［，００５−５１１，／ｄ、　６．　ｈｈ　スホ
グル７ン酸脱水素酵素０．ＯＩ・−・１０ｊｌ／ｄが好
ましい４、まメζ、−・船釣な他の成分の使用蓋は、グ
ルニｌ゛・酸０．トヘ５０ｍＭ／　Ｅ　、　ＡＴＰ　Ｏ
，１−２００ｍＭ／　１、Ｎ＾叶”　０．１”・１００
ｍＭ／　ｅ、キレ−ト剤０．００５〜２５ｄ／　Ｉ！で
ある。検体中の、・グネシウムを定ｔする場合、キレ−
１−剤としてノゾ応系にＧ　Ｅ　ｎ　Ｔ　Ａを添加゛す
るのかが好ｔＬ＜、ぞの、どきはＧＥＤＴＡを０．Ｏ１
＝２５ｍＭ／　１使用ｔ　ルｏ　カ、ｈ　＜またカルシ
ウムを定量ψ゛る場合、」川、・−１・剖とｊ。

て反；１も系にＣｙＤＴＡを添ｙＴｌ］−Ｊるのがが好
ｄ、１．＜、そのききばＣ、−１１Ｔ　Ａを０．００５
・−１０ｍＭ／　ｊｌ！使用苅るのがよい。

一本発明の定匍用試薬組成物を使用し５℃、検体中のマ
グネシウムまたはカルシウム４定ｖ４る（５゛際し１て
は、測定４る反応系のＩ）ＩＩ苓’７　、０・・８゜５
〕、好ましくは７．５〜・８．０に調整−づる。どのｐ
　ｌ（調整は、例えばグリう・ルグリシン、塩酸トすｌ
、り′）　ルア、ミン、塩酸１リス（シＩ・ロキュ゛／
メチ゛ル）アご≧ツメタン、ＴＢＳ（Ｎ−（）リス、メ
・ヂ１−１−ルメｙ・ル）−２−アミ、／　ｊ：タンス
ルホン酸）などのグ・２・Ｉ緩衝液な、１′公知の緩衝
剤を１０〜・４００ｍＭ、／　ｊ！使用４４るのが好ま
（、い本発明にかかる試ｊ；組成物谷ｌ使用し−こ検体中のマ
グネシウムまたはカルシウムを実際ζ、４゛定量するに
は、検体と定量用試薬とを混合゛４ればよいが、上記緩
衝剤を含む試薬組成物を分割した一液混合方式を採用す
るのが好ましい。すなわち、試薬組成物中のグルコン酸
、キレート剤（１・”ゲイソウムを定量する場合はＧＥ
ＤＴＡ　、またカルシラＪ、を定量する場合はＣｙＤＴ
Ａ）、グルコン酸４”　−Ｊ−すｇおよび６−ボス本グ
ルコン酸脱水素酵素を緩衝剤と？Ｒ台しまた溶液をＡ液
とり７、ＡＴｌｌおよびＮＡＤＰ″を精製水に溶解りま
た溶液−ＩＢ液とする。ぞし、乙、検体をＡ液と沼、合
して例えば３７°に付込の温度に加温し、ｃｌ、温し、
た分光光度計りごセル室を挿入する。次いで、［３液を
渭４合して回し、温度に保持Ｌ７ながらＭ素反応を進行
させ、波長　３４０ｎｍにお■る吸光度の増大を測定す
る。反応時間はＡ液を加えてから５分間程度、さらにＢ
液を加えてから５分間程度、全体ご１０分間程度の比較
的短時間ごングネシウム量：Ｊｉ　）ｌ“はカルシウム
量を測定することが目Ｊ能ごある。

次に、本発明を実施例によ、　ｃＵ体的に説明Ａ−る。

実施例１．Ｙ′グネシウムの定量グル′」ン酸キｌ−セ゛０．０６２５１１／ｄ、　６−
ホスホグルコン酸脱水素酵！１．２５１１７ｄ、グルコ
ン酸３．７５ｍＭ／　（！、Ｇ目）ＴＡ２．５＋ｌ１Ｍ
／　ｉ！およびｐＨ８，０のゲ１用ンルグリシン緩衝液
１００ｍＭ／　１からなるＡ液と、精製水心、盲容解ｉ
１．たＡＴＰ　２Ｏｎ＋Ｍ／　ｊ’！　オヨびＮＡＤＰ
’　１０＋ｎＭ／　１からなるｎｉ’を調整した。

検体とじ−こは所定の濃度（ご調整（た塩化トグネシウ
ム水溶液５０μｆを採取し、６ごれに上記Ａ液を１．６
　ａｆ加λ、３７°Ｃ；の温度で３）分間加温した１、
次いで１−記ＢＩｅｌハ０．４　ｔｄ）Ｍ工、同ｉｌｌ
　ａ　Ｌ、コ５３）　Ｈ保持シた。

−・方、塩化マグネシラｊ、水熔滑に代乏て精製水を使
用し、１−記しまた手順４経て得らイする溶液をブラン
ク溶液とした。

このブランク溶液を対照とし′で、Ｉ３液の添加３分後
から５分後までの吸光度の増加をｍ４Ｂ３４０ｎｍにお
いで分光光度計により測定し、１分間当りの吸光度の増
大を求めた。その結果を第１図に示す。

濃縮尿を検体としたマグネシウム濃度の測定可能な上限
が従来１７　ｌＩｇ／　ｄｉ程度であるのに対し、本発
明によれば、第１図に示すように、マグネシウム濃度が
従来より約３倍高濃度の５０■／ｄ１まで直線的な検量
線が得られた。したがって、本発明ムこかかるマグネシ
ウム定量用試薬組成物は通常の臨床検査に十分に利用可
能である。

実施例２　カルシウムの定量実施例１に示したＧＥＤＴＡをＣｙＤＴ八０．へ５ｍＭ
／　ｌに代え、検体として塩化カルシウムを使用する以
外は、マグネシウムの定量にかかる実施例１と同様にし
て吸光度を測定した。その結果を第２図に示す。　第２
図に示すように、カルシウム濃度３０■／ｄ１．まで直
線的な検量線が得られ、本発明にかかるカルシウム定量
用試薬組成物は通常の臨床検査に　十分に利用可能であ
る。

なお、第１図および第２図に示した検量線は、横軸にそ
れぞれマグネシウム濃度（Ｉ１ｇ／ｄｌ）およびカルシ
ウム濃度（■／ｄｌ）をとり、継軸に１分間当りの吸光
度Ａ　Ｂ　Ｓ　（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）変化をとった
もので、マグネシウムおよびカルシウムの各濃度におけ
る１分間当りの吸光度を１０４倍した変化を表わす。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明にかかるマグネシウム定量用試薬組成物
によるマグ２シウム検量線を示し、第２図は本発明にか
かるカルシウム定量用試薬組成物によるカルシウム検量
線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）グルコン酸、アデノシン三リン酸、酸化型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、キレート剤、
グルコン酸キナーゼおよび６−ホスホグルコン酸脱水素
酵素からなるマグネシウム定量用試薬組成物。
（２）前記キレート剤がグリコールエーテルジアミン四
酢酸である請求項（１）記載のマグネシウム定量用試薬
組成物。
（３）グルコン酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸
、グルコン酸キナーゼおよび６−ホスホグルコン酸脱水
素酵素を緩衝剤と混合したＡ液と、アデノシン三リン酸
および酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリ
ン酸を水に溶解したＢ液とからなるマグネシウム定量用
試薬組成物。
（４）グルコン酸、アデノシン三リン酸、酸化型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、キレート剤、
グルコン酸キナーゼおよび６−ホスホグルコン酸脱水素
酵素からなるカルシウム定量用試薬組成物。
（５）前記キレート剤がトランス−１，２−シクロヘキ
サンジアミン四酢酸である請求項（４）記載のカルシウ
ム定量用試薬組成物。
（６）グルコン酸、トランス−１，２−シクロヘキサン
ジアミン四酢酸、グルコン酸キナーゼおよび６−ホスホ
グルコン酸脱水素酵素を緩衝剤と混合したＡ液と、アデ
ノシン三リン酸および酸化型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチドリン酸を水に溶解したＢ液とからなるカル
シウム定量用試薬組成物。