JPH047673B2 - - Google Patents
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- JPH047673B2 JPH047673B2 JP62196139A JP19613987A JPH047673B2 JP H047673 B2 JPH047673 B2 JP H047673B2 JP 62196139 A JP62196139 A JP 62196139A JP 19613987 A JP19613987 A JP 19613987A JP H047673 B2 JPH047673 B2 JP H047673B2
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Description
本発明は、新規酵素Ｎ−カルバモイルサルコシ
ン−アミドヒドロラーゼ並びにＮ−カルバモイル
サルコシン−アミドヒドロラーゼの取得法に関す
る。 微生物がクレアチニンをＮ−カルバモイルサル
コシンに変換する能力を有することが判明した。
この分解工程の研究のためには、Ｎ−カルバモイ
ルサルコシンの測定のための特異的方法が望まし
い。更に、この種の方法は、前記のＮ−カルバモ
イルサルコシンへの変換により、クレアチニンそ
のものの測定にも使用できるはずである。 従つて、本発明は、Ｎ−カルバモイルサルコシ
ンの特異的測定を可能にする酵素及びその取得法
を課題とする。 被測定物質含有溶液をＮ−カルバモイルサルコ
シンーアミドヒドロラーゼを用いて分解してサル
コシンにし、サルコシンを測定することにより、
Ｎ−カルバモイルサルコシンを測定することがで
きる。 本発明は、新規酵素Ｎ−カルバモイルサルコシ
ン−アミドヒドロラーゼ（CSHと略す）の発見
に基づき、これは、次式に従つて、CO2及びNH3
の離脱下に特異的にサルコシンを形成する： この方法で生じるサルコシンは、例えば、サル
コシン−デヒドロゲナーゼの使用下に、生じる
NADHを計測するか又はサルコシンオキンダー
ゼを用いて生じるH2O2又は消費O2を計測する公
知方法で測定することができる。サルコシンオキ
ンダーゼに使用下に、生じるH2O2を計測するこ
とによる測定が有利である。H2O2は滴定法、電
圧測定法、ポーラログラフイ測定法、比色法並び
に酵素法で測定できる。これらの中で、カタラー
ゼ又はペルオキシダーゼ（POD）の使用下にお
ける酵素法は、極めて特異的かつ確実であるの
で、有利である。カタラーゼを用いる測定は、β
−ジケトン例えばアセチルアセトン及びメタノー
ルもしくはエタノール又はメチレングリコールの
存在で行なう。ペルオキシダーゼを用いる測定
は、１種以上の色原体の存在で行なう。好適な色
原体の例は、２，2′−アミノベンズチアゾリンス
ルホン酸（ABTS）、トリンダー（Trinder）の
指示薬系（Ann.Clin.Biochem.6巻（1969年、24
〜27頁）であり、この系では、フエノール又は他
の芳香族アルコールもしくは芳香族アミンが４−
アミノフエナゾン又は４−アミノフエナゾン誘導
体と酸化的に結合して色素になる。好適な芳香族
アルコールもしくはアミンは、例えばｐ−クロル
フエノール、アミノフエノール、ナフトール及び
その誘導体、ナフチルアミン及びその誘導体、ア
ミノキノリン、ヒドロキシキノリン、ジヒドロキ
シフエニル酢酸及び類似物である。４−アミノフ
エナゾンの代りに、４−アミノフエナゾン誘導
体、フエニレンジアミンスルホン酸、メチルベン
ゾチアゾロンヒドラゾン（MBTH）、スルホン化
されたメチルベンゾチアゾロンヒドラゾン（Ｓ−
MBTH）及びこれらの誘導体を使用することが
できる。 Ｎ−カルバモイルサルコシンの測定は、緩衝液
中で行なうのが有利である。好適なPH−値は、約
６〜９の間である。 本発明の酵素を用いて、Ｎ−カルバモイルサル
コシンの測定試薬が得られ、これは、Ｎ−カルバ
モイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ及びサル
コシン検出系を含有する。 前記種類の有利な試薬は、サルコシンの検出系
としてサルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ及び発色団を含有する。 もう一つの有利なサルコシンの検出系は、サル
コシンデヒドロゲナーゼ及びNADよりなる。 更に、本発明による試薬はなお、緩衝液（PH６
〜９）及び場合によつては界面活性剤を含有す
る。 本発明の目的は、新規酵素Ｎ−カルバモイルサ
ルコシン−アミドヒドロラーゼ（CSH）である。 この酵素に関して、次の特性が測定された。 安定性 至適安定性：PH６〜6.5；良好な安定特性は、
燐酸塩緩衝液中で存在し、最良安定性は、グリセ
リンの添加時に得られる。 50％グリセリン（PH６）中でのCSH20mg／ml
の20分間の加熱： 残留活性（％）：40℃／100 50℃／48 60℃／24 80℃／０ ＋４℃、50％グリセリン中では、４週間後の活
性保持は100％である。 特異性：クレアチニン、クレアチン、サルコシ
ン、Ｎ−メチルヒダントイン及びヒダントインは
変換されない。 25℃におけるＮ−カルバモイルサルコシンに関す
るミハエリス定数： 0.1M／ｌトリス緩衝液（PH8.0）中： 3.3〜3.8×10-3MQ。 0.1M／lK4P2O7緩衝液（PH8.5）中： 5.0〜7.1×10-3Ｍ。 至適PH 至適PHは緩衝物質に依る。0.1MK4P2O7緩衝液
の場合は7.5〜9.0であり、トリス緩衝液及びヘペ
ス緩衝液（Hepespuffer）の場合には8.0まである
ことが測定された。 分子量： MG＝約40000（デイスク−電気泳動で測定）。 阻害剤： メチルチオレート5μｇ／mlは95％まで阻害す
る。 平衡： この平衡は、CSH0.5U／mlを用い、90mM／
（トリス；PH8.0）中で測定した： Ｎ−カルバモイルサルコシン／サルコシン ＝12.5mM／＜0.001mM＝＞１×104 CSHの取得は、適当な微生物の培養及びビオ
マス又は培養液からの酵素の回収により行なう。
アルトロバクター（Arthrobacter）及びモラキ
セラ（Moraxella）属の微生物が特に好適である
ことが立証された。最良の結果は、アルトロバク
ターDSM2563、DSM2564、マイクロコツカス・
spec.DSM2565又はモラキセラDSM2562を用い
て得られた。 微生物は、細胞懸濁液の形で、本発明の測定法
に使用することができる。しかしながら、本発明
にとつて、精製された酵素製剤を使用するのが有
利である。この製造のために、Ｎ−メチルヒダン
トイン上で培養された後処理に引き合う量のＮ−
カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼを
含有する微生物を常法で溶解させ、不溶分を除
く。この溶解のためには、慣用の方法例えば高圧
分散、超音波、分解ミル又はリゾチーム−添加が
好適である。得られる透明な抽出物に、ポリエチ
レンアミン0.3〜0.5重量％を添加し、生じる沈澱
を分離し、上澄みを水で希釈すると、酵素が沈澱
するから、これを分離することができる。 精製のために、こうして得た酵素を慣用の酵素
精製法に供することができる。前記のようにして
製造した酵素製剤を適当な緩衝液中に溶かし、
1.3M−及び2.2M−硫酸アンモニウムの間で分別
させる。フエニルセフアロース及びDE−52−セ
ルロース上でのクロマトグラフイ並びに、セフア
クリル（Sephacryl）S200上でのゲル濾過によ
り、異種活性を有せず2U／mg（蛋白質）の特異
活性を有する製剤が、細胞エキス中に予め存在す
る量に対して約70％の収率で得られる。こうして
得られる酵素は、活性損失なしに、50％グリセリ
ン／水溶液（PH6.5）中、＋４℃で、最低半年間貯
蔵できる。 本発明は、Ｎ−カルバモイルサルコシンを特異
的に測定することを可能とする。このような方法
は、クレアチニン−物質代謝の解明にとつて殊に
重要に寄与する。クレアチニンをＮ−カルバモイ
ルサルコシンに変じることと関連して、本発明の
方法は、直接クレアチニン測定に使用することが
できる。 次の実施例につき本発明を更に詳述する。 例１ （参考例） Ｎ−カルバモイルサルコシンの測定 原 理： Ｎ−カルバモイルサルコシン＋H2OCSH ――――→ サルコシン＋CO2＋NH3 サルコシン＋O2＋H2Oサルコシンオキシターゼ ――――――――――――――→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H2O2 H2O2＋４−アミノエナゾンペルオキシターゼ ―――――――――――→ 色素＋2H2O＋フエノール誘導体 試 薬： トリス緩衝液（PH８）0.1モル／ ４−アミノフエナゾン 0.2ｍモル／ ４−アミノフエナゾン 0.2ｍモル／ トリブロムヒドロキシベンゾエート0.2maモル／色形
成系 トリトンＸ−100（溶解度改良剤としての界面
活性剤） 0.4％ カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラー
ゼ 2.0U／ml サルコシン−オキシダーゼ 2.0U／ml POD 2.0U／ml 試 料： Ｎ−カルバモイルサルコシン ０〜35.6μモ
ル／を含有する水溶液 試験バツチ： 試 薬 ２ml 試 料 100μ 試験法： 試料と試薬を混合し、室温で30分放置し、キユ
ベツト中に入れ、試薬空値に対する試料の吸光度
をλ＝546nmで読み取る。 結 果： 試料中のＮ−カルバモイルサルコシン−濃度と
吸光度との間に直線関係が得られる。 例 ２ Ａ Ｎ−メチル−ヒダントイン10mlを含有する培
地（組成は後記）に、アルトロバクター
DSM2563、BMTU2194−１を同じ組成の傾斜寒
天から接種し、100mlエ−レンマイヤーフラスコ
中で28℃、160r.p.m.で約24時間振動させる。引
続き、同じ組成の培地中に１％を更に接種して、
50−培養装置に対してこの培養段階物500mlを
存在させる（各100ml／500mlエーレンマイヤー中
の第１培養液５×１ml、24時間／28℃及び160r.
p.m.）。 この500mlを同じ組成の培地50中に移し、２
個の平板パドル攪拌機／そらせ板を備えた培養装
置中で、空気1000／ｈ、500r.p.m.を用い、28
℃で更に培養させる。 10〜12時間の後に、Ｎ−メチル−ヒダントイン
−分解酵素の形成が開始し、これは、対数的成長
期の終わりまで保持される。18時間の培養時間の
後に、収穫される微生物を、冷却遠心分離機中で
分離し、ビオマスを引続き0.1M燐酸塩緩衝液
（PH８）中で洗浄し、改めて、遠心分離しかつ凍
結させる。こうして、培養液50からビオマス約
800ｇが得られた。 培地組成： 試料１：Na2HPO4×2H2O ７ｇ、KH2PO4 ３
ｇ、MgSO4×7H2O 0.5ｇ、Ｎ−メチル−ヒダン
トイン（無菌濾過）10ｇ、酵母エキス／Difco5
ｇ、少量溶液１〓 １ml、少量溶液２〓〓0.1ml、
ビタミン溶液〓〓〓（無菌濾過）１ml。 〓少量溶液１＝ MnC2×4H2O 100mg、FeCl3×6H2O 100ｇ、
Ca Cl2×2H2O 100mgを再蒸留水100ml中に溶
かし、滅菌する。培地１当たりこの溶液１
ml。 〓〓少量溶液２＝ CuCl2×2H2O １mg、Cl2 １mg、（NH4）
2MoO4 １mg、CoCl2×6H2O １mgを再蒸留水
1000ml中に溶かし、滅菌する。培地１当たり
この溶液0.1ml。 〓〓〓ビタミン溶液＝ ビオチン0.1mg、ピリドキソール0.1mg、ピリド
キサミン×HCl 0.1mg、PABS0.1mg、リボフラ
ビン1.0mg、ニコチンアミド1.0mg、葉酸1.0mg、
チアミン×HCl10.0mgを再蒸留水100ml中に溶
かし、無菌濾過する。培地１当たりこの溶液
１ml。 Ｂ 洗浄した細胞（乾燥重量１Kg）を燐酸カリウ
ム緩衝液（PH6.5）50mM／中で、15にし、
高圧分散法で約600バール（atu）で溶解させる。
細胞残分を分離する。澄明エキスは、CSHを含
有する。これに、10％ポリエチレンイミン（Ｇ−
35−）溶液（PH6.5）４％を加える。核酸の分離
の後に、この酵素を水での稀釈により沈澱させ
る。この少量の蛋白室沈澱を燐酸カリウム緩衝液
（PH6.5）50mM／中に入れ、1.3M及び2.2M／
の間で硫酸アンモニウムで分別する。引続く、
フエニルセフアロースによる疎水性クロマトグラ
フイにより、サルコシンオキシダーゼを完全に除
去する。 減少性勾配の硫酸カリウム緩衝液（PH6.5）
20mモル／（硫酸アンモニウム1.0モル／、
燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）20mM／までを
含有）において、CSHは硫酸アンモニウム約
0.4M／で溶離される。 この溶離液を、燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）
20mM／に対して冷時に透析させ、同じ緩衝液
で平衡にしたカラム上にDE−52−セルロースと
共に装入する。CSHを前記緩衝液でのNaCl50〜
500mM／の増加性勾配により溶離させる。溶
離液を限外濾過により濃縮させる。 引続く、0.1M燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）
（Seohacryl−Ｓ−200）中でのゲル濾過の後に、
CSHは53％収率でかつ2.1U／mgの特異活性で得
られる。酵素は、損失なしに、50％グリセリ溶液
（PH6.5）中、＋４℃で６週間にわたり貯蔵できる。 詳細を次表に示す。
ン−アミドヒドロラーゼ並びにＮ−カルバモイル
サルコシン−アミドヒドロラーゼの取得法に関す
る。 微生物がクレアチニンをＮ−カルバモイルサル
コシンに変換する能力を有することが判明した。
この分解工程の研究のためには、Ｎ−カルバモイ
ルサルコシンの測定のための特異的方法が望まし
い。更に、この種の方法は、前記のＮ−カルバモ
イルサルコシンへの変換により、クレアチニンそ
のものの測定にも使用できるはずである。 従つて、本発明は、Ｎ−カルバモイルサルコシ
ンの特異的測定を可能にする酵素及びその取得法
を課題とする。 被測定物質含有溶液をＮ−カルバモイルサルコ
シンーアミドヒドロラーゼを用いて分解してサル
コシンにし、サルコシンを測定することにより、
Ｎ−カルバモイルサルコシンを測定することがで
きる。 本発明は、新規酵素Ｎ−カルバモイルサルコシ
ン−アミドヒドロラーゼ（CSHと略す）の発見
に基づき、これは、次式に従つて、CO2及びNH3
の離脱下に特異的にサルコシンを形成する： この方法で生じるサルコシンは、例えば、サル
コシン−デヒドロゲナーゼの使用下に、生じる
NADHを計測するか又はサルコシンオキンダー
ゼを用いて生じるH2O2又は消費O2を計測する公
知方法で測定することができる。サルコシンオキ
ンダーゼに使用下に、生じるH2O2を計測するこ
とによる測定が有利である。H2O2は滴定法、電
圧測定法、ポーラログラフイ測定法、比色法並び
に酵素法で測定できる。これらの中で、カタラー
ゼ又はペルオキシダーゼ（POD）の使用下にお
ける酵素法は、極めて特異的かつ確実であるの
で、有利である。カタラーゼを用いる測定は、β
−ジケトン例えばアセチルアセトン及びメタノー
ルもしくはエタノール又はメチレングリコールの
存在で行なう。ペルオキシダーゼを用いる測定
は、１種以上の色原体の存在で行なう。好適な色
原体の例は、２，2′−アミノベンズチアゾリンス
ルホン酸（ABTS）、トリンダー（Trinder）の
指示薬系（Ann.Clin.Biochem.6巻（1969年、24
〜27頁）であり、この系では、フエノール又は他
の芳香族アルコールもしくは芳香族アミンが４−
アミノフエナゾン又は４−アミノフエナゾン誘導
体と酸化的に結合して色素になる。好適な芳香族
アルコールもしくはアミンは、例えばｐ−クロル
フエノール、アミノフエノール、ナフトール及び
その誘導体、ナフチルアミン及びその誘導体、ア
ミノキノリン、ヒドロキシキノリン、ジヒドロキ
シフエニル酢酸及び類似物である。４−アミノフ
エナゾンの代りに、４−アミノフエナゾン誘導
体、フエニレンジアミンスルホン酸、メチルベン
ゾチアゾロンヒドラゾン（MBTH）、スルホン化
されたメチルベンゾチアゾロンヒドラゾン（Ｓ−
MBTH）及びこれらの誘導体を使用することが
できる。 Ｎ−カルバモイルサルコシンの測定は、緩衝液
中で行なうのが有利である。好適なPH−値は、約
６〜９の間である。 本発明の酵素を用いて、Ｎ−カルバモイルサル
コシンの測定試薬が得られ、これは、Ｎ−カルバ
モイルサルコシン−アミドヒドロラーゼ及びサル
コシン検出系を含有する。 前記種類の有利な試薬は、サルコシンの検出系
としてサルコシンオキシダーゼ、ペルオキシダー
ゼ及び発色団を含有する。 もう一つの有利なサルコシンの検出系は、サル
コシンデヒドロゲナーゼ及びNADよりなる。 更に、本発明による試薬はなお、緩衝液（PH６
〜９）及び場合によつては界面活性剤を含有す
る。 本発明の目的は、新規酵素Ｎ−カルバモイルサ
ルコシン−アミドヒドロラーゼ（CSH）である。 この酵素に関して、次の特性が測定された。 安定性 至適安定性：PH６〜6.5；良好な安定特性は、
燐酸塩緩衝液中で存在し、最良安定性は、グリセ
リンの添加時に得られる。 50％グリセリン（PH６）中でのCSH20mg／ml
の20分間の加熱： 残留活性（％）：40℃／100 50℃／48 60℃／24 80℃／０ ＋４℃、50％グリセリン中では、４週間後の活
性保持は100％である。 特異性：クレアチニン、クレアチン、サルコシ
ン、Ｎ−メチルヒダントイン及びヒダントインは
変換されない。 25℃におけるＮ−カルバモイルサルコシンに関す
るミハエリス定数： 0.1M／ｌトリス緩衝液（PH8.0）中： 3.3〜3.8×10-3MQ。 0.1M／lK4P2O7緩衝液（PH8.5）中： 5.0〜7.1×10-3Ｍ。 至適PH 至適PHは緩衝物質に依る。0.1MK4P2O7緩衝液
の場合は7.5〜9.0であり、トリス緩衝液及びヘペ
ス緩衝液（Hepespuffer）の場合には8.0まである
ことが測定された。 分子量： MG＝約40000（デイスク−電気泳動で測定）。 阻害剤： メチルチオレート5μｇ／mlは95％まで阻害す
る。 平衡： この平衡は、CSH0.5U／mlを用い、90mM／
（トリス；PH8.0）中で測定した： Ｎ−カルバモイルサルコシン／サルコシン ＝12.5mM／＜0.001mM＝＞１×104 CSHの取得は、適当な微生物の培養及びビオ
マス又は培養液からの酵素の回収により行なう。
アルトロバクター（Arthrobacter）及びモラキ
セラ（Moraxella）属の微生物が特に好適である
ことが立証された。最良の結果は、アルトロバク
ターDSM2563、DSM2564、マイクロコツカス・
spec.DSM2565又はモラキセラDSM2562を用い
て得られた。 微生物は、細胞懸濁液の形で、本発明の測定法
に使用することができる。しかしながら、本発明
にとつて、精製された酵素製剤を使用するのが有
利である。この製造のために、Ｎ−メチルヒダン
トイン上で培養された後処理に引き合う量のＮ−
カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラーゼを
含有する微生物を常法で溶解させ、不溶分を除
く。この溶解のためには、慣用の方法例えば高圧
分散、超音波、分解ミル又はリゾチーム−添加が
好適である。得られる透明な抽出物に、ポリエチ
レンアミン0.3〜0.5重量％を添加し、生じる沈澱
を分離し、上澄みを水で希釈すると、酵素が沈澱
するから、これを分離することができる。 精製のために、こうして得た酵素を慣用の酵素
精製法に供することができる。前記のようにして
製造した酵素製剤を適当な緩衝液中に溶かし、
1.3M−及び2.2M−硫酸アンモニウムの間で分別
させる。フエニルセフアロース及びDE−52−セ
ルロース上でのクロマトグラフイ並びに、セフア
クリル（Sephacryl）S200上でのゲル濾過によ
り、異種活性を有せず2U／mg（蛋白質）の特異
活性を有する製剤が、細胞エキス中に予め存在す
る量に対して約70％の収率で得られる。こうして
得られる酵素は、活性損失なしに、50％グリセリ
ン／水溶液（PH6.5）中、＋４℃で、最低半年間貯
蔵できる。 本発明は、Ｎ−カルバモイルサルコシンを特異
的に測定することを可能とする。このような方法
は、クレアチニン−物質代謝の解明にとつて殊に
重要に寄与する。クレアチニンをＮ−カルバモイ
ルサルコシンに変じることと関連して、本発明の
方法は、直接クレアチニン測定に使用することが
できる。 次の実施例につき本発明を更に詳述する。 例１ （参考例） Ｎ−カルバモイルサルコシンの測定 原 理： Ｎ−カルバモイルサルコシン＋H2OCSH ――――→ サルコシン＋CO2＋NH3 サルコシン＋O2＋H2Oサルコシンオキシターゼ ――――――――――――――→ グリシン＋ホルムアルデヒド＋H2O2 H2O2＋４−アミノエナゾンペルオキシターゼ ―――――――――――→ 色素＋2H2O＋フエノール誘導体 試 薬： トリス緩衝液（PH８）0.1モル／ ４−アミノフエナゾン 0.2ｍモル／ ４−アミノフエナゾン 0.2ｍモル／ トリブロムヒドロキシベンゾエート0.2maモル／色形
成系 トリトンＸ−100（溶解度改良剤としての界面
活性剤） 0.4％ カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラー
ゼ 2.0U／ml サルコシン−オキシダーゼ 2.0U／ml POD 2.0U／ml 試 料： Ｎ−カルバモイルサルコシン ０〜35.6μモ
ル／を含有する水溶液 試験バツチ： 試 薬 ２ml 試 料 100μ 試験法： 試料と試薬を混合し、室温で30分放置し、キユ
ベツト中に入れ、試薬空値に対する試料の吸光度
をλ＝546nmで読み取る。 結 果： 試料中のＮ−カルバモイルサルコシン−濃度と
吸光度との間に直線関係が得られる。 例 ２ Ａ Ｎ−メチル−ヒダントイン10mlを含有する培
地（組成は後記）に、アルトロバクター
DSM2563、BMTU2194−１を同じ組成の傾斜寒
天から接種し、100mlエ−レンマイヤーフラスコ
中で28℃、160r.p.m.で約24時間振動させる。引
続き、同じ組成の培地中に１％を更に接種して、
50−培養装置に対してこの培養段階物500mlを
存在させる（各100ml／500mlエーレンマイヤー中
の第１培養液５×１ml、24時間／28℃及び160r.
p.m.）。 この500mlを同じ組成の培地50中に移し、２
個の平板パドル攪拌機／そらせ板を備えた培養装
置中で、空気1000／ｈ、500r.p.m.を用い、28
℃で更に培養させる。 10〜12時間の後に、Ｎ−メチル−ヒダントイン
−分解酵素の形成が開始し、これは、対数的成長
期の終わりまで保持される。18時間の培養時間の
後に、収穫される微生物を、冷却遠心分離機中で
分離し、ビオマスを引続き0.1M燐酸塩緩衝液
（PH８）中で洗浄し、改めて、遠心分離しかつ凍
結させる。こうして、培養液50からビオマス約
800ｇが得られた。 培地組成： 試料１：Na2HPO4×2H2O ７ｇ、KH2PO4 ３
ｇ、MgSO4×7H2O 0.5ｇ、Ｎ−メチル−ヒダン
トイン（無菌濾過）10ｇ、酵母エキス／Difco5
ｇ、少量溶液１〓 １ml、少量溶液２〓〓0.1ml、
ビタミン溶液〓〓〓（無菌濾過）１ml。 〓少量溶液１＝ MnC2×4H2O 100mg、FeCl3×6H2O 100ｇ、
Ca Cl2×2H2O 100mgを再蒸留水100ml中に溶
かし、滅菌する。培地１当たりこの溶液１
ml。 〓〓少量溶液２＝ CuCl2×2H2O １mg、Cl2 １mg、（NH4）
2MoO4 １mg、CoCl2×6H2O １mgを再蒸留水
1000ml中に溶かし、滅菌する。培地１当たり
この溶液0.1ml。 〓〓〓ビタミン溶液＝ ビオチン0.1mg、ピリドキソール0.1mg、ピリド
キサミン×HCl 0.1mg、PABS0.1mg、リボフラ
ビン1.0mg、ニコチンアミド1.0mg、葉酸1.0mg、
チアミン×HCl10.0mgを再蒸留水100ml中に溶
かし、無菌濾過する。培地１当たりこの溶液
１ml。 Ｂ 洗浄した細胞（乾燥重量１Kg）を燐酸カリウ
ム緩衝液（PH6.5）50mM／中で、15にし、
高圧分散法で約600バール（atu）で溶解させる。
細胞残分を分離する。澄明エキスは、CSHを含
有する。これに、10％ポリエチレンイミン（Ｇ−
35−）溶液（PH6.5）４％を加える。核酸の分離
の後に、この酵素を水での稀釈により沈澱させ
る。この少量の蛋白室沈澱を燐酸カリウム緩衝液
（PH6.5）50mM／中に入れ、1.3M及び2.2M／
の間で硫酸アンモニウムで分別する。引続く、
フエニルセフアロースによる疎水性クロマトグラ
フイにより、サルコシンオキシダーゼを完全に除
去する。 減少性勾配の硫酸カリウム緩衝液（PH6.5）
20mモル／（硫酸アンモニウム1.0モル／、
燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）20mM／までを
含有）において、CSHは硫酸アンモニウム約
0.4M／で溶離される。 この溶離液を、燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）
20mM／に対して冷時に透析させ、同じ緩衝液
で平衡にしたカラム上にDE−52−セルロースと
共に装入する。CSHを前記緩衝液でのNaCl50〜
500mM／の増加性勾配により溶離させる。溶
離液を限外濾過により濃縮させる。 引続く、0.1M燐酸カリウム緩衝液（PH6.5）
（Seohacryl−Ｓ−200）中でのゲル濾過の後に、
CSHは53％収率でかつ2.1U／mgの特異活性で得
られる。酵素は、損失なしに、50％グリセリ溶液
（PH6.5）中、＋４℃で６週間にわたり貯蔵できる。 詳細を次表に示す。
【表】
例 ３
例2Aに記載と同様にＮ−メチルヒダントイン
上で培養した培養バツチモラキセラDSM2562
（BMTU2193−１）から、乾燥物質180ｇを得る。
このCSHを例1B）と同様に精製する。但し、細
胞を高圧分散法の代わりに、0.05％リゾチーム
（ｇ／ｇ乾燥物質）を用いて、PH7.0で溶解させ
る。
上で培養した培養バツチモラキセラDSM2562
（BMTU2193−１）から、乾燥物質180ｇを得る。
このCSHを例1B）と同様に精製する。但し、細
胞を高圧分散法の代わりに、0.05％リゾチーム
（ｇ／ｇ乾燥物質）を用いて、PH7.0で溶解させ
る。
【表】
【表】
例４ （参考例）
ｏ−ジアニシジンを用いるCSHの測定
原 理：
Ｎ−カルバモイルサルコシン＋H2OCSH
――――→
サルコシン＋CO2＋NH3
サルコシン＋O2＋H2Oサルコシン−OD
――――――――――――→
グルシン＋ホルムアルデヒド＋H2O2
H2O2＋ｏ−ジアニシジンPOD
――――→
色素＋2H2O
溶 液：
１ トリス緩衝液；0.1モル／（PH8.0）
２ オルト−ジアニシジン−溶液；ｏ−ジアニシ
ジン−塩酸塩66mgを緩衝液(1)10ml中に溶かす。 ３ 試験緩衝液；溶液199ml中に溶液21.0mlをピ
ペツト装入し、混合する。＋４℃で１週間保持
可能である。 ４ ペルオキシダーゼ：POD（BM108090、純度
Ｉ）２mgをH2O １mlに溶かす。 ５ サルコシン−オキシダーゼ：精製されたサル
コシンオキシダーゼ（ウリカ−ゼ及びカタラー
ゼ不含）100U／mlをH2O中に溶かす。 ６ Ｎ−カルバモイルサルコシン0.25モル／。 試 料： 冷 KPO4緩衝液（PH6.5）50mモル／で稀
釈。 実 施 436nm；25℃；Ｖ＝2.00ml；ｄ＝１cm； ε＝
8.3cm2×μモル-1 ×１ キユペツト中に、 緩衝液 (3) 1.80ml POD (4) 0.01ml サルコシンオキシダーゼ (5) 0.05ml カルバモイルサルコシン (6) 0.10ml をピペツト装入し、混合し、約10分間待ち、次い
で、試料を用いて開始し、 試 料 0.04ml と混合し、10分間進行させ、直線相からＥ／min
を算出する： 計算：ΔE／min×２×稀釈度／8.3×使用試料ml＝Ｕ
／ml
ジン−塩酸塩66mgを緩衝液(1)10ml中に溶かす。 ３ 試験緩衝液；溶液199ml中に溶液21.0mlをピ
ペツト装入し、混合する。＋４℃で１週間保持
可能である。 ４ ペルオキシダーゼ：POD（BM108090、純度
Ｉ）２mgをH2O １mlに溶かす。 ５ サルコシン−オキシダーゼ：精製されたサル
コシンオキシダーゼ（ウリカ−ゼ及びカタラー
ゼ不含）100U／mlをH2O中に溶かす。 ６ Ｎ−カルバモイルサルコシン0.25モル／。 試 料： 冷 KPO4緩衝液（PH6.5）50mモル／で稀
釈。 実 施 436nm；25℃；Ｖ＝2.00ml；ｄ＝１cm； ε＝
8.3cm2×μモル-1 ×１ キユペツト中に、 緩衝液 (3) 1.80ml POD (4) 0.01ml サルコシンオキシダーゼ (5) 0.05ml カルバモイルサルコシン (6) 0.10ml をピペツト装入し、混合し、約10分間待ち、次い
で、試料を用いて開始し、 試 料 0.04ml と混合し、10分間進行させ、直線相からＥ／min
を算出する： 計算：ΔE／min×２×稀釈度／8.3×使用試料ml＝Ｕ
／ml
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ Ｎ−カルバモイルサルコシンを特異的に複分
解するが、クレアチニン、クレアチン、サルコシ
ン、Ｎ−メチルヒダントイン及びヒダントインを
複分解せず、＋４℃〜約40℃の作用適温範囲、６
〜９の安定PH範囲、0.1M K4P2O7緩衝液中の至
適PH7.5〜9.0及び0.1M K4P2O7緩衝液（PH8.5）中
のミハエリス定数5.0〜7.1×10-3Ｍを有し、メル
チオレートで阻害されるＮ−カルバモイルサルコ
シン−アミドヒドロラーゼ。 ２ Ｎ−カルバモイルサルコシンを特異的に複分
解するが、クレアチニン、クレアチン、サルコシ
ン、Ｎ−メチルヒダントイン及びヒダントインを
複分解せず、＋４℃〜約40℃の作用適温範囲、６
〜９の安定PH範囲、0.1M K4P2O7緩衝液中の至
適PH7.5〜9.0及び0.1M K4P2O7緩衝液（PH8.5）中
のミハエリス定数5.0〜7.1×10-3Ｍを有し、メル
チオレートで阻害されるＮ−カルバモイルサルコ
シン−アミドヒドロラーゼを取得するために、Ｎ
−メチルヒダントイン上で培養された、後処理に
引き合う量のＮ−カルバモイルサルコシン−アミ
ドヒドロラーゼを有するアルトロバクター、マイ
クロコツカス又はモラキセラ属の微生物を慣用法
で溶解させ、不溶分を除いた澄明な上澄みに、ポ
リエチレンイミン0.3〜0.5重量％を添加し、生じ
る沈澱を除去し、この上澄みから、H2Ｏでの希
釈によりＮ−カルバモイルサルコシン−アミドヒ
ドロラーゼを沈澱させ、かつ単離することを特徴
とする、Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒ
ドロラーゼの取得法。 ３ アルトロバクターDSM2563、DSM2564、マ
イクロコツカス・spec.DSM2565又はモラキセラ
DSM2562を使用する特許請求の範囲第２項記載
の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19823248145 DE3248145A1 (de) | 1982-12-27 | 1982-12-27 | Verfahren und reagenz zur bestimmung von n-carbamoylsarcosin und hierfuer geeignetes neues enzym |
| DE3248145.4 | 1982-12-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63102680A JPS63102680A (ja) | 1988-05-07 |
| JPH047673B2 true JPH047673B2 (ja) | 1992-02-12 |
Family
ID=6181852
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58242347A Granted JPS59132891A (ja) | 1982-12-27 | 1983-12-23 | Ｎ−カルバモイルサルコシンの測定法及び測定試薬 |
| JP62196139A Granted JPS63102680A (ja) | 1982-12-27 | 1987-08-05 | Ｎ−カルバモイルサルコシン−アミドヒドロラ−ゼ及びその取得法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58242347A Granted JPS59132891A (ja) | 1982-12-27 | 1983-12-23 | Ｎ−カルバモイルサルコシンの測定法及び測定試薬 |
Country Status (13)
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| EP (1) | EP0112571B1 (ja) |
| JP (2) | JPS59132891A (ja) |
| AT (1) | ATE28758T1 (ja) |
| AU (1) | AU545903B2 (ja) |
| CA (1) | CA1210675A (ja) |
| DD (2) | DD216255A5 (ja) |
| DE (2) | DE3248145A1 (ja) |
| DK (1) | DK173112B1 (ja) |
| ES (1) | ES528117A0 (ja) |
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| US4812399A (en) * | 1986-04-21 | 1989-03-14 | Eastman Kodak Company | Analytical element and method for the determination of creatinine or creatine |
| DE3821077A1 (de) * | 1988-02-12 | 1989-08-24 | David Diagnostics Inc | Verfahren zur bestimmung des sauerstoffgehaltes in biologischen fluessigsubstraten und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
| DE4029844A1 (de) * | 1990-09-20 | 1992-03-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Carbamoylsarcosinhydrolase, kloniert |
| DE4103220A1 (de) * | 1991-02-02 | 1992-08-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur stabilisierung von 1-methylhydantoinase, verwendung einer stabilisierten 1-methylhydantoinase zur bestimmung eines analyten, entsprechendes bestimmungsverfahren sowie hierfuer geeignete mittel |
| BR9600672A (pt) * | 1996-03-08 | 1997-12-30 | Dedini S A Administracao E Par | Processo de hidrólise ácido de material lignocelulósico e reator de hidrólise |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2122255C3 (de) * | 1971-05-05 | 1987-01-22 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur spezifischen Bestimmung von Creatinin |
| US4039384A (en) * | 1975-04-05 | 1977-08-02 | Noda Institute For Scientific Research | Creatinine amidohydrolase and creatine amidinohydrolase and process for producing them |
| JPS603480B2 (ja) * | 1980-11-10 | 1985-01-28 | 東洋紡績株式会社 | クレアチニンおよびクレアチンの定量法 |
| IT1137075B (it) * | 1981-05-28 | 1986-09-03 | Chemical Lab S R L | Procedimento per la determinazione della creattinina (creatininio) in liquidi biologici, e reattivo per la sua attuazione |
-
1982
- 1982-12-27 DE DE19823248145 patent/DE3248145A1/de not_active Withdrawn
-
1983
- 1983-12-01 AU AU21870/83A patent/AU545903B2/en not_active Ceased
- 1983-12-05 IE IE2856/83A patent/IE56346B1/en not_active IP Right Cessation
- 1983-12-16 US US06/562,072 patent/US4645739A/en not_active Expired - Lifetime
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- 1983-12-22 DD DD83258475A patent/DD216255A5/de not_active IP Right Cessation
- 1983-12-22 DK DK198305925A patent/DK173112B1/da not_active IP Right Cessation
- 1983-12-22 ZA ZA839522A patent/ZA839522B/xx unknown
- 1983-12-22 CA CA000444052A patent/CA1210675A/en not_active Expired
- 1983-12-22 DD DD83268005A patent/DD222631A5/de not_active IP Right Cessation
- 1983-12-23 EP EP83113075A patent/EP0112571B1/de not_active Expired
- 1983-12-23 AT AT83113075T patent/ATE28758T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-12-23 JP JP58242347A patent/JPS59132891A/ja active Granted
- 1983-12-23 DE DE8383113075T patent/DE3372870D1/de not_active Expired
-
1987
- 1987-08-05 JP JP62196139A patent/JPS63102680A/ja active Granted
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| DD222631A5 (de) | 1985-05-22 |
| ZA839522B (en) | 1984-09-26 |
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| IE56346B1 (en) | 1991-07-03 |
| CA1210675A (en) | 1986-09-02 |
| DK173112B1 (da) | 2000-01-31 |
| EP0112571B1 (de) | 1987-08-05 |
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| DE3248145A1 (de) | 1984-06-28 |
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