JPH0469370A - Ｌ―フェニルアラニンと桂皮酸の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明はＬ−フェニルアラニンと桂皮酸の分離方法に関
する。

Ｌ−フェニルアラニンは人間の必須アミノ酸の一種であ
り、医薬品あるいは飼料用などその用途は広く、またＬ
−フェニルアラニンはジペプチド甘味料であるアスパル
テームの製造原料としても用いられていることから、近
年その需要は高まりつつあり産業上有用なものである。

Ｌ−フェニルアラニンの生成方法は、化学合成法、発酵
法などが知られているが、これらの方法においては生産
効率が低いという問題がある。効率的な生成方法として
は、桂皮酸を原料としてアンモニア源の存在下、Ｌ−フ
ェニルアラニンアンモニア・リアーゼを用いて酵素的に
Ｌ−フェニルアラニンを製造する方法が知られている。

この反応は平衡反応であるため、反応液中には生成物で
あるＬ−フェニルアラニンと未反応の桂皮酸が存在する
。従って、製造上の主要な問題点の一つに、いかにして
Ｌ−フェニルアラニンと桂皮酸を分離するかという問題
が挙げられる。

〔従来の技術］ 溶液中のＬ−フェニルアラニンの回収は、陽イオン交換
樹脂にＬ−フェニルアラニンを吸着させる方法が公知で
ある。英国特許１４８９４６８号公報には、酸性条件下
で桂皮酸を析出させ、析出した桂皮酸を遠心分離等によ
り排診し、Ｌ−フェニルアラニンを含有する溶液を陽イ
オン交換樹脂に吸着させる。

続いて溶＃液として水酸化アンモニウムを用いてＬ−フ
ェニルアラニンを溶離させ、その溶離液を加熱、濃縮す
ることによりＬ−フェニルアラニンを回収する方法を開
示している。

しかし、該方法によれば、塩基性（ｐ）１８〜１０．５
）の反応液を酸性にするために酸が必要であり、操作が
煩雑で、工業的な生産方法としては多くの問題を有して
いる。

特開昭６０−１８１０５５号公報、特開昭６０−１０４
０５２号公報、特開昭６０−１０４０５１号公報におい
ては合成吸着樹脂を用い、Ｌ−フェニルアラニンの精製
法を開示している。即ち、ｐｉあるいは塩濃度を調整し
たしフェニルアラニンと桂皮酸の混合溶液を合成吸着樹
脂カラムに通液して、Ｌ−フェニルアラニンと桂皮酸を
クロマト分離し、さらに樹脂に吸着したＬフェニルアラ
ニンと桂皮酸は、溶離液として塩濃度あるいはｐＨを調
整したものを用いることにより桂皮酸とＬ−フェニルア
ラニンをクロマト分離する方法である。これらの方法に
おいては反応液中のアンモニア及びその対イオンが樹脂
に吸着されず、桂皮酸とＬ−フェニルアラニンのみが吸
着されるため、アンモニア及び対イオンの回収が容易に
可能脂が吸着しうる桂皮酸、Ｌ−フェニルアラニンの量
がイオン交換樹脂に比べ極端に少ないことに加えて、桂
皮酸とＬ−フェニルアラニンの両方が樹脂に吸着させる
ため必要な樹脂の量が膨大となる等のラニンを容易に分
離する方法を鋭意検討した結果、桂皮酸とアンモニア源
からＬ−フェニルアラニンを生成する反応溶液、即ち、
炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからなる上述の
溶液中では、強塩基性陰イオン交換樹脂には桂皮酸のみ
が吸着し、Ｌ−フェニルアラニンの吸着は桂皮酸に比較
してごく僅かであることを見いだし、本発明を完成する
に至った。

即ち、炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからなる
溶液中で、Ｌ−フェニルアラニンアンモニア・リアーゼ
存在下、桂皮酸からＬ−フェニルアラニンを生成させ、
その反応液からＬ−フェニルアラニンを分離精製するに
際し、強塩基性陰イオン交換樹脂を用いて、桂皮酸を分
離除去することを特徴とするＬ−フェニルアラニンと桂
皮酸の分離方法である。

本発明において使用するＬ−フェニルアラニンアンモニ
ア・リアーゼは、桂皮酸とアンモニア供与体からＬ−フ
ェニルアラニンを生成せしめる酵素であり、ロドスボリ
ジウム属などの酵母、カヒ等の微生物のほかに、ジャガ
イモ、パセリ等の植物にも分布していることが知られて
おり、これらの生物を直接利用するか、もしくは、これ
らの生物からＰＡＬの構造遺伝子を取り出し遺伝子操作
により大腸菌などの微生物を該酵素生産能を有する形質
転換体とし利用することができる。更に、ＰＡＬ生産能
を有する微生物の培養液・該培養液から遠心分離等によ
り得られる菌体、または該菌体の処理物（例えば、洗浄
菌体、固定化菌体、菌体破砕物、菌体の自己消化物、菌
体の超音波処理物、凍結融解物）等を用いることができ
る。

本発明に係わる反応方法は、例えば上記微生物の培養液
、該反応液から遠心分離等により得られる菌体、あるい
は該菌体処理物を用いて行う。

Ｌ−フェニルアラニンをＬ−フェニルアラニンアンモニ
ア・リアーゼの存在下で桂皮酸から反応生成させる条件
については、特開昭６１−１２２９７３号公報、特開昭
６１−２４７３９５号公報に述べられているように、ア
ンモニウム源として炭酸アンモニウムを用いることが反
応上有利であることが知られている。

Ｌ−フェニルアラニンを、Ｌ−フェニルアラニンアンモ
ニア・リアーゼの存在下で桂皮酸から反応生成させる際
の反応条件は、炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウム
からなる反応′Ｉｊ、（ｐＨ９，６〜１２．０、好まし
くは１０．０〜１０．６、アンモニア濃度が１０モル／
１以上）中で行われる。この反応は平衡反応であるので
、反応後の反応液中には未反応の桂皮酸と反応生成物の
Ｌ−フェニルアラニンが共に溶解した状態で存在してい
る０反応液中に残存する桂皮酸は生成物のＬ−フェニル
アラニンに対して約１０％程度である。従って、Ｌ−フ
ェニルアラニンと桂皮酸を樹脂を用いて分離する場合、
桂皮酸のみを樹脂に吸着させることが、Ｌ−フェニルア
ラニンのみを吸着させる、あるいは、桂皮酸とＬ−フェ
ニルアラニンの両者を樹脂に吸着させ、クロマト分離す
る、などの方法よりも必要となる樹脂量の点から明らか
に有利である。

このような考えから桂皮酸とＬ−フェニルアラニンを、
桂皮酸のみを１着させることにより分離するために陰イ
オン交換樹脂を用いる方法について鋭意検討した結果、
桂皮酸とＬ−フェニルアラニンを含む上述のような反応
液を強塩基性陰イオン交換樹脂に接触させることにより
、桂皮酸を樹脂に吸着させ、Ｌ−フェニルアラニンと分
離することが可能であることを見いだした。

一般に、強塩基性陰イオン交換樹脂にアルカリ性条件下
において桂皮酸とＬ−フェニルアラニンを接触させると
、カルボキシル基を持つ桂皮酸、Ｌフェニルアラニンが
共に吸着する。しかし、反応条件の炭酸アンモニウム・
水酸化アンモニウム反応液（ｐＨ９，６〜１２．０、ア
ンモニア濃度１０モル／１以上）中という高アンモニア
濃度、高塩濃度の特殊な状態下では、し−フェニルアラ
ニンの強塩基性陰イオン交換樹脂への吸着は桂皮酸に比
べ非常に少ない。

また、反応液中の他の陰イオンである炭酸イオンも強塩
基性陰イオン交換樹脂に吸着せず、また桂皮酸の樹脂へ
の吸着に影響を与えない。従って、反応液をそのまま強
塩基性陰イオン交換樹脂交換樹脂塔に通液することによ
り桂皮酸を吸着させ、反応液中のＬ−フェニルアラニン
と分離することが可能となる。

本発明のごとく、強塩基性陰イオン交換樹脂を用いて桂
皮酸とＬ−フェニルアラニンを分離するという試みは現
在まで行われていない。

一方、弱塩基性の陰イオン交換樹脂では、桂皮酸は前述
の反応条件下では、桂皮酸の吸着量が極端に少ないため
、本発明における強塩基性陰イオン交換樹脂を用いたよ
うな桂皮酸とＬ−フェニルアラニンの分離に用いること
はできない。

また、本発明における炭酸アンモニウムの代わりに硫酸
アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等
を用いると、それらの陰イオンである硫酸イオン、塩化
物ジオン、硝酸イオンが樹脂に吸着するために、本発明
の方法には用いることができない。

本発明の主要な利点は、 ■本発明においては強塩基性陰イオン交換樹脂には、反
応後の残存した桂皮酸のみ吸着させ、生成物のＬ−フェ
ニルアラニンを殆ど吸着させないため、必要な樹脂蓋は
桂皮酸吸着分のみであり、樹脂が少量で実施できる。

■樹脂塔通過後の桂皮酸の除かれた反応液中のしフェニ
ルアラニン濃度は、通液前と殆ど変化しない。そのため
、それ以後の濃縮等の精製が容易である。

■樹脂に吸着された桂皮酸の回収が可能であり、その桂
皮酸は再度反応に用いることができる。

などの点を挙げることができる。

本発明の方法には交換基に４級アンモニウム基をもつ強
塩基性陰イオン交換樹脂が用いられる。

強塩基性陰イオン交換樹脂としては、例えばレバチット
＠　ＭＰ５００Ａ、レバチット■ＡＰ２４６　、ダイア
イオン■５ＡＩＯＡ　、ダイアイオン＠５Ａ２１、アン
バーライト■ＩＲＡ−４００、アンバーライト■ＩＲＡ
−４０２、アンバーライト■ＩＲＡ−９００などがψげ
られる。

本発明における桂皮酸樹脂吸着は、ハツチでの吸着、あ
るいはカラムに充填し、反応液をその塔に給液する等の
方法が可能である。

カラム法を用いる場合、カラムへの反応液の通液速度は
低速である方が好ましく、Ｓｖ・０．１〜ＩＯｈ好まし
くはＳＶ、０．３〜１．ｏｈ−’　（７）範囲で行う。

５ｖ＝ｉｏｈ−’を越える流速では、桂皮酸の吸着量は
着用に減少する。カラム温度は１０〜３０°Ｃで行う。

３０°Ｃを越えると桂皮酸の吸着量が低下する。

給液終了後、カラム中に存在する未吸着のＬ−フェニル
アラニンは桂皮酸、し−フェニルアラニンを含まない反
応液、あるいは水を給液することにより回収するか、カ
ラムを枯渇させる等により回収することができる。

このようにして強塩基性陰イオン交換樹脂を通過した反
応液中には、桂皮酸が含まれない。

該処理液からＬ−フェニルアラニンの回収法としては、
加熱により濃縮し、さらに濾過により結晶を回収する方
法、あるいは、Ｌ−フェニルアラニンが吸着しうる樹脂
等を充填した塔に本発明の処理液を通液し、Ｌ−フェニ
ルアラニンを吸着させ、吸着させたＬ−フェニルアラニ
ンを常法により溶離させ、そ−の溶離液を濃縮し、さら
に濾過し、Ｌ−フェニルアラニンの結晶を得る方法など
がある。

本発明者らは、強塩基性陰イオン交換樹脂に吸着した桂
皮酸の好ましい溶離法として、低級アルコールと水酸化
ナトリウムとの混合液を溶離液として用いる方法を見い
だしている。このようにして得た溶離液を、加熱により
濃縮し、結晶を取り出すか、必要に応じては酸で溶液の
ｐＨを酸性に調整し、桂皮酸を晶析、回収し、再び反応
に用いることができる。溶離液に用いる低級アルコール
としては、炭素数Ｃ２〜Ｃ４であり、例えば、メタノー
ル、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピ
ルアルコール、ｎ−ブタノール等が挙げられる。

Ｃ発明の効果〕 し−フェニルアラニンと桂皮酸の分離が容易に行なえる
ことで、反応液からのＬ−フェニルアラニンの回収が容
易となり、工業的に有利な精製法を寄与するも−のであ
る。

［実施例〕 以下、実施例及び参考例を挙げて本発明について更に具
体的に説明する。しかし、具体的な例として示すもので
あり、発明を限定するものではない。

実施例においての桂皮酸またはＬ−フェニルアラニンの
定量は、紫外唆収分光光度計を検出器に設置した液体ク
ロマトグラフィー法により行った。

移動相は、燐酸でｐＨ２に調整した５０％メタノール水
溶液を用い、検出波長は２２３ｎ＋ｗで、カラムは日本
分光＄１ノＦｒＮＥＰＡＫ　＠　ＳＩＬ　Ｃ１８を用い
て行った。

アンモニア濃度の測定は水藤気蒸留−逆滴定法により行
った。

実施例１ Ｌ−フェニルアラニンと桂皮酸それぞれ１０．０　ｇを
ｐＨ１０，２、アンモニア濃度１０．３モル／ｌの炭酸
アンモニウムと水酸化アンモニウムからなる反応液１３
００＋ｄに熔解した。この溶液を強塩基性陰イオン交換
樹脂のダイアイオン＠５ＡＩＯ１あるいはダイアイオン
■５Ａ２１　（三菱化成■；登録商標）５０厩を充填し
たカラムに５Ｖ＝１．Ｏｈ−’、カラム温度２０’Ｃで
通液した。通液終了後、さらに、水１０００−を５Ｖ＝
５ｈの流速で通液することにより、樹脂に非吸着の結晶
あるいはＬ−フェニルアラニンを洗浄除去した。

カラムを通過した液、及び水で洗浄した液中の桂皮酸、
し−フェニルアラニンの濃度を測定し、それより樹脂に
吸着したそれぞれの量を求めた。

結果を第１表に示す。

（以下余白） 第１表　強塩基性陰イオン交換樹脂に吸着する桂皮酸と
Ｌ−フェニルアラニン量の比較 性：表中の値はカラム給液前の液中の桂皮酸としフェニ
ルアラニンの量を１００％としたときのそれぞれに存在
する量の割合を示した。

第１表はカラムに給液した液中には桂皮酸とＬフェニル
アラニンが等量存在していたにもかかわらず、桂皮酸に
対してのＬ−フェニルアラニンの吸着量は極端に少ない
ことを示している。

従って、反応の条件下においては、強塩基性陰イオン交
換樹脂に桂皮酸がＬ−フェニルアラニンよりも明らかに
吸着されやすいことがわかる。

実施例２ Ｌ−フェニルアラニンアンモニア・リアーゼ産生菌体（
ＭＴ−１０４２３株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−１７１３）、特
願昭６２−１５２３５７参照）をポリペプトンｌＯｇ／
　１、酵母エキス５ｇ／ｌ、ＮａＣＬ５ｇ／　ｊ２を含
む培地に接種し、振とう培養を３０’Ｃで１６時間行っ
た。培養液４Ｎを１００００　Ｘ　Ｇで１０分遠心して
湿菌体を回収した。この温菌体を炭酸アンモニウムと水
酸化アンモニウムからなる溶液２１に懸濁させ、桂皮酸
を加え２０時間３０°Ｃで反応を行った。

反応後の反応液を１００００　ｘ　ｃで３０分間遠心す
るーことにより菌体固形分を除去した。その除菌液はｐ
Ｈ１０，２、アンモニア濃度１０．４モル／！、Ｌ−フ
ェニルアラニン濃度５．０％、桂皮酸濃度０．５％であ
った。

このようにして調製した反応液をカラム給液用として用
いた。

強塩基性陰イオン交換樹脂のダイアイオン０ＳＡ１０（
三菱化成■：登録商標）　２００ｍを充填したカラムに
５Ｖ＝１．Ｏｈ−’、カラム温度２０゛ｃで上記の液を
カラムに通液した。そして２００ｍごとにカラム通過液
を分取し、Ｌ−フェニルアラニンと桂皮酸濃度を測定し
た。給液量が１２００ｍ１から１４００Ｗ１の間で、桂
皮酸の溶出を認めたので給液を中止した。さらに水２０
０ｄをカラムに給液することにより、桂皮酸とＬ−フェ
ニルアラニンの未吸着分を回収した。

結果を第２表、第３表に示す６ （以下余白） 第２表　強塩基性陰イオン交換樹脂を用いた桂皮酸とＬ
−フェニルアラニンの分離 第３表　樹脂塔通過液のＬ−フェニルアラニンと桂皮酸
の濃度 注二カラムに給液した反応液中の桂皮酸及びＬ−フェニ
ルアラニン量を１００％としたときの、カラム通過液と
水洗浄液中の量をパーセントで示した。なお、樹脂製着
分は供給液との差がから求めた。

（以下余白） 第２表は、反応液中の桂皮酸のみ樹脂に吸着され、Ｌ−
フェニルアラニンは吸着されないことを示す。

第３表は反応液中のＬ−フェニルアラニン濃度は樹脂塔
給液前と後とで変化しないことを示している。

実施例３ 炭酸アンモニウム・水酸化アンモニウムがらなるｐＨ１
０，３、アンモニア濃度１０．２モル／ｌに桂皮酸を溶
解した溶液を調整し、三角フラスコに各々５０．０ｇを
加え、更に強塩基性陰イオン交換樹脂、あるいは弱塩基
性陰イオン交換樹脂２．５ｇを加え、室温で２時間振盪
攪拌した。その後、その上清液中の桂皮酸濃度を測定し
、樹脂当りの桂皮酸の吸着量を求めた。結果を第４表に
示す。

第４表　強塩基性及び弱塩基性陰イオン交換樹脂性：表
中の数字は、樹脂１．０ｇ当りの桂皮酸の吸着量を示す
。

第４表は、前述した反応の条件下では、弱塩基性陰イオ
ン交換樹脂への桂皮酸の吸着は、強塩基性陰イオン交換
樹脂に対するものと比べ、非常に少ないことを示してい
る。

実施例４ 実施例２と同様の方法により、Ｌ−フェニルアラニンア
ンモニア・リアーゼ産生菌体を培養し、遠心により集菌
体を回収し、さらに炭酸アンモニウムと水酸化アンモニ
ウムからなる溶液（ｐＨ１０，３、アンモニア濃度１０
．２モル／ｌ）中に、菌体を懸濁し、桂皮酸を装入する
ことにより反応を行った。

反応後の反応液を１００００　ｘ　ｃで１０分遠心し、
菌体等の固形分を除去し、し−フェニルアラニン、桂皮
酸を含む反応液を得た。

アンバーライト■ＩＲ＾−９００，２００ｄを充填した
カラムニＬ−フェニルアラニン、桂皮酸を含む前述の様
にして得た反応液１１００ｄ（Ｌ−フェニルアラニン４
８．５ｇ　、桂皮酸３．９ｇを含む。）を流速Ｓシ＝１
．０ｈカラム温度２０℃で通液した。通液後、炭酸アン
モニウムと水酸化アンモニウムからなる溶液（ｐＨ１０
，３アンモニア濃度１Ｏ０２モル／ｆ）２００ｄを更に
通液することにより、樹脂に不Ｗ＆着のＬ−フェニルア
ラニンを回収した。

カラム通過液及び不吸着物回収液中には、桂皮酸は存在
せずＬ−フェニルアラニンのみが存在した。

これらの液の混合液中のＬ−フェニルアラニン量は４５
．１ｇであった。

この混合液１２６０ｄを常圧、９０℃で９１１ｄまで濃
縮し、更に減圧下（約６００ｗｈｖａＨｇ）、６５℃で
４０２〆までｉｆｌ！した。この濃縮液を１０℃まで冷
却、晶析させ、さらに、ろ過、真空乾燥（７０℃）によ
りし−フェニルアラニンの結晶３４．５ｇを回収した。

実施例５ 実施例２と同様の方法により、Ｌ−フェニルアラニンア
ンモニア・リアーゼ産生菌体を培養し、遠心により集菌
体を回収し、さらに炭酸アンモニウムと水酸化アンモニ
ウムからなる溶液（ρ）１１０．３、アンモニア濃度１
０．２モル／ｆｆ１）中に、菌体を懸濁し、桂皮酸を装
入することにより反応を行った。

反応後の反応液をｔｏｏｏｏ　ｘ　ｃで１０分遠心し、
菌体等の固形分を除去し、Ｌ−フェニルアラニン、桂皮
酸を含む上清液を得た。

レバチット＠　ＭＰ５００Ａ、２００−を充填したカラ
ムにＬ−フェニルアラニン、桂皮酸を含む前述の様にし
て得た反応液１１００ｄ（Ｌ−フェニルアラニン５０．
４ｇ、桂皮酸４．６ｇを含む。）を流速Ｓｌ’＝１．Ｏ
ｈ　−１力ラム温度２０’Ｃで通液した。！液後、炭酸
アンモニウムと水酸化アンモニウムからなるｉ？＆、（
ｐＨ１Ｏ，３アンモニア濃度１０．２モル＃！＞２００
−を更ムこ通液することにまり、樹脂に不役着のＬ−フ
ェニルアラニンを回収した。

カラム通過液及び不吸着物回収液中には、桂皮酸は存在
せずＬ−フェニルアラニンのみが存在した。

これらの液の混合液中のＬ−フェニルアラニン量は４８
９ｇであった。

この混合液１２０９ｍを活性炭（ヤンガラ炭ＣＷ８３０
Ｂ二村化学工業■製）を充填したカラムに通液速度ＳＶ
・１．Ｏｈ畳、カラム温度２０°Ｃで通液し、Ｌ−フェ
ニルアラニンを活性炭に吸着させた。カラムを通過した
溶液は、反応に用いる溶液とｐＨ、アンモニア濃度とも
に同等であった。

活性炭に吸着したＬ−フェニルアラニンはアンモニア水
（５−Ｔ−ル／　ｆ　）６３０献を流速５Ｖ＝１．Ｏｈ
−’、カラムム温度５０°Ｃで通液し溶離回収した。？
８離液６３２．ｄ中にはＬ−フェニルアラニンを４５．
０ｇ含んでいた。

この溶離液を減圧下（約６００ｍｍ）Ｉｇ）、５５°Ｃ
で３３０　ｄまで濃縮後、ｌｏ’ｃまで冷却、晶析させ
、ろ過によりＬ−フェニルアラニンの湿結晶を得た。さ
らに、減圧下、７０°Ｃで湿結晶を乾燥させ、Ｌ−フェ
ニルアラニンを３６．５ｇ回収した。

特許出願人　　三井東圧化学株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）炭酸アンモニウムと水酸化アンモニウムからなる
   溶液中で、Ｌ−フェニルアラニンアンモニア・リアーゼ
   存在下、桂皮酸からＬ−フェニルアラニンを生成させた
   反応液からＬ−フェニルアラニンを分離精製するに際し
   、強塩基性陰イオン交換樹脂を用いることを特徴とする
   Ｌ−フェニルアラニンと桂皮酸の分離方法。