JPH0466556B2

JPH0466556B2 -

Info

Publication number: JPH0466556B2
Application number: JP63215865A
Authority: JP
Inventors: Masami Hoshino
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-08-29
Filing date: 1988-08-29
Publication date: 1992-10-23
Also published as: JPH0265777A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕この発明は納豆菌に関し、特にその菌により熟
成させた食品が糸引性を有しない新規な納豆菌
HOS80に関する。〔従来の技術と解決すべき課題〕熟成納豆は、良質の植物性蛋白質が適度に分解
されて消化性が良く、栄養価が高いだけでなく、
美味しく、安価であり、しかも保存性に優れてい
るなどの利点を備えた、優れたバランス食品であ
る。しかも近時、納豆の中から脳血栓の予防・治
療薬となる線溶酵素が多量に含まれているのが発
見される等、納豆の価値が見直されてきている。
しかし、納豆は特有の糸引性を有するため、納豆
を食するとき、その粘質物が唇や食器に付着して
容易に取れず、人に不快感や嫌悪感を与えてしま
うことがある。また、納豆熟成後は取り扱いが困
難となり、後加工ができない等、糸引性が有るた
め納豆の普及が制限されあるいは副食物としての
利用に限定されている等、利用分野が制限されて
いた。そこで、納豆の糸引性に関して研究が為され、
糸引性を有しない納豆菌の開発が為された。すな
わち、九州大学の原教授は納豆菌からプラスミド
を取り出し、プラスミドのない納豆菌により熟成
した納豆は糸引がないことを見出したのである。
具体的には、納豆菌からプラスミドを取り出すこ
とにより、その納豆菌のγ−GTPase（グルタミ
ルトランスペプチターゼglutamyl trans
peptidase）活性がほぼ０となることから、公知
の納豆菌を突然変異させることによつて得られた
納豆菌変異株からγ−GTPase活性がほぼ０の納
豆菌（以下、HOS−０株と言う。）を選び出して
培養し、そのHOS−０株により製造した納豆に
は糸引性がほとんどなかつたのである。しかしながら、HOS−０株により製造した納
豆には疎水性アミノ酸（チロシン）がほとんど析
出せず、強い苦味が残つてしまうという問題があ
つた。そのため、製造した納豆から苦味を消すた
めに食塩を添加する必要があるなど、用途が限定
されるものであつた。本発明者においても納豆菌の糸引性に関して長
年研究を続けており、その結果、γ−GTPase活
性が親株の50％以上もあるのにかかわらず、熟成
した納豆に糸引性が実質的にほとんどなく、しか
も極めて苦味の少ない納豆菌を見出したのであ
る。〔課題を解決するための手段〕本発明に係る納豆菌HOS80の要旨とするとこ
ろは、バチラス・ズブチリス（Bucillus
subtilis）に属し、γ−STPase活性が100単位以
上で有り、且つ熟成させた蛋白が実質的に糸引性
を有しないことにある。〔作用〕ここで、「実質的に糸引性を有しない」とは、
たとえば乾燥、凍結乾燥、粉体混合などの手段が
施されていない未加工状態の熟成蛋白が、熟成蛋
白に特有の糸引性を有しないことを言う。また、
「熟成」とは、蛋白が分解されていつて、旨味
が出る。ペプチドの増加が見られる。後期にな
ると、分解されて生じたアミノ酸の疎水性アミノ
酸（チロシン）の結晶が生じて来る。柔らかく
なる、状態を言う。本発明に係る納豆菌HOS80は、公知の納豆菌
を突然変異させることによつて得られる納豆菌変
異株から製造される。変異株を得るために使用する納豆菌としては、
たとえばバチラス・ズブチリス（Bucillus
subtilis枯草菌）に属するビオチン（biotin）要
求性を有する公知の納豆菌がいずれも親株として
使用できる。その具体例としては、たとえば宮城
野納豆菌、高橋菌、旭川菌、松村菌、成瀬菌など
を挙げることができる。突然変異の方法としては、たとえば突然変異源
を接触させる方法、遺伝子操作による方法、Ｘ
線、紫外線、光などを照射する方法など、公知の
方法をいずれも採用することができる。突然変異の方法として好適な突然変異源を接触
させる方法によれば、親株である公知の納豆菌を
突然変異源を加えた栄養培地で培養し、得られた
変異株からγ−GTPase活性が100単位以上の菌
株がスクリーニングされる。得られたγ−
GTPase活性が100単位以上の変異株を用いて発
酵食品、たとえば納豆を製造し、その中から風味
を損なわず、且つ実質的に糸引性のない納豆を製
造し得る菌株が出されるのである。ここで、製造された発酵食品にチロシンを析出
させ、極めて苦味の少ない発酵食品を得るために
は、変異株のγ−GTPase活性が100単位以上、
好ましくは200単位以上となるように親株が選定
される。また、突然変異源とては公知のものがいずれも
使用でき、たとえばアクリジンオレンジ、Ｎ−メ
チル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、
ジメチル硫酸などの薬剤を挙げることができる。
更に、突然変異源の接触濃度は、使用する突然変
異源により異なつて特に制限されないが、通常こ
のよな操作を行う場合と同程度で良い。たとえ
ば、アクリジンオレンジでは通常１〜200mcg（マ
イクログラム）／ml程度とすれば良い。栄養培地としては公知のものがいずれも使用で
き、たとえば肉エキス、ペプトン、子牛血漿、寒
天、ゼラチン、食塩などを添加した培地、肉汁培
地、肉汁寒天培地、肉汁ゼラチン培地、リトマス
ミルク、MEM培地などを挙げることができる。
培養は、静置培養、振盪培養などの公知の方法に
従つて行えば良い。培養温度及び時間は、通常の
親株の納豆菌の培養と同じで良く、培養温度は通
常30〜45℃程度で、培養時間は１〜５日程度で良
い。このようにして得られた突然変異株の具体例と
しては、Bucillus subtilis HOS80（工業技術院微
生物工業技術研究所に微工研菌寄第10195号
（FERM Ｐ−10195）なる受託番号で寄託されて
いる。以下「HOS80株」とする。）を挙げること
ができる。HOS80株は、親株として宮城野納豆
菌を用いて、この宮城野納豆菌を突然変異させて
得られた変異株である。 HOS80株の菌学的性質を示す。 (a) 形態形状；桿状大きさ；2.3〜3.5×0.7〜0.9μm 胞子の有無；有胞子の大きさ；0.8×1.6〜1.8μm 胞子の形状；楕円状胞子嚢膨脹の有無；無胞子の部位；中央グラム染色性；陽性 (b) 普通寒天培地での生育状態（25℃で25時間培
養）形状；環状表面；粗く、皺がある周縁部；波状色相；不透明、クリーム色 (c) ゼラチン穿刺培養生育の状態；＋液化；層状 (d) 嫌気性寒天培地での生育の有無；− (e) サブロー蔗糖培地での生育の有無；＋ (f) リトマスミルクでの生育の有無；資化した。凝固することなくカゼインを分解 (g) 生理学的性質カタラーゼ；＋オキシダーゼ；＋デンプンの加水分解；＋ゼラチンの加水分解；＋リジンデカルボキシラーゼ；− アルギニンジヒドラーゼ；− オルニチンデカルボキシラーゼ；− インドールの生成；− 硝酸塩の還元；＋エスキユリン；＋ウレアーゼ；− クエン酸の利用；＋フエニルアラニンデアミナーゼ；− 卵黄反応；− 生育の範囲 55℃；− 50℃；＋ 20℃；＋７℃；− ５℃；− グルコースからのガスの生成；− アセトインの生成；＋下記の糖類から酸の生成の有無グルコール；＋キシロース；；＋フルクトース；＋マニトール；＋マルトース：＋シユクロース；＋ガラクトース；− ラクトース；± β−ガラクトシダーゼ；＋ビオチン要求性；＋塩化ナトリウム５％存在下における生育；＋塩化ナトリウム５％存在下における生育；＋リゾチーム0.001％存在下における生育；＋アジド0.02％存在下における生育；− 上記した変異株における菌学的性質は、細胞及
び胞子の大きさが僅かに異なることを除いて、親
株である宮城野納豆菌のそれと一致するが、
HOS80株は実質的に糸引性を有しない納豆を製
造し得る点において、親株である宮城野納豆菌と
は明確に区別し得るものである。得られた納豆菌HOS80を用いて、公知の方法
にしたがつて納豆を製造した。先ず、大豆を洗浄
した後、水に浸漬して、大豆を1.5〜3.0倍程度、
好ましくは2.0〜2.5倍に膨潤させる。次に、その
大豆を加圧蒸気にて圧力1.5〜2.0Kg／cm²程度の下
で10〜30分程度、蒸煮するかあるいは直接加熱し
て煮た後、これを80℃以下程度に冷却する。その
後、これにHOS80を接種して、30〜50℃の温度
の下で12〜80時間程度培養し、納豆が製造され
る。HOS80による熟成時間は親株の約1.2倍程度
必要とした。このようにして得られた納豆には親株に見られ
るような糸引性を有しないが、場合によつてはヌ
メリ感を有していることがある。また、納豆が熟
成するにしたがつて、蛋白が分解されていつて、
旨味が出るとともに柔らかくなり、ペプチドの増
加が見られた。そして、後期になると分解されて
生じたアミノ酸の疎水性アミノ酸（チロシン）の
結晶が生じてきた。チロシンの析出は、理論的解
明は充分ではないが、納豆菌HOS80が親株の50
％以上のγ−GTPase活性（約200単位以上）を
備えているためと考えられる。したがつて、極め
て苦味のない納豆が得られ、また風味なども何ら
損なわれていない。本発明に係る納豆菌HOS80は納豆に代表され
る大豆の他、グリンピース等の豆類、とうもろこ
しや小麦等の穀類、その他、種実類、いも類、果
実類、きのこ類、藻類など蛋白質を含有する食物
に対して適用し得るものである。〔実施例〕次に、本発明を実施例により、一層詳しく説明
する。実施例１（HOS80株の製造）肉エキス１％、ペプトン１％及び食塩0.5％を
含む液体栄養培地（以下「液体培地」と言う）で
培養した宮城野納豆菌を遠心分離で集菌し、0.5
mg／mlのＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ングアニジン（NTG）を含む１／10Mりん酸
Buffer（PH6.8）に懸濁し、氷冷しながら30分放
置した。その後、遠心分離で菌を集め、同
Bufferで３回洗浄してNTGを洗い落とす。その
後、肉エキス１％、ペプトン１％、食塩0.5％、
寒天２％を含む平板培地に塗抹し、40℃で24時間
培養した後、生育したコロニーのうち200個を無
差別に捨いあげて、それぞれの菌株について納豆
を製造し、継代培養を繰り返しても実質的に糸引
性のない納豆を製造し得る菌株を選び出し、その
後γ−GTPase活性を測定して、γ−GTPase活
性が100単位以上の菌を選定した。このようにし
て安定な突然変異株であるHOS80株を得た。実施例２（γ−GTPase活性の測定） γ−GTPase活性の測定は、バイオキミカエ
バイオフイジカアクタ（Biochimica et
Biophysica Acta，73（1963）679〜681）に記載
の方法に従つて、以下のようにして行つた。 (a) 試料の調製実施例１で得られたHOS80株を下記の各成分
からなる前培養培地にそれぞれ接種し、165r.p.m
で振盪させつつ37℃で７日間及び14日間それぞれ
培養させる振盪培養を行つた。得られた各々の培
養液を10000r.p.m、５分間で遠心分離し、上澄を
酵素液とした。前培養培地（PH6.8に調整）ペプトン 1.2％クエン酸 0.2％グリセロール 2.0％ NH₄Cl 0.7％ K₂HPO₄ 0.05％ MgSO₄7H₂O 0.05％ FeCl₃7H₂O 0.004％ビオチン 0.1μg／ml (b) 酵素活性測定方法下記の各成分を、PH9.0の50mMトリス緩衝液
20mlに溶解して、基質溶液を調製した。基質溶液Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド・１
水和物（基質）；29mg MgCl₂ ；41mg グリシルグリシン；166mg 上記７日培養の酵素液と14日培養の酵素液のそ
れぞれについて、その酵素液0.1mlと得られた基
質溶液３mlとを混合し、37℃で所定時間（０分、
４分、６分、８分、10分）反応させた後、吸光光
度計により波長410nmの吸光度を測定した。結果を第１図に示す。 γ−GTPase活性の１単位は、上記反応条件下
（37℃）にｐ−ニトロアニリド1μmolを遊離する
酵素量とし、γ−GTPase活性は吸光度の時間に
対する変化率に一定値を乗じた値であらわす。 HOS80株のγ−GTPase活性は７日培養では
291単位であり、14日培養では271単位であつた。結果を第１表に示す。比較例１実施例２と同様の条件で、親株である宮城野納
豆菌について、γ−GTPase活性を調べた。すなわち、親株を７日間及び14日間、実施例２
と同じ条件で振盪培養を行つた後、同様にして酵
素液を調製した。得られた酵素液について、実施
例２と同様に基質溶液と混合して、吸光光度計に
より吸光度を測定した。結果を第１図に示す。親株のγ−GTPase活性は、７日培養では455
単位であり、14日培養では388単位であつた。結
果を第１表に示す。比較例２実施例２と同様の条件で、従来技術で述べた原
教授によつて提案されたHOS−０株について、
γ−GTPase活性を調べた。すなわち、HOS−０株を７日間及び14間、実
施例２と同じ条件で振盪培養を行つた後、同様に
して酵素液を調製した。得られた酵素液につい
て、実施例２と同様に基質溶液と混合して、吸光
光度計により吸光度を測定した。結果を第１図に示す。 HOS−０株のγ−GTPase活性は、７日培養
では６単位であり、14日養培では17単位であつ
た。結果を第１表に示す。

【表】実施例３実施例１で得られたHOS80のうち、実施例２
で使用したものとは異なる菌株を用いて、γ−
GTPase活性を調べた。 (a)試料の調製及び(b)酵素活性測定方法は実施例
２と全く同様に行つた。但し、振盪培養は７日培
養のみで、14日培養は行わなかつた。その結果、
吸光度と時間との関係は第２図に示す通りで、γ
−GTPase活性は307単位であつた。比較例３実施例３で用いたHOS80株を製造するのに用
いた親株を使用して、実施例３と同様の条件でγ
−GTPase活性を調べた。その結果、吸光度と時間との関係は第２図に示
す通りで、γ−GTPase活性は427単位であつた。比較例４比較例３で用いた親株を使用してHOS−０株
を製造した。このHOS−０株を使用して、実施
例３と全く同様の条件で、γ−GTPase活性を調
べた。その結果、吸光度と時間との関係は第２図に示
す通りであり、γ−GTPase活性は０単位であつ
た。実施例４精選大豆を洗浄して、2.0〜2.5倍に膨潤するま
で水に浸漬した。これを、加圧蒸気により圧力
2.0Kg／cm²の下で20分間蒸煮した後、80℃以下ま
で冷却し、この大豆に実施例１で得られた
HOS80株を接種した。HOS80株を接種した大豆
を、40℃で24時間保持し、熟成納豆を製造した。
得られた納豆は納豆特有の良好な風味を有し、ま
た保存性にも優れていた。次に、得られた納豆について、次のようにして
糸引性を調べた。得られた納豆２個をくつつけた状態からゆつ
くり引き離して、納豆の間に形成される糸が切
れるまでの距離を測定した。その結果、納豆を数mm引き離しただけで糸が
切れ、実質的に糸引性を有していなかつた。得られた納豆100ｇを水200mlに溶解し、これ
に最終濃度が85％となるようにエチルアルコー
ルを添加した。その結果、溶液はほぼ均一な濁りを生じ、ガ
ラス棒で攪拌しても、ガラス棒には何も付着し
なかつた。比較例５親株である宮城野納豆菌を用いて、実施例３と
同様の条件で、納豆を製造した。得られた納豆に
ついて、実施例３と同様に、糸引性を調べた。その結果、くつつけた納豆を10数cm以上引き
離しても、糸は切れなかつた。その結果、糸状物が析出し、ガラス棒で攪拌
すると、ガラス棒にその糸状物が付着して、巻
き取ることができた。実施例５ HOS80株でプログラム培養納豆を製造し、そ
の納豆を冷蔵保存して、保存中における納豆の品
質の変化を肉眼的観察と酸可溶性ペプチドの測定
により調べた。 (a) 試料の作成常法により煮豆を作り、この煮豆にHOS80株
を接種した後、カツプに盛り込んでプログラム培
養した。プログラム培養は、第３図に示すよう
に、温度40℃、湿度93％で９時間保持した後、湿
度93％の状態で温度を40℃から52℃まで４時間か
けて徐々に上昇させ、その後温度52℃、湿度93％
で４時間保持し、その後、温度を52℃から35℃に
なるまで一気に下げ、３時間保持するものであつ
た。その時の湿度は60％であつた。プログラム培養をして得られた納豆を冷蔵庫に
保存して、経時的に肉眼的観察及び酸可溶性ペプ
チドの測定を行つた。 (b) 酸可溶性ペプチドの測定法サンプル液の調製納豆５ｇを正確に測り取り、水を95ｇ加えて
（20培希釈）、充分にホモゲナイズした。この液10
ｇに0.44M TCA10ｇを加えてよく混合し、室温
で２時間以上抽出（40培希釈）した後、濾紙にて
濾過し、更に、0.45μmフイルターにて濾過した
ものをサンプル液とした。測定サンプル液；0.5ml 蒸留水；0.5ml 0.44M CaCO₃ ４ml ２倍希釈フオリン試薬；１ml サンプル液に蒸留水、0.44M CaCO₃及び２倍
希釈フオリン試薬を所定量加えた後、室温で30分
間反応させ、その後、0.D.660nmで吸光度の測定
を行つた。測定は初日、４日後、７日後及び14日後に上述
の方法により行つた。測定結果を第２表及び第４
図に示す。表中、Blankはサンプル液の代わりに
蒸留水を用いた。 (c) 結果肉眼的観察外観的に、少し色が濃くなつた。酸可溶性ペプチドの測定冷蔵保存により、酸可溶性ペプチドが経時的に
わずかながら増加していた。この結果より、
HOS80株は冷蔵保存中にいても、熟成が進むこ
とがわかつた。比較例６ HOS−０株を用いて、実施例５と同様の条件
で試料を作成するとともに肉眼的観察と酸可溶性
ペプチドの測定を行つた。肉眼的観察外観的に、14日経過後も変化は認められなかつ
た。酸可溶性ペプチドの測定冷蔵保存中、酸可溶性ペプチドは経時的測定に
おいて、ほとんど増加していなかつた。この結
果、HOS−０株は冷蔵保存中、ほとんど熟成し
ないことがわかつた。

〔発明の効果〕

本発明に係る納豆菌HOS80によれば、親株で
ある従来の納豆菌が備えていた優れた特質を兼ね
備えている。したがつて、納豆菌HOS80によつ
て製造された発酵食品は、糸引性が実質的にない
点を除いて、従来の納豆と同様に、旨味があると
ともに消化性に優れて栄養価が高く、しかも保存
性に優れ、極めて苦味が少ないという利点を備
え、安価な発酵食品を提供することが可能となつ
た。HOS80によつて熟成された発酵食品には実
質的に糸引がないため、あらゆる人に不快感を与
えることはなく、またいわゆる副食物としての用
途だけに止まらず、菓子などの用途にも利用で
き、更に、食品素材として後加工を自由に施すこ
とが可能となる等、本発明は優れた効果を奏す
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は熟成蛋白のγ−GTPase活性を算出す
るため、吸光度と時間との関係を示すグラフであ
る。第２図は本発明の他の実施例と比較例におい
て、γ−GTPase活性を算出するため、吸光度と
時間との関係を示すグラフである。ただし、〇はHOS80株の７日培養 ●はHOS80株の14日培養 △は親株の７日培養 ▲は親株の14日培養 □はHOS−０株の７日培養 ■はHOS−０株の14日培養、をそれぞれ示す。第３図は本発明の他の実施例におけるプログラ
ム培養を説明するための図であり、第４図は冷蔵
保存における吸光度と経時日数との関係を示すグ
ラフである。ただし、〇はHOS80株 □はHOS−０株、をそれぞれ示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１バチラス・ズブチリス（Bucillus subtilis）
に属し、γ−GTPase活性が100単位以上で有り、
且つ熟成させた蛋白が実質的に糸引性を有しない
ことを特徴とする納豆菌HOS80。