JPH04638B2 - - Google Patents
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- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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Description
［産業上の利用分野］
本発明は一体型多層化学分析要素に関し、詳し
くは水性液体試料、特に生物液体、例えば血液、
りんぱ液、髄液、尿等に含まれる成分の定量分析
において過酸化水素を生成するオキシダーゼ酵素
反応形を利用する場合に特に効果的な一体型多層
化学分析要素（一体型多層分析要素、一体型多層
分析素子、多層分析フイルムなどとも称される）
に関するものである。 ［従来技術］ オキシダーゼを用い被検物質またはその反応生
成物を酸化すると同時に生成されるH2O2をペル
オキシダーゼを用いて色素の生成反応に導き、比
色的に色素を定量する原理に基づく被検物質の定
量分析のための乾式分析器具としてフイルム状ま
たはシート状の一体型多層化学分析要素（以下、
多層分析要素ということがある。）が提案または
実用化されている。オキシダーゼとペルオキシダ
ーゼを用いて色素の生成反応に導く試薬としては
P.Trinderが「Annales of Clinical
Biochemistry」，６，24−27（1969）において提
案した試薬系およびその改良試薬系がよく知られ
ており、改良試薬系が多層分析要素に組こまれて
いる。Trinder試薬の改良系はオキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、水素供与体（色原体）として４
−アミノアンチピリンまたは４−アミノ−２−メ
チル−３−フエニル−１−（２，４，６，−トリク
ロロフエニル）−３−ピラゾリン−５−オン等の
４−アミノアンチピリンホモログまたは誘導体、
およびカプラーとして１，７−ジヒドロキシナフ
タレン、１−ヒドロキシナフタレン−２−スルホ
ン酸ナトリウム等のヒドロキシナフタレン類を含
む呈色試薬系である。Trinderにより提案された
試薬系およびその改良試薬系（以下、両者を含め
て単にTrinder試薬系という。）の利点はオキシ
ダーゼの種類をかえても残余の成分は同じままで
呈色試薬系として用いることができる点にある。
オキシダーゼとしてはグルコースオキシダーゼ、
コレステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、グリ
セロールオキシダーゼ等を用いうることが知られ
ている。またオキシダーゼとペルオキシダーゼを
含む呈色試薬系において、ジアニシジンまたは
４，５−ビス［４−（ジメチルアミノ）フエニル］
−２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフ
エニル）イミダゾール等の無色の水素供与体であ
るロイコ色素を水素供与体（色原体）とカプラー
の組合せのかわりに用いることも知られている
（米国特許第3992158号、特公昭56−45599号、特
公昭55−25840号、特公昭57−5519号等の明細書
参照）。 Trinder試薬系を含む多層分析要素において
は、水性液体中の被検物質が、水性液体中に溶解
した状態で試薬層に到達し、そこでオキシダーゼ
の触媒作用を受けて空気中の酸素（O2）と反応
してH2O2を生成し、ついでペルオキシダーゼの
触媒作用を受けて酸化カプリング反応（酸化的呈
色反応）が進み発色（または変色）が発現すると
考えられる。このようにTrinder試薬系を含む多
層分析要素においては空気中の酸素が一連の共役
反応の一反応に必須であるので、オキシダーゼを
Trinder試薬系の残余の成分を含む層よりも上側
（支持体から遠い側）に含ませて呈色反応の進行
を早め、同時に分析精度を向上させる提案がなさ
れている（特開昭57−208997号）。オキシダーゼ
をTrinder試薬系の残余の成分を含む層よりも上
側に含有させることは、特開昭55−164356号等に
記載のTrinder試薬系を含む試薬層の上に非孔性
光遮蔽層、多孔性展開層をこの順に設けてなる多
層分析要素において呈色反応の進行を早め、分析
精度を向上させるという効果が顕著であつた。 しかしながら、オキシダーゼをTrinder試薬系
の残余の成分を含む層よりも上側に含有させた多
層分析要素は多孔性展開層に点着された水性液体
試料に含まれる酸化還元性妨害物質による妨害ま
たは干渉を受け分析精度が損われるという問題点
を有することが明らかになつた。ここにいう酸化
還元性妨害物質とは、水性液体試料が生物体液の
場合、カタラーゼ、ヘモグロビン等の過酸化水素
分解活性（本明細書において過酸化水素分解活性
とはカタラーゼ活性、ペルオキシダーゼ活性のい
ずれか一方または両方を意味する。）を有する物
質、アスコルビン酸等を意味し、また前述の問題
点は水性液体試料として全血、溶血全血、血漿、
血清を用いる場合に顕著に現われることが判明し
た。 ［発明の目的］ 本発明の目的は、オキシダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、水素供与体（色原体）、およびカプラー
（または水性供与体とカプラーの組合せのかわり
に酸化により発色または変色しうる単一化合物で
ある水素供与体）を必須成分として含み、オキシ
ダーゼが残余の成分を含む層よりも上側（支持体
から遠い側）に含有されてなる一体型多層化学分
析要素において、水性液体試料に含まれる酸化還
元性妨害物質による妨害または干渉により生ずる
負誤差等となつて現れる分析精度の劣化を排除し
て分析精度を向上させつつ分析時間を短縮し、同
時に被検物質の測定可能濃度範囲を広げることで
ある。特に水性液体試料として血液（全血、血
漿、血清）を用いる場合には溶血に起因する血液
中の酸化還元性妨害物質である過酸化水素分解活
性を有するカタラーゼやヘモグロビン等の複合蛋
白質等に起因する妨害または干渉を著しく低下ま
たは排除して分析精度を向上させつつ分析時間を
短縮し同時に被検物質の測定可能濃度範囲を広げ
ることである。 ［発明の構成］ 前記の目的は多層分析要素において、オキシダ
ーゼを含む層を残余の成分を含む層と酸素透過性
蛋白質不透過性光遮蔽層との間に設けることによ
り達成される。 本発明は、(1)水不浸透性光透過性支持体の上に
(a)ペルオキシダーゼと過酸化水素との存在下で検
出可能な変化を生ずる過酸化水素指示薬、および
ペルオキシダーゼを含む指示薬層、(b)オキシダー
ゼを含むオキシダーゼ層、(c)酸素透過性蛋白質不
透過性光遮蔽層、および(d)多孔性展開層がこの順
に設けられてなる一体型多層化学分析要素な、ら
びに(2)前記オキシダーゼ層に媒染剤が含有される
一体型多層化学分析要素である。 本発明の一体型多層化学分析要素の特徴点は指
示薬層と酸素透過性蛋白質不透過性光遮蔽層との
間にオキシダーゼを含む層またはオキシダーゼと
媒染剤とを含む層が設けられている点である。 本発明に用いることができる水不浸透性光透過
性支持体としては、特公昭53−21677号、特開昭
55−164356号等の明細書に記載の多層分析要素の
支持体に用いられているものから適宜に選択して
用いることができる。支持体の具体例としては、
酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、ポリ（エ
チレンテレフタレート）、ビスフエノールＡのポ
リカルボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタ
クリレートなどの親水性にとぼしいかまたは疎水
性のポリマーで、約50μｍから約１mm、好ましく
は約80μｍから約400μｍの範囲の厚さの透明なフ
イルムまたはシート、および厚さ約100μｍから
約２mm、好ましくは約150μｍから約１mmの範囲
の透明なガラス板などをあげることができる。支
持体の表面は必要により公知の物理化学的処理
（例、紫外線照射、コロナ放電処理、グロー放電
処理等）を実施して指示薬層等との接着力を高め
るか、あるいは物理化学的処理を施して（また
は、施さずに）親水性ポリマーであるゼラチン等
の下塗り層を設けて指示薬層等との接着力を高め
ることができる。 指示薬層はペルオキシダーゼと過酸化水素との
存在下で検出可能な変化を生ずる過酸化水素指示
薬、およびペルオキシダーゼが親水性の被膜形成
能を有するポイマーバインダーの中に分散または
溶解して含有される層である。過酸化水素指示薬
としては「Annales of Clinical Chemisty」，
６，24−27（1969）、米国特許第3992158号、特公
昭55−25840号、特公昭56−45599号、特公昭58−
18628号、特開昭59−54962号等に記載の水素供与
体（色原体）とフエノールまたはナフトール系カ
プラーとの組合せ、特公昭57−5519号、特開昭59
−193352号等に記載のトリアリールイミダゾール
系ロイコ色素、特公昭56−45599号、特公昭58−
18628号等に記載の単一の化合物でペルオキシダ
ーゼと過酸化水素との存在下で自己カプリング等
により発色または変色する色素前駆体化合物等を
用いることができる。好ましい過酸化水素指示薬
の例として次の化合物がある。 水素供与体（色原体）とカプラーとの組合せ：
［水素供与体］４−アミノアンチピリン、４−
アミノ−２−メチル−３−フエニル−１−（２，
４，６−トリクロロフエニル）−３−ピラゾリ
ン−５−オン等の４−アミノアンチピリンホモ
ログまたは誘導体 ［カプラー］１，７−ジヒドロキシナフタレ
ン、１−ヒドロキシナフタレン−２−スルホン
酸ナトリウム（またはカリウム）等の１−ヒド
ロキシナフタレン誘導体 トリアリールイミダゾール系ロイコ色素：４，５
−ビス［４−（ジメチルアミノ）フエニル］−２
−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフエ
ニル）イミダゾール、４−（ジメチルアミノ）
フエニル−２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジ
メトキシフエニル）−５−フエネチルイミダゾ
ール等 色素前駆体化合物：ジアニシジン、４−メトキシ
−１−ナフトール等 ペルオキシダーゼとしては特公昭56−45599号、
特公昭57−5520号等に記載の植物起源および動物
起源のペルオキシダーゼ（ECI.11.1.7）、特公昭
58−5035号等に記載の微生物起源のペルオキシダ
ーゼ（ECI.11.1.7）を用いることができる。これ
らのうちでは植物起源または微生物起源の非特異
的ペルオキシダーゼが好ましい。好ましいペルオ
キシダーゼの例として西洋わさび、大根から抽出
したペルオキシダーゼ、Cochliobolus属、
Curvularia属の微生物から抽出したペルオキシダ
ーゼ等がある。 指示薬層に用いられる親水性ポリマーバインダ
ーとしては特公昭53−21677号、特公昭56−45599
号、特公昭57−5519号、特開昭55−164356号、特
開昭57−208997号等に記載の多層分析要素の試薬
層の親水性ポリマーバインダーとして用いられて
いる公知の親水性ポリマーから適宜に選択して用
いることができる。親水性ポリマーの例としはゼ
ラチン（例、酸処理ゼラチン、脱イオン化ゼラチ
ン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン、
ヒドロキシメチルアクリレートグラフト化ゼラチ
ン等）、プルラン、プルラン誘導体、アガロース、
ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、
ポリアクリルアミド等がある。これらのうちでは
ゼラチンが一般的でかつ好ましい。 指示薬層の乾燥厚さは約5μｍから約60μｍ、好
ましくは約10μｍから約30μｍの範囲である。ペ
ルオキシダーゼの指示薬層における含有量は約５
千Ｕ／m2から約10万Ｕ／m2、好ましくは約１万
Ｕ／m2から約６万Ｕ／m2の範囲である。過酸化水
素指示薬の指示薬層における含有量は水性液体試
料に含有される被検成分の予想される含有量に応
じて適宜定めることができる。 指示薬層にはペルオキシダーゼの最適PH値また
はその近傍の値に維持するPH緩衝剤、またはペル
オキシダーゼの活性が実質的に阻害されずかつ過
酸化水素指示薬の発色（または変色）反応が速か
に進行する範囲のPH値に維持するPH緩衝剤を含有
させることができる。ペルオキシダーゼの最適PH
値は西洋ワサビ起源のものPH約7.0、
Cochliobolus miyabeanus起源のものPH5.0〜5.3、
Pellicularia filamentosa起源のものPH4.7〜4.9と
いうように起源により異なる。従つて分析条件下
において指示薬層のPH値を約4.0から7.5、好まし
くは約4.5から約7.0の範囲に維持するPH緩衝剤を
指示薬層に含有させることができる。PH緩衝剤と
しては「Biochemistry」、５（２），467−477
（1966），R.M.C.Dawson et al.編「Data for
Biochemical Research」第２版、（Oxford at
the Clarendon Press，1969年発行）476−508
頁、「Analytical Biochemistry」，104，300−
310（1980）、日本化学会編「化学便覧基礎編」（東
京、丸善、1966年発行）1312−1320頁、日本生化
学会編「生化学データブツク」（東京化学同人、
1979年発行）17−24頁、特公昭57−28277号等に
記載の公知のPH緩衝剤から適宜に選択して用いる
ことができる。 指示薬層の上に、直接または中間層（後述）を
介して、オキシダーゼを含むオキシダーゼ層を設
ける。オキシダーゼ層に含有させるオキシダーゼ
は被検物質を酸素（O2）により酸化してH2O2を
生成させるオキシダーゼであればよい。オキシダ
ーゼは被検物質に応じて選択することができる。
本発明において用いることができるオキシダーゼ
具体例として次のもがある。 グルコースオキシダーゼ （EC1.1.3.4；最適PH約5.6） コレステロールオキシダーゼ （EC1.1.3.6；最適PH約5.8） ウリカーゼ （EC1.7.3.3；最適PH約7.5〜8.0） サンコシンオキシダーゼ （EC1.5.3.1；最適PH約7.0〜9.0） ラクテートオキシダーゼ、ピルベートオキシダ
ーゼ、グルタメートオキシダーゼ、グリセロール
オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、等。 この他にも特開昭53−24893号、特公昭56−
45599号、特開昭57−208998号、特開昭59−54962
号等に記載のオキシダーゼまたはオキシダーゼを
含む複数種の酵素の組合せを用いることができ
る。必要に応じてオキシダーゼとともに補因子お
よび／または補酵素を組合せて用いることができ
る。 オキシダーゼ層はオキシダーゼ（必要に応じて
組合せられる補因子および／または補酵素ととも
に）が被膜形成能を有する親水性ポリマーバイン
ダーの中に分散（または溶解）されてなる層であ
る。親水性ポリマーバインダーとしては指示薬層
の親水性ボリマーバインダーとして用いられるポ
リマーの中から選択して用いることができる。代
表的な親水性ポリマーバインダーはゼラチンであ
る。オキシダーゼ層の乾燥厚さは約0.5μｍから約
5μｍ、好ましくは約1μｍから約3μｍの範囲であ
る。オキシダーゼ層におけるオキシダーゼの含有
量はオキシダーゼの種類により異なるが、概して
約１千Ｕ／m2から約10万Ｕ／m2、好ましくは約３
千Ｕ／m2から約５万Ｕ／m2の範囲である。グルコ
ースオキシダーゼの場合には含有量は約２千Ｕ／
m2から約４万Ｕ／m2、好ましくは約４千Ｕ／m2か
ら約３万Ｕ／m2の範囲である。 オキシダーゼ層には含有させるオキシダーゼの
最適PH値またはその近傍のPH値に分析条件下に維
持するPH緩衝剤を含有させることができる。PH緩
衝剤としては前述の諸文献、特許に記載の公知の
PH緩衝剤から選択して用いることができる。指示
薬層とペルオキシダーゼ層のPH値が大きく異なる
場合には少なくとも一方の層に特願昭58−17542
号、特開昭60−10171号等に記載のカルボキシル
基またはスルホン酸基含有酸性ポリマー、または
同特許に記載の塩基性ポリマーをPH緩衝剤として
含有させることができる。 オキシダーゼ層にはカチオン性媒染剤を含有さ
せることができる。オキシダーゼ層にカチオン性
媒染剤を含有させることにより水性液体試料が血
液、ことに溶血血液（全血、血漿または血清）の
場合にカタラーゼ、ことにヘモグロビン等の過酸
化水素分解活性物質による妨害または干渉を著し
く減少させるかまたは実質的に除去することがで
きる。カチオン性媒染剤として特公昭58−18628
号、特開昭54−29700号、特開昭56−19454号、特
開昭53−72622号、特開昭54−138432号等に記載
されている多層分析要素のレジストレーシヨン層
（検出層）またはミグレーシヨン阻止層（拡散防
止層）等に用いられている、あるいはハロゲン化
銀カラー写真材料に用いられている公知のアンモ
ニウム基、ホスホニウム基またはスルホニウム基
含有カチオン性ポリマーを用いることができる。
好ましい媒染剤はアンモニウム基含有カチオン性
ポリマー媒染剤であり、好ましい具体例として、
スチレン／ｐ−［（Ｎ−ベンジル−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアンモニオ）メチル］スチレン／ジビニルベン
ゼン・コポリマー、スチレン／ｐ−［（１−メチル
−１−ピペリジニオ）メチル］スチレン／ジビニ
ルベンゼン・コポリマー（対陰イオンはいずれも
塩素陰イオン等）等がある。媒染剤の含有量は親
水性ポリマーバインダーに対し重量比で約５％か
ら約200％、好ましくは約20％から約100％の範囲
である。オキシダーゼ層にカチオン性媒染剤が含
有される場合にもオキシダーゼ層の乾燥厚さは約
0.5μｍから約5μｍ、好ましくは約1μｍから約3μｍ
の範囲である。 オキシダーゼ層（またはカチオン性媒染剤を含
むオキシダーゼ層）の上に酸素透過性蛋白質不透
過性光遮蔽層（以下、単に光遮蔽層ということが
ある。）が設けられる。酸素透過性蛋白質不透過
性とは、分析条件下に、すなわち水性液体試料の
溶媒である水がこの層に浸透してこの層が浸潤ま
たは膨潤しているときに、この層を空気中の酸素
（O2）は実質的に通過可能であり、一方蛋白質は
実質的に通過不可能であることを意味する。また
ここでいう蛋白質とは分子量約５千以上の通常の
意味での蛋白質であり、特にはヘモグロビン（分
子量約６万５千）に代表されるヘム蛋白質、カタ
ラーゼ（分子量約25万）等の過酸化水素分解活性
を有する複合蛋白質である。酸素透過性蛋白質不
透過性光遮蔽層は光遮蔽性微粉末が少量の被膜形
成能を有する親水性（または弱親水性）ポリマー
バインダーに分散保持されている実質的に非孔性
の層である。光遮蔽層は指示薬層における発色ま
たは変色を光透過性支持体側から反射測光する際
に後述する展開層に点着された水性液体試料の
色、特に全血の場合のヘモグロビンによる赤色等
を遮蔽し同時に光反射層および背景層としても機
能する。 光遮蔽性微粉末の例として、二酸化チタン微粉
末、硫酸バリウム微粉末、カーボンブラツク、ア
ルミニウム微粉末または微小フレーク等があり、
これらのうちで二酸化チタン微粉末、硫酸バリウ
ム微粉末等が好ましい。被膜形成能を有する親水
性（または弱親水性）ポリマーバインダーとして
はゼラチン（例、酸処理ゼラチン、脱イオン化ゼ
ラチン等）、ゼラチン誘導体（例フタル化ゼラチ
ン、ヒドロキシメチルアクリレートグラフト化ゼ
ラチン等）、ホリビニルアルコール、再生セルロ
ース、セルロースアセテート（例、セルロースジ
アセテート）等があり、これらのうちではゼラチ
ン、ゼラチン誘導体等が好ましい。ゼラチン、ゼ
ラチン誘導体は公知の硬化剤（架橋剤）とともに
用いることができる。なお、後述する接着層にこ
れらのポリマーを用いる場合には光遮蔽層のポリ
マーバインダーとしては指示薬層に用いるのと同
様に広範囲の親水性ポリマーから選択して用いる
ことができる。 光遮蔽層における光遮蔽性微粉末とポリマーバ
インダー（乾燥時）との比は、光遮蔽層の酸素透
過性が保たれ、かつ同時に蛋白不透過性が保たれ
る程度に非孔性である（これは多孔性展開層にお
ける展開作用（メータリング作用とも称される）
が現れる平均孔サイズよりも小さく、展開作用ま
たはメータリング作用を有しない程度の微孔性を
も包含する。）範囲で用いることができる。これ
は具体的には体積比で光遮蔽性微粉末10に対しポ
リマーバインダー（乾燥体積）約2.5から約7.5、
好ましくは約3.0から約6.5の範囲である。光遮蔽
性微粉末が二酸化チタン微粉末の場合には重量比
で二酸化チタン微粉末10に対しポリマーバインダ
ー（乾燥重量）約0.6から約1.8、好ましくは約0.8
から約1.5の範囲である。光遮蔽層の乾燥厚さは
約3μｍから約30μｍ、好ましくは約5μｍから約
20μｍの範囲である。 指示薬層とオキシターゼ層との間、オキシダー
ゼ層と光遮蔽層との間には必要に応じて中間層を
設けることができる。中間層としては指示薬に用
いるのと同様な被膜形成能を有する親水性ポリマ
ーを用いることができる。中間層の厚さは約0.2μ
ｍから約10μｍ、好ましくは約0.5μｍから約7μｍ
の範囲である。光遮蔽層と後述する多孔性展開層
との間には必要に応じて接着層を設けることがで
きる。接着層としては指示薬層に用いるのと同様
な被膜形成能を有し、水で湿潤しているとき、ま
たは水を含んで膨潤しているときに多孔性展開層
を接着し一体化できる親水性ポリマーを用いるこ
とができる。接着層の厚さは約0.5μｍから約20μ
ｍ、好ましくは約1μｍから約10μｍの範囲であ
る。中間層および接着層に用いられる代表的で好
ましい親水性ポリマーはゼラチン、ゼラチン誘導
体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール
等がある。 指示薬層、オキシダーゼ層またはカチオン性媒
染剤含有オキシダーゼ層、光遮蔽層、中間層、接
着層には必要に応じて界面活性剤を含有させるこ
とができる。界面活性剤としてはノニオン界面活
性剤、とくにオキシエチレンまたはオキシプロピ
レン基が８〜15個連なつた鎖状構造を含むノニオ
ン界面活性剤が好ましい。これらの層にはこの他
に必要に応じて硬化剤（架橋剤）、柔軟化剤また
は可塑剤等の公知の添加剤を含有させることがで
きる。 光遮蔽層の上に、直接または接着層を介して、
多孔性展開層または定面積多孔性層（パツチ）が
設けられる。多孔性展開層（以下、単に展開層と
もいう。）としては特公昭53−21677号（米国特許
3992158号に対応）、特開昭55−90859号（米国特
許4258001号に対応）、特開昭58−123458号等に記
載の非繊維等方的多孔性媒体層、特開昭55−
164356号、特開昭57−66359号等に記載の織物展
開層、特開昭57−148250号に記載のポリオレフイ
ンポリマーフイラメントパルプを含む紙からなる
層などを用いることができる。定面積多孔性層と
しては実開昭57−42951号等に記載の多孔性素材
がある。これらのうちでは展開層が好ましく、ま
た展開層としてはメンブランフイルター層（ブラ
ツシユポリマー層）、ポリマービーズを水で膨潤
しないポリマー接着剤で点接触状に接着してなる
三次元格子粒状構造物層、織物展開層が好まし
い。展開層、定面積多孔性層は前述の諸特許等に
記載の方法に従つて設けることができる。 多孔性展開層には必要に応じて界面活性剤、好
ましくは前述のノニオン界面活性剤を含有させる
ことができる。さらに多孔性展開層には特公昭55
−45599号に記載のごとくコレステロールエステ
ラーゼ等の酵素を含む試薬の一部を含有させるこ
とができる。また、多孔性展開層にも光遮蔽性微
粉末を分散含有させることができる。 前述の諸層を積層一体化して調製された一体型
多層化学分析要素は適宜なサイズに裁断され、特
開昭54−156079号、実開昭56−142454号、特開昭
57−63452号、特表昭58−501144号、実開昭58−
32350号等に記載のスライド枠に収容して分析ス
ライドとして用いるのが便利である。この他に多
層分析要素は長テープ状や裁断片をアパーチユア
カード等に貼付またははめこんで用いることもで
きる。 本発明の多層分析要素を用いて前述の諸特許、
および「Clinical Chemistry」、27（８），1335−
1342（1979）等に記載の方法により主として比色
分析法の原理により水性液体試料中の被検物質の
定量分析を実施できる。 以下の実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ ゼラチン下塗りが施されている厚さ180μｍの
無色透明ポリエチレンテレフタレート（PET）
平滑フイルムの上に下記組成の指示薬層を乾燥層
厚が約15μｍになるようにして水溶液を用いて塗
布し乾燥して設けた。 ペルオキシダーゼ 25000IU １，７−ジヒドロキシンフタレン ５ｇ ４−アミノアンチピリン ５ｇ ゼラチン 200ｇ ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル２ｇ 指示薬層の上に下記組成のグルコースオキシダ
ーゼ層を乾燥層厚が約2μｍになるようにして水
溶液を用いて塗布し乾燥して設けた。 ゼラチン 4.6ｇ グルコースオキシダーゼ 4000IU ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル
0.1ｇ グルコースオキシダーゼ層の上に下記組成の酸
素透過性蛋白質不透過性光遮蔽層を乾燥厚さが約
7μｍになるようにして水分散液を用いて塗布し
乾燥して設けた。 二酸化チタン微粉末 100ｇ ゼラチン 10ｇ 光遮蔽層の上に下記組成の接着層を乾燥層厚が
約2μｍになるようにして水溶液を塗布し乾燥し
て設けた。 ゼラチン 10ｇ ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル
0.1ｇ 次に接着層に約30ｇ／m2の割合で水を全面に供
給して湿潤させたのち、綿100％のブロード織物
（100双ブロード）を軽く圧力をかけてラミネート
し、乾燥させグルコース定量用一体型多層化学分
析要素を調製した。 比較例 １ グルコースオキシダーゼ層を設けず、かわりに
指示薬層の上に下記組成のグルコースオキシダー
ゼ含有光遮蔽層を乾燥厚が約7μｍになるように
して水分散液を塗布し乾燥させて設けた他は実施
例１と同様にしてグルコース定量用化学分析スラ
イド（比較スライド１）を調製した。 二酸化チタン微粉末 10ｇ ゼラチン １ｇ グルコースオキシダーゼ 2000IU このようにして調製した２種の化学分析スライ
ド各々に、水性液体試料として、グルコース濃度
は同一でヘモグロビン濃度は第１表に示したとお
り５レベルに変化させたヒト血漿を8μ点着し、
37℃で６分インキベーシヨンし直ちに発色光学濃
度をPETフイルム側から反射測光した（測定中
心波長500nｍ）。測光結果を第１表に示す。
くは水性液体試料、特に生物液体、例えば血液、
りんぱ液、髄液、尿等に含まれる成分の定量分析
において過酸化水素を生成するオキシダーゼ酵素
反応形を利用する場合に特に効果的な一体型多層
化学分析要素（一体型多層分析要素、一体型多層
分析素子、多層分析フイルムなどとも称される）
に関するものである。 ［従来技術］ オキシダーゼを用い被検物質またはその反応生
成物を酸化すると同時に生成されるH2O2をペル
オキシダーゼを用いて色素の生成反応に導き、比
色的に色素を定量する原理に基づく被検物質の定
量分析のための乾式分析器具としてフイルム状ま
たはシート状の一体型多層化学分析要素（以下、
多層分析要素ということがある。）が提案または
実用化されている。オキシダーゼとペルオキシダ
ーゼを用いて色素の生成反応に導く試薬としては
P.Trinderが「Annales of Clinical
Biochemistry」，６，24−27（1969）において提
案した試薬系およびその改良試薬系がよく知られ
ており、改良試薬系が多層分析要素に組こまれて
いる。Trinder試薬の改良系はオキシダーゼ、ペ
ルオキシダーゼ、水素供与体（色原体）として４
−アミノアンチピリンまたは４−アミノ−２−メ
チル−３−フエニル−１−（２，４，６，−トリク
ロロフエニル）−３−ピラゾリン−５−オン等の
４−アミノアンチピリンホモログまたは誘導体、
およびカプラーとして１，７−ジヒドロキシナフ
タレン、１−ヒドロキシナフタレン−２−スルホ
ン酸ナトリウム等のヒドロキシナフタレン類を含
む呈色試薬系である。Trinderにより提案された
試薬系およびその改良試薬系（以下、両者を含め
て単にTrinder試薬系という。）の利点はオキシ
ダーゼの種類をかえても残余の成分は同じままで
呈色試薬系として用いることができる点にある。
オキシダーゼとしてはグルコースオキシダーゼ、
コレステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、グリ
セロールオキシダーゼ等を用いうることが知られ
ている。またオキシダーゼとペルオキシダーゼを
含む呈色試薬系において、ジアニシジンまたは
４，５−ビス［４−（ジメチルアミノ）フエニル］
−２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフ
エニル）イミダゾール等の無色の水素供与体であ
るロイコ色素を水素供与体（色原体）とカプラー
の組合せのかわりに用いることも知られている
（米国特許第3992158号、特公昭56−45599号、特
公昭55−25840号、特公昭57−5519号等の明細書
参照）。 Trinder試薬系を含む多層分析要素において
は、水性液体中の被検物質が、水性液体中に溶解
した状態で試薬層に到達し、そこでオキシダーゼ
の触媒作用を受けて空気中の酸素（O2）と反応
してH2O2を生成し、ついでペルオキシダーゼの
触媒作用を受けて酸化カプリング反応（酸化的呈
色反応）が進み発色（または変色）が発現すると
考えられる。このようにTrinder試薬系を含む多
層分析要素においては空気中の酸素が一連の共役
反応の一反応に必須であるので、オキシダーゼを
Trinder試薬系の残余の成分を含む層よりも上側
（支持体から遠い側）に含ませて呈色反応の進行
を早め、同時に分析精度を向上させる提案がなさ
れている（特開昭57−208997号）。オキシダーゼ
をTrinder試薬系の残余の成分を含む層よりも上
側に含有させることは、特開昭55−164356号等に
記載のTrinder試薬系を含む試薬層の上に非孔性
光遮蔽層、多孔性展開層をこの順に設けてなる多
層分析要素において呈色反応の進行を早め、分析
精度を向上させるという効果が顕著であつた。 しかしながら、オキシダーゼをTrinder試薬系
の残余の成分を含む層よりも上側に含有させた多
層分析要素は多孔性展開層に点着された水性液体
試料に含まれる酸化還元性妨害物質による妨害ま
たは干渉を受け分析精度が損われるという問題点
を有することが明らかになつた。ここにいう酸化
還元性妨害物質とは、水性液体試料が生物体液の
場合、カタラーゼ、ヘモグロビン等の過酸化水素
分解活性（本明細書において過酸化水素分解活性
とはカタラーゼ活性、ペルオキシダーゼ活性のい
ずれか一方または両方を意味する。）を有する物
質、アスコルビン酸等を意味し、また前述の問題
点は水性液体試料として全血、溶血全血、血漿、
血清を用いる場合に顕著に現われることが判明し
た。 ［発明の目的］ 本発明の目的は、オキシダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、水素供与体（色原体）、およびカプラー
（または水性供与体とカプラーの組合せのかわり
に酸化により発色または変色しうる単一化合物で
ある水素供与体）を必須成分として含み、オキシ
ダーゼが残余の成分を含む層よりも上側（支持体
から遠い側）に含有されてなる一体型多層化学分
析要素において、水性液体試料に含まれる酸化還
元性妨害物質による妨害または干渉により生ずる
負誤差等となつて現れる分析精度の劣化を排除し
て分析精度を向上させつつ分析時間を短縮し、同
時に被検物質の測定可能濃度範囲を広げることで
ある。特に水性液体試料として血液（全血、血
漿、血清）を用いる場合には溶血に起因する血液
中の酸化還元性妨害物質である過酸化水素分解活
性を有するカタラーゼやヘモグロビン等の複合蛋
白質等に起因する妨害または干渉を著しく低下ま
たは排除して分析精度を向上させつつ分析時間を
短縮し同時に被検物質の測定可能濃度範囲を広げ
ることである。 ［発明の構成］ 前記の目的は多層分析要素において、オキシダ
ーゼを含む層を残余の成分を含む層と酸素透過性
蛋白質不透過性光遮蔽層との間に設けることによ
り達成される。 本発明は、(1)水不浸透性光透過性支持体の上に
(a)ペルオキシダーゼと過酸化水素との存在下で検
出可能な変化を生ずる過酸化水素指示薬、および
ペルオキシダーゼを含む指示薬層、(b)オキシダー
ゼを含むオキシダーゼ層、(c)酸素透過性蛋白質不
透過性光遮蔽層、および(d)多孔性展開層がこの順
に設けられてなる一体型多層化学分析要素な、ら
びに(2)前記オキシダーゼ層に媒染剤が含有される
一体型多層化学分析要素である。 本発明の一体型多層化学分析要素の特徴点は指
示薬層と酸素透過性蛋白質不透過性光遮蔽層との
間にオキシダーゼを含む層またはオキシダーゼと
媒染剤とを含む層が設けられている点である。 本発明に用いることができる水不浸透性光透過
性支持体としては、特公昭53−21677号、特開昭
55−164356号等の明細書に記載の多層分析要素の
支持体に用いられているものから適宜に選択して
用いることができる。支持体の具体例としては、
酢酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、ポリ（エ
チレンテレフタレート）、ビスフエノールＡのポ
リカルボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタ
クリレートなどの親水性にとぼしいかまたは疎水
性のポリマーで、約50μｍから約１mm、好ましく
は約80μｍから約400μｍの範囲の厚さの透明なフ
イルムまたはシート、および厚さ約100μｍから
約２mm、好ましくは約150μｍから約１mmの範囲
の透明なガラス板などをあげることができる。支
持体の表面は必要により公知の物理化学的処理
（例、紫外線照射、コロナ放電処理、グロー放電
処理等）を実施して指示薬層等との接着力を高め
るか、あるいは物理化学的処理を施して（また
は、施さずに）親水性ポリマーであるゼラチン等
の下塗り層を設けて指示薬層等との接着力を高め
ることができる。 指示薬層はペルオキシダーゼと過酸化水素との
存在下で検出可能な変化を生ずる過酸化水素指示
薬、およびペルオキシダーゼが親水性の被膜形成
能を有するポイマーバインダーの中に分散または
溶解して含有される層である。過酸化水素指示薬
としては「Annales of Clinical Chemisty」，
６，24−27（1969）、米国特許第3992158号、特公
昭55−25840号、特公昭56−45599号、特公昭58−
18628号、特開昭59−54962号等に記載の水素供与
体（色原体）とフエノールまたはナフトール系カ
プラーとの組合せ、特公昭57−5519号、特開昭59
−193352号等に記載のトリアリールイミダゾール
系ロイコ色素、特公昭56−45599号、特公昭58−
18628号等に記載の単一の化合物でペルオキシダ
ーゼと過酸化水素との存在下で自己カプリング等
により発色または変色する色素前駆体化合物等を
用いることができる。好ましい過酸化水素指示薬
の例として次の化合物がある。 水素供与体（色原体）とカプラーとの組合せ：
［水素供与体］４−アミノアンチピリン、４−
アミノ−２−メチル−３−フエニル−１−（２，
４，６−トリクロロフエニル）−３−ピラゾリ
ン−５−オン等の４−アミノアンチピリンホモ
ログまたは誘導体 ［カプラー］１，７−ジヒドロキシナフタレ
ン、１−ヒドロキシナフタレン−２−スルホン
酸ナトリウム（またはカリウム）等の１−ヒド
ロキシナフタレン誘導体 トリアリールイミダゾール系ロイコ色素：４，５
−ビス［４−（ジメチルアミノ）フエニル］−２
−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフエ
ニル）イミダゾール、４−（ジメチルアミノ）
フエニル−２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジ
メトキシフエニル）−５−フエネチルイミダゾ
ール等 色素前駆体化合物：ジアニシジン、４−メトキシ
−１−ナフトール等 ペルオキシダーゼとしては特公昭56−45599号、
特公昭57−5520号等に記載の植物起源および動物
起源のペルオキシダーゼ（ECI.11.1.7）、特公昭
58−5035号等に記載の微生物起源のペルオキシダ
ーゼ（ECI.11.1.7）を用いることができる。これ
らのうちでは植物起源または微生物起源の非特異
的ペルオキシダーゼが好ましい。好ましいペルオ
キシダーゼの例として西洋わさび、大根から抽出
したペルオキシダーゼ、Cochliobolus属、
Curvularia属の微生物から抽出したペルオキシダ
ーゼ等がある。 指示薬層に用いられる親水性ポリマーバインダ
ーとしては特公昭53−21677号、特公昭56−45599
号、特公昭57−5519号、特開昭55−164356号、特
開昭57−208997号等に記載の多層分析要素の試薬
層の親水性ポリマーバインダーとして用いられて
いる公知の親水性ポリマーから適宜に選択して用
いることができる。親水性ポリマーの例としはゼ
ラチン（例、酸処理ゼラチン、脱イオン化ゼラチ
ン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化ゼラチン、
ヒドロキシメチルアクリレートグラフト化ゼラチ
ン等）、プルラン、プルラン誘導体、アガロース、
ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、
ポリアクリルアミド等がある。これらのうちでは
ゼラチンが一般的でかつ好ましい。 指示薬層の乾燥厚さは約5μｍから約60μｍ、好
ましくは約10μｍから約30μｍの範囲である。ペ
ルオキシダーゼの指示薬層における含有量は約５
千Ｕ／m2から約10万Ｕ／m2、好ましくは約１万
Ｕ／m2から約６万Ｕ／m2の範囲である。過酸化水
素指示薬の指示薬層における含有量は水性液体試
料に含有される被検成分の予想される含有量に応
じて適宜定めることができる。 指示薬層にはペルオキシダーゼの最適PH値また
はその近傍の値に維持するPH緩衝剤、またはペル
オキシダーゼの活性が実質的に阻害されずかつ過
酸化水素指示薬の発色（または変色）反応が速か
に進行する範囲のPH値に維持するPH緩衝剤を含有
させることができる。ペルオキシダーゼの最適PH
値は西洋ワサビ起源のものPH約7.0、
Cochliobolus miyabeanus起源のものPH5.0〜5.3、
Pellicularia filamentosa起源のものPH4.7〜4.9と
いうように起源により異なる。従つて分析条件下
において指示薬層のPH値を約4.0から7.5、好まし
くは約4.5から約7.0の範囲に維持するPH緩衝剤を
指示薬層に含有させることができる。PH緩衝剤と
しては「Biochemistry」、５（２），467−477
（1966），R.M.C.Dawson et al.編「Data for
Biochemical Research」第２版、（Oxford at
the Clarendon Press，1969年発行）476−508
頁、「Analytical Biochemistry」，104，300−
310（1980）、日本化学会編「化学便覧基礎編」（東
京、丸善、1966年発行）1312−1320頁、日本生化
学会編「生化学データブツク」（東京化学同人、
1979年発行）17−24頁、特公昭57−28277号等に
記載の公知のPH緩衝剤から適宜に選択して用いる
ことができる。 指示薬層の上に、直接または中間層（後述）を
介して、オキシダーゼを含むオキシダーゼ層を設
ける。オキシダーゼ層に含有させるオキシダーゼ
は被検物質を酸素（O2）により酸化してH2O2を
生成させるオキシダーゼであればよい。オキシダ
ーゼは被検物質に応じて選択することができる。
本発明において用いることができるオキシダーゼ
具体例として次のもがある。 グルコースオキシダーゼ （EC1.1.3.4；最適PH約5.6） コレステロールオキシダーゼ （EC1.1.3.6；最適PH約5.8） ウリカーゼ （EC1.7.3.3；最適PH約7.5〜8.0） サンコシンオキシダーゼ （EC1.5.3.1；最適PH約7.0〜9.0） ラクテートオキシダーゼ、ピルベートオキシダ
ーゼ、グルタメートオキシダーゼ、グリセロール
オキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、等。 この他にも特開昭53−24893号、特公昭56−
45599号、特開昭57−208998号、特開昭59−54962
号等に記載のオキシダーゼまたはオキシダーゼを
含む複数種の酵素の組合せを用いることができ
る。必要に応じてオキシダーゼとともに補因子お
よび／または補酵素を組合せて用いることができ
る。 オキシダーゼ層はオキシダーゼ（必要に応じて
組合せられる補因子および／または補酵素ととも
に）が被膜形成能を有する親水性ポリマーバイン
ダーの中に分散（または溶解）されてなる層であ
る。親水性ポリマーバインダーとしては指示薬層
の親水性ボリマーバインダーとして用いられるポ
リマーの中から選択して用いることができる。代
表的な親水性ポリマーバインダーはゼラチンであ
る。オキシダーゼ層の乾燥厚さは約0.5μｍから約
5μｍ、好ましくは約1μｍから約3μｍの範囲であ
る。オキシダーゼ層におけるオキシダーゼの含有
量はオキシダーゼの種類により異なるが、概して
約１千Ｕ／m2から約10万Ｕ／m2、好ましくは約３
千Ｕ／m2から約５万Ｕ／m2の範囲である。グルコ
ースオキシダーゼの場合には含有量は約２千Ｕ／
m2から約４万Ｕ／m2、好ましくは約４千Ｕ／m2か
ら約３万Ｕ／m2の範囲である。 オキシダーゼ層には含有させるオキシダーゼの
最適PH値またはその近傍のPH値に分析条件下に維
持するPH緩衝剤を含有させることができる。PH緩
衝剤としては前述の諸文献、特許に記載の公知の
PH緩衝剤から選択して用いることができる。指示
薬層とペルオキシダーゼ層のPH値が大きく異なる
場合には少なくとも一方の層に特願昭58−17542
号、特開昭60−10171号等に記載のカルボキシル
基またはスルホン酸基含有酸性ポリマー、または
同特許に記載の塩基性ポリマーをPH緩衝剤として
含有させることができる。 オキシダーゼ層にはカチオン性媒染剤を含有さ
せることができる。オキシダーゼ層にカチオン性
媒染剤を含有させることにより水性液体試料が血
液、ことに溶血血液（全血、血漿または血清）の
場合にカタラーゼ、ことにヘモグロビン等の過酸
化水素分解活性物質による妨害または干渉を著し
く減少させるかまたは実質的に除去することがで
きる。カチオン性媒染剤として特公昭58−18628
号、特開昭54−29700号、特開昭56−19454号、特
開昭53−72622号、特開昭54−138432号等に記載
されている多層分析要素のレジストレーシヨン層
（検出層）またはミグレーシヨン阻止層（拡散防
止層）等に用いられている、あるいはハロゲン化
銀カラー写真材料に用いられている公知のアンモ
ニウム基、ホスホニウム基またはスルホニウム基
含有カチオン性ポリマーを用いることができる。
好ましい媒染剤はアンモニウム基含有カチオン性
ポリマー媒染剤であり、好ましい具体例として、
スチレン／ｐ−［（Ｎ−ベンジル−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアンモニオ）メチル］スチレン／ジビニルベン
ゼン・コポリマー、スチレン／ｐ−［（１−メチル
−１−ピペリジニオ）メチル］スチレン／ジビニ
ルベンゼン・コポリマー（対陰イオンはいずれも
塩素陰イオン等）等がある。媒染剤の含有量は親
水性ポリマーバインダーに対し重量比で約５％か
ら約200％、好ましくは約20％から約100％の範囲
である。オキシダーゼ層にカチオン性媒染剤が含
有される場合にもオキシダーゼ層の乾燥厚さは約
0.5μｍから約5μｍ、好ましくは約1μｍから約3μｍ
の範囲である。 オキシダーゼ層（またはカチオン性媒染剤を含
むオキシダーゼ層）の上に酸素透過性蛋白質不透
過性光遮蔽層（以下、単に光遮蔽層ということが
ある。）が設けられる。酸素透過性蛋白質不透過
性とは、分析条件下に、すなわち水性液体試料の
溶媒である水がこの層に浸透してこの層が浸潤ま
たは膨潤しているときに、この層を空気中の酸素
（O2）は実質的に通過可能であり、一方蛋白質は
実質的に通過不可能であることを意味する。また
ここでいう蛋白質とは分子量約５千以上の通常の
意味での蛋白質であり、特にはヘモグロビン（分
子量約６万５千）に代表されるヘム蛋白質、カタ
ラーゼ（分子量約25万）等の過酸化水素分解活性
を有する複合蛋白質である。酸素透過性蛋白質不
透過性光遮蔽層は光遮蔽性微粉末が少量の被膜形
成能を有する親水性（または弱親水性）ポリマー
バインダーに分散保持されている実質的に非孔性
の層である。光遮蔽層は指示薬層における発色ま
たは変色を光透過性支持体側から反射測光する際
に後述する展開層に点着された水性液体試料の
色、特に全血の場合のヘモグロビンによる赤色等
を遮蔽し同時に光反射層および背景層としても機
能する。 光遮蔽性微粉末の例として、二酸化チタン微粉
末、硫酸バリウム微粉末、カーボンブラツク、ア
ルミニウム微粉末または微小フレーク等があり、
これらのうちで二酸化チタン微粉末、硫酸バリウ
ム微粉末等が好ましい。被膜形成能を有する親水
性（または弱親水性）ポリマーバインダーとして
はゼラチン（例、酸処理ゼラチン、脱イオン化ゼ
ラチン等）、ゼラチン誘導体（例フタル化ゼラチ
ン、ヒドロキシメチルアクリレートグラフト化ゼ
ラチン等）、ホリビニルアルコール、再生セルロ
ース、セルロースアセテート（例、セルロースジ
アセテート）等があり、これらのうちではゼラチ
ン、ゼラチン誘導体等が好ましい。ゼラチン、ゼ
ラチン誘導体は公知の硬化剤（架橋剤）とともに
用いることができる。なお、後述する接着層にこ
れらのポリマーを用いる場合には光遮蔽層のポリ
マーバインダーとしては指示薬層に用いるのと同
様に広範囲の親水性ポリマーから選択して用いる
ことができる。 光遮蔽層における光遮蔽性微粉末とポリマーバ
インダー（乾燥時）との比は、光遮蔽層の酸素透
過性が保たれ、かつ同時に蛋白不透過性が保たれ
る程度に非孔性である（これは多孔性展開層にお
ける展開作用（メータリング作用とも称される）
が現れる平均孔サイズよりも小さく、展開作用ま
たはメータリング作用を有しない程度の微孔性を
も包含する。）範囲で用いることができる。これ
は具体的には体積比で光遮蔽性微粉末10に対しポ
リマーバインダー（乾燥体積）約2.5から約7.5、
好ましくは約3.0から約6.5の範囲である。光遮蔽
性微粉末が二酸化チタン微粉末の場合には重量比
で二酸化チタン微粉末10に対しポリマーバインダ
ー（乾燥重量）約0.6から約1.8、好ましくは約0.8
から約1.5の範囲である。光遮蔽層の乾燥厚さは
約3μｍから約30μｍ、好ましくは約5μｍから約
20μｍの範囲である。 指示薬層とオキシターゼ層との間、オキシダー
ゼ層と光遮蔽層との間には必要に応じて中間層を
設けることができる。中間層としては指示薬に用
いるのと同様な被膜形成能を有する親水性ポリマ
ーを用いることができる。中間層の厚さは約0.2μ
ｍから約10μｍ、好ましくは約0.5μｍから約7μｍ
の範囲である。光遮蔽層と後述する多孔性展開層
との間には必要に応じて接着層を設けることがで
きる。接着層としては指示薬層に用いるのと同様
な被膜形成能を有し、水で湿潤しているとき、ま
たは水を含んで膨潤しているときに多孔性展開層
を接着し一体化できる親水性ポリマーを用いるこ
とができる。接着層の厚さは約0.5μｍから約20μ
ｍ、好ましくは約1μｍから約10μｍの範囲であ
る。中間層および接着層に用いられる代表的で好
ましい親水性ポリマーはゼラチン、ゼラチン誘導
体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール
等がある。 指示薬層、オキシダーゼ層またはカチオン性媒
染剤含有オキシダーゼ層、光遮蔽層、中間層、接
着層には必要に応じて界面活性剤を含有させるこ
とができる。界面活性剤としてはノニオン界面活
性剤、とくにオキシエチレンまたはオキシプロピ
レン基が８〜15個連なつた鎖状構造を含むノニオ
ン界面活性剤が好ましい。これらの層にはこの他
に必要に応じて硬化剤（架橋剤）、柔軟化剤また
は可塑剤等の公知の添加剤を含有させることがで
きる。 光遮蔽層の上に、直接または接着層を介して、
多孔性展開層または定面積多孔性層（パツチ）が
設けられる。多孔性展開層（以下、単に展開層と
もいう。）としては特公昭53−21677号（米国特許
3992158号に対応）、特開昭55−90859号（米国特
許4258001号に対応）、特開昭58−123458号等に記
載の非繊維等方的多孔性媒体層、特開昭55−
164356号、特開昭57−66359号等に記載の織物展
開層、特開昭57−148250号に記載のポリオレフイ
ンポリマーフイラメントパルプを含む紙からなる
層などを用いることができる。定面積多孔性層と
しては実開昭57−42951号等に記載の多孔性素材
がある。これらのうちでは展開層が好ましく、ま
た展開層としてはメンブランフイルター層（ブラ
ツシユポリマー層）、ポリマービーズを水で膨潤
しないポリマー接着剤で点接触状に接着してなる
三次元格子粒状構造物層、織物展開層が好まし
い。展開層、定面積多孔性層は前述の諸特許等に
記載の方法に従つて設けることができる。 多孔性展開層には必要に応じて界面活性剤、好
ましくは前述のノニオン界面活性剤を含有させる
ことができる。さらに多孔性展開層には特公昭55
−45599号に記載のごとくコレステロールエステ
ラーゼ等の酵素を含む試薬の一部を含有させるこ
とができる。また、多孔性展開層にも光遮蔽性微
粉末を分散含有させることができる。 前述の諸層を積層一体化して調製された一体型
多層化学分析要素は適宜なサイズに裁断され、特
開昭54−156079号、実開昭56−142454号、特開昭
57−63452号、特表昭58−501144号、実開昭58−
32350号等に記載のスライド枠に収容して分析ス
ライドとして用いるのが便利である。この他に多
層分析要素は長テープ状や裁断片をアパーチユア
カード等に貼付またははめこんで用いることもで
きる。 本発明の多層分析要素を用いて前述の諸特許、
および「Clinical Chemistry」、27（８），1335−
1342（1979）等に記載の方法により主として比色
分析法の原理により水性液体試料中の被検物質の
定量分析を実施できる。 以下の実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ ゼラチン下塗りが施されている厚さ180μｍの
無色透明ポリエチレンテレフタレート（PET）
平滑フイルムの上に下記組成の指示薬層を乾燥層
厚が約15μｍになるようにして水溶液を用いて塗
布し乾燥して設けた。 ペルオキシダーゼ 25000IU １，７−ジヒドロキシンフタレン ５ｇ ４−アミノアンチピリン ５ｇ ゼラチン 200ｇ ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル２ｇ 指示薬層の上に下記組成のグルコースオキシダ
ーゼ層を乾燥層厚が約2μｍになるようにして水
溶液を用いて塗布し乾燥して設けた。 ゼラチン 4.6ｇ グルコースオキシダーゼ 4000IU ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル
0.1ｇ グルコースオキシダーゼ層の上に下記組成の酸
素透過性蛋白質不透過性光遮蔽層を乾燥厚さが約
7μｍになるようにして水分散液を用いて塗布し
乾燥して設けた。 二酸化チタン微粉末 100ｇ ゼラチン 10ｇ 光遮蔽層の上に下記組成の接着層を乾燥層厚が
約2μｍになるようにして水溶液を塗布し乾燥し
て設けた。 ゼラチン 10ｇ ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル
0.1ｇ 次に接着層に約30ｇ／m2の割合で水を全面に供
給して湿潤させたのち、綿100％のブロード織物
（100双ブロード）を軽く圧力をかけてラミネート
し、乾燥させグルコース定量用一体型多層化学分
析要素を調製した。 比較例 １ グルコースオキシダーゼ層を設けず、かわりに
指示薬層の上に下記組成のグルコースオキシダー
ゼ含有光遮蔽層を乾燥厚が約7μｍになるように
して水分散液を塗布し乾燥させて設けた他は実施
例１と同様にしてグルコース定量用化学分析スラ
イド（比較スライド１）を調製した。 二酸化チタン微粉末 10ｇ ゼラチン １ｇ グルコースオキシダーゼ 2000IU このようにして調製した２種の化学分析スライ
ド各々に、水性液体試料として、グルコース濃度
は同一でヘモグロビン濃度は第１表に示したとお
り５レベルに変化させたヒト血漿を8μ点着し、
37℃で６分インキベーシヨンし直ちに発色光学濃
度をPETフイルム側から反射測光した（測定中
心波長500nｍ）。測光結果を第１表に示す。
【表】
【表】
第１表に示した結果から、比較スライド１では
ヘモグロビン濃度ゼロにおいてすでに本発明の化
学分析スライドに比して発色光学濃度値が小さ
く、さらにヘモグロビン濃度が増大するにつれて
ヘモグロビンの過酸化水素分解活性に起因する干
渉（妨害）により発色光学濃度値が著しく低下す
る負誤差が顕著に現れている。一方、本発明の化
学分析スライドではヘモグロビンの存在による干
渉（妨害）は著しく少なく質実的にないといえる
ほどであり、かつヘモグロビンの有無にかかわり
なく大きな発色光学濃度値が得られている。 比較例 ２ グルコースオキシダーゼ層を設けず、かわりに
下記組成の指示薬層を乾燥厚さが約15μｍになる
ようにして水溶液を用いて塗布し乾燥して設けた
他は実施例１と同様にしてグルコース定量用スラ
イド（比較スライド２）を調製した。 グルコースオキシダーゼ 2500IU ペルオキシダーゼ 2500IU １，７−ジヒドロキシナフタレン 0.5ｇ ４−アミノアンチピリン 0.5ｇ ゼラチン 20ｇ ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル
0.2ｇ 比較スライド２の指示薬層には単位面積当り、
実施例１の本発明のグルコース分析スライドのグ
ルコースオキシダーゼ層に含有されるのとほぼ同
じ活性値割合のグルコースオキシダーゼが含まれ
ている。実施例１のグルコース分析スライドと比
較スライド２の各々にグルコース濃度86mg／dl
のヒト血漿およびグルコースを添加して第２表に
示したとおり５レベルにグルコース濃度を変化さ
せたヒト血漿をいずれも8μ点着し、37℃で６
分インクベーシヨンし、直ちに発色光学濃度を
PETフイルム側から反射測光した（測定中心波
長500nｍ）。測光結果を第２表に示す。
ヘモグロビン濃度ゼロにおいてすでに本発明の化
学分析スライドに比して発色光学濃度値が小さ
く、さらにヘモグロビン濃度が増大するにつれて
ヘモグロビンの過酸化水素分解活性に起因する干
渉（妨害）により発色光学濃度値が著しく低下す
る負誤差が顕著に現れている。一方、本発明の化
学分析スライドではヘモグロビンの存在による干
渉（妨害）は著しく少なく質実的にないといえる
ほどであり、かつヘモグロビンの有無にかかわり
なく大きな発色光学濃度値が得られている。 比較例 ２ グルコースオキシダーゼ層を設けず、かわりに
下記組成の指示薬層を乾燥厚さが約15μｍになる
ようにして水溶液を用いて塗布し乾燥して設けた
他は実施例１と同様にしてグルコース定量用スラ
イド（比較スライド２）を調製した。 グルコースオキシダーゼ 2500IU ペルオキシダーゼ 2500IU １，７−ジヒドロキシナフタレン 0.5ｇ ４−アミノアンチピリン 0.5ｇ ゼラチン 20ｇ ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル
0.2ｇ 比較スライド２の指示薬層には単位面積当り、
実施例１の本発明のグルコース分析スライドのグ
ルコースオキシダーゼ層に含有されるのとほぼ同
じ活性値割合のグルコースオキシダーゼが含まれ
ている。実施例１のグルコース分析スライドと比
較スライド２の各々にグルコース濃度86mg／dl
のヒト血漿およびグルコースを添加して第２表に
示したとおり５レベルにグルコース濃度を変化さ
せたヒト血漿をいずれも8μ点着し、37℃で６
分インクベーシヨンし、直ちに発色光学濃度を
PETフイルム側から反射測光した（測定中心波
長500nｍ）。測光結果を第２表に示す。
【表】
第２表に示した結果から、比較スライド２では
グルコース濃度測定可能範囲の上限が468mg／dl
またはそれ未満であり、かつ発色光学濃度値が小
さいのに対し、本発明の化学分析スライドではグ
ルコース濃度測定可能範囲の上限が少なくとも
699mg／dlにおよんでおり、かつ発色光学値が大
きく検量線の傾きも大きいので分析精度が高いこ
とがわかる。またこの結果から本発明の化学分析
スライドのグルコース濃度測定可能範囲は比較ス
ライド２のそれの約1.5以上に及んでいることも
明らかである。 実施例 ２ 下記組成のカチオン性ポリマー媒染剤を含むグ
ルコースオキシダーゼ層を乾燥層厚が約2μｍに
なるようにして水溶液を塗布し乾燥したほかは実
施例１と同様にしてグルコース分析スライドを調
製した。 ゼラチン 3.0ｇ スチレン／Ｐ［（１−メチル−１−ピペラジニオ）
メチル］スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー
1.5ｇ グルコースオキシダーゼ 4000IU ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル
0.1ｇ 実施例２および実施例１のグルコース分析スラ
イドを用い、実施例１、比較例１、２と同様にし
てヘモグロビン濃度と発色光学濃度値（第３表）
およびグルコース濃度と発色濃度値（第４表）の
それぞれの関係を得た。
グルコース濃度測定可能範囲の上限が468mg／dl
またはそれ未満であり、かつ発色光学濃度値が小
さいのに対し、本発明の化学分析スライドではグ
ルコース濃度測定可能範囲の上限が少なくとも
699mg／dlにおよんでおり、かつ発色光学値が大
きく検量線の傾きも大きいので分析精度が高いこ
とがわかる。またこの結果から本発明の化学分析
スライドのグルコース濃度測定可能範囲は比較ス
ライド２のそれの約1.5以上に及んでいることも
明らかである。 実施例 ２ 下記組成のカチオン性ポリマー媒染剤を含むグ
ルコースオキシダーゼ層を乾燥層厚が約2μｍに
なるようにして水溶液を塗布し乾燥したほかは実
施例１と同様にしてグルコース分析スライドを調
製した。 ゼラチン 3.0ｇ スチレン／Ｐ［（１−メチル−１−ピペラジニオ）
メチル］スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー
1.5ｇ グルコースオキシダーゼ 4000IU ポリオキシエチレンノニルフエニルエーテル
0.1ｇ 実施例２および実施例１のグルコース分析スラ
イドを用い、実施例１、比較例１、２と同様にし
てヘモグロビン濃度と発色光学濃度値（第３表）
およびグルコース濃度と発色濃度値（第４表）の
それぞれの関係を得た。
【表】
【表】
第３表および第４表の結果から、カチオン性媒
染剤を含むグルコースオキシダーゼ層を有する本
発明の化学分析スライドはカチオン性媒染剤を含
まないグルコースオキシダーゼ層を有する本発明
の化学分析スライドに比べて一段とヘモグロビン
の過酸化水素分解活性による妨害を受けにくくな
つており、実質的に妨害による負誤差はないとい
えるぼどであり、同時に発色光学濃度値が大きく
かつ検量線の傾きも大きいので分析精度が高く、
さらにグルコース濃度測定可能範囲も広いことが
わかる。
染剤を含むグルコースオキシダーゼ層を有する本
発明の化学分析スライドはカチオン性媒染剤を含
まないグルコースオキシダーゼ層を有する本発明
の化学分析スライドに比べて一段とヘモグロビン
の過酸化水素分解活性による妨害を受けにくくな
つており、実質的に妨害による負誤差はないとい
えるぼどであり、同時に発色光学濃度値が大きく
かつ検量線の傾きも大きいので分析精度が高く、
さらにグルコース濃度測定可能範囲も広いことが
わかる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 水不浸透性光透過性支持体の上に(a)ペルオキ
シダーゼと過酸化水素との存在下で検出可能な変
化を生ずる過酸化水素指示薬、およびペルオキシ
ダーゼを含む指示薬層、(b)オキシダーゼを含むオ
キシダーゼ層、(c)酸素透過性蛋白質不透過性光遮
蔽層、および(d)多孔性展開層がこの順に設けられ
てなる一体型多層化学分析要素。 ２ 前記オキシダーゼ層に媒染剤が含有される特
許請求の範囲第１項に記載の要素。 ３ 前記光遮蔽層が、光遮蔽性微粉末が被膜形成
能を有する親水性ポリマーバインダーに分散保持
されてなる非孔性の層である特許請求の範囲第１
項に記載の要素。 ４ 前記過酸化水素指示薬が水素供与体とカプラ
ーとからなる特許請求の範囲第１項に記載の要
素。 ５ 前記微粉末が二酸化チタン微粉末であり、か
つ二酸化チタン微粉末と前記ポリマーバインダー
の重量比が10対0.6から10対1.8の範囲にある特許
請求の範囲第３項に記載の要素。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19124683A JPS6082859A (ja) | 1983-10-13 | 1983-10-13 | 一体型多層化学分析要素 |
| EP19840112413 EP0137521B1 (en) | 1983-10-13 | 1984-10-15 | Integral multilayer element for chemical analysis |
| DE8484112413T DE3479900D1 (en) | 1983-10-13 | 1984-10-15 | Integral multilayer element for chemical analysis |
| US07/603,243 US5183741A (en) | 1983-10-13 | 1990-10-22 | Integral multilayer element for glucose analysis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19124683A JPS6082859A (ja) | 1983-10-13 | 1983-10-13 | 一体型多層化学分析要素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6082859A JPS6082859A (ja) | 1985-05-11 |
| JPH04638B2 true JPH04638B2 (ja) | 1992-01-08 |
Family
ID=16271330
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19124683A Granted JPS6082859A (ja) | 1983-10-13 | 1983-10-13 | 一体型多層化学分析要素 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0137521B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6082859A (ja) |
| DE (1) | DE3479900D1 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60108753A (ja) * | 1983-11-18 | 1985-06-14 | Fuji Photo Film Co Ltd | 多層化学分析要素 |
| JPS60205364A (ja) * | 1984-03-30 | 1985-10-16 | Kyoto Daiichi Kagaku:Kk | 酸素供給層を有する分析用具 |
| EP0281000B1 (en) * | 1987-02-27 | 1991-10-16 | Konica Corporation | Multi-layer analytical element for creatinine analysis |
| CA1311179C (en) * | 1987-05-14 | 1992-12-08 | Richard Linn Detwiler | Element and method for determination of creatinine or creatine |
| DE3821077A1 (de) * | 1988-02-12 | 1989-08-24 | David Diagnostics Inc | Verfahren zur bestimmung des sauerstoffgehaltes in biologischen fluessigsubstraten und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
| JPH0721455B2 (ja) | 1988-12-01 | 1995-03-08 | 株式会社京都第一科学 | 液体試料中の特定成分を分析するための用具および方法 |
| CN101107521B (zh) | 2005-02-28 | 2012-04-18 | 富士胶片株式会社 | 干式分析元件 |
| AU2007332902B2 (en) * | 2006-12-08 | 2012-04-26 | Opti Medical Systems | Spreading layer and humidity control layer for enhancing sensor performance |
| JP2014142245A (ja) * | 2013-01-23 | 2014-08-07 | Sharp Corp | 標的物質分析マイクロチップおよび分析方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4166763A (en) * | 1976-12-10 | 1979-09-04 | Eastman Kodak Company | Analysis of lactic acid or lactate using lactate oxidase |
| JPS5920853A (ja) * | 1982-07-28 | 1984-02-02 | Fuji Photo Film Co Ltd | 多層分析材料 |
| JPS5954962A (ja) * | 1982-09-22 | 1984-03-29 | Fuji Photo Film Co Ltd | 多層分析材料 |
| JPS59143959A (ja) * | 1983-02-07 | 1984-08-17 | Fuji Photo Film Co Ltd | 乾式分析要素 |
| JPS59193352A (ja) * | 1983-04-18 | 1984-11-01 | Fuji Photo Film Co Ltd | 分析試薬および多層化学分析要素 |
-
1983
- 1983-10-13 JP JP19124683A patent/JPS6082859A/ja active Granted
-
1984
- 1984-10-15 DE DE8484112413T patent/DE3479900D1/de not_active Expired
- 1984-10-15 EP EP19840112413 patent/EP0137521B1/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0137521A2 (en) | 1985-04-17 |
| DE3479900D1 (en) | 1989-11-02 |
| JPS6082859A (ja) | 1985-05-11 |
| EP0137521A3 (en) | 1987-04-01 |
| EP0137521B1 (en) | 1989-09-27 |
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