JPH0456008B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 吸水性高分子は、高い吸水力を示す高分子であ
り、水溶性高分子を架橋によつて水に不溶化して
得られ、水を吸収してヒドロゲルとなるものであ
つて、比較的生体適合性が良いことが知られてお
り、医用材料としての利用が研究されている。し
かし、これを例えば薬物包埋カプセルまたはエム
ボリゼーシヨン等に利用しても薬物保持効果が極
めて低いという欠点がある。 本発明者等は、この欠点を克服するために、一
旦薬物を卵黄レシチンよりなる人工細胞リポソー
ム、または天然由来多糖誘導体で修飾したリポソ
ームでカプセル化し、更にそれを吸水性高分子に
よつて二重にカプセル化する、いわゆる「ダブル
カプセル化する」方法を開発した。 そしてこれをバイオテクノロジーの分野に進め
て、生細胞に対して適合性の良い吸水性高分子
と、人工細胞リポソームとの併用により、増殖効
率の高い動物細胞培養器および培地に応用でき
る。 発明が解決しようとする問題点 天然由来脂質から形成されるリポソームは、生
体適合性がよく、これまでにも医学、薬学の幅広
い分野での利用が提案されている。しかし目的達
成のためには生体適合性を保持しつつ免疫性・毒
性が低く、適切な時間構造安全性が保たれ、尚か
つ目的を達成した後は、出来るだけ速やかに生物
分解されるという二律相反する性質の両方が要求
される。 本発明者等は、この二律相反する性質を克服す
べく研究を重ね、比較的生体適合性の良い不溶性
吸水性高分子の親水性多孔を利用し、ここにリポ
ソームを包埋することにより、リポソームの優れ
た基本的特性を損なうことなく、構造安定性を向
上させうる方法を開発するに至つた。 先ず医療における薬物投与においては組織指
向性と徐放効果の改善が２つの大きな課題であ
る。一方、徐放効果を発現させるためには、薬
物を混合した、または薬物を化学的に結合した
不溶性かつ生物分解性ポリマーを特定組織（例
えば癌組織）にインプラントし、そこで薬物
（例えば制癌剤）を徐放させる方法が従来最も
効果的であるとされて来た。しかしこの方法で
は元来水溶性薬物のポリマーへの包埋が困難で
あること、他方脂溶性薬物ではポリマーからの
放出が困難であること、更にポリマーと薬物を
共有結合によつて結合させたときには薬効発現
に先立つて生体内での酵素的または、非酵素的
解裂段階を考慮しなければならない点などが問
題となる。本発明になる吸水性高分子カプセル
化リポソームを用いれば薬物（制癌剤）は脂溶
性・水溶性を問わず、またその両者とも同時に
リポソームにカプセル化することが可能であ
り、しかもリポソームへのカプセル化には全く
化学結合を伴わないので薬効発現に際しては何
等支障を来さない長所がある。しかも、吸水性
高分子そのものに直接薬物をカプセル化する場
合に比較して、はるかに薬物の放出速度を抑制
し得る。他方リポソームのみでは、特定生体組
織中へインプラントし固定化することは不可能
であるが、不溶性かつ生体適合性吸水性高分子
中にこれをカプセル化することにより、インプ
ラント化が可能となる。しかも上述のごとく吸
水性高分子−リポソーム−薬物の３者の間には
全く共有結合が存在せず且つ徐放効果が発現さ
れるため極めて理想的なインプラント型薬物徐
放システムを組み立てることが可能である。 次に、近年バイオテクノロジーの急速な発展
に伴い改善されねばならない課題は動物細胞の
培養効率の向上、特に無血清培地での培養が一
つの目標となつている。この場合の問題は培地
中への脂溶性ビタミン類Ａ，Ｋ，Ｄなどや各種
脂肪酸例えばリノール酸、リノレイン酸、オレ
イン酸などの添加方法である。従来このような
水に離溶性または不溶性物質を培地中に可溶化
させるために、天然には存在しない合成界面活
性剤を用いているが、正常な細胞増殖において
非天然物質の存在が好ましくないことは自明の
理である。既に述べたごとく、リポソームは脂
溶性物質をその２分子膜中に共存させることが
可能であり、しかも細胞との相互作用が容易で
あるため、細胞培養培地中でのリポソームの共
存は、増殖細胞への脂溶性栄養源の供給を極め
て容易にし、その効果を向上せしめうる。一方
適切な化学構造をもつ吸水性高分子は細胞接着
性が極めて良好なることも既に知られている。
即ち本発明になるリポソームカプセル化吸水性
高分子は動物細胞培養の極めて適切な培地とし
ても利用が期待できる。 かくのごとく、本発明になる吸水性高分子に
カプセル化されたリポソームは構造的にも強
度、安定性を向上させることができ、医学、薬
学におけるリポソームの利用の途を更に拡大す
るものである。 問題点を解決するための手段 以下において、吸水性高分子カプセル化リポソ
ームの製造法とその効果の実証の詳細を述べる。 実験方法 試料調製 人工細胞リポソームは卵黄レシチンに200mM
carboxyfluorescein（CF）水溶液をカプセル化し
た small unilamellar vesicle（SUV）として作
製した。得られたリポソーム懸濁水液のリン脂質
濃度は、２×10^-3Ｍであつた。吸水性高分子約３
mgを精秤し、１cm石英けい光セルに入れ、上記リ
ポソーム懸濁水液150μを吸収させた。吸収が
平衡に達す るまで30分間、37℃でインキユベートした後、
2.0mlの緩衝液（10mMTris−HCl−100mM
NaClPH8.6）をゆるやかに加えて、CFのけい光
強度変化を追跡した。希釈後はテフロン攪拌子に
より攪拌を行い、測定の１分前に攪拌を停止し、
吸水性高分子を沈降させた。 測定方法 CFのけい光強度の測定には、ユニオン技研の
けい光偏光解消装置FS−501を使用した。150W
Xeランプを光源とし、この光を、470nmに分光
し、更に垂直成分に偏光して、CFを励起し、生
じたけい光を水平成分（I_H）と垂直成分（I_V）に
偏光し、それぞれ光電子増培管（HTVR464）で
検出した。検出側では、偏光する前に色ガラスフ
イルター（Ｙ−50およびＹ−54）により500nmお
よび540nm以下の波長の光をカツトし、観測され
るけい光量を制限した。全けい光強度に相当する
値Ｉは、次式で求められる。 Ｉ＝I_V＋2GI_H (1) ここでＧ値は補正係数であり、主に２つのホト
マルの検出感度の差によるものである。本装置で
はＧ値はほぼ0.95である。測定はgate timeを
1secとし、10回サンプリングして、その平均をと
つた。 吸水性高分子の主原料、架橋剤及び形状、外観
を表１に示す。

【表】 実験結果 リポソームをカプセル化した吸水性高分子（以
後この操作をダブルカプセル化と呼ぶ）に、2.0
mlの緩衝液を加えた時を時間ゼロとし、その後30
分間CFのけい光強度変化を追跡した（表２）。
CFの流出量は(2)式により求めた。 CF流出量（％）＝It−Io／Ｉ∞−Io×100 (2) IoおよびItは観測されたけい光強度で、添字は
それぞれ時間ゼロ、およびある時間ｔを、Ｉ∞は
10％TirtonX−100 30μを加え、リポソームを
破壊した時を意味している。またダブルカプセル
化の比較実験として、リポソームを緩衝液で希釈
したサンプルのCFの流出を追跡し、コントロー
ルとして示した。 No.１とNo.２はそれぞれ、アクリル酸−酢酸ビニ
ル共重合体と、アクリル酸−ビニルアルコール共
重合体の吸水性高分子であり、リポソームを安定
にカプセル化することができた。しかし、アクリ
ル酸、アクリルアミドあるいは、スターチポリア
クリレートを主原料とする吸水性高分子では比較
的短時間でリポソームの破壊が観測された。

【表】 上表２より、人工細胞リポソームを安定にカプ
セル化することのできる吸水性高分子としては、
アクリル酸−酢酸ビニルの共重合体およびアクリ
ル酸−ビニルアルコールの共重合体が特に好まし
いことがわかつた。なかんずく、アクリル酸−酢
酸ビニル共重合体ではダブルカプセル化によつて
24時間後でも、リポソームの崩壊は全く観察され
なかつた。 またCF溶液を吸水性高分子にカプセル化させ
たときのバルク水相へのCFの流出はかなり顕著
であるが、リポソームを用いてダブルカプセル化
することでCFの流出を抑えることができた。こ
のとき吸水性高分子にカプセル化されたリポソー
ムは機械的衝撃により容易に放出されてしまう
が、静置しておけば、かなり安定に保持されるこ
とも判明した。さらに多糖被覆リポソームを用い
るとCFの流出は一層抑制することができ、リポ
ソーム自身の安定性は単純リポソームの場合と全
く同じであつた。ダブルカプセル化吸水性高分子
の形態観察は螢光顕微鏡により行なう。 発明の効果 本発明のダブルカプセル化により、リポソーム
を安定にカプセル化することができることに起因
して薬物の保持効果が向上した。 また、本発明により、動物細胞培養器の改良が
できる。すなわち、動物細胞培養における培養器
の生体適合性の改良及び培養効率の向上が可能と
なつた。 詳述すれば、最適培地成分をカプセル化したり
リポソームを更に、最も細胞適合性の良い吸水性
高分子により、ダブルカプセル化する。それをガ
ラスシヤーレ上に展開し、ここで人、フイブロプ
ラストの接地培養を試み、細胞の正常生育状態を
観察するのである。 得られた結果に基づいて、吸水性高分子により
改良されたプラスチツクおよびガラスシヤーレの
代替物を製造した。 細胞培養効率に影響する重要な因子としては、
細胞膜脂質源となるリノール酸、オレイン酸など
の存在状態およびその細胞内搬入媒体として重要
な血清アルブミンの存在状態、即ち細胞に対する
栄養分としての安定供給状態およびこれらの成分
の溶液内平衡濃度などがある。 かくて、従来用いられてきたガラス或はプラス
チツクに代つて、生体適合性に優れた吸水性高分
子のカプセル化されたリポソームは、産業上極め
て有用である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 薬物を人工細胞リポソーム、または天然由来
   多糖誘導体で修飾したリポソームでカプセル化
   し、その懸濁水液を、吸水性高分子に吸収させて
   ダブルカプセル化することを特徴とするリポソー
   ム製剤の製造法。 ２ 吸水性高分子が、アクリル酸−酢酸ビニル共
   重合体、アクリル酸−ビニルアルコール共重合
   体、アクリル酸ナトリウムまたはカリウム、アク
   リルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプ
   ロパンスルホン酸、ポリアクリル酸、スターチポ
   リアクリレート及びアクリル系重合体より成る群
   から選択される少くとも１種である特許請求の範
   囲第１項記載のリポソームの製造法。 ３ リポソーム膜が、脂質または脂質とコレステ
   ロールより構成されるリポソーム膜である特許請
   求の範囲第１項記載のリポソームの製造法。 ４ 脂質がホスフアチジルコリンである特許請求
   の範囲第３項記載のリポソームの製造法。 ５ 天然由来多糖類がプルラン、アミロペクチ
   ン、アミロース、デキストラン、及びマンナンか
   らなる群より選択される少くとも１種である特許
   請求の範囲第１項記載のリポソームの製造法。 ６ 天然由来多糖類が、プルラン、アミロペクチ
   ン、アミロース、デキストラン、及びマンナンか
   らなる群のいずれかの100単糖あたり0.5〜5.0の
   第１級アルコール基がパミルトイル基、またはコ
   レステリルオキシカルボニルアミノエチルアミノ
   カルボニルメチル基によつて置換されたものから
   なる群より選択される少くとも１種である特許請
   求の範囲第１項、または第５項記載のリポソーム
   の製造法。 ７ ホスフアチジルコリン１重量部に対して天然
   由来多糖誘導体が1/3〜１重量部である特許請求
   の範囲第１項または第４項記載のリポソームの製
   造法。