CN106551917B - 一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法及利用该微胶囊杀死癌细胞的检测方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法及利用该微胶囊杀死癌细胞的检测方法。本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法及利用该微胶囊杀死癌细胞的检测方法。本发明是为了解决现有治疗癌症的方法具有较大副作用的问题。方法：一、PBS缓冲溶液的配制；二、制备氨基化牛血清白蛋白和聚N‑异丙基丙烯酰胺耦联体；三、制备包载海藻酸钠的微胶囊。本发明利用海藻酸钠凝胶化选择性杀死癌细胞，克服了药物治疗对正常组织的毒副作用，同时也展示了利用AFM检测证明细胞死亡的方法。

Description

一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法及利用该微 胶囊杀死癌细胞的检测方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法及利用该微胶囊杀死癌细胞的检测方法。
背景技术
随着近代科技的发展，人类生活环境的改变，癌症发病率连年上升。目前，癌症已成为仅次于心血管疾病和传染病的人类第三号“杀手”，每年导致全球数百万人死亡，严重危害公共健康。因此，如何安全有效的治疗癌症一直是科研工作者和医学人员的研究重点。当前，虽然治疗肿瘤有手术治疗、化学疗法、放射治疗及联合治疗等多种方法，但化学疗法仍然是治疗许多肿瘤的首选方法。但是化疗法自身存在许多缺陷，绝大多数的化疗药物在杀死癌细胞的同时会严重损伤人体的正常细胞，并给病人带来腹痛、呕吐和腹泄等毒副作用。尽管针对特定的癌症的诊断方法和治疗方法都有了显著的进步，但是对于有效治疗肿瘤仍然存在极大地挑战。无论使用哪种抗癌药物进行治疗，药物本身除去对肿瘤部位有药效作用外，不可避免的要对其他正常的细胞造成伤害。此外，细胞作为所有生命体的基本组成单元，其生理状态的主要变化趋势终将投射到生命体的整体上并改变整个生命体的生理状态。而细胞的任何生理状态的改变都伴随着其力学特性的改变，且两者之间的关系是有规律的。因此细胞力学特性如杨氏模量、粘弹性等对于加深人类对细胞的了解以及丰富医学检测治疗手段均有难以估量的价值。
发明内容
本发明是为了解决现有治疗癌症的方法具有较大副作用的问题，而提供了一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法及利用该微胶囊杀死癌细胞的检测方法。
一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法具体是按以下步骤进行的：
一、PBS缓冲溶液的配制：将NaH2PO4和Na2HPO4混合溶解在去离子水中配制成PBS缓冲溶液；所述NaH2PO4与Na2HPO4的质量比为1:(26～45)；所述PBS缓冲溶液的浓度为45mmol/L～55mmol/L，pH值为8.0～8.2；
二、制备氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺耦联体：将氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺溶解在步骤一得到的PBS缓冲溶液中，然后采用磁力搅拌反应10h～14h，得到混合液，将混合液透析2d，冷冻干燥，得到氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺耦联体；所述氨基化牛血清白蛋白的质量与步骤一得到的PBS缓冲溶液的体积比为1mg:(1.1～1.7)mL；所述氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺的质量比为1:(0.9～1.3)；
三、制备包载海藻酸钠的微胶囊：将步骤二得到的氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺耦联体配置成浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液，然后向浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液中依次加入浓度为3～5mg/mL的海藻酸钠、浓度为0.06～0.08mol/L的EDTA-Ca络合液和异辛醇，混合后震荡10s，超声处理，得到包载海藻酸钠的微胶囊；所述浓度为0.06～0.08mol/L的EDTA-Ca络合液是由EDTA和CaCl2按质量比为1:1配置而成的；所述浓度为3～5mg/mL的海藻酸钠与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:(1.8～4.4)；所述浓度为0.06～0.08mol/L的EDTA-Ca络合液与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:(1.8～4.4)；所述异辛醇与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:(0.04～0.08)。
利用包载海藻酸钠的微胶囊杀死癌细胞的检测方法具体是按以下步骤进行的：
将包载海藻酸钠的微胶囊转移至水相，得到水相微胶囊；将含有5％～10％FBS的DMEM培养基、肝癌细胞悬液和水相微胶囊混合后在细胞培养箱中培养20～30h，培养完成后采用原子力显微镜进行检测；所述水相微胶囊的浓度为2mg/mL。
本发明的有益效果：
本发明利用癌细胞本身微环境的pH值(5.0～6.0)调控海藻酸钠与钙离子结合，使癌细胞内部凝胶化，靶向性杀死癌细胞，避免化疗药物和放射疗法对正常组织带来的副作用；凝胶化的癌细胞可以被快速降解。同时利用原子力显微镜技术中的力学检测方法来原位监测癌细胞的存活与凋亡状态，提供了一种新型的治疗癌症和监测癌细胞生命状态的方法。
附图说明
图1为实施例一得到的包载海藻酸钠的微胶囊的外观形貌图；
图2为实施例一得到的包载海藻酸钠的微胶囊进入癌细胞后的外观形貌图；
图3为实施例一得到的包载海藻酸钠的微胶囊进入癌细胞后的在德国莱卡DMi8型荧光倒置显微镜下的外观形貌图；
图4为未吞噬实施例一得到的包载海藻酸钠的微胶囊的癌细胞采用原子力显微镜力学测试技术检测后的杨氏模量分布图；
图5为采用AFM力学检测技术检测吞噬了包载海藻酸钠的微胶囊的凝胶化癌细胞的杨氏模量分布图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法具体是按以下步骤进行的：
一、PBS缓冲溶液的配制：将NaH2PO4和Na2HPO4混合溶解在去离子水中配制成PBS缓冲溶液；所述NaH2PO4与Na2HPO4的质量比为1:(26～45)；所述PBS缓冲溶液的浓度为45mmol/L～55mmol/L，pH值为8.0～8.2；
二、制备氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺耦联体：将氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺溶解在步骤一得到的PBS缓冲溶液中，然后采用磁力搅拌反应10h～14h，得到混合液，将混合液透析2d，冷冻干燥，得到氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺耦联体；所述氨基化牛血清白蛋白的质量与步骤一得到的PBS缓冲溶液的体积比为1mg:(1.1～1.7)mL；所述氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺的质量比为1:(0.9～1.3)；
三、制备包载海藻酸钠的微胶囊：将步骤二得到的氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺耦联体配置成浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液，然后向浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液中依次加入浓度为3～5mg/mL的海藻酸钠、浓度为0.06～0.08mol/L的EDTA-Ca络合液和异辛醇，混合后震荡10s，超声处理，得到包载海藻酸钠的微胶囊；所述浓度为0.06～0.08mol/L的EDTA-Ca络合液是由EDTA和CaCl2按质量比为1:1配置而成的；所述浓度为3～5mg/mL的海藻酸钠与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:(1.8～4.4)；所述浓度为0.06～0.08mol/L的EDTA-Ca络合液与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:(1.8～4.4)；所述异辛醇与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:(0.04～0.08)。
本实施例中采用法国吉尔森移液枪进行溶剂的量取。采用梅特勒-托利多万分之一精密天平用于药品的称取。采用梅特勒-托利多SevenCompact系列pH计用于pH的测量。采用IKA VORTEX振荡器用于溶质的溶解。采用宁波新芝生物科技超声波清洗机用于超声。采用德国莱卡DMi8型荧光倒置显微镜用于胶囊形貌的观察。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述NaH2PO4与Na2HPO4的质量比为1:40。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中所述所述PBS缓冲溶液的浓度为50mmol/L。其他步骤及参数与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中所述氨基化牛血清白蛋白的质量与步骤一得到的PBS缓冲溶液的体积比为1mg:1.2mL。其他步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤二中所述所述氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺的质量比为1:1。其他步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤三中所述浓度为3～5mg/mL的海藻酸钠与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:2。其他步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤三中所述浓度为0.06～0.08mol/L的EDTA-Ca络合液与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:2。其他步骤及参数与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤三中所述异辛醇与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:0.06。其他步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九：本实施方式利用包载海藻酸钠的微胶囊杀死癌细胞的检测方法具体是按以下步骤进行的：
将包载海藻酸钠的微胶囊转移至水相，得到水相微胶囊；将含有5％～10％FBS的DMEM培养基、肝癌细胞悬液和水相微胶囊混合后在细胞培养箱中培养20～30h，培养完成后采用原子力显微镜进行检测；所述水相微胶囊的浓度为2mg/mL。
通过以下实施例验证本发明的有益效果
实施例一：一种利用pH值调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法具体是按以下步骤进行的：
一、PBS缓冲溶液的配制：将NaH2PO4和Na2HPO4混合溶解在去离子水中配制成PBS缓冲溶液；所述NaH2PO4和Na2HPO4的质量比为1:(26～45)；所述PBS缓冲溶液的浓度为45mmol/L～55mmol/L，pH值为8.0～8.2；
二、制备氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺耦联体：将20mg氨基化牛血清白蛋白和20mg聚N-异丙基丙烯酰胺溶解在步骤一得到的PBS缓冲溶液中，然后采用磁力搅拌反应12h，得到混合液，将混合液透析2d，冷冻干燥，得到氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺耦联体；所述氨基化牛血清白蛋白的质量与步骤一得到的PBS缓冲溶液的体积比为1mg:(1.1～1.7)mL；
三、制备包载海藻酸钠的微胶囊：将步骤二得到的氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺耦联体配置成浓度为10mg/mL的水溶液，然后向20μL浓度为10mg/mL的水溶液中依次加入10μL浓度为5mg/mL的海藻酸钠、10μL浓度为0.075mol/L的EDTA-Ca络合液和400μL异辛醇，混合后震荡10s，超声处理，得到包载海藻酸钠的微胶囊。
实施例二：本实施例与实施例一的不同之处在于：步骤三中向20μL浓度为15mg/mL的水溶液中依次加入10μL浓度为5mg/mL的海藻酸钠、10μL浓度为0.075mol/L的EDTA、10μL浓度为0.06～0.08mol/L的CaCl2溶液和400μL异辛醇。其他与实施例一相同。
实施例三：本实施例与实施例一的不同之处在于：步骤三中向20μL浓度为20mg/mL的水溶液中依次加入10μL浓度为5mg/mL的海藻酸钠、10μL浓度为0.075mol/L的EDTA-Ca络合液和400μL异辛醇。其他与实施例一相同。
实施例四：本实施例与实施例一的不同之处在于：步骤三中向20μL浓度为10mg/mL的水溶液中依次加入10μL浓度为3mg/mL的海藻酸钠、10μL浓度为0.075mol/L的EDTA-Ca络合液和400μL异辛醇。其他与实施例一或二相同。
实施例五：本实施例与实施例一的不同之处在于：步骤三中向20μL浓度为10mg/mL的水溶液中依次加入10μL浓度为5mg/mL的海藻酸钠、10μL浓度为0.07mol/L的EDTA-Ca络合液和400μL异辛醇。其他与实施例一或二相同。
实施例六：包载海藻酸钠的微胶囊的验证和检测方法具体是按以下步骤进行的：
将包载海藻酸钠的微胶囊转移至水相，得到水相微胶囊；将含有5％～10％FBS的DMEM培养基、肝癌细胞悬液和水相微胶囊混合后在细胞培养箱中培养20～30h，培养完成后采用原子力显微镜进行检测。
图1为实施例一得到的包载海藻酸钠的微胶囊的外观形貌图；从图中可以看出其大小分布均匀(尺寸在0.5～1.5μm之间)，透光性好，说明其具有明显的空心胶囊结构，并且具有良好的稳定性。
图2为实施例一得到的包载海藻酸钠的微胶囊进入癌细胞后的外观形貌图；从图中可以看出微胶囊能够被细胞吞入，具有较高的吞噬率，并且在细胞内分布均匀；说明该微胶囊结构具有良好的生物相容性。
图3为实施例一得到的包载海藻酸钠的微胶囊进入癌细胞后的在德国莱卡DMi8型荧光倒置显微镜下的外观形貌图；从图中可以看出微胶囊能够被细胞吞入，具有较高的吞噬率，并且在细胞内分布均匀，短期在细胞内仍旧能保持胶囊形貌；说明了微胶囊的良好生物相容性。
图4为未吞噬实施例一得到的包载海藻酸钠的微胶囊的癌细胞采用原子力显微镜力学测试技术(AFM)检测后的杨氏模量分布图；从图中可以看出未吞噬微胶囊的细胞的杨氏模量数值分布在200～1200E/Pa范围内，其平均值为578.6E/Pa。
图5为采用AFM力学检测技术检测吞噬了包载海藻酸钠的微胶囊的凝胶化癌细胞的杨氏模量分布图；从图中可以看出吞噬微胶囊的凝胶化细胞的杨氏模量数值分布在200～1800E/Pa范围内，其平均值为938.4E/Pa.因此对比图4中数据可以看出吞噬微胶囊前后的杨氏模量差异，从整体杨氏模量数据的增长中可以证明细胞凝胶化的过程。

Claims (9)

1.一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法，其特征在于利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法具体是按以下步骤进行的：
一、PBS缓冲溶液的配制：将NaH2PO4和Na2HPO4混合溶解在去离子水中配制成PBS缓冲溶液；所述NaH2PO4与Na2HPO4的质量比为1:(26～45)；所述PBS缓冲溶液的浓度为45mmol/L～55mmol/L，pH值为8.0～8.2；
二、制备氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺耦联体：将氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺溶解在步骤一得到的PBS缓冲溶液中，然后采用磁力搅拌反应10h～14h，得到混合液，将混合液透析2d，冷冻干燥，得到氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺耦联体；所述氨基化牛血清白蛋白的质量与步骤一得到的PBS缓冲溶液的体积比为1mg:(1.1～1.7)mL；所述氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺的质量比为1:(0.9～1.3)；
三、制备包载海藻酸钠的微胶囊：将步骤二得到的氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺耦联体配置成浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液，然后向浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液中依次加入浓度为3～5mg/mL的海藻酸钠、浓度为0.06～0.08mol/L的EDTA-Ca络合液和异辛醇，混合后震荡10s，超声处理，得到包载海藻酸钠的微胶囊；所述浓度为0.06～0.08mol/L的EDTA-Ca络合液是由EDTA和CaCl2按质量比为1:1配置而成的；所述浓度为3～5mg/mL的海藻酸钠与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:(1.8～4.4)；所述浓度为0.06～0.08mol/L的EDTA-Ca络合液与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:(1.8～4.4)；所述异辛醇与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:(0.04～0.08)。
2.根据权利要求1所述的一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法，其特征在于步骤一中所述NaH2PO4与Na2HPO4的质量比为1:40。
3.根据权利要求1所述的一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法，其特征在于步骤一中所述PBS缓冲溶液的浓度为50mmol/L。
4.根据权利要求1所述的一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法，其特征在于步骤二中所述氨基化牛血清白蛋白的质量与步骤一得到的PBS缓冲溶液的体积比为1mg:1.2mL。
5.根据权利要求1所述的一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法，其特征在于步骤二中所述氨基化牛血清白蛋白和聚N-异丙基丙烯酰胺的质量比为1:1。
6.根据权利要求1所述的一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法，其特征在于步骤三中所述浓度为3～5mg/mL的海藻酸钠与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:2。
7.根据权利要求1所述的一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法，其特征在于步骤三中所述浓度为0.06～0.08mol/L的EDTA-Ca络合液与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:2。
8.根据权利要求1所述的一种利用pH调控癌细胞凝胶化微胶囊的制备方法，其特征在于步骤三中所述异辛醇与浓度为10mg/mL～20mg/mL的水溶液的体积比为1:0.06。
9.利用权利要求1制备的包载海藻酸钠的微胶囊杀死癌细胞的检测方法，其特征在利用包载海藻酸钠的微胶囊杀死癌细胞的检测方法于具体是按以下步骤进行的：
将包载海藻酸钠的微胶囊转移至水相，得到水相微胶囊；将含有5％～10％FBS的DMEM培养基、肝癌细胞悬液和水相微胶囊混合后在细胞培养箱中培养20～30h，培养完成后采用原子力显微镜进行检测；所述水相微胶囊的浓度为2mg/mL。
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杨氏模量及细胞骨架重塑对肝癌细胞侵袭的影响;温稳，等;《中华消化杂志》;20150630;第35卷(第6期);第372页左栏第2-3段、右栏实验方法部分，第375页左栏第2段、最后1段 *

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