CN102921014A - 一种具有协同抗肿瘤效应的生物兼容纳米药物复合载体、药物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有协同抗肿瘤效应的生物兼容纳米药物复合载体、药物及其制备方法。本发明所提供的由核芯、包覆所述核芯的连接层以及包覆所述连接层的壳层组成；所述核芯为吸附了抗癌药物的可降解多孔无机纳米粒子，所述连接层由聚电解质组成，所述壳层由蛋白质和聚电解质层层交替组装构成，所述蛋白质选自肿瘤坏死因子超家族成员之一。本发明利用层层组装技术，可简便地制备大量的核壳结构的蛋白质/多糖纳米复合药物载体，并能用于水溶性药物的包裹和释放，有效的降低了成本，容易实现规模化的生产。

Description

一种具有协同抗肿瘤效应的生物兼容纳米药物复合载体、药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种具有协同抗肿瘤效应的生物兼容纳米药物复合载体、药物及其制备方法。

背景技术

药物载体是能够改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物释放速度并将药物输送到靶向器官的体系。作为药物缓释载体的材料，是药物缓释体系的重要组成部分，是调节药物释放速度的重要物质，也是影响药效的主要因素。需要具有生物相容性和生物可降解性，也就是能在体内降解为小分子化合物，从而被机体代谢、吸收或排泄，对人体无毒副作用，并且降解过程发生的时机要合适。药物经过载体运输后，要损伤很小，而且还可以有效控制释放，延长药物的作用时间。因而对它的研究越来越受到重视。理想的药物载体应满足下列要求：(1)可提高难溶性药物的生物利用率，(2)可缓慢释放药物，延长药物作用时间，(3)可降低药物与肠胃的接触，减少副作用，(4)可实现靶向和定位给药，(5)减少给药量，提高药物疗效，减少毒副反应，(6)可提高药物的稳定性，(7)载体及其生物降解物易被消除，(8)能携带多种药物。

纳米科技是20世纪80年代末刚刚诞生并崛起的新技术，它的基本含义是在纳米尺寸(10^-9-10^-7)范围内认识和改造自然，通过直接操作和安排原子、分子创造新的物质。纳米生物材料是纳米生物技术所需的纳米材料，其包括纳米生物医用材料、纳米药物及药物的纳米化技术。纳米生物材料在生命科学中的应用，包括纳米无机生物材料、纳米生物高分子材料和纳米复合生物材料。纳米复合生物材料可以通过不同质的组成、不同相的结构、不同含量及不同方式的复合而制备出来，以满足各种用途的需要。其综合性能远优于各单组元，并且可以具有单组元所不具备的新性质。无机-有机杂化纳米材料的显著特征是在无机的粒子核周围包裹着有机或生物分子，这是一种核-壳结构。在这种杂化体系中，材料的主要物理化学性质取决与作为核的无机粒子。在核周围的有机分子可以对无机粒子提供有效的保护环境，并且对整个体系起到稳定的作用。更重要的是，不同有机分子的多样性质可以直接影响整个材料的反应能力、溶解度以及界面之间的相互作用。

1991年，Decher等人重新提出静电交替沉积技术，并将其用于聚电解质和有绩效分子的超薄膜制备中，这种由带相反电荷的物质在液固界面通过静电作用交替沉积形成多层超薄膜的技术就是现在所说的层层组装技术(Layer-by-Layer，LbL)。通过模板法与LbL技术相结合可以制备出微胶囊、纳米管以及无机-有机杂化材料。近年来，随着研究的不断深入，科学家们利用不同材质和方法研制出各种各样的超分子材料。这些不同材质、不同功能的纳米材料在能源、信息材料、医药与放生以及工业等领域都有广泛的应用。

癌症(即恶性肿瘤)是一类严重危害人类生命、影响生活质量和健康的常见病。目前，在癌症的治疗方法中，化学治疗作为一种全身性治疗手段，具有对原发灶、转移灶和亚临床转移灶均有治疗作用等很多优点。现有抗癌药物对癌细胞的杀伤强度高，但是对正常组织同样具有致死性，并且在肿瘤组织处分布较低。目前为了降低化疗药物的副作用，具有缓释、控释和靶向功能的生物兼容的纳米球载药体系得到了广泛的研究。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种具有协同抗肿瘤效应的纳米药物载体及其制备方法。

本发明所提供的具有协同抗肿瘤效应的纳米药物载体，由核芯、包覆所述核芯的连接层以及包覆所述连接层的壳层组成；所述核芯为可降解多孔无机纳米粒子，所述连接层由聚电解质组成，所述壳层由蛋白质和聚电解质层层交替组装构成，所述蛋白质选白肿瘤坏死因子超家族成员(Tumor necrosis factor(TNF)-superfamily)之一。

其中，所述可降解多孔无机纳米粒子具体可为纳米碳酸钙、纳米二氧化硅或其他生物兼容的多孔纳米粒子，如磁性纳米粒子、量子点等。所述多孔无机纳米粒子的直径小于1微米。

在众多无机纳米微粒中，纳米碳酸钙因制造工艺简单、价格相对低廉等而备受青睐。近年来，随着纳米碳酸钙的开发应用和粒子表面处理技术的进步以及复合材料制备技术的迅速发展。纳米碳酸钙粒子具有高比表面积、多孔疏松的内部结构以及良好的生物兼容性。因此，本发明优选纳米碳酸钙粒子作为构筑核壳结构药物载体的核材料。

所述聚电解质具体可为带有负电荷的聚电解质，包括多糖类物质和高分子聚合物。所述多糖类物质包括：海藻酸、海藻酸钠、肝素或透明质酸等；所述高分子聚合物包括：聚对苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸、聚乙烯膦酸等。

所述蛋白质优选肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体是通过重组带有相关基因的质粒在大肠杆菌中重组表达制得的，其是近几年来发现的肿瘤坏死因子家族新成员，能选择性诱导转化细胞、肿瘤细胞和病毒感染细胞发生凋亡，而对正常组织无明显损伤，因而成为目前研究的热点。TRAIL活性三聚体诱发死亡受体活化，并与死亡受体胞外富含Cys区域相结合，死亡受体与胞内接头分子的死亡结构域相互结合，导致细胞内的半胱&天冬氨酸蛋白酶原(pro-caspase)在附近的募集，接头蛋白的另一端含有与半胱-天冬氨酸蛋白酶原分子相似的死亡效应蛋白结构域(death domain DD)，可以相互串联结合，这样由“死亡配体-死亡受体-接头蛋白-半胱-天冬氨酸蛋白酶原”以串联组合而形成大型的分子复合物，后者激活caspase-8。caspase-8的激活可以进一步募集和激活caspase家族中的下游信号传导酶(caspase-6，caspase-7)，形成逐步激活的瀑布效应(cascade)，直至最终效应酶(caspase-3)的激活，从而介导细胞的凋亡。自TRAIL及其受体被发现以来，人们一直认为它具有广阔的临床应用前景。现已证明，TRAIL可以在体内、体外高效杀伤多种肿瘤细胞。已经证实TRAIL体外可以抑制或诱发大多数常见人类肿瘤细胞株死亡，如结肠癌、肺癌、乳腺癌、恶性神经胶质瘤、肾癌、恶性黑素瘤及白血病细胞等。许多实验表明多种化疗药物、酶抑制剂以及放疗可以使抗性肿瘤对TRAIL恢复敏感或使敏感肿瘤变得更加敏感这些试剂主要通过调节TRAIL受体、Caspases、cFLIP、线粒体途径、1APs、NF-KB、Akt等活性来增强细胞的TRAIL敏感性。

本发明采用的作为壳层的材料优选肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和带负电荷的多糖类物质。多糖是自然界中含量最丰富的多聚物及其特有的性质，无毒，无副作用，可被淀粉酶降解，是药物理想的赋型剂。相关现有技术文献披露，多糖和蛋白质之间的相互作用主要是静电作用和输水作用。因此，本发明优选在水溶液中带有负电荷的多糖作为构筑药物载体的材料。

本发明所提供的具有协同抗肿瘤效应的纳米药物载体的制备方法，包括下述步骤：

1)将多孔无机纳米粒子置于聚电解质的氯化钠溶液中进行吸附，然后离心分离并清洗，去掉纳米粒子上未吸附的聚电解质，得到包覆聚电解质层的多孔无机纳米粒子；

2)将所述包覆聚电解质层的多孔无机纳米粒子置于蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中进行吸附，然后离心分离并清洗，去掉纳米粒子未吸附的蛋白质；

3)将步骤2)得到的产物继续置于聚电解质的氯化钠溶液中进行吸附，然后离心分离并清洗，去掉纳米粒子上未吸附的聚电解质；

4)以所述步骤2)-3)作为一次组装处理，重复所述组装处理直至得到目标层数，即得到所述具有协同抗肿瘤效应的纳米药物载体。

其中，步骤1)中所述聚电解质的氯化钠溶液中聚电解质的浓度为0.1mg/mL，氯化钠的浓度为0.1mol/L。步骤1)中吸附的时间为15-20min。

步骤2)中所述磷酸盐缓冲溶液的pH值在蛋白质的等电点以下，使蛋白质带正电荷。但所述蛋白质具体为肿瘤坏死因子相关调往诱导配体(TRAIL)时，所述磷酸盐缓冲溶液可为PBS。所述蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中蛋白质的浓度为0.5mg/mL。步骤2)中吸附的时间为15-20min。

步骤3)中所述聚电解质的氯化钠溶液中聚电解质的浓度为0.1mol/L，氯化钠的浓度为0.1mg/mL。步骤3)中吸附的时间为15-20min。

本发明的方法特别适合制备生物材料为壳的复合载体，可应用于制备药物水剂、精确控制靶向给药、药物的缓释，以及放生物膜制备等方面。

本发明的再一个目的是提供一种具有协同抗肿瘤效应的药物。

本发明所提供的具有协同抗肿瘤效应的药物，由核芯、包覆所述核芯的连接层以及包覆所述连接层的壳层组成；所述核芯为吸附了抗癌药物的可降解多孔无机纳米粒子，所述连接层由聚电解质组成，所述壳层由蛋白质和聚电解质层层交替组装构成，所述蛋白质选自肿瘤坏死因子超家族成员(Tumor necrosis factor(TNF)-superfamily)之一。

其中，所述多孔无机纳米粒子具体可为纳米碳酸钙、纳米二氧化硅或其他生物兼容的多孔纳米粒子，如磁性纳米粒子、量子点等。所述多孔无机纳米粒子的直径小于1微米。所述抗癌药物为水溶性抗癌药物，具体可为多柔比星(阿霉素)。

所述聚电解质具体可为带有负电荷的聚电解质，包括多糖类物质和高分子聚合物。所述多糖类物质包括：海藻酸、海藻酸钠、肝素或透明质酸等；所述高分子聚合物包括：聚对苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸、聚乙烯膦酸等。

所述蛋白质优选肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)。

制备上述具有协同抗肿瘤效应的药物的方法，包括下述步骤：

a)将多孔无机纳米粒子置于抗癌药物的溶液中进行吸附，然后离心去掉所述多孔无机纳米粒子上未吸附的抗癌药物，然后洗涤至清洗液中无药物，得到载抗癌药物的多孔无机纳米粒子；

b)将所述载抗癌药物的多孔无机纳米粒子置于聚电解质的氯化钠溶液中进行吸附，然后离心分离并清洗，去掉纳米粒子上未吸附的聚电解质，得到包覆聚合物层的多孔无机纳米粒子；

c)将所述包覆聚合物层的多孔无机纳米粒子置于蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中进行吸附，然后离心分离并清洗，去掉纳米粒子未吸附的蛋白质；

d)将步骤c)得到的产物继续置于聚电解质的氯化钠溶液中进行吸附，然后离心分离并清洗，去掉纳米粒子上未吸附的聚电解质；

e)以所述步骤c)-d)作为一次组装处理，重复所述组装处理直至得到目标层数，即得到所述具有协同抗肿瘤效应的药物。

其中，步骤a)中所述抗癌药物的溶液中抗癌药物的浓度为1mg/mL。步骤a)中吸附的时间为6-8h。

步骤b)中所述聚电解质的氯化钠溶液中聚电解质的浓度为0.1mg/mL，氯化钠的浓度为0.1mol/L。步骤b)中吸附的时间为15-20min。

步骤c)中所述磷酸盐缓冲溶液的pH值在蛋白质的等电点以下，使蛋白质带正电荷。但所述蛋白质具体为肿瘤坏死因子相关调往诱导配体(TRAIL)时，所述磷酸盐缓冲溶液可为PBS。所述蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中蛋白质的浓度为0.5mg/mL。步骤c)中吸附的时间为15-20min。

步骤d)中所述聚电解质的氯化钠溶液中聚电解质的浓度为0.1mg/mL，氯化钠的浓度为0.1mol/L。步骤d)中吸附的时间为15-20min。

本发明通过以负载模型药物的碳酸钙粒子为模板，通过多糖作为连接桥梁，将TRAIL吸附与模板粒子表面从而构筑了一种具有协同抗肿瘤效应的纳米复合载药体系。

该体系完全采用生物兼容材料，利用层层吸附技术和模板法相结合，通过多次实验，最终得到了稳定性、生物兼容性和显著抗癌效果的新型药物联用载体，用于水溶性药物的包裹和释放，有效的降低了成本，容易实现规模化的生产。

附图说明

图1本发明的药物联用控释载体的制备方法示意图；

图2本发明采用的粒径500-800nm的碳酸钙粒子的扫描电镜照片及粒径分布图。

图3为实施例1制备的组装后的药物复合载体的扫描电镜图片。

图4是本发明的药物复合载体与宫颈癌细胞在体外共培养的激光共聚焦图片。

图5是本发明的药物复合载体、对照组分别与宫颈癌细胞共培养的细胞毒性实验结果；柱形图从左到右依次代表：单纯的Hela细胞、单纯碳酸钙纳米粒子、5个TRAIL/ALG的未吸附阿霉素的碳酸钙粒子、未包裹5个TRAIL/ALG的吸附阿霉素的碳酸钙粒子、包裹5个TRAIL/ALG的吸附阿霉素的碳酸钙粒子。

具体实施方式

下面将结合实施例及附图对本发明进行详细描述，以便于本领域技术员理解和实施本发明，并进一步认识本发明的优点。

除非在本发明说明书中另有定义，否则在此所有的技术术语都是根据本领域一般技术人员所通常使用和理解的惯用定义来使用。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

药物模型

本发明采用多柔比星作为模型药物。该模型药物是一种水溶性的广谱的抗癌药物，其对用于治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、骨肉瘤及软组织肉瘤、肺癌均有效，对膀胱癌、睾丸肿瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、肾母细胞瘤、肝癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌及头颈部癌亦有效；对胰腺癌、子宫内膜癌、脑瘤及多发性骨髓瘤也有一定疗效。该模型药物的选用，是为本发明进一步应用提供启示。

核结构材料的选用

本发明采用的作为核结构的模板材料为多孔碳酸钙纳米粒子。在众多无机纳米微粒中，纳米碳酸钙因制造工艺简单、价格相对低廉等而备受青睐。近年来，随着纳米碳酸钙的开发应用和粒子表面处理技术的进步以及复合材料制备技术的迅速发展。纳米碳酸钙粒子具有高比表面积、多孔疏松的内部结构以及良好的生物兼容性。因此，本发明优选纳米碳酸钙粒子作为构筑核壳结构药物载体的核材料。

壳结构材料的选用

本发明采用的作为壳结构的材料为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和带负电荷的黏多糖类物质。多糖是自然界中含量最丰富的多聚物及其特有的性质，无毒，无副作用，可被淀粉酶降解，是药物理想的赋型剂。相关现有技术文献披露，多糖和蛋白质之间的相互作用主要是静电作用和输水作用。因此，本发明优选的在水溶液中带有负电荷的多糖作为构筑药物载体的材料。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体是通过重组带有相关基因的质粒在大肠杆菌中重组表达制得的，其是近几年来发现的肿瘤坏死因子家族新成员，能选择性诱导转化细胞、肿瘤细胞和病毒感染细胞发生凋亡，而对正常组织无明显损伤，因而成为目前研究的热点。TRAIL活性三聚体诱发死亡受体活化，并与死亡受体胞外富含Cys区域相结合，死亡受体与胞内接头分子的死亡结构域相互结合，导致细胞内的半胱&天冬氨酸蛋白酶原(pro-caspase)在附近的募集，接头蛋白的另一端含有与半胱-天冬氨酸蛋白酶原分子相似的死亡效应蛋白结构域(death domain DD)，可以相互串联结合，这样由“死亡配体-死亡受体-接头蛋白-半胱-天冬氨酸蛋白酶原”以串联组合而形成大型的分子复合物，后者激活caspase-8。caspase-8的激活可以进一步募集和激活caspase家族中的下游信号传导酶(caspase-6，caspase-7)，形成逐步激活的瀑布效应(cascade)，直至最终效应酶(caspase-3)的激活，从而介导细胞的凋亡。自TRAIL及其受体被发现以来，人们一直认为它具有广阔的临床应用前景。现已证明，TRAIL可以在体内、体外高效杀伤多种肿瘤细胞。已经证实TRAIL体外可以抑制或诱发大多数常见人类肿瘤细胞株死亡，如结肠癌、肺癌、乳腺癌、恶性神经胶质瘤、肾癌、恶性黑素瘤及白血病细胞等。许多实验表明多种化疗药物、酶抑制剂以及放疗可以使抗性肿瘤对TRAIL恢复敏感或使敏感肿瘤变得更加敏感 这些试剂主要通过调节TRAIL受体、Caspases、cFLIP、线粒体途径、1APs、NF-KB、Akt等活性来增强细胞的TRAIL敏感性。

因此，本发明通过以负载模型药物的碳酸钙粒子为模板，通过多糖作为连接桥梁，将TRAIL吸附与模板粒子表面从而构筑了一种具有协同抗肿瘤效应的纳米复合载药体系。

蛋白质的缓冲溶液的配制

配制适当pH(如7.4)的1mg/mL TRAIL缓冲溶液，优选使pH值在蛋白质的等电点以下，从而达到调节蛋白质典型的目的，使其带正电荷。

多糖的水溶液的配制

配制1mg/mL的多糖溶液，其中加入0.1mol/L的NaCl

复合载药的制备步骤

如图1所示，首先，选取一定尺寸范围的碳酸钙纳米粒子，将其放入一定浓度的阿霉素的水溶液吸附，离心分离、清洗、去除未吸附的阿霉素；然后加入多糖溶液，吸附一段时间后，离心分离、清洗、去除未吸附的多糖溶液；再将其投入到TRAIL的水溶液中，吸附一段时间后，离心分离、清洗、去除未吸附的TRAIL溶液；反复重复上述步骤数次，将磷脂和TRAIL通过交替吸附的方式包裹在负载阿霉素的碳酸钙纳米粒子表面，从而制备出纳米复合载药体系。

实施例1、制备具有协同抗肿瘤效应的药物

取0.5g尺寸在500-800nm的碳酸钙粒子(见图2)，加入1mg/mL的阿霉素水溶液中，吸附8h，离心分离3min，去掉上层未吸附的阿霉素溶液，清洗2-3次；然后加入1mg/mL的海藻酸钠(ALG)溶液中，吸附20min后，离心分离3min，去掉上层多余的海藻酸钠的氯化钠溶液，清洗23次；再加入到1mg/mL的TRAIL缓冲溶液中，吸附20min后，离心分离3min，去掉上层多余的TRAIL缓冲溶液，清洗2-3次，然后加入1mg/mL的海藻酸钠(ALG)溶液中，吸附20min后，离心分离3min，去掉上层多余的海藻酸钠的氯化钠溶液，清洗2-3次；重复上述吸附TRAIL-海藻酸钠的过程4次，最终获得包裹5个TRAIL/ALG的吸附阿霉素的碳酸钙粒子(见图3)。

取一定量(20mg)的纳米复合载体，与Hela细胞(10⁶个)共培养30min，通过激光共聚焦显微镜，可以发现纳米复合载体已经进入到Hela细胞内部(如图4)。

比较例

分别制备包裹5个TRAIL/ALG的未吸附阿霉素的碳酸钙粒子，以及未包裹5个TRAIL/ALG的吸附阿霉素的碳酸钙粒子，作为比对照组。

利用MTT分析纳米复合载体的对宫颈癌细胞(Hela)抗肿瘤效果，各个对照组的细胞存活率如下：单纯碳酸钙的Hela细胞存活率为96％，5个TRAIL/ALG的未吸附阿霉素的碳酸钙粒子的Hela细胞存活率为83％，未包裹5个TRAIL/ALG的吸附阿霉素的碳酸钙粒子为的Hela细胞存活率为29％，包裹5个TRAIL/ALG的吸附阿霉素的碳酸钙粒子的Hela细胞存活率仅为7％(见图5，其中第一个柱状图是单纯的HeLa细胞没有加任何药品，作为空白对照组)。可以看出复合纳米载体在体外具有明显的协同抗宫颈癌效果。

实施例2

按照本发明的方法，将实施实例1中的海藻酸钠溶液替换为相同浓度的肝素钠溶液，基于同样的操作和原理进行纳米复合药物载体的构筑和细胞毒性实验。结果与实施例1相似，两者之间无显著差异。

实施例3

按照本发明的方法，将实施实例1中的海藻酸钠溶液替换为相同浓度的透明质酸钠溶液，基于同样的操作和原理进行纳米复合药物载体的构筑和细胞毒性实验。结果与实施例1相似，两者之间无显著差异。

结论

将TRAIL蛋白和多糖包裹在吸附阿霉素的碳酸钙粒子表面，不仅获得了一种生物兼容的药物载体，而且得到了具有显著抗肿瘤效果的药物联用体系。由此可见，对于水溶性抗肿瘤药物，采用模板吸附法，将其与TRAIL构筑在同一体系内，并且实现了对阿霉素的缓释效果，这一药物联用体系是可行的。

尽管本发明已经参照附图和优选实施例进行了说明，但是，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本发明的各种更改、变化、和等同物由所附的权利要求书的内容涵盖。

Claims (10)

1.一种具有协同抗肿瘤效应的纳米药物载体，由核芯、包覆所述核芯的连接层以及包覆所述连接层的壳层组成；所述核芯为可降解多孔无机纳米粒子，所述连接层由聚电解质组成，所述壳层由蛋白质和聚电解质层层交替组装构成，所述蛋白质选自肿瘤坏死因子超家族成员之一。

2.根据权利要求1所述的药物载体，其特征在于：所述多孔无机纳米粒子为纳米碳酸钙、纳米二氧化硅或其他生物兼容的多孔纳米粒子；所述多孔无机纳米粒子的直径小于1微米。

3.根据权利要求1或2所述的药物载体，其特征在于：所述聚电解质带有负电荷的聚电解质，包括多糖类物质和高分子聚合物；

所述多糖类物质选自下述至少一种：海藻酸、海藻酸钠、肝素和透明质酸；所述高分子聚合物选自下述至少一种：聚对苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸和聚乙烯膦酸；

所述蛋白质为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体。

4.制备权利要求1-3中任一项所述的具有协同抗肿瘤效应的纳米药物载体的制备方法，包括下述步骤：

1)将所述多孔无机纳米粒子置于所述聚电解质的氯化钠溶液中进行吸附，然后离心分离并清洗，去掉纳米粒子上未吸附的聚电解质，得到包覆聚电解质层的多孔无机纳米粒子；

2)将所述包覆聚电解质层的多孔无机纳米粒子置于蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中进行吸附，然后离心分离并清洗，去掉纳米粒子未吸附的蛋白质；

3)将步骤2)得到的产物继续置于聚电解质的氯化钠溶液中进行吸附，然后离心分离并清洗，去掉纳米粒子上未吸附的聚电解质；

4)以所述步骤2)-3)作为一次组装处理，重复所述组装处理直至得到目标层数，即得到所述具有协同抗肿瘤效应的纳米药物载体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤1)中所述聚电解质的氯化钠溶液中聚电解质的浓度为1mg/mL，氯化钠的浓度为0.1mol/mL；步骤1)中吸附的时间为15-20min；

步骤2)中所述磷酸盐缓冲溶液的pH值在蛋白质的等电点以下，使蛋白质带正电荷；所述蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中蛋白质的浓度为0.5mg/mL；步骤2)中吸附的时间为15-20min；

步骤3)中所述聚电解质的氯化钠溶液中聚电解质的浓度为1mg/mL，氯化钠的浓度为0.1mol/L；步骤3)中吸附的时间为15-20min。

6.一种具有协同抗肿瘤效应的药物，由核芯、包覆所述核芯的连接层以及包覆所述连接层的壳层组成；所述核芯为吸附了抗癌药物的可降解多孔无机纳米粒子，所述连接层由聚电解质组成，所述壳层由蛋白质和聚电解质层层交替组装构成，所述蛋白质选自肿瘤坏死因子超家族成员之一。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于：所述多孔无机纳米粒子为纳米碳酸钙、纳米二氧化硅或其他生物兼容的多孔纳米粒子；所述多孔无机纳米粒子的直径小于1微米；

所述抗癌药物为水溶性抗癌药物，具体为多柔比星。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述聚电解质带有负电荷的聚电解质，包括多糖类物质和高分子聚合物；

所述多糖类物质选自下述至少一种：海藻酸、海藻酸钠、肝素和透明质酸；所述高分子聚合物选自下述至少一种：聚对苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚苯乙烯磺酸、聚乙烯磺酸和聚乙烯膦酸；

所述蛋白质为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体。

9.制备权利要求6-8中任一项所述药物的方法，包括下述步骤：

a)将多孔无机纳米粒子置于抗癌药物的溶液中进行吸附，然后离心去掉所述多孔无机纳米粒子上未吸附的抗癌药物，然后洗涤至清洗液中无药物，得到载抗癌药物的多孔无机纳米粒子；

b)将所述载抗癌药物的多孔无机纳米粒子置于聚电解质的氯化钠溶液中进行吸附，然后离心分离并清洗，去掉纳米粒子上未吸附的聚电解质，得到包覆聚合物层的多孔无机纳米粒子；

c)将所述包覆聚合物层的多孔无机纳米粒子置于蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中进行吸附，然后离心分离并清洗，去掉纳米粒子未吸附的蛋白质；

d)将步骤c)得到的产物继续置于聚电解质的氯化钠溶液中进行吸附，然后离心分离并清洗，去掉纳米粒子上未吸附的聚电解质；

e)以所述步骤c)-d)作为一次组装处理，重复所述组装处理直至得到目标层数，即得到所述具有协同抗肿瘤效应的药物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤a)中所述抗癌药物的溶液中抗癌药物的浓度为1mg/mL；步骤a)中吸附的时间6-8h；

步骤b)中所述聚电解质的氯化钠溶液中聚电解质的浓度为1mg/mL，氯化钠的浓度为0.1mol/L；步骤b)中吸附的时间为15-20min；

步骤c)中所述磷酸盐缓冲溶液的pH值在蛋白质的等电点以下，使蛋白质带正电荷；所述蛋白质的磷酸盐缓冲溶液中蛋白质的浓度为0.5mg/mL；步骤c)中吸附的时间为15-20min。

步骤d)中所述聚电解质的氯化钠溶液中聚电解质的浓度为1mg/mL，氯化钠的浓度为0.1mol/L；步骤d)中吸附的时间为15-20min。

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