JPH0453491A - 酵素反応方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は酵素反応方法に係り、特に、従来、回収が困難
であったプロテアーゼやアミラーゼ等の酵素を失活させ
ることなく有効に回収、再利用することができる酵素反
応方法に関する。

［従来の技術］ でんぷん、セルロース、蛋白質等を各種酵素により分解
し、得られる低分子分解物を製品とする場合には、従来
、これらの原料液に酵素を加え、分解後、熱変性やその
他の方法により失活させ、分解物と失活酵素とを分離し
、製品としている。

この場合には、酵素は１回限りの使用で失活させるため
、再使用は不可能である。

これに対して、酵素の再利用を図る方法として、特公昭
６３−６２１９７号には、セルロース性物質の分解にセ
ルラーゼを用い、反応終了後、キトサン溶液を加え、ｐ
）（をアルカリ性に調整し、セルラーゼ凝集物を回収、
再利用する方法が開示されている。

［発明が解決しようとする課題］ 特公昭６３−６２１９７号の方法よれば、セルラーゼの
回収、再利用が可能ではあるが、この方法は、セルラー
ゼとキトサンとの親和性が特異的に良いことを利用した
発明であり、セルラーゼ以外の、このような特異的な親
和性のない酵素については適用することができない。

一方、可溶不溶可逆担体（ヒドロキシメチルセルロース
系ポリマー　：　Ｂｉｏ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、　　６　
、　１１　。

８３３　（１９８９））に酵素を固定化する研究がなさ
れているが、完全な溶解性の調節が難しく、反復刊剛性
が十分に解明されていない、可溶状態が不溶状態に変化
するｐＨ域が３〜５でかなり酸性域にあるため、酵素に
よっては失活してしまい、反復利用が不可能である、な
どの問題が残されている。

本発明は上記従来の問題点を解決し、酵素を失活させる
ことなく、有効に回収、再利用することができる酵素反
応方法を提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］ 本発明の酵素反応方法は、ｐＨ７以下の高分子基質含有
液にキトサンを担体とする固定化酵素を添加して反応さ
せた後、反応生成液のｐＨを７．５以上に調整して該固
定化酵素を析出させることを特徴とする。

以下に、本発明の詳細な説明する。

まず、本発明で用いるキトサンを担体とする酵素（以下
「キトサン固定化酵素」と称す。）について説明する。

キトサン（グルコサミンポリマー）は、通常、広く、カ
ニ、エビ等の甲羅に含まれ、それらを脱タンパク、脱カ
ルシウムすることにより得られるキトサン（Ｎ−アセチ
ルグルコサミンポリマー）を脱アセチルすることにより
得られるが、本発明で用いるキトサンはカニ、エビの甲
羅から調製されたものに限らず、広く化学合成品、酵素
合成品等、その構造が同じであればいずれでも良く、特
に限定されるものではない。本発明において、キトサン
は、分子量が５，０００〜１，０００．Ｇｏｏ脱ア脱ア
セチル化率５エ〜１００ 従って、通常の場合、このような比較的低分子量のキト
サンを得るために、キチンの脱アセチル化により得られ
た分子量ｓｏ．ｏｏｏ〜１０　、０００　、０００、平
均粒径９〜３００メツシユ、固有粘度０．２５〜２ｏｄ
ｘ／ｇーキトサン（３０℃、０．２モル酢酸＋０．１モ
ル酢酸ナトリウムで測定）、コロイド当量値（　ｐ　Ｈ
　４　）　２　、　　５　〜６　、　　２　ｍ　ｅ　ｇ
　／　ｇ−キトサンのキトサンを、常法に従って、低分
子化処理する。

本発明において、キトサンに固定化する酵素としては特
に制限はないが、特にα−アミラーゼ等のでんぷん分解
酵素、プロテアーゼ等の蛋白質分解酵素等が好適である
。勿論、前述のセルラーゼにも適用することができる。

本発明は、特に至適ｐＨ領域が７．０以下の酵素に有効
である。

酵素をキトサンに固定化するには、ｐＨ２．０〜１２．
０程度のキトサン液又は懸濁液中に酵素を添加して０〜
９０℃程度のもとに攪拌してキトサンに酵素を吸着させ
た後、架橋剤を加えて架橋処理を行なう．なお、酵素の
添加量は、キトサン１００ｇに対して１０ｍｇ〜１０ｇ
程度とする。

また、架橋剤としては、エピクロルヒドリン、グルタル
アルデヒド、カルボジイミド、有機ジイソシアネート類
等を用いることができる。架橋処理後は濾過、洗浄を行
なって、キトサン固定化酵素を得る。

本発明においては、このようなキトサン固定化酵素をｐ
Ｈ７以下の高分子基質含有液に添加してその酵素の好適
反応条件にて反応させる。その後、適当なアルカリを添
加してｐを７，５以上に調整してキトサン固定化酵素を
析出させる。析出させたキトサン固定化酵素は濾過等に
より分離回収し、適当な洗浄液で洗浄することにより、
有効に次の反応に再使用することができる。

［作用］ キトサンはその溶液のｐＨを変化させることにより可溶
・不溶の状態を調節することができる。

即ち、その可溶・不溶はキトサンの分子量（重合度）に
は左右されず、ｐＨ７．０〜７．５にて急激に溶解度が
変化し、このｐＨよりも酸性域では可溶状態、アルカリ
性域では不溶状態となる。

従フて、このようなキトサンによる可溶・不溶可逆担体
に酵素を固定化したキトサン固定化酵素は、ｐＨ７以下
で可溶状態、ｐＨ７．５以上で不溶状態の可溶・不溶可
逆酵素であり、単に溶液のｐＨを調整するのみで、容易
かつ確実に溶解性の調節を行なうことができ、反応への
供与及び回収を効率的に行なうことができる。しかも、
本発明に係るキトサン固定化酵素は可溶・不溶の繰り返
しに対しても失活することはなく、酵素活性回収率は著
しく高い。

［実施例］ 以下に実験例及び実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明する。

実験例１ ■　キトサンの調製 紅ズワイガニの甲羅を脱タンパク、脱カルシウム、脱ア
セチル化することにより得られた下記物性のキトサンを
原料としてキトサンの低分子化を行なった。

厚−料キトサン物性 粒径：９メツシュパスル２００メツシユオン平均粒径：
１６〜２４メツシユ 蒸発残分（１０５℃）／キトサン：９０．４％灰分（６
００℃）／蒸発残分：０．２％固有粘度［η］　　：　
１３．８ｄＪＲｇ−キトサンコロイド当量値（ｐＨ４）
　：　５　、　　ｔ　ｍｅｑ／ｇ−キトサン低分子化反
応は、６１の水に原料キトサン４００ｇを添加した液を
攪拌機で攪拌しながら、ｐＨ１１，０±０．２、反応温
度７０℃にて３６ｍでのＨ２Ｏ２（濃度３５％）を１０
ｍＡ／ｍｉｎの速度で添加し、添加終了後更に３０分間
保温することにより行なった。反応終了後は、濃塩酸１
６０ｍＪ２を用いて溶解し、濾過することによフてキト
サン中の不溶解分を除去した後、Ｎａ０Ｈｉ液によりｐ
Ｈ１１としキトサンを沈殿させた。この沈殿をＮａＢＨ
４を添加して還元処理した後、脱イオン水で洗浄を繰り
返し、溶解している極低分子キトサン、ＮａＣ１、Ｎａ
ＯＨ等を除去し、凍結乾燥することによりキトサン粉末
を得た。このキトサンの平均分子量は約６３０００、脱
アセチル化率は約９５％であった。

■　キトサンへの酵素の固定化 ■で調製したキトサン１００ｇを１０ｍＭ酢酸緩衝液（
ＰＨ７，５）１４２に懸濁した。そこへ酵素としてα−
アミラーゼ（Ｌｉｑｕｅｆｙｉｎｇ　Ｔｙｐｅ；Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ″　（生化学工業（株）
製））ｆｏＯｍｇ（比活性６００　Ｕ　／　ｍ　ｇ以上
）を添加した。４℃にて静かに２４時間攪拌し、酵素を
吸着させた。その後、静置し、上清をデカンテーション
により分離し、予め調製しておいた２、５重量％グルタ
ルアルデヒド−５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ７，５）１ｊ２
を加え、架橋を行なった。架橋終了後、濾過した後、４
ｍＭのＮａ２　ＳＯ４溶液で洗浄し、更に１００ｍＭの
酢酸緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄し、キトサン固定化α
−アミラーゼを得た。このキトサン固定化α−アミラー
ゼを１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）にて溶解し可
溶状態の酵素とした。

同様に、酵素として酸性プロテアーゼ（“Ａｓｐ　。

ｎｉｇｅｒ”（生化学工業（株）製））を用いて、キト
サン固定化プロテアーゼを得、可溶状態の酵素とした。

■　担体固定化酵素の溶解性の変化 ■で得られたキトサン固定化α−アミラーゼと、従来の
腸溶性ポリマー（ヒドロキシメチルセルロース系ポリマ
ー。以下ｒＡＳ−ＬＪと略記することがある。）を担体
として用いてα−アミラーゼを固定化したＡＳ−Ｌ固定
化α−アミラーゼとについて、ＰＨに対する溶解性の変
化を、相対濁度及び上清中の相対活性を測定することに
より調べ、結果を第１図に示した。

第１図により明らかなように、本発明に係るキトサン固
定化α−アミラーゼは、腸溶性ポリマーを用いた場合と
異なり、可溶・不溶変化ｐＨは７．０〜７．５であり（
Ａ　Ｓ　−Ｌ固定化α−アミラーゼはｐＨ３，０〜５．
０）、こ（７）ｐＨより酸性にて可溶であり、不溶状態
の固定化酵素は存在せず１００％の活性が認められた。

■　繰り返しによる酵素活性回収率 ■で得られたキトサン固定化α−アミラーゼをｐＨ６，
０Ｌで可溶化させ、次に、ｐＨを８．　０にて不溶化さ
せるという操作を５回繰り返し行なった。同様にＡＳ−
Ｌ固定化α−アミラーゼをｐＨ６，０にて可溶化しｐＨ
３，０にて不溶化するという操作を５回繰り返し行ない
、各々、可溶状態の時の活性値を測定し、結果を第１表
に示した。

第１表より明らかなように、キトサン固定化α−アミラ
ーゼは５回の操作で殆ど活性の変化が認められず、酵素
自体の回収率と殆ど等しい酵素活性回収率が得られた。

一方、ＡＳ−Ｌ固定化α−アミラーゼの場合には、５回
の操作で活性が約１／２以下となった。これは、用いた
α−アミラーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ
）の安定ｐＨ域が５．０〜１０．５であることに由来し
ている。

なお、■で得られたキトサン固定化プロテアーゼについ
ても同様の操作を行なったが、同様に酵素活性の低下は
殆どなく、良好な酵素活性回収率が得られた。

第１表　酵素活性回収率（％） この結果から、本発明に係るキトサン固定化酵素を、α
−アミラーゼの如く、安定ｐＨ域が中性付近ないしアル
カリ性域にある酵素に適用した場合には、酵素の失活を
防ぎ、容易にしかも完全かつ確実な溶解性の調節と、可
溶・不溶化の繰り返し使用が可能な、可溶・不溶可逆酵
素を調製できることが明らかである。

実験例２ ■　キトサンへの酵素の固定化 実験例１の■で調製したキトサン１００ｇを１０ｍＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ７，５）ＩＪ２に懸濁した。そこへ酵素
としてβ−アミラーゼ（５ｗｅｅｔＰｏｔａｔｏ；”５
ｅｒｖａ　Ｆｅ１ｎｂｉｏｃｈｅＩＩ＋ｉｃａ”（Ｇｍ
ｂＨ＆　Ｃｏ　（西独）製））ｊｏｏｍｇ（比活性５０
０　Ｕ　／　ｍ　ｇ以上）相当を添加した。４℃にて静
かに２４時間攪拌し、酵素を吸着させた。その後、静置
し、上滑をデカンテーションにより分離し、予め調製し
ておいた２、５重量％グルタルアルデヒド−５ｍＭ酢酸
Ｍ衝液（ＰＨ７，５）１４２を加え、架橋を行なった。

架橋終了後、濾過した後、４ｍＭのＮａ２５Ｏ＋溶液で
洗浄し、更に１００　ｍ　Ｍの酢酸ｔ＆衝液（ｐＨ７，
５）で洗浄し、キトサン固定化β−アミラーゼを得た。

このキトサン固定化β−アミラーゼを１００ｍＭ酢酸Ｍ
衝液（ｐＨ５，０）にて溶解し可溶状態の酵素とした。

■　担体固定化酵素の溶解性の変化 ■で得られたキトサン固定化β−アミラーゼと、従来例
に係るＡＳ−Ｌ固定化β−アミラーゼとについて、ｐＨ
に対する溶解性の変化を、相対濁度及び上清中の相対活
性を測定することにより調べ、結果を第２図に示した。

第２図により明らかなように、本発明に係るキトサン固
定化β−アミラーゼは、その酵素β−アミラーゼの至適
ｐＨ３，５において可溶である。一方、ＡＳ−Ｌ固定化
β−アミラーゼはｐＨ３，５では不溶である。

この結果から、β−アミラーゼ（至適ｐＨ３，５）の如
く、従来のＡＳ−Ｌ等では、酵素の至適ｐＨでは不溶と
なってしまうために適用不可能であった酵素にも、本発
明は有効に適用できることが明らかである。

■　キトサンへの酵素固定化の効果 本発明に従って、キトサンへ酵素を共有結合により固定
化した場合と、単に吸着により担持した場合とについて
その効果を確認した。即ち、上記■で得られたキトサン
固定化β−アミラーゼと、上記■において、グルタルア
ルデヒドによる架橋処理を省略して調製したキトサン吸
着β−アミラーゼ（この場合、キトサンとβ−アミラー
ゼとに特別な親和性がないため、キトサン吸着β−アミ
ラーゼは、共有結合で固定化したキトサン固定化β−ア
ミラーゼのと比較して活性にして１０％以下しか酵素を
固定化することができなかった。）とについてそれぞれ
、ｐＨ６，０にて可溶化させ、ｐＨ８，０にて不溶化し
、上清を取り除くという操作を３回繰り返し、酵素活性
回収率を求め、結果を第２表に示した。なお、いずれの
場合も、処理回数０の場合の活性を１００として相対値
で表示した。

第２表より明らかなように、キトサン固定化β−アミラ
ーゼは、全く活性が変化しなかったのに対し、キトサン
吸着β−アミラーゼは３回の繰り返しで殆ど活性は失わ
れた。これは可溶化、不溶化の操作の中でβ−アミラー
ゼはキトサンへの吸着力のみでは保持できず、損失され
てしまったためと考えられる。

第２表　酵素活性回収率（％） 実施例１ 実験例１で調製したキトサン固定化α−アミラーゼを用
いて、本発明の方法に従って酵素反応を行なった。

まず、下記高分子基質含有液ｉｆｌにキトサン固定化α
−アミラーゼ１０ｇを添加し、６５℃で５時間反応させ
た。

高　子基質含有液 高分子基質：さつまいもでんぷん （和光純薬工業（株）製品） 溶媒：０，１モルリン酸緩衝液 濃度：１００ｇ／ｕ ｐ’Ｈ：６．０ 反応終了後、反応生成液に３０％アンモニア水を添加し
てｐＨを８．０に調整したところ、析出物を得た。得ら
れた析出物を濾過分離した後、０．１モルリン酸緩衝液
（ｐＨ８，０）で洗浄した。この析出物は分析の結果、
キトサン固定化α−アミラーゼであり、その回収率は１
００％、酵素活性回収率は１００％であることが確認さ
れた。

一方、濾液について分析したところ、高分子基質は、グ
ルコース、デキストラン、オリゴ環等に完全に分解され
ていることが確認された。

上記で回収したキトサン固定化α−アミラーゼを用いて
、同様の酵素反応を繰り返し行なったところ、第１回目
の反応とほぼ等しい、高い反応効率にて分解を行なうこ
とができた。

［発明の効果］ 以上詳述した通り、本発明の酵素反応方法によれば、高
分子基質と酵素との反応において、可溶・不溶可逆性の
キトサン固定化酵素を用いることにより、車にｐＨを所
定域に調整するのみで、容易かつ確実に、効率的に酵素
反応及び酵素の回収、再利用を実施することが可能とさ
れる。

しかも、回収にあたり、酵素を失活させることがなく、
その酵素活性の回収率は著しく高い。更に、キトサンは
安価に人手可能であるため、経済的にも極めて有利であ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は実験例１で得られた担体固定化α−アミラーゼ
のｐＨに対する溶解性の変化を示すグラフ、第２図は実
験例２で得られた担体固定化β−アミラーゼのｐＨに対
する溶解性の変化を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）ｐＨ７以下の高分子基質含有液にキトサンを担体
   とする固定化酵素を添加して反応させた後、反応生成液
   のｐＨを７．５以上に調整して該固定化酵素を析出させ
   ることを特徴とする酵素反応方法。