JPH04502159A - マガイニンペプチドの欠失アナログ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 マガイニンペプチドの欠失アナログ 本発明はマガイニンとして知られている生物学的活性ペプチド群に関する。特に 本出願は該ペプチド中の少なくとも１残基がそのペプチド鎖から欠失したマガイ ニンペプチドのアナログに関する。このようなアナログは一般に′欠失アナログ と呼ばれる。

本発明の特徴に従がい、以下の一文字アミノ酸コードおよびペプチド中の各アミ ノ酸の位置を示す数字を用いた構造式で表わされるマガイニンＩで： ＧＩＧＫＦＬＨＳＡＧ　Ｋ　Ｆ　Ｇ　Ｋ　Ａ　Ｆ　Ｖ　Ｇ　Ｅ　Ｉ　Ｍ　Ｋ　Ｓ ｌ　２３４５６７　ｇ　９１０　Ｉｆ　１２１３１４１５１６１７１８１９２０ ２１２２２３かつ１５から２３のアミノ酸のうちの少なくとも１つを欠失するア ミドまたはカルボキシ末端を有するマガイニンＩのペプチド欠失アナログを含む 化合物が提供される。好ましい態様ではアミノ酸残基１５．１６．１８．１９． ２１．２２および２３のうちの少なくとも１つが欠失している。ある態様におい ては少なくともアミノ酸残基１８が欠失している一方、他の態様では少なくとも アミノ酸残基１９が欠失してふり、また別の態様においては少なくともアミノ酸 残基２１を欠失している。好ましい態様ではアミノ酸残基１８．１９および２１ のうちのどれか１つのみが欠失している。また別の好ましい態様にはアミノ酸残 基２１，２２および２３が欠失しているもの、アミノ酸残基１９乃至２３が欠失 しているもの、アミノ酸残基Ｉ８乃至２３が欠失しているもの、およびアミノ酸 残基１７乃至２３が欠失しているものがある。これらの化合物はアミドまたはカ ルボキシ末端を有するマガイニンＩの欠失アナログといい得る。

これらの欠失アナログを以後マイナス記号（−）、アミノ酸残基の１文字コード および配列中の残基位置を示す下付きの数字で表わす。またマガイニンＩまたは ■も参照する。

本発明の別の特徴に従がい、１文字アミノ酸コードとペプチド中の残基位置を示 す各アミノ酸残基の下の数字を用いた以下の構造式： ％式％ であられされるマガイニン■で、かつアミノ酸残基１５乃至２２の少なくとも１ つの残基を欠失するアミドまたはカルボキシ末端を有するマガイニン■の欠失ア ナログも提供される。好ましい態様ではアミノ酸残基１５．１８．１９．２０． ２１、及び２２の少なくとも１つが欠失している。ある態様では少なくともアミ ノ酸残基１８が欠失している。別の態様では少なくともアミノ酸残基１９が欠失 している。また別の態様では少なくともアミノ酸残基２１が欠失しているか、ま たは少なくともアミノ酸残基２２が欠失している。好ましい態様においてはアミ ノ酸残基１８．１９．２１および２２のうちの各々１つのみが欠失している。こ れらの化合物はアミド末端を有するマガイニン■の欠失アナログということがで きる。

先に述べたように７ガイニンＩおよびマガイニン■の欠失アナログはグラム陽性 およびグラム陽性のバクテリアに対し有効であるがヒトの赤血球細胞に対する溶 血作用はわずかであることが分っている。

本発明に従かいマガイニンＩまたはマガイニン■ペプチドの欠失アナログを含む 化合物は抗生物質として有効であり、バクテリア、菌類、ウィルスなどの微生物 の増殖を阻害または阻止するのに使用し得る。同様にこれらの化合物はウィルス の増殖を阻害または阻止する抗ウィルス剤として使用し得る。

このような化合物は精子の運動を阻害または阻止する殺精子剤としても使用し得 る。

またこれらの化合物は腫瘍の増殖を阻害または阻止する抗腫瘍剤としても使用し 得る。

この化合物はグラム陽性およびグラム陰性細菌、菌類、プロトシア、などを含む 多くの微生物に対して巾広い強力な抗生活性を有する。これらの化合物はこれら の化合物に対して感受性の生物によって引き起こされる微生物感染を治療または コントロールするのにも使用し得る。

またこれらの化合物は微生物で汚染した物質の保存剤または滅菌剤としても使用 し得る。

本発明はいかなる理論によっても制限されることはないけれども予備的なＮＭＲ 実験から、マガイニン■の構造は溶媒依存であり、水中でのランダムコイルから トリフルオロエタノールなどのより疎水的溶媒におけるα−ヘリックスへと変化 することが示されている。これらの結果はマガイニンが種々の微生物の脂質膜に 接する時α−へリックス構造が誘導され得ることを示している。

一般に、マガイニンＩまたはマガイニン■ペプチドの欠失アナログは全身投与さ れる場合体重キログラム当り約１ｍｇ乃至約５００ｍｇか投与される。局所的に 投与される場合このペプチドは約０．５％乃至約５％の濃度のものが使用される 。

本発明に従かうマガイニンＩまたはマガイニン■の欠失アナログを含む化合物は 広範囲の宿主の治療に使用し得る。好ましい態様における宿主は動物であり、そ の動物はヒトでもヒト以外の動物でもよい。

マガイニンＩまたはマガイニン■の欠失アナログを含む化合物は賦形剤、無毒性 バッファ、または生理食塩水などの無毒性医薬キャリヤーまたはベヒクルととも に広範囲な医薬組成物に使用し得る。これらの医薬組成物は局部的または全身的 に使用され、かつ液体、固体、半固体、注射液、錠剤、軟こう、ローション、ベ ースト、カプセルなど適当な形状で用いられる。またマガイニンＩまたはマガイ ニン■の欠失アナログを含む化合物は、プロトシア、ウィルスなどを含む有害微 生物によって引き起こされる感染をコントロールするのに有利と思われる場合は アジュバント、プロテアーゼインヒビター、または適合する薬剤と組合せて使用 し得る。

本発明のマガイニンＩまたは■の欠失アナログを含む化合物はその抗生有効量、 および、または抗腫瘍有効量、および、または抗ウイルス有効量および、または 抗微生物有効量、および、または殺精子有効量を宿主、特に動物に投与し得る。

マガイニンＩおよびマガイニン■ならびに本発明のマガイニン■およびマガイニ ン■ペプチドの欠失アナログ（マガイニンエおよびマガイニン■各々のアミド末 端型およびカルボキシ末端型の両型）は当業者によく知られているペプチド合成 の従来法合成し得る。特に固相法が好ましい。

ここで述べるペプチドは同時多重ペプチド合成法（ＳＭＰＳ）で合成した。この 方法は、ホーテン（Ｈｏｒｇｈｔｅｎ）、Ｒ，Ａ、、　”多数のペプチドの迅速 固相合成の一般的方法・各アミノ酸レベルでの抗原−抗体相互作用の特異性”　 、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

８２、　ｐｐ　５１３１−５１３５　（１９８５）、およびホーテン（Ｈｏｒｇ ｈｔｅｎ）、Ｒ，Ａ、。

等“同時多重ペプチド合成：生物学的、免疫学的および方法論的研究を目的とし た多種ペプチドの迅速な大量合成”Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｃｈｅｍ−ｉｓｔｒｙ、　 ｐｐ、　２９５−２９８（１９８７）　に詳しく報告されている。この方法によ り、完全な一連の欠失アナログを合成し得る。

以下に示す例を実施するための欠失アナログシリーズは２３種のペプチドからな る。最初のペプチドはアミノ酸残基１を欠失しており、第２ペプチドはアミノ酸 残基２を欠失しており、以下同様にして２３番目のペプチドはアミノ酸残基２３ を欠失しているものである。このように一連の欠失アナログはマガイニンｌおよ びマガイニンＨの両方について合成し得る。

比較のためにアミド末端またはカルボキシ末端の完全なマガイニンＩおよびマガ イニン■もＳＭＰＳ法で合成する。また本発明の範囲にはマガイニン■またはマ ガイニン■構造から１つ以上のアミノ酸残基が欠失したものも合成し得ることが 含まれる。このようなペプチドについては例５で述べる。

ここで本発明の図式について述べる。

第１ａ図はマガイニンＩまたはそのアナログおよび大腸菌を含むサンプルに関す る１／（光学密度変化）とペプチドのマイクログラム数／−のグラフである。

第１ｂ図はマガイニン■またはそのアナログおよび大腸菌を含むサンプルに関す る１／（光学密度変化）とペプチドのマイクログラム数／ｒｎ１のグラフである 。

第２ａ図はマガイニンＩまたはそのアナログおよびＳ、エビデルミス（ｅｐｉｄ ｅｒｍｉｓ）を含むサンプルに関する１／（光学密度変化）とペプチドのマイク ログラム数／ｄのグラフである。

第２ｂ図はマガイニン■またはそのアナログおよびＳ、エビデルミス（ｅｐｉｄ ｅｒｍｉｓ）を含むサンプルに関する１／（光学密度変化）とペプチドのマイク ログラム数／ｄのグラフである。

第３図は】Ｏｇ（大腸菌１゜ＯＸｌ　０’　ＣＦＵ／−の１０−２．１０−３お よび１０−４希釈物由来のバクテリア数）と大腸菌をマガイニンＨの一６１＠欠 失アナログ（０）、マガイニンＨの−Ｅ１９欠失アナログ（−−−）　、アミド 末端マガイニンＩＩ　（Ｄ）またはコントロール（ロ）とインキュベーションし た時間のグラフである。

ここで本発明の例を示すが、これによって本発明の範囲が限定されることはない 。

例１−ペプチド合成 マガイニン１１マガイニン■およびその欠失アナログのペプチド合成は同時多重 ペプチド合成法を用いて行った。全ての溶媒および試薬は分析用のもので精製せ ずに使用した。標準的Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ−保護アミノ酸を合成に用いた。側鎖の保 護にはベンジル（Ｓｅｒ、Ｇ　Ｉ！　ｎ）、２Ｃｊ’−Ｚ（Ｌｙｓ）　（Ｚ＝ベ ンジルオキシカルボニル基）　、Ｎ”−ＤＮＰ　（旧Ｓ）およびスルホキシド（ Ｎｅｔ）を用いた。

ペプチド合成はレジンパケット当り１００ｍｇのＢｏｃ−アミノ酸−Ｐａｍレジ ンを用いてＣ末端カルボキシルペプチド（アブライドバイオシステムズからＰＡ Ｍとして市販されている、置換能０．５６ｍｅｑ／ｇｍのアミノポリスチレンの アミノアシル−４−〔オキシメチル〕フェニル酢酸誘導体）を作るかまたは１０ ０ｍｇのメチルベンズヒドリルアミンレジン（置換能０．６５　ｍｅｑ／ｎ＋４ りを用いてＣ−末端アミドペプチドを作った。

合成後完全に保護されたペプチドレジンを０．５ＭチオフェーノールのＤＭＦ溶 液で３回処理しヒスチジンからＮ”−ジニトロフェニル基を除去した。最後のＢ ｏｃ基はＴＦＡで除去し最終的ＨＦ処理の際のメチオニル残基のｔ−ブチル化を 回避した。高低ＨＦ操作を用いて切断した。タム（Ｔａｍ）等Ｊ、　Ａｍ、　Ｃ ｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　１０５．　ｐｐ６４４２　（１９８３）。Ｐａｍ　レジン 上で合成したペプチドに対してパケットにレジンを入れたまま、多重ＨＦ装置中 ０℃、２時間かけて低ＨＦ処理を行った。ＭＢＨＡレジンを用いて合成したペプ チドに対しては一般的反応容器中０℃、２時間かけて低ＨＦ処理を行った。Ｐａ ｍレジンペプチドについては２４個の反応容器中の低ＨＦ混合物を水流ポンプ、 ついで真空ポンプを用いて乾燥させた。ジメチルスルフィド（低ステップ由来） およびＨＦを除去してから、このペプチドを一５℃〜０℃で３０分間〜１時間、 高ＨＦ（１０％アニソール）処理した。ＨＦは高流量の窒素ガスで蒸発させた。

ＭＢＨＡレジンの入ったバッグを含む低ＨＦ反応容器は廃液容器中に低ＨＦ混合 物中の液体を注ぎ出すことで空にした。そのバッグを直ちに冷エーテル、つづい てＣＨ，ＣＡ、　、ＤＭＦ、ＣＨ，ＣＩ２゜、ＩＰＡ％ＣＨ２Ｃｌ、の順で洗浄 した。このパケットを乾燥し、スキャベンジャ−として０．７−のアニソールを 用い２４連ＨＦ装置の各チューブに入れた。−７０℃で乾燥フッ化水素を凝縮さ せて高ＨＦ処理を行った。反応は一１０℃で１時間行ない、つづいて−５℃〜０ ℃で３０分間行った。つぎに高流量の窒素ガスでＨＦを除去した。最後に乾燥エ ーテルで洗浄することにより残存するカルボニウムイオンスキャベンジャ−を除 去した。

つづいて１０％の酢酸で粗ペプチドを抽出した後ベックマン−アルチクモデル４ ２１ＨＰＬＣシステムおよび２つのモデルｌｌ０Ａポンプを用いた分析用逆相力 ラム（ヴイダツクＯＤ３２５ｃｍｘ４、６ｍｍ＞によるＲＰ−ＨＰＬＣで分画し た。溶媒系には流速１．〇−／ｍｉｎで、バッフｙＡ０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２０ 、および）くツファＢ、０．０５％ＴＦＡ／ＣＨ，ＣＮを用いた。ペプチドは日 立１００−２０スペクトロフオトメーターを用い２１５ｎｍで検出した。

このペプチドの精製はＣＨ３ＣＮと０．０５％ＴＦＡで作った溶出勾配を用いた ヴイダックＣ＋ｓ　（２２ｍｍＸ２５ｃｍ）　１０ｔｔｒｔｒノ’？　−７キン グカラムの逆相ＨＰＬＣで行った。アミノ酸分析は定常的（沸騰）６ＮＨＣＡ中 での１１０℃、２４時間のペプチドの加水分解につづくベックフッ６３００分析 機で行った。これらの分析値は理論値の±１０％の範囲にあった。

例２−抗微生物検定 抗微生物検定は９６穴組織培養プレートで行った。ＬＢ培地（大腸菌（Ｅｓｃｈ ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）およびスタフィロコッカス　エビデルミス（Ｓｔａ ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ））またはＹＴＢ培地（カンタイ タ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ））に懸濁した所定の微 生物を各ウェル中でインキュベートした。ペプチドまたはそれらの欠失アナログ （１ｘＰＢＳ、ｐＨ７，０に溶解した）を加えて各ウェルの最終的細胞密度を１ ．０Ｘ１０”コロニー形成単位（ＣＦＵ）／Ｗｄｌとした。使用した最終的ペプ チド濃度は各々１００μｇ／ｍｅ、７５、０　μｇ／ｍｌ、　５０　μｇ／ｄ、 ２５μｇ／ｍ１、および１０μｇ／ｍｉ！であった。しかしＣ，アルビカンス（ ａｌｂｉｃａｎｓ）に対しては５００μｇｏｄまでの濃度を用いた。

ウェルへのペプチドの添加を時間ゼロとする。６時間後にプレートをタイターチ ク・マルチスキャン装置に入れＯＤ　ｓ　ｔ。を測定した。このプレートおよび 最初の接種物を３７℃でインキュベートした。

プレート当り５個のウェルには培地のみを入れた。一方別の５個のウェルには培 地と細胞を入れた。これらのコントロールは培地汚染の可能性の除外および微生 物の非阻害増殖の尺度に用いた。

大腸菌またはＳ、エビデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）に関する上述の種々の濃 度のペプチドまたはその欠失アナログを含むウェルの１／（光学密度変化）の値 を第１図および第２図に示した。第１図はマガイニンＩまたはその欠失アナログ 、またはマガイニン■またはその欠失アナログと大腸菌を含むウェルに関する１ ／（光学密度変化）の測定値のグラフである。第１ａ図はマガイニンＩ　（Ｘで 示されている）およびその欠失アナログに関するグラフであり（アミノ酸残基２ ３を欠失する欠失アナログはテストしなかった）、第１ｂ図は、マガイニンＩＩ （Ｘで示されている）およびその欠失アナログに関するグラフである。両グラフ ともＺは培地子細胞のコントロールである。

第２図はマガイニンｌまたはマガイニン■またはそれらの欠失アナログとＳ、エ ビデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）を含むウェルに関する１／（光学密度変化） の測定値のグラフである。第２ａ図はマガイニン１　（Ｘで示されている）およ びその欠失アナログに関するグラフであり（アミノ酸残基２３を欠失する欠失ア ナログはテストしていない）、第２ｂ図はマガイニンＩｔ（Ｘで示されている） およびその欠失アナログに関するグラフである。両グラフともＺは培地＋細胞の コントロールである。マガイニンエおよびマガイニン■およびそれらの欠失アナ ログに関して測定した１／（光学密度変化）の測定値は大腸菌およびＳ、エビデ ルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）に対するそれらの効果の測定値と相関関係がある 。

ペプチドの活性度は欠失アナログの阻害的増殖をコントロール細胞の非阻害的増 殖と６時間以上に渡って比較することにより決定した。それらのペプチドおよび それらの欠失アナログ各々の増殖阻害効果を以下の第１表に示した。第１表にリ ストしであるＭＩＣはＣ末端カルボキシル型（カルボキシル末端）マガイニンＩ であり、一方、Ｍ２ＡはＣ末端アミド型（アミド末端）マガイニン■である。各 ＭＩＣまたはＭ２Ａの後の文字および数字コードはマガイニンＩ（カルボキシル 末端）またはマガイニン■（アミド末端）の特定の欠失アナログから欠失したア ミノ酸残基を示している。

また粗マガイニンＩおよびマガイニン■ならびに粗欠失アナログ調製物の抗微生 物活性は実験誤差の範囲で精製したマガイニン！およびマガイニン■ならびにそ れらの欠失アナログの活性と同じであった。

先の第１表ならびに第１図および第２図に示されているようにＮ末端領域（アミ ノ酸１〜１４）にペプチド欠失を有するアナログは大腸菌およびＳ、エビデルミ ス（ｅｐｉｄｅｒｎ＋ｉｓ）に対するペプチドの活性が減少している。マガイニ ンＩまたはマガイニン■からのグリシン（アミノ酸１８）またはグルタミン酸（ アミノ酸１９）の欠失はそれらの相対的阻害濃度で比較したときマガイニンＩお よびマガイニン■の両方に関して最も活性の高い欠失アナログを与えた。Ｃ，７ ７１，ビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）に関し１００μｇ／ｍｌ！ではどの欠失ア ナログも活性を示さなかったが、４００μｇ／−でテストした場合、アラニン（ アミノ酸１５）が欠失したマガイニン■の欠失アナログは低いが有意な活性を示 した。

全配列をもつマガイニンＩとマガイニン■を比較するとＣ末端アミドを有するペ プチドはＣ末端カルボキシ型のものより活性が高いことが分った。ペプチド濃度 ２５μｇ／ｄのマガイニンＩアミド型に関する大腸菌の増殖阻害は１００％であ った。しかし、２５μｇ７ｍＩ！の対応するカルボキシ型の増殖阻害はわずか７ ０％であった。マガイニン■のアミドおよびカルボキシ型に関する大腸菌に対す る抗微生物活性の差はより有意でっだ。第１表に示すようにマガイニンのＣ末端 カルボキシ型は５０μｇ／−の濃度で１００％阻害を示したがマガイニン■のア ミド型が１００％阻害を示す濃度は２５μｇ／−であった。

（例３）微生物死滅の速度論 アミド末端マガイニン■、グリシン（アミノ酸１８）欠失アミド末端マガイニン ■およびグルタミン酸（アミノ酸１９）欠失アミド末端マガイニン■の溶解ペプ チド調製物を大腸菌（１，ＯＸｌ　０’　ＣＦＵ／ｍｌ’）の入った試験管に最 終ペプチド濃度２５μｇ／ｄとなるように加えた。第３図に示したように添加後 １５．３０．４５および６０分の時点で各チューブから１０．０μｌを採取し、 ＬＢ培地で１４倍に希釈した。各時点でのバクテリア数は１０４．１０−３およ び１０−４希釈物１０．０μｌをブレーティングして測定した。各時点の各希釈 物のバクテリア数の対数値を計算し、第３図のグラフにプロットした。培地のみ およびペプチドなしの２つのコントロールをインキュペプチドおよび細胞を含む チューブとともにインキュベートした。使用したチューブおよび寒天プレートの インキュベーションは３７℃で行った。

第３図に示されているように、マガイニン■の−Ｇ”またはＥ　＋ｓ欠失アナロ グとインキュベートした場合、大腸菌の増殖は速やかに停止した。各々の場合、 ペプチド調製物添加後１５分以内に全ての大腸菌は死滅した。大腸菌を完全に死 滅させることに関し、完全な配列のアミド末端型マガイニン■は−Ｇ１１ｊ；よ び−Ｅ”欠失アナログよりも非常に時間がかかった。このようにアミド末端型マ ガイニン■の−Ｇｌ″および−Ｅ’″欠失アナログは大腸菌について非常に高い 細胞溶解を行ない得る。

（例４）ヒト赤血球の溶血 マガイニンおよびそれらの欠失アナログの溶血活性をヒトの赤血球を用いて調べ た。１０μｌの血液をＰＢＳ等張バッファ（ｐｔ１７）に懸濁し、ついでペプチ ドを添加して全容量をｌｌ１１７！とじた。

このサスペンションを緩やかに混合し３７℃で３０分間インキュベートした。つ いでこのサンプルを１０００ｇで５分間遠心し、その上清をペレットから分離し て４１４％ｍの光学密度を測定した。

１００％の溶血は純水中でヒト赤血球を破壊することにより測定した。この結果 を以下の第２表に示す。

ＭＩＣ／Ｍ２Ａ　２　４　２　２　１　２　０　０　０　０ＭＩＣ−５”／Ｍ２ Ａ−Ｓ”　ＮＤ　Ｉ　ＮＤ　Ｉ　ＮＤ　Ｉ　ＮＤ　ＯＮＤ　ＯＭＩＣ−Ｋ”／Ｍ ２Ａ−Ｎ！２０　２　０　０　０　０　０　０　０　０ＭＩＣ−Ｍ”／Ｍ２Ａ− Ｍ”　１　０　０　０　０　０　０　０　０　０ＭＩＣ−１”／Ｍ２Ａ−１”° 　１００００１００Ｏ００００００”／Ｍ２Ａ−Ｅ”　１　０　０　０　０　０ 　０　０　０　０ＭＩＣ−Ｇ”／Ｍ２Ａ−Ｇ”　１　４　０　４　０　４　０　 ３　０　０ＭＩＣ−Ｖ”／Ｍ２Ａ−Ｖ１７１　０　１　０　１　０　０　０　０ 　０ＭＩＣ−Ｆ”／Ｍ２Ａ−Ｆ”　１　１　０　０　０　０　０　０　０　０Ｍ ＩＣ−Ａ”／Ｍ２Ａ−Ａ”　１　４　１　３　１　３　０　３　０　０ＭＩＣ− Ｋ”／Ｍ２Ａ−ＫＩ４０　１　０　１　０　０　０　０　０　０ＭＩＣ−Ｇ”　 ／Ｍ２Ａ−Ｇ’！　０３０２０２０１００ＭＩＣ−Ｆ”／Ｍ２Ａ−Ｆ”　０　１ 　０　１　０　１　０　０　０　０ＭＩＣ−に目／Ｍ２Ａ−Ｋ”　１　１　１　 ０　０　０　０　０　１　０ＭＩＣ−Ｇ”／Ｍ２Ａ−に１０１　１　１　０　０ 　０　０　０　１　０ＭＩＣ−Ａ’／Ｍ２Ａ−Ａ’　０　０　０　０　０　０　 ０　０　０　０ＭＩＣ−５”／Ｍ２Ａ−Ｓ”　０　０　０　０　０　０　０　０ 　０　０ＭＩＣ−Ｈ’／Ｍ２Ａ−Ｈ２Ｏ０００００００００ＭＩＣ−Ｌ’／Ｍ２ Ａ−Ｌ”　０　１　０　０　０　０　０　０　０　０ＭＩＣ−Ｆ’／Ｍ２Ａ−Ｆ ２Ｏ１０１００００００ＭＩＣ−に’／Ｍ２Ａ−に’　０　２　０　１　０　０ 　０　０　０　０ＭＩＣ−Ｇ’／Ｍ２Ａ−Ｇ’　０　０　０　０　０　０　０　 ０　０　０ＭＩＣ−１”／Ｍ２Ａ−１”　ＮＤ　ＯＮＤ　ＯＮＤ　ＯＮＤ　ＯＮ Ｄ　ＯＭＩＣ−Ｇ’／Ｍ２Ａ−Ｇ’　ＮＤ　ＯＮＤ　ＯＮＤ　ＯＮＤ　ＯＮＤ　 Ｏ’ＭＩＣ＝Ｃ末端カルボキシ型マガイニンＩＭ２Ａ＝Ｃ末端アミド型マガイニ ン■ 先の第２表に示したようにアミド末端型マガイニン■は５０μｇ／−で２％の溶 血を起したが、カルボキシ末端型マガイニンＩは５０μｇ／ｄの濃度で１％の溶 血を示した。マガイニン■およびマガイニン■とも２５μｇ／ｒｎＩの濃度では ヒトの赤血球の溶解は起こさなかった。マガイニンＩおよびマガイニン■両方の −６１および−Ｅ”欠失アナログは例２の抗微生物検定で示された最小阻害濃度 である１０μｇ／ｒｎＩで溶血活性を示さなかった。

また第２表に示されているようにマガイニンＩの欠失アナログ中アミノ酸１５乃 至２２のいずれか１つが欠失しているものは１００および７５μｇ／−の濃度で 溶血活性の減少が見られた。

５０μｇ／−ではマガイニンエの欠失アナログ中アミノ酸１６．１８．１９．２ ０．２Ｉまたは２２のいずれか１つが欠失しているものに溶血活性の減少が見ら れた。マガイニン■の欠失アナログについても１００．７５および５０μｇ／− の濃度でアミノ酸１６．１７．１９．２０．２１または２２のいずれか１つが欠 失しているものに溶血活性の減少が見られた。

したがってマガイニンＩおよび■のこれらの欠失アナログはマガイニンＩおよび マガイニン■よりもヒトの赤血球の溶血を起こさないことが分った。つまりマガ イニンＩまたはマガイニン■よりも大きい抗微生物活性を示すが、赤血球の溶血 活性は小さい特定の欠失アナログを用いることが望ましい。

（例５）多重ペプチド欠失を有するマガイニン■のアミド末端型欠失アナログに 関する大腸菌の有効な増殖阻害光に述べた同時多重ペプチド合成法を用いてアミ ド末端型マガイニン■の欠失アナログを合成した。この例で使用するために合成 したペプチドはアミノ酸残基２３を欠失しているもの、アミノ酸残基２２および ２３を欠失しているもの、アミノ酸残基２１．２２および２３を欠失しているも の、および同様にしてアミノ酸残基１７乃至２３を欠失しているものまでのペプ チドである。

つぎに各ペプチドを組織培養ペプチドのウェル中、ＬＢ培地に懸濁した大腸菌と インキュベートした。欠失アナログを添加する際（ＩＸＰＢＳ％ｐＨ７，０に溶 解したもの）、各ウェルには最終細胞密度１．０Ｘ１０’コロニ一形成単位／ｄ のものが入っている。

ウェルへのペプチドの添加時を時間ゼロとする。採用した最終ペプチド１度は１ ００μｇ／ｒｎｌ、　？５．Ｏｕｇ／ｍｆ、　５０．０μｇ／ｍｌおよび２５μ ｇ／ｍｌである。このペプチドを大腸菌と３７℃で６時間インキュベートした。

６時間後にこのプレートをタイターチク・マルチスキャン装置に入れ０Ｄ６２゜ を測定した。

ペプチドの活性度は６時間に渡り大腸菌の増殖を阻害する相対能力に関し本来の 配列のものと欠失アナログを比較することにより測定した。各ペプチドの効果的 増殖阻害を以下の第３表にリストした。°第３表において各ペプチドの末端にあ る”Ｂ”マガイニンＩ欠失アナログのアミド末端を示している。

第３表 ペプチド（アミド末端型　欠失アミノ　大腸菌１００％阻害のマガイニンＩ欠失 アナログ）　酸残基　最小ペプチド濃度ＧＩＧＫＦＬ）ＩＳＡＧＫＦＧＫＡＦＶ ＧＥＩＭＫＢ　２３　２５　ｍｇ／ｍ／ＧＩＧＫＦＬＨ３ＡＧＫＦＧＫＡＦＶＧ ＥＩＭＢ　２２および２３　７５　ｍｇ／ＪＧＩＧＫＦＬＨ３ＡＧＫＦＧＫＡＦ ＶＧＥＩＢ　２１　〜２３　５０　ｍｇ／ｒｎＩＧＩＧＫＦＬＨ３ＡＧＫＦＧＫ ＡＦＶＧＥＢ　２０　〜２３　１００　ｍｇ／＋ＪＧＩＧＫＦＬＨＳＡＧＫＦＧ ＫＡＦＶＧＢ　１９　〜２３　２５　ｍｇ／＋ＪＧＩＧＫＦＬＨＳＡＧＫＦＧＫ ＡＦＶＢ　１８　〜２３　５０　ｍｇ／ｍｊＧ４ＧＫＦＬＨ３ＡＧＫＦＧＫＡＦ Ｂ　１７　〜２３　５０　ｍｇ／ｍｊ「 先に述べたようにマガイニンＩおよびマガイニン■の両方ともα−へリックス構 造をとっていると推定される。ペプチドの構造と生物学的活性の関係を決定する のにい（っがの方法が使われている。本発明はいかなる理論によっても制限を受 けることはないが、構造−活性の関係を研究するより一般的な基礎を提供する１ つの方法はこのペプチド鎖中の単一アミノ酸残基の欠失によるものである。ペプ チド鎖に沿ったアミノ酸残基の欠失はこのペプチド鎖のバックボーンを短縮し、 したがって側鎖を新しい空間的配向へと導くことから、α−へリックスが誘導さ れる場合そのようなアナログは新しい構造をとらざるを得ない。したがってより 安定な両親媒性構造を取りやすくするようにバックボーンを短縮する欠失は生物 学的に活性なペプチドを設計する上で重要な因子となり得る。ペプチドの構造と 動力学を測定するための物理学的方向はたくさんあるが、明らかに、これらの分 子に行ない得る最も重要なテストはそれらの生物学的活性に関するものである。

マガイニンＩとマガイニン■と欠失アナログとの比較はマガイニンＩとマガイニ ン■のＮ末端がそれらの抗微生物活性に重要であることを示している。例２およ び第１表に示されているように残基１〜１４の欠失はどれもが抗生作用に関しネ ガティブな効果を有していることが分った。もしマガイニンペプチドが微生物の 脂質膜と接触して両親媒的構造をとるならそれらのペプチドか本来のバックボー ンを維持する必要性および、または構造的配置を示す必要性があると考えられる 。しかし、マガイニンエおよびマガイニン■アミド型の一連の欠失アナログによ って示される抗微生物性はわずかに異なっている。このことはマガイニン■のよ り大きい活性を示した以前の報告と一致しているようである。ザスロフ（Ｚａｓ ｌｏｆｆ）、　Ｍ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎｏｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８４ 　、　ｐｐ　５４４９−５４５３　（＋９８７）。ここで示されているデータに よって証明されているようにマガイニンＩおよび１＃不二瘉■中のセリン（アミ ノ酸残基８）、アラニン（アミノ酸残基９）、グリシン（アミノ酸残基１３）ま たは効果は小さいがグリシン（アミノ酸残基３）の欠失は第１表に示されている ように大腸菌に対して異なった活性を示した。Ｓ、エビデルミス（ｅｐｉｄｅｒ ｍｉｓ）についてはマガイニンＩおよびマガイニン■のＮ末端欠失アナログ（残 基１−１４）間に抗微生物活性に関する実質的差はなかった。

重要なアミノ酸残基の欠失によるＮ末端マガイニンＩアナログのへリックス性の 破壊はそれらの微生物膜との相互作用能の減少から予測し得る。一般にマガイニ ン■のＮ末端欠失アナログはマガイニンＩアナログのＮ末端欠失に見られる活性 の減少は起こさずこれを保持し得る。Ｎ末端領域における唯一の差はマガイニン ■におけるグリシンのリジンによる置換なので、強いα−へリックス誘導残基で あるリジンはマガイニン■の安定化に関する重要なアミノ酸であると考えられる 。

両タイプのアナログのＣ末端領域についてはアミノ酸残基欠失後の活性を維持す る傾向はより大きい。しかしＣ末端アナログは大腸菌およびＳ、エビデルミス（ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）に対して活性の失なわせるＮ末端とは反対にいくらかの種 選択性を示す。マガイニンエおよびマガイニン■の両Ｃ末端における欠失アナロ グで処理した場合大腸菌はＳ、エビデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）より感受性 が高い。

マガイニン■中の疎水性残基であるフェニルアラニン（アミノ酸残基１６）また はバリン（アミノ酸残基１７）は大腸菌およびＳ、エビデルミス（ｅｐｉｄｅｒ ｍｉｓ）の両種に対する抗微生物活性を減少させる最も重要な修正であると考え る。合成マガイニン■のイソロイシン２０欠失アナログをテストしたときＳ　エ ビデルミス（ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）に対する活性は見られなかったが大腸菌の増 殖の完全な阻害には７５μｇ／ｙｎｌのイソロイシン２０欠失アナログが必要で あった。マガイニンＩおよびマガイニン■の両方においてそれらの位置に疎水性 残基が保存される必要がある。フェニルアラニン１６、バリンまたはイソロイシ ン２０の欠失に関するより低いまたは完全な抗微生物活性のロスはマガイニンベ ブチドがバクテリア膜のリボ多糖と相互作用する上でこれらのアミノ酸から提供 される疎水性を必要とすることを示している。もっともこの理論が本発明の範囲 を制限することはない。カルボキシ末端領域におけるマガイニンＩとマガイニン ■のわずかな差は部位２２のより疎水臼Ｎ（アスパラギン）に対するＫ（リジン ）残基の置換である。先の結論はマガイニン■かマガイニンＩより活性が高い理 由を説明している。この結論を支持する他の観測はＣ末端アミドを有するマガイ ニンの実質的により高い活性である。

マガイニンＩおよびマガイニン■そのものと比べて低い赤血球の溶血作用を示す 欠失アナロググリシン１８およびグルタミン酸１９の高い抗微生物活性はこれら ２つのアナログを臨床的応用への良い候補者としている。両マガイニンのグリシ ン１８欠失アナログによって示される強い抗微生物活性はへリックス形成に関し て能力の低いグリシンの欠失で説明し得る。一方、はとんとポジティブに帯電し ているペプチドからネガティブに帯電しているアミノ酸残基グルタミン酸１９の 欠失が問題となる。おそらくこのネガティブに帯電したアミノ酸残基の除去はバ クテリアのネガティブに帯電しているリボ多糖層との相互作用を容易にしている のであろう。本来のマガイニンと比べた活性の増加および赤血球溶解の減少はこ の欠失アナログを臨床的応用において非常に重要なものとしている。またメチオ ニンを欠失した欠失アナログでこのペプチドのよりよい安定性と保存性が得られ た。

上述の内容から本発明の多くの修正形および変化形か可能である。つまり以下の 請求の範囲内で特に述べられている事以外でも本発明を実施し得る。

浄書（内容に変更なし） 欠失アミノ酸 欠失アミノ酸 欠失アミノ酸 欠失アミノ酸 時間　（ｍｉｎ） 平成　年　月　日

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．１文字アミノ酸コードを用い、かつ各アミノ酸の下の数字でペプチド中の残 基の位置を示した以下の構造式ＧＩＧＫＦＬＨＳＡＧＫＦＧＫＡＦＶＧＥＩＭＫ Ｓ１２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６１７１８１９２０２１２２ ２３で表わされるマガイニンＩで、アミノ酸１５乃至２３のうちの少なくとも１ つが欠失したアミド末端型またはカルボキシ型マガイニンＩの欠失アナログを含 む化合物。
2. ２．アミノ酸１５、１６、１８、１９、２１、２２および２３のうちの少なくと も１つが欠失した請求の範囲１記載の化合物。
3. ３．少なくともアミノ酸１８が欠失した請求の範囲２記載の化合物。
4. ４．少なくともアミノ酸１９が欠失した請求の範囲２記載の化合物。
5. ５．少なくともアミノ酸２１が欠失した請求の範囲２記載の化合物。
6. ６．少なくともアミノ酸２２が欠失した請求の範囲２記載の化合物。
7. ７．少なくともアミノ酸２３が欠失した請求の範囲２記載の化合物。
8. ８．アミノ酸１８のみが欠失した請求の範囲３記載の化合物。
9. ９．アミノ酸１９のみが欠失した請求の範囲４記載の化合物。
10. １０．アミノ酸２１のみが欠失した請求の範囲５記載の化合物。
11. １１．前記化合物がアミノ末端型マガイニンＩの欠失アナログである請求の範囲 １記載の化合物。
12. １２．前記化合物がカルボキシ末端型マガイニンＩの欠失アナログである請求の 範囲１記載の化合物。
13. １３．アミノ酸２１、２２および２３が欠失した請求の範囲２記載の化合物。
14. １４．アミノ酸１９、２０、２１、２２および２３が欠失した請求の範囲１記載 の化合物。
15. １５．アミノ酸１８、１９、２０、２１、２２および２３が欠失した請求の範囲 １記載の化合物。
16. １６．アミノ酸１７、１８、１９、２０、２１、２２および２３が欠失した請求 の範囲１記載の化合物。
17. １７．１文字アミノ酸コードを用い、かつ各アミノ酸の下の数字でペプチド中の 残基の位置を示した以下の構造式：【配列があります】 で表されるマガイニンＩＩで、アミノ酸１５乃至２２のうちの少ナくとも１つが 欠失したアミド末端型またはカルボキシ型マガイニンＩＩの欠失アナログを含む 化合物。
18. １８．アミノ酸１５、１８、１９、２０、２１および２２のうちの少なくとも１ つが欠失した請求の範囲１７記載の化合物。
19. １９．少なくともアミノ酸１８が欠失した請求の範囲１８記載の化合物。
20. ２０．少なくともアミノ酸１９が欠失した請求の範囲１８記載の化合物。
21. ２１．少なくともアミノ酸２１が欠失した請求の範囲１８記載の化合物。
22. ２２．少なくともアミノ酸２２が欠失した請求の範囲１８記載の化合物。
23. ２３．アミノ酸１８のみが欠失した請求の範囲１９記載の化合物。
24. ２４．アミノ酸１９のみが欠失した請求の範囲２０記載の化合物。
25. ２５．アミノ酸２１のみが欠失した請求の範囲２１記載の化合物。
26. ２６．アミノ酸２２のみが欠失した請求の範囲２２記載の化合物。
27. ２７．前記化合物がアミド末端型マガイニンＩＩの欠失アナログである請求の範 囲１７記載の化合物。
28. ２８．宿主に抗微生物効果量の請求の範囲１記載の化合物を投与することを含む 方法。
29. ２９．宿主に抗ウィルス効果量の請求の範囲１記載の化合物を投与することを含 む方法。
30. ３０．宿主に抗腫瘍効果量の請求の範囲１記載の化合物を投与することを含む方 法。
31. ３１．宿主に精子殺傷効果量の請求の範囲１記載の化合物を投与することを含む 方法。
32. ３２．宿主に抗微生物効果量の請求の範囲１７記載の化合物を投与することを含 む方法。
33. ３３．宿主に抗ウィルス効果量の請求の範囲１７記載の化合物を投与することを 含む方法。
34. ３４．宿主に抗腫瘍効果量の請求の範囲１７記載の化合物を投与することを含む 方法。
35. ３５．宿主に精子殺傷効果量の請求の範囲１７記載の化合物を投与することを含 む方法。