NO904846L - Amfifile peptider og anvendelse derav. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye polypeptider. Oppfinnelsen vedrører spesielt nye polypeptider som er biologisk aktive og som kan bli anvendt som antibiotika, antimikrobielle midler, spermicider og antivirale midler og mel-lomprodukter derav.

Biologisk aktive peptider betegnet "magainins" er beskrevet i Proe. Nati. Acad. Sei., Vol. 84 s. 5449-53 (aug. -87).

I henhold til ett aspekt ved oppfinnelsen, er det tilveiebragt et syntetisk polypeptid som er amfifilisk og som er positivt ladet (basisk).

Det er spesielt tilveiebragt et basisk (positivt ladet) polypeptid som har minst seksten aminosyrer der polypeptidet omfatter minst åtte hydrofobe aminosyrer ogminst 8 hydrofile aminosyrer. De hydrofobe aminosyrene er i grupper på to ved siden av liggende aminosyrer, og hver gruppe av to hydrofobe aminosyrer er i avstand fra en annen gruppe på to hydrofobe aminosyrer med minst én aminosyre forskjellig fra en hydrofob aminosyre (fortrinnsvis minst to aminosyrer) og generelt med ikke mer enn fire aminosyrer, og aminosyrene mellom parene av hydrofobe aminosyrer kan, eller behøver ikke, være hydrofile.

De hydrofile aminosyrene er generelt også i grupper på to ved siden av liggende aminosyrer, der minst én av de to aminosyrene er en basisk hydrofil aminosyre, der slike grupper av to hydrofile aminosyrer er i avstand fra hverandre med minst én aminosyre forskjellig fra en hydrofil aminosyre (fortrinnsvis minst to aminisyrer) og generlt ikke mer enn fire aminosyrer, og aminosyrene mellom parene av hydrofile aminosyrer kan, eller behøver ikke, være hydrofobe.

I henhold til en spesielt foretrukket utførelsesform omfatter polypeptidet en kjede av minst fire grupper av aminosyrer, der hver gruppe består av fire aminosyrer. To av de fire aminosyrene i hver gruppe er hydrofobe aminosyrer, og to av de fire aminosyrene i hver gruppe er hydrofile, der minst én av de hydrofile aminosyrene i hver gruppe er en basisk hydrofil aminosyre, og den andre er en basisk eller nøytral hydrofil aminosyre.

Hydrofobe aminosyrer kan bli valgt fra klassen bestående av Ala, Cys, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, Val, Trp og Tyr. De nøytrale hydrofile aminosyrene kan bli valgt fra klassen bestående av Ser, Asn, Gin og Thr. Basiske hydrofile aminosyrer kan bli valgt fra klassen bestående av Lys, Arg og His.

Hver av gruppene på fire aminosyrer kan ha sekvensen ABCD, BCAB, CDAB eller DABC, der A og B hver er hydrofobe aminosyrer og kan være like eller forskjellige, én av C eller D er en basisk hydrofil aminosyre, og den andre av C eller D er en basisk eller nøytral hydrofil aminosyre, og kan være lik eller forskjellig. I en foretrukket utførelsesform kan polypeptidkjeden omfatte 5 eller 6 grupper av denne sekvensen. I hver gruppe kan hver av A, B, C og D være lik i noen eller alle gruppene, eller kan være forskjellige i noen eller alle gruppene.

Polypeptidkjeden har fortrinnsvis minst 20 aminosyrer, og ikke mer enn 50 aminosyrer. Det er derimot å bemerke at polypeptidet ikke bare behøver å bestå av gruppene beskrevet ovenfor. Polypeptidet kan ha aminosyrer som enten rekker fra én av endene eller begge endene av de angitte gruppene som danner polypeptidkjeden, og/eller det kan være aminosyrer mellom én eller flere av de minst fire gruppene og enda høre inn under rammen av oppfinnelsen.

Gruppene av aminosyrer kan være repeterende grupper av aminosyrer, eller aminosyrene i de forskjellige gruppene kan variere, forutsatt at det i hver gruppe av de minst fire gruppene av aminosyrene er to hydrofobe og to hydrofile aminosyrer som angitt ovenfor.

I en foretrukket utførelsesform omfatter det biologisk aktive polypeptidet en kjede, omfattende minst fire grupper av aminosyrer, som hver inneholder fire aminosyrer. To av de fire aminosyrene i hver gruppe er hydrofobe, minst én aminosyre er basisk hydrofil, og den gjenværende er basisk eller nøytral hydrofil, idet polypeptidkjeden fortrinnsvis har minst 20 aminosyrer, men ikke mer enn 50 aminosyrer.

I en utførelsesform har hver av de minst fire gruppene av aminosyrene som er i peptidkjeden sekvensen A-B-C-D, B-C-D-A, C-D-A-B eller D-A-B-C der A og B er hydrofobe, én av C eller D er basisk hydrofil og den andre av C eller D er basisk eller nøytral hydrofil. Den resulterende polypeptidkjeden kan derfor ha én av følgende sekvenser:

hvori Xj_ er D; C-D- eller B-C-D-, Y1er -A eller -A-B eller

-A-B-C

Det er å bemerke at peptidkjeden kan omfatte aminosyrene mellom de ovenfor angitte gruppene på fire aminosyrer forutsatt at avstanden mellom slike grupper og ladningen på aminosyrene ikke forandrer karaktertrekkene til peptidkjeden som tilveiebringer amfifilisitet og en positiv ladning, og som ikke påvirker på en negativ måte foldekaraktertrekkene til kjeden til det som er betraktelig forskjellig fra én i hvilken ovenfor angitte gruppe på fire aminosyrer ikke er i avstand fra hverandre.

Som representative eksempler på peptider i henhold til foreliggende oppfinnelse kan følgende nevnes:

Peptidet kan ha aminosyrer som rekker fra hvilken som helst ende av kjeden. For eksempel kan kjedene ha en Ser-Lys-sekvens før "Ala"-enden, og/eller en Ala-Phe-sekvens etter "lys"-enden. Andre aminosyresekvenser kan også bli knyttet til "Ala"- og/eller "Lys"-enden.

I en hvilken som helst polypeptidkjede ifølge foreliggende oppfinnelse med minst fire grupper av aminosyrene til sekvensen som beskrevet ovenfor, kan kjeden for eksempel ha en C-D-sekvens foran den første A-B-C-D-gruppen. Andre aminosyresekvenser kan også bli knyttet til "A" og/eller "D"-enden til én av disse polypeptidkj edene. Det kan også være amino syrer i kjeden som gjør at én eller flere av gruppene av de ovenfor angitte aminosyrene blir 1 avstand fra hverandre.

Polypeptldene ifølge foreliggende oppfinnelse er generelt vannoppløselige til en konsentrasjon på minst 20 mg/ml ved nøytral pH i vann. Polypeptidet er ikke-hemolytisk, dvs. det vil ikke ødelegge røde blodceller ved effektive antimikrobielle konsentrasjoner. Strukturen til polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fleksibilitet til polypeptidmolekylet. Når polypeptidet blir plasser i vann, opptar det ikke en amfifilisk struktur. Når polypeptidet møter en oljeholdig overflate eller membran, folder polypeptidkjeden seg om seg selv til en stavlignende struktur.

Peptidene kan bli fremstilt ved kjente teknikker og blir tilveiebragt i vesentlig ren form. Peptidene kan f.eks. bli syntetisert manuelt eller på en automatisk syntesemaskin (J.A.C.S. Vol 85, s. 2149-54 (1963). Det er også mulig å fremstille slike peptider ved genetiske ingeniørteknikker.

Polypeptldene ifølge foreliggende oppfinnelse er biologisk aktive eller bioaktive. Sammensetningene kan virke som antimikrobielle midler, antivirale midler, antibiotika, antitumormidler, spermicider, samt ha andre bioaktive funksj oner.

Betegnelsen "antimikrobiell" som anvendt heri, betyr at polypeptdiene ifølge foreliggende oppfinnelse hemmer, forhindrer eller ødelegger veksten eller proliferasjonen av mikrober så som bakterier, sopp, virus el.l.

Betegnelsen "antibiotisk" som anvendt heri, betyr at polypeptldene som blir anvendt i foreliggende oppfinnelse produserer effekter som er forskjellig fra normale biologiske funksjoner til cellen, vevet eller organismen inkludert død eller destruksjon eller forhindring av veksten eller proliferasjonen av det biologiske systemet når kontaktet med polypeptldene.

Betegnelsen "spermicidal" som anvendt heri, betyr at polypeptldene anvendt i foreliggende oppfinnelse inhiberer, forhindrer eller ødelegger bevegelsen av spermier.

Betegnelsen "antiviral" som anvendt heri, betyr at polypeptldene anvendt i foreliggende oppfinnelse inhiberer, forhindrer eller ødelegger veksten eller proliferasjonen av viruser.

Betegnelsen antitumor som anvendt heri, betyr at polypeptidet inhiberer veksten av, eller ødelegger, tumorer.

Polypeptldene ifølge foreliggende oppfinnelse har en bredspektret potent antibiotisk aktivitet overfor mange mikroorganismer inkludert gram-posite og gram-negative bakterier, sopp,. protozoer o.l. Polypeptldene ifølge foreliggende oppfinnelse tillateren metode for behandling eller kontrollering av mikrobiell infeksjon forårsaket av organismer som er følsomme overfor polypeptldene. Slik behandling kan omfatte administrering til en vertsorganisme eller vev, mottagelig for eller påvirket med, en mirkobiell infeksjon, en antimikrobiell mengde av minst én av polypeptldene .

På grunn av de antibiotiske egenskapene til polypeptldene, kan de også bli anvendt som konserveringsmidler eller steriliseringsmidler for materialer mottagelig for mikrobiell kontaminasjon.

Farmasøytiske sammensetninger som omfatter polypeptldene ifølge foreliggende oppfinnelse kan i tillegg bli kombinert eller plassert i en ikke-toksisk farmasøytisk bærer eller beholder så som et fyllstoff, ikke-toksisk buffer eller fysiologisk saltvannsoppløsning. Slike farmasøytiske sammensetninger kan bli anvendt topisk eller systemisk, og kan være i en hvilken som helst egnet form så som en flytende, fast, semifast, injiserbar oppløsning, tabletter, salve, lotion, pasta, kapsel el.l. Polypeptidsammensetningene kan også bli anvendt i kombinasjon med adjuvants, proteaseinhibitorer eller kompatible medikamenter der hvor en slik kombinasjon er ønskelig eller fordelaktig for kontrollering av infeksjon forårsaket av skadelige mikroorganismer, inkludert protozoa-virus o.l.

Det bioaktive peptidet(er) iføgle foreliggende oppfinnelse, kan bli administrert til en vert, spesielt et dyr, i en effektiv antibiotisk og/eller antitumor og/eller antiviral og/eller antimikrobiell og/eller en antispermlcidal mengde.

I henhold til et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt et peptid (polypeptid) med fra åtte til femten aminosyrer bestående av minst fire hydrofobe aminosyrer og fire hydrofile aminosyrer. De hydrofobe aminosyrene er i grupper på to ved siden av liggende aminosyrer, hvori hver gruppe av de to hydrofobe aminosyrene er i avstand fra hverandre med minst én aminosyre forskjellig fra en hydrofob aminosyre (fortrinnsvis minst to aminosyrer) og generelt ikke mer enn fire aminosyrer, og aminosyren(er) mellom parene av hydrofobe aminosyrer kan, eller behøver ikke, være hydrofile. Hydrofile aminosyrer er generelt også i grupper på to ved siden av liggende aminosyrer der minst én av de to aminosyrene er en basisk hydrofil aminosyre og den andre av de to er basisk eller nøytral. Gruppene på to hydrofile aminosyrer er i avstand fra hverandre med minst én aminosyre forskjellig fra en hydrofil aminosyre (fortrinnsvis minst to aminosyrer) og generelt ikke mer enn 4 aminosyrer, og aminosyrene mellom parene av hydrofile aminosyrer kan eller behøver ikke å være hybrof obe.

Peptidet som har fra 8 til 15 qminosyrer er amfifillsk og er positivt ladet (basisk).

Peptidet med 8 til 15 aminosyrer beskrevet ovenfor kan, eller behøver ikke, være bioaktivt, og i det tilfellet hvor et slikt peptid er bioaktivt, har det anvendelse som et mellomprodukt for tilveiebringing av de ovennevnte peptidene som har minst 16 aminosyrer og som er bioaktive. For eksempel kan to peptider, én med åtte aminosyrer og den andre med tolv aminosyrer, bli koblet til hverandre for å danne et peptid som har 20 aminosyrer av typen beskrevet ovenfor og som er bioaktiv. Peptidene kan bli koblet ved standard peptldkjemi-teknikker. Slike peptider kan derfor for eksempel bli kondensert i oppløsning ved teknikken beskrevet av Johnson et al., "Peptldes", s. 239-42 (Walter de Gruzter & Co., 1986).

Som representative eksempler på slike peptider, kan peptider representert ved følgende struktur nevnes, der A, B, C og D er som tidligere definert;

hvori W-l er D-, C-D-, B-C-D-

W2er A-. D-A-, C-D-A-

W3er B-, A-B-, D-A-B-

W4er C-, B-C-, A-B-C

Z1er -A, -A-B, -A-B-C

Z2er -B, -B-C, -B-C-D

Z3er -C, -C-D, -C-D-A

Z4er -D, -D-A, -D-A-B

n er 2 eller 3, a er 0 eller 1 og b er 0 eller 1.

Følgende eksmepler skal illustrere de forskjellige an-vendelsene av de biologisk aktive polypeptidsammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse. Rammen av foreliggende oppfinnelse skal derimot ikke bli begrenset derav.

EKSEMPEL

Peptid ble syntetisert på en 430A Applied Biosystems Synethsizer. Den generelle metoden anvendte t-Boc-kjemien til Merrifield, ovenfor.

Fremgangsmåte: t-Boc-lys (Cl-Z) - Pam-harpiks, substitu-sjon: 0,57 mmol/g.

Kjedeoppstilling: 0,5 mol skala. Fordampede symmetriske anhydrider, koblet i DMF som oppløsningsmiddel. Koblingsef-fektiviteten overskrider.97$ basert på ninhydrinregistrering. Koblinstemperaturene var 10-15°C.

Spaltnin<g>: Vannfri HF anvendt for deblokkering og fjerning fra harpiksen.

Renhet: Større enn 95%, basert på revers fase p HLC-separasjon, over C8 300A° , 10 cm x 2,1 mm kolonne, utviklet på en 0-60$ buffer B-gradient i 45 min. (A = 0,1$ TFA; B=100$ CH3CH/0,09$ TFA). Visualisert ved 220 nm. Denne metoden blir også anvendt for peptidrensning.

Omtrent 10^ bakterier fra en mid log-kultur, ble inokulert i 8 ml 0,7$ agarose i trypticase soyakraft og belagt over en plate med 1,5$ agarose i tryptikase soyakraft. 10 yl av hvert peptid i en konsentrasjon på 5 mg/ml ble applisert på topplaget og platene inkubert ved 37°C i 8 timer. Inhibi-sjonssonen av veksten ble målt.

Omtrent 10^ organsimer ble plassert 1 omtrent 200 yl destillert vann. Peptid ble tilsatt fra en oppløsning av 5 mg/ml i vann. Konsentrasjonen ved fullstendig fysisk ødeleg-gelse som oppstod i løpet av 10 minutter ved romtemperatur bestemt ved retningsmikroskopisk undersøkelse, er angitt. Avhengig av anvendelse, vil en sammensetning i henhold til oppfinnelsen inneholde en effektiv antimikrobiell mengde og/eller en effektiv antispermicidal mengde og/eller en effektiv antiviral mengde og/eller en effektiv antitumormengde og/eller en effektiv antibiotisk mengde av én eller flere av ovennevnte peptider som har slik aktivitet.

Petidene, når de blir anvendt i topiske sammensetninger, er vanligvis tilstede i en mengde på minst 0,1 vekt-$. I de fleste tilfellene er det nødvendig å anvende peptidet i en mengde som er større enn 1,0 vekt-%.

Ved anvendelse av slike sammensetninger systemisk (intramus-kulært, intravenøst, intraperitonealt), er det aktive peptidet tilstede i en mengde for oppnåelse av et serumnivå av peptidet på minst omtrent 5 jjg/ml. Generelt behøver serumnivået til peptidet ikke å overskride 500 jjg/ml. Slike serumnivåer kan bli oppnådd ved inkorporering av peptidet i en sammensetning som skal bli administrert systemisk i en dose på omtrent 10 mg/kg. Generelt behøver peptidet(er) ikke å bli administrert i en dose som overskrider 100 mg/kg.

Det er å bemerke at rammen av foreliggende oppfinnelse ikke skal bli begrenset til de spesifikke eksemplene beskrevet ovenfor. Forskjellige utførelsesformer av polypeptidsammen-setninger andre enn dem som spesifikt er angitt, kan bli anvendt. Oppfinnelsen kan bli utført forskjellig fra det som er beskrevet, og enda være innenfor rammen av vedlagtre krav.

Claims (24)

1. Peptid, karakterisert ved at det omfatter nevnte peptid inneholdende minst åtte aminosyrer, nevnte peptid inneholdnede minst to grupper av aminosyrer A-B, der hver A-B-gruppec er separert med minst én aminosyre forskjellig fra en hydrofob aminosyre og minst to grupper av aminosyrer C-B der C-D er separert av minst én aminosyre forskjellig fra en hydrofil aminosyre, hvori hver av A og B er en hydrofob aminosyre der hver av A og B kan være like eller forskjellige aminosyrer og én av C og D er en basisk hydrofil aminosyre og den andre av C og D er en basisk eller nøytral hydrofil aminosyre.

2 . Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at peptidet har fra 8 til 15 aminosyrer.

3. Peptid ifølge krav 2, karakterisert ved at peptidet omfatter én av følgende sekvenser:

hvori W} er D-, C-D-, B-C-D- W2 er A-. D-A-, C-D-A-W3 er B-, A-B-, D-A-B-W4 er C-, B-C-, A-B-C Z1 er -A, -A-B, -A-B-C Z2 er -B, -B-C, -B-C-D Z3 er -C, -C-D, -C-D-A Z4 er -D, -D-A, -D-A-B n er 2 eller 3, a er 0 eller 1 og b er 0 eller 1.

4 . Peptid ifølge krav 1, karakterisert ved at peptidet inneholder minst 16 aminosyrer og det er minst fire grupper av aminosyrene A-B og minst 3 grupper av aminosyrene C-D.

5. Peptid ifølge krav 4, karakterisert ved at peptidet inneholder minst fire grupper av aminosyrene C-D.

6. Peptid ifølge krav 5, karakterisert ved at peptidet omfatter minst fire grupper av peptidsekvensen-A-B-C-D-, -B-C-D-A-, -C-D-A-B, -D-A-B-C-.

7. Peptid ifølge krav 6, karakterisert ved at peptidet omfatter én av følgende sekvenser:

hvori Xx er D; C-D- eller B-C-D-, Y1 er -A eller -A-B eller -A-B-C X2 er A-, D-A- eller C-D-A-Y2 er -B, -B-C er B-C-D X3 er B-, A-B-, D-A-B-Y3 er -C, -C-D, -C-D-A X4 er C-, B-C-, A-B-C Y4 er -D. -D-A, -D-A-B a er 0 eller 1; b er 0 eller 1 og n er minst 4.

8. Polypeptid ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte hydrofobe aminosyrer blir valgt fra klassen bestående av Ala, Phe, Gly, Ile, Leu, Met, VAL og Trp, nevnte nøytrale hydrofile aminosyrer blir valgt fra klassen bestående av Ser og Thr, og nevnte basiske hydrofile aminosyrer blir valgt fra klassen bestående av Lys, Arg og His.

9. Polypeptid ifølge krav 8, karakterisert ved at minst én av nevnte i det minste fire grupper av nevnte aminosyrer har sekvensen A-B-C-D, der A og B er hydrofobe aminosyrer, én av C er en nøytral eller basisk hydrofil aminosyre, den andre Cor D er en basisk hydrofil aminosyre.

10. Polypeptid ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte polypeptid omfatter følgende sekvens: -(Ala-Phe-Ser-Lys)4 -

11. Polypeptid ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte polypeptid omfatter en kjede på minst 20 aminosyrer og ikke mer enn 50 aminosyrer.

12. Polypeptid ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte polypeptid omfatter fem grupper av nevnte sekvens.

13. Polypeptid ifølge krav 6, karakterisert ved at nevnte polypeptid omfatter seks grupper av nevnte sekvens.

14 . Polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte polypeptid omfatter repeterende grupper av nevnte fire aminosyrer.

15 . Fremgangsmåte, karakterisert ved at den omfatter administrering til et dyr en effektiv antimikrobiell mengde av peptidet ifølge krav 5.

16. Fremgangsmåte, karakterisert ved at den omfater administrering til et dyr en effektiv antiviral mengde av peptidet ifølge krav 5.

17. Fremgangsmåte, karakterisert ved at den omfatter administrering i en effektiv antitumormengde av peptidet ifølge krav 5.

18. Fremgangsmåte, karakterisert ved at den omfatter administrering til et dyr en effektiv antibiotisk mengde av peptidet ifølge krav 5.

19. Fremgangsmåte, karakterisert ved at den omfatter administrering til et dyr en effektiv antispermicidal mengde av peptidet Ifølge krav 5.

20. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en farmasøytisk bærer inneholdende effektiv antimikrobiell mengde av peptidet ifølge krav 5.

21. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en farmasøytisk bærer inneholdende effektiv antiviral mengde av peptidet ifølge krav 5.

22. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en farmasøytisk bærer inneholdende effektiv antibiotisk mengde av peptidet ifølge krav 5.

23. Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en farmasøytisk bærer, inneholdende effektiv antitumor mengde av peptidet ifølge krav 5.

24 . Sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en farmasøytisk bærer inneholdende effektiv antispermicidal mengde av peptidet ifølge krav 5.