JP2011521902A - 抗菌ペプチド多量体 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図4
Description
hBD3(配列番号1)
GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKK
配列番号2
GIINTLQKYYXRVRGGRXAVLSXLPKEEQIGKXSTRGRKXXRRZZ
Xは任意のアミノ酸を包含し;Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。例えば、Zとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、Zはリジンであってよい。
前記多量体には、ペプチドUの繰り返しが存在する。具体的には、繰り返し単位であるペプチドU同士は共有結合により連結している。さらに、ペプチドU同士は、少なくとも1つのアミノ酸Bを介して連結していてもよい。Bはそれぞれ、アミン基を少なくとも2つ有するアミノ酸であってよい。例えば、Bとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
ペプチドUとしては、配列番号2に由来するペプチドフラグメントなどが挙げられる。このフラグメントは、配列番号2に由来するものであれば、いかなる長さのフラグメントであってもよい。具体的には、ペプチドUは、配列番号3またはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
配列番号3
GIINTLQKYYXRVRGGRXAVLSXLPKEEQIGKXSTRGRKXXRR
Xは任意のアミノ酸を包含する。
多量体のペプチドUは、+1〜+11の電荷を有してもよい。
分岐状の多量体、例えば多量体(U)nBmZjに関しては、末端の残基BmZjで分岐していてもよい。
従って、本発明は、式(U)n(式中、Uは、配列番号2を含むペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体である)で表される少なくとも1つの多量体を製造する方法であって、少なくとも2つのUを連結することを含む方法に関する。
(i)少なくとも1つの固相を準備する工程;
(ii)固相に少なくとも1つの1番目のアミノ酸Zを結合させる工程;
(iii)固相に結合させた1番目のアミノ酸残基に、保護基を有するアミノ酸残基Bを少なくとも1つ連結する工程;
(iv)連結させた残基Bから保護基を除去する工程;
(v)ペプチドUの配列に従って、保護基を有するアミノ酸残基をC末端からN末端の方向へ順に連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらなる鎖の伸長を行う工程;および
(vi)加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程
を含む方法に関する。
(iv)(a)連結させた残基Bに、保護基を有する残基Bをさらに連結する工程;
(iv)(b)(iv)(a)で連結させた残基Bから保護基を除去する工程;および
(iv)(c)工程(iv)(a)および(iv)(b)を繰り返し行う工程、または
(iv)(d)工程(v)および(vi)に進む工程
をさらに含む。
ペプチド配列中または式中にXが存在する場合、Xは任意のアミノ酸を示す。任意のアミノ酸には、保護基を有するシステイン残基が含まれ、例えばC(Acm)、C(But)、C(Cam)、C(t−Buthio)、C(Bzl)、C(4−MeO−Bzl)、C(Mmt)が挙げられるが、これらに限定されない。
配列番号2
GIINTLQKYYXRVRGGRXAVLSXLPKEEQIGKXSTRGRKXXRRZZ
Xは任意のアミノ酸を包含してよく;Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。例えば、Zとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、Zはリジンであってよい。
前記多量体には、ペプチドUの繰り返しが存在する。具体的には、繰り返し単位であるペプチドU同士は共有結合により連結している。ペプチドU同士は、少なくとも1つのアミノ酸Bを介して連結していてもよい。Bは、アミン基を少なくとも2つ有するアミノ酸を包含してもよい。例えば、Bとしては、リジン、オルニチンまたはアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。
ペプチドUとしては、配列番号2に由来するペプチドフラグメントなどが挙げられる。このフラグメントは、配列番号2に由来するものであれば、いかなる長さのフラグメントであってもよい。具体的には、ペプチドUは、配列番号3またはそのフラグメントもしくは変異体を含んでもよい。
配列番号3
GIINTLQKYYXRVRGGRXAVLSXLPKEEQIGKXSTRGRKXXRR
Xは任意のアミノ酸を包含する。
多量体のペプチドUは、+1〜+11の電荷を有してもよい。
配列番号4(hBD3のC末端38アミノ酸由来のペプチド)
KYYXRVRGGRXAVLSXLPKEEQIGKXSTRGRKXXRRZZ
Xは任意のアミノ酸を包含し;Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号5(hBD3のC末端36アミノ酸由来のペプチド)
YXRVRGGRXAVLSXLPKEEQIGKXSTRGRKXXRRZZ
Xは任意のアミノ酸を包含し;Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号6(hBD3のC末端40アミノ酸由来のペプチド)
LQKYYXRVRGGRXAVLSXLPKEEQIGKXSTRGRKXXRRZZ
Xは任意のアミノ酸を包含し;Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号7(hBD3のC末端29アミノ酸由来のペプチド)
RXAVLSXLPKEEQIGKXSTRGRKXXRRZZ
Xは任意のアミノ酸を包含し;Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号8
KEEQIGKXSTRGRKXXRRZZ(hBD3のC末端20アミノ酸由来のペプチド)
Xは任意のアミノ酸を包含し;Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号9
KXSTRGRKXXRRZZ(hBD3のC末端14アミノ酸由来のペプチド)
Xは任意のアミノ酸を包含し;Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
KYYXRVRGGRXAVLSXLPK
Xは任意のアミノ酸を包含する。
配列番号11
GIINTLQKYYXRVRGGR(hBD3のN末端17アミノ酸由来のペプチド)
Xは任意のアミノ酸を包含する。
配列番号12(CがWで置換された全長型hBD3由来のペプチド)
GIINTLQKYYWRVRGGRWAVLSWLPKEEQIGKWSTRGRKWWRRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号13(CがFで置換された全長型hBD3由来のペプチド)
GIINTLQKYYFRVRGGRFAVLSFLPKEEQIGKFSTRGRKFFRRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号14(CがYで置換された全長型hBD3由来のペプチド)
GIINTLQKYYYRVRGGRYAVLSYLPKEEQIGKYSTRGRKYYRRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号15(CがSで置換された全長型hBD3由来のペプチド)
GIINTLQKYYSRVRGGRSAVLSSLPKEEQIGKSSTRGRKSSRRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号16(CがAで置換された全長型hBD3由来のペプチド)
GIINTLQKYYARVRGGRAAVLSALPKEEQIGKASTRGRKAARRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号17(CがC(Acm)で置換された全長型hBD3由来のペプチド)
GIINTLQKYYC(Acm)RVRGGRC(Acm)C(Acm)VLSALPKEEQIGKC(Acm)STRGRKC(Acm)C(Acm)RRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号18(CがC(But)で置換された全長型hBD3由来のペプチド)
GIINTLQKYYC(But)RVRGGRC(But)C(But)VLSALPKEEQIGKC(But)STRGRKC(But)C(But)RRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号19(CがC(t−Buthio)で置換された全長型hBD3由来のペプチド)
GIINTLQKYYC(t−Buthio)RVRGGRC(t−Buthio)C(t−Buthio)VLSALPKEEQIGKC(t−Buthio)STRGRKC(t−Buthio)C(t−Buthio)RRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
GIINTLQKYYC(Bzl)RVRGGRC(Bzl)C(Bzl)VLSALPKEEQIGKC(Bzl)STRGRKC(Bzl)C(Bzl)RRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号21(CがC(4−MeBzl)で置換された全長型hBD3由来のペプチド)
GIINTLQKYYC(4−MeBzl)RVRGGRC(4−MeBzl)C(4−MeBzl)VLSALPKEEQIGKC(4−MeBzl)STRGRKC(4−MeBzl)C(4−MeBzl)RRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号22(CがC(4−MeOBzl)で置換された全長型hBD3由来のペプチド)
GIINTLQKYYC(4−MeOBzl)RVRGGRC(4−MeOBzl)C(4−MeOBzl)VLSALPKEEQIGKC(4−MeOBzl)STRGRKC(4−MeOBzl)C(4−MeOBzl)RRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号23(CがC(Mmt)で置換された全長型hBD3由来のペプチド)
GIINTLQKYYC(Mmt)RVRGGRC(Mmt)C(Mmt)VLSALPKEEQIGKC(Mmt)STRGRKC(Mmt)C(Mmt)RRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号24(Cが修飾を受けたCで置換された全長型hBD3由来のペプチド)
GIINTLQKYYXRVRGGRXXVLSALPKEEQIGKXSTRGRKXXRRZZ
XはC(Acm)、C(But)、C(t−Buthio)、C(Bzl)、C(4−MeBzl)、C(4−MeOBzl)またはC(Mmt)を包含し;Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号25(Cが任意のアミノ酸Xで置換されたhBD3のC末端10アミノ酸由来のフラグメント)
RGRKXXRRZZ
Xは任意のアミノ酸を包含し;Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号26(CがWで置換されたhBD3のC末端10アミノ酸由来のフラグメント)
RGRKWWRRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号27(CがFで置換されたhBD3のC末端10アミノ酸由来のフラグメント)
RGRKFFRRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号28(CがYで置換されたhBD3のC末端10アミノ酸由来のフラグメント)
RGRKYYRRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号29(CがLで置換されたhBD3のC末端10アミノ酸由来のフラグメント)
RGRKLLRRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
RGRKIIRRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号31(CがHで置換されたhBD3のC末端10アミノ酸由来のフラグメント)
RGRKHHRRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号32(CがC(Acm)、C(But)、C(t−Buthio)、C(Bzl)、C(4−MeBzl)、C(4−MeOBzl)またはC(Mmt)で置換されたhBD3のC末端10アミノ酸由来のフラグメント)
RGRKXXRRZZ
XはC(Acm)、C(But)、C(t−Buthio)、C(Bzl)、C(4−MeBzl)、C(4−MeOBzl)またはC(Mmt)を包含し;Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号33(CがVで置換されたhBD3のC末端10アミノ酸由来のフラグメント)
RGRKVVRRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号34(hBD3のC末端10アミノ酸由来のペプチド)
RGRKCCRRZZ
Zは任意のアミノ酸を包含するか、または存在しなくてもよい。
配列番号35(CがC(Acm)、C(But)、C(t−Buthio)、C(Bzl)、C(4−MeBzl)、C(4−MeOBzl)またはC(Mmt)で置換されたhBD3のC末端10アミノ酸由来のペプチド)
RGRKXXRRKK
XはC(Acm)、C(But)、C(t−Buthio)、C(Bzl)、C(4−MeBzl)、C(4−MeOBzl)またはC(Mmt)を包含する。
配列番号36(Cが任意のアミノ酸で置換されたhBD3のC末端由来のペプチド。ただし、hBD3のC末端のKKは含まない。)
RGRKXXRR
配列番号37(W2−8AA:CがWで置換されたhBD3のC末端由来のペプチド。ただし、hBD3のC末端のKKは含まない。)
RGRKWWRR
配列番号38(CがFで置換されたhBD3のC末端由来のペプチド。ただし、hBD3のC末端のKKは含まない。)
RGRKFFRR
配列番号39(Y2−8AA:CがYで置換されたhBD3のC末端由来のペプチド。ただし、hBD3のC末端のKKは含まない。)
RGRKYYRR
RGRKLLRR
配列番号41(CがIで置換されたhBD3のC末端由来のペプチド。ただし、hBD3のC末端のKKは含まない。)
RGRKIIRR
配列番号42(CがHで置換されたhBD3のC末端由来のペプチド。ただし、hBD3のC末端のKKは含まない。)
RGRKHHRR
配列番号43(CがC(Acm)、C(But)、C(t−Buthio)、C(Bzl)、C(4−MeBzl)、C(4−MeOBzl)またはC(Mmt)で置換されたhBD3のC末端由来のペプチド。ただし、hBD3のC末端のKKは含まない。)
RGRKCXXRR
XはC(Acm)、C(But)、C(t−Buthio)、C(Bzl)、C(4−MeBzl)、C(4−MeOBzl)またはC(Mmt)を包含する。
配列番号44(V2−8AA:CがVで置換されたhBD3のC末端由来のペプチド。ただし、hBD3のC末端のKKは含まない。)
RGRKVVRR
配列番号45(V2モノマー)
RGRKVVRRKK
配列番号46(V4モノマー、V4−10 AA)
RGRKVVRRVV
配列番号47(Y4モノマー、Y4−10 AA)
RGRKYYRRYY
配列番号48(W4モノマー、W4−10 AA)
RGRKWWRRWW
配列番号49(V3モノマー)
RVRKVVRR
RRRKVVRR
配列番号51(V2Dモノマー)
RDRKVVRR
配列番号52(E2モノマー)
RGRKEERR
配列番号53(K2モノマー)
RGRKKKRR
配列番号54
RRRRRRRRRR
配列番号55
VVVV
配列番号56
YYYY
配列番号57
RRVVKRGR
配列番号58
RRVVKRGRK
例えば、m=n−1、j=1、B=Z=Kであり、かつUが配列番号44を含む場合、多量体は式(配列番号44)nKn−1Kを有する。n=2である場合、多量体は式(配列番号44)2KKを有する。
分岐状の多量体、例えば多量体(U)nBmZjに関しては、末端の残基BmZjで分岐していてもよい。
(i)少なくとも1つの固相を準備する工程;
(ii)固相に少なくとも1つの1番目のアミノ酸残基Zを結合させる工程;
(iii)固相に結合させた1番目のアミノ酸残基に、保護基を有するK残基を少なくとも1つ連結する工程;
(iv)連結させたK残基から保護基を除去する工程;
(v)ペプチドUの配列に従って、保護基を有するアミノ酸残基をC末端からN末端の方向へ順に連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらなる鎖の伸長を行う工程;および
(vi)加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程
を含む方法に関する。
具体的には、XがVで、ZがKである場合、下記のダイマーが合成される。このダイマーは、(配列番号44)2KKで表されるV2ダイマーである。
(iv)(a)連結させた2番目のリジン残基に、保護基を有するリジン残基をさらに連結する工程;
(iv)(b)(iv)(a)で連結させたリジン残基から保護基を除去する工程;および
(iv)(c)工程(iv)(a)および(iv)(b)を繰り返し行う工程、または
(iv)(d)工程(v)および(vi)に進む工程
をさらに含む。
(i)少なくとも1つの固相を準備する工程;
(ii)固相に少なくとも1つの1番目のアミノ酸Zを結合させる工程;
(iii)必要に応じて、固相に結合させたZにアミノ酸Bを少なくとも1つ連結する工程;
(iv)ZまたはBに、異なる保護基で保護された基を少なくとも2つ含むアミノ酸Cを少なくとも1つ連結する工程;
(v)連結させたアミノ酸Cから第1の保護基を除去して、第1の反応側鎖を露出させる工程;
(vi)Cの第1の反応側鎖から、第1のペプチドU1の鎖を伸長させる工程;
(vii)連結させたアミノ酸Bから第2の保護基を除去して、少なくとも1つの第2の反応側鎖を露出させる工程;および
(viii)Cの第2の反応側鎖から、第2のペプチドU2の鎖を伸長させる工程
を含む方法に関する。
任意で実施できる工程(ii)を省略すると、ヘテロダイマーが形成される。任意で実施できる工程(ii)を1回行うと、ヘテロテトラマーを製造することができる。工程(ii)を適宜繰り返すことにより、その他のヘテロ多量体を製造することができる。
C、BおよびZとしては、リジン(K)、オルニチンまたはアルギニン(R)が挙げられるが、これらに限定されない。
具体的には、U1またはU2はそれぞれ、配列番号2を含むペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体であってよい。
U1は、配列番号1〜58のいずれかを含んでもよいが、これらに限定されない。
U2は、配列番号1〜58のいずれかを含んでもよいが、これらに限定されない。
n=2かつm=1である場合、多量体は、式[(U1)(U2)]CZで表されるヘテロダイマーである。
(i)少なくとも1つの固相を準備する工程;
(ii)固相に少なくとも1つの1番目のアミノ酸Zを結合させる工程;および
(iii)Zから、ペプチドU1の鎖を伸長させる工程
を含む方法。
ただし、
(A)前記ペプチドトリマーが、式U3U2(C)U1Zで表されるヘテロペプチドである場合、
前記方法は、
(iv)ペプチドU1のアミノ酸に、異なる保護基を有するアミノ酸Cを連結する工程;
(v)連結させたアミノ酸Cから第1の保護基を除去する工程;
(vi)アミノ酸Cから、ペプチドU2の鎖を伸長させる工程;
(vii)連結させたアミノ酸Cから第2の保護基を除去する工程;および
(viii)アミノ酸Cから、ペプチドU3の鎖を伸長させる工程
をさらに含み、
(B)U2=U3=U1かつC=Bであり、前記ペプチドトリマーが式(U1)2BU1Zを含む場合、
前記方法は、
(iv)ペプチドU1のアミノ酸に、保護基を有するアミノ酸Bを連結する工程;
(v)連結させたアミノ酸Bから保護基を除去する工程;および
(vi)アミノ酸Bから、2つのペプチドU1の鎖を伸長させる工程
をさらに含み、
(C)U2=U3≠U1かつC=Bであり、前記ペプチドトリマーが式(U2)2B(U1)Zを含む場合、
前記方法は、
(iv)ペプチドU1のアミノ酸に、保護基を有するアミノ酸Bを連結する工程;
(v)連結させたアミノ酸Bから保護基を除去する工程;および
(vi)アミノ酸Bから、少なくとも2つのペプチドU2の鎖を伸長させる工程
をさらに含む。
上記(A)および(C)の場合には、ヘテロペプチドトリマーを製造することができる。上記(B)の場合には、ホモペプチドトリマーを製造することができる。
このとき、上記単離ペプチドトリマーは、下記の構造を含む。
例えば、U1、U2またはU3はそれぞれ、配列番号1〜58のいずれかを含んでもよい。ヘテロペプチドトリマーである場合、2つのペプチドが同一の配列を含み、第3のペプチドがそれとは異なる配列を有してもよい。
ヘテロペプチドトリマーU3U2CU1Zにおいて、U1、U2およびU3はそれぞれ異なるペプチド配列であってもよいが、そうでなくてもよい。例えば、U1およびU2が同一の配列を含み、U3がそれとは異なる配列を含んでいてもよい。また、U1およびU3が同一の配列を含み、U2もそれと同一の配列を有してもよい。
U2=U3≠U1かつC=Bである場合、上記ペプチドは式(U2)2BU1Zで表される。
U1=U3≠U2である場合、上記ペプチドは式U1U2CU1Zで表される。
U1=U2≠U3である場合、上記ペプチドは式U3U1CU1Zで表される。
ただし、U1=U2=U3かつC=Bである場合、上記ペプチドは式(U1)2BU1Zで表されるホモペプチドトリマーとなる。
ヘテロペプチドトリマーおよびその合成の一例を図8に示し、実施例1Dに記載する。
前記微生物は、ウイルス、真菌、細菌のいずれであってもよい。
(A)ホモダイマーの合成
以下のペプチドの合成方法は、Krajewskiら(2004)の方法を改変したものである。フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)基で保護されたL−アミノ酸および樹脂は、Advanced Automated Peptide Protein TECHNOLOGIES社(AAPPTEC社)(ケンタッキー州、米国)から購入し、側鎖保護基、すなわちLys(Fmoc)、Arg(pbf)、Lys(Boc)、Tyr(But)、Trp(Boc)およびFmoc−Lys(Boc)−Wang樹脂(置換率0.72mmol/g)と共に使用した。ただしLys(Fmoc)は、ダイマーの合成において、C末端から2番目の残基としてのみ組み込んだ。ダイマーの合成は、Apex 396(Advanced ChemTech社)を用いてFmoc法により行った。
この合成方法のスキームを図2に示す。
上記の合成方法を拡張して、図9に示すようなホモテトラマーを合成してもよい。
図7に示すヘテロダイマーの合成においては、異なる保護基で保護されたアミノ酸Fmoc−Lys(Aloc)−OHを分岐点として用いてヘテロダイマーを合成した。Fmoc基とAloc基の反応性は異なり、Fmoc基の除去に用いられる塩基条件下では、Aloc基は安定である。
ヘテロペプチドトリマーの合成例を図8に示す。固相化リジン(K)残基から、まずRGRKVVRR(配列番号57)で表される第1のペプチド(U1)を伸長させる。次いで、ペプチドRGRKVVRRのN末端にあるR残基にFmoc−Lys(Aloc)−OHを連結する。次いで、Fmoc基を除去して、Lys(Aloc)残基の第1のアミン基に、鎖の伸長反応により、RGRKVVRR(配列番号44)で表される第2のペプチド(U2)を加える。第2の鎖を伸長させた後、Aloc基を除去して、リジン残基の第2のアミン基に、鎖の伸長反応により、RGRKVVRRVV(配列番号46)で表される第3のペプチド(U3)を加える。
抗菌ペプチドの抗菌活性の試験方法として、以下に示す絶対的殺菌の手法を用いた。
試験微生物として、米国培養菌保存施設(ATCC)から入手した基準培養菌、またはシンガポール総合病院病理部(the Department of Pathology,Singapore General Hospital)から入手した臨床分離株を用いた。試験に使用する培養菌はすべて、ストックからの継代数が5代以下のものとした。
以下の微生物を試験に使用した。
1.セレウス菌(Bacillus cereus)ATCC 11778
2.カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)ATCC 10231
3.緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)臨床分離株
PAE230 DR4877/07、唾液由来
4.緑膿菌臨床分離株PAE239 DM5790/07、創傷由来
5.緑膿菌臨床分離株PAE240 DU14476/07、尿由来
6.緑膿菌臨床分離株PAE249 DM15013、創傷由来
7.緑膿菌臨床分離株07DM023257、眼由来
8.緑膿菌臨床分離株07DM023376、眼由来
9.緑膿菌臨床分離株07DM023155、眼由来
10.緑膿菌臨床分離株07DM023104、眼由来
11.緑膿菌ATCC 9027
12.緑膿菌ATCC 27853
13.大腸菌(Escherichia coli)ATCC 25922
14.大腸菌臨床分離株DB16027、血液由来
15.大腸菌臨床分離株DU46381R、尿由来
16.メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)DM09808R、眼由来
17.黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)臨床分離株
DM4001、眼由来
18.カンジダ・アルビカンス臨床分離株DF2672R、尿由来
19.フザリウム・ソラニ(Fusarium solani)ATCC 36031
凍結乾燥した抗菌化合物を精製水に溶解し、1,000μg/mlの濃度に調製してスクリューキャップ付プラスチックチューブに分注した。これをストック液として−20℃で保存した。
V2ダイマーの抗菌性を緑膿菌ATCC 9027を用いて調べた。
上述したhBD3由来の10アミノ酸からなるペプチドモノマー(WO2007/126392)の緑膿菌ATCC 9027に対する抗菌活性も調べた。
USP規格リン酸緩衝液を用いてV2、L2、C2、F2およびH2モノマーの抗菌性を調べたものを表4に示す。
唾液、創傷、尿および眼に由来する複数の緑膿菌の臨床分離株に対しても、V2ダイマーの抗菌活性を調べた。V2ダイマーは、これらの臨床分離株に対しても抗菌活性を示す(表5〜8を参照)ことから、実際の臨床試料に対してもV2ダイマーを効果的に使用できることが示唆される。
緑膿菌の臨床分離株に対するV2ダイマーとゲンタマイシンの抗菌活性を比較した。
(A)カンジダ・アルビカンスATCC 10231
カンジダ・アルビカンスATCC 10231に対するV2ダイマーの抗菌活性を調べた。7.2×105CFUのカンジダ・アルビカンスを含むUSP規格リン酸緩衝液を、種々の濃度に調製したV2ダイマーと混合し、35℃で4時間インキュベートした。その結果、50、25および12.5μg/mlの濃度におけるV2ダイマーのカンジダ・アルビカンスATCC 10231に対する対数減少値は3.6〜4であった(表14)。
セレウス菌ATCC 11778に対するV2ダイマーの抗菌活性を調べた。V2ダイマーは、セレウス菌に対して抗菌活性を示した(表15)。
さらに、V2ダイマーは、ゲンタマイシン、アンピシリンなどの抗生物質に対して耐性を有する薬剤感受性パターンを示す大腸菌の多剤耐性株DB0016027R(血液由来の臨床分離株)の菌数を減少させることが可能であった。
WO2007/126392に記載の方法に従って、ヒト結膜細胞に対するV2ダイマーの毒性を調べ、野生型hBD3と比較した。図4から、V2ダイマーのヒト結膜細胞に対する毒性は野生型hBD3より低いことが分かる。野生型hBD3は、およそ15μg/mlの濃度で細胞毒性を示したが、V2ダイマーは100μg/mlの濃度でも細胞毒性を示さなかった。V2ダイマーの細胞毒性プロファイルは、WO2007/126392に記載のモノマーペプチドと同等であった。
米国臨床研究所規格委員会(NCCL)のマクロ液体希釈法を改変して、MICを求めた。希釈には、Ca2+とMg2+を加えず、1/6の濃度に希釈したミュラーヒントンブロス(Mueller Hinton Broth(MHB))を使用した。このMHB(1/6の濃度)を用いて、V2ダイマー溶液の2倍段階希釈系列を試験管に作製した。MHB(1/6の濃度)を用いて調製した試験微生物の接種液1mlを、V2ダイマーの各希釈液1mlに添加し、各試験管内の終濃度が104〜105コロニー形成単位/mlになるようにした。これらの試験管を35℃で16〜20時間インキュベートした。試験サンプルと平行して、培地と微生物のみを含むポジティブコントロールの試験管と、培地のみを含むネガティブコントロールの試験管もインキュベートした。上記の操作を、試験微生物ごとに独立した試験として繰り返した。それぞれの臨床分離株または基準微生物に対するV2ダイマーペプチドのMICは、試験微生物の視認可能な増殖を阻害するペプチドの最小濃度とした。
他のペプチドのMICも求めて、ゲンタマイシンと比較した。MICの結果を表17〜20に示す。
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WO 2007/126392
Claims (57)
- 式(U)n(式中、Uは、配列番号2を含むペプチド、またはそのフラグメントもしくは変異体であり、nは2以上である)で表されるディフェンシンペプチドの単離多量体。
- 前記ペプチドU同士が、共有結合により連結している請求項1に記載の単離多量体。
- 前記ペプチドU同士が、少なくとも1つのアミノ酸Bを介して連結している、先行する請求項のいずれか1項に記載の単離多量体。
- 前記ペプチドUが、配列番号3〜58のいずれかまたはそのフラグメントもしくは変異体を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載の単離多量体。
- 前記ペプチドUが、+1〜+11の電荷を有する、先行する請求項のいずれか1項に記載の単離多量体。
- 式(U)nBmZj(式中、Uは、配列番号3またはそのフラグメントもしくは変異体を含み、Bはそれぞれ、アミン基を少なくとも2つ有するアミノ酸を少なくとも1つ包含し、Zは任意のアミノ酸を包含し、mは1以上であり、jは0以上である)を有する、先行する請求項のいずれか1項に記載の単離多量体。
- 前記ペプチドUが、配列番号36〜44のいずれかまたはそのフラグメントもしくは変異体を含む請求項6に記載の単離多量体。
- Bがそれぞれ、リジン、オルニチンまたはアルギニンを包含する請求項6または7に記載の単離多量体。
- m=n−1、j=1かつB=Z=Kであり、前記多量体が式(U)nKn−1Kを有し、Uが配列番号36〜44のいずれかを含む請求項6〜8のいずれか1項に記載の単離多量体。
- n=2であり、前記多量体が式(U)2KKを有し、Uが配列番号36〜44のいずれかを含む請求項8に記載の単離多量体。
- m=n−1、j=1かつB=Z=Kであり、Uが配列番号44を含み、前記多量体が式(配列番号44)nKn−1Kを有する請求項6〜8のいずれか1項に記載の単離多量体。
- n=2であり、前記多量体が式(配列番号44)2KKを有する請求項11に記載の単離多量体。
- 分岐状である、先行する請求項のいずれか1項に記載の単離多量体。
- 直鎖状である、先行する請求項のいずれか1項に記載の単離多量体。
- 先行する請求項のいずれか1項に記載の多量体の全長または任意の一部をコードする単離核酸分子。
- 請求項15に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項15に記載の核酸分子または請求項16に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 少なくとも2つのペプチドUを連結することを含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の多量体を製造する方法。
- 前記多量体が式(U)nBmZjで表され、
(i)少なくとも1つの固相を準備する工程;
(ii)固相に少なくとも1つの1番目のアミノ酸Zを結合させる工程;
(iii)固相に結合させたZに、保護基を有するアミノ酸残基Bを少なくとも1つ連結する工程;
(iv)連結させたアミノ酸残基Bから保護基を除去する工程;
(v)ペプチドUの配列に従って、保護基を有するアミノ酸残基をC末端からN末端の方向へ順に連結し、連結の都度、次の連結のために保護基を除去することによって、さらなる鎖の伸長を行う工程;
(vi)加える残基の数に応じて、アミノ酸残基の連結を終了する工程;および
(vii)必要に応じて、得られた多量体を固相から遊離させる工程
を含む請求項18に記載の方法。 - 工程(iv)の後に、
(iv)(a)連結させた残基Bに、保護基を有する残基Bをさらに連結する工程;
(iv)(b)(iv)(a)で連結させた残基Bから保護基を除去する工程;および
(iv)(c)工程(iv)(a)および(iv)(b)を繰り返し行う工程、または
(iv)(d)工程(v)および(vi)に進む工程
をさらに含む請求項19に記載の方法。 - Bがそれぞれ、リジン、アルギニンまたはオルニチンを包含する請求項19または20に記載の方法。
- 前記ペプチドUが、配列番号3またはそのフラグメントもしくは変異体を含む請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ペプチドUが、配列番号36〜44のいずれかを含む請求項19〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1種の微生物の増殖を阻害および/または抑制するための請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の単離多量体。
- 少なくとも1つの微生物感染症の治療に使用するための請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の単離多量体。
- 点眼用の組成物および/もしくは液剤ならびに/またはコンタクトレンズ用液剤に使用するための請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の単離多量体。
- 請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の多量体を含む抗菌組成物。
- 請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の多量体を含む医薬組成物。
- 外用、経口投与用、非経口投与用または吸入用に製剤化されている、請求項27に記載の抗菌組成物または請求項28に記載の医薬組成物。
- 点眼剤および/またはコンタクトレンズ用液剤に適した、請求項27もしくは29に記載の抗菌組成物または請求項28もしくは29に記載の医薬組成物。
- 請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の多量体ならびに/または請求項27もしくは29に記載の抗菌組成物を含むコンタクトレンズ用液剤。
- 請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の多量体を含む、器具をコーティングするための組成物。
- 請求項32に記載の組成物でコーティングされた器具。
- 医療器具を包含する請求項33に記載の器具。
- カテーテル、針、シース、ステントまたは包帯を包含する請求項33または34に記載の器具。
- 少なくとも1つの適切な容器に、請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の少なくとも1つの多量体、請求項27もしくは29に記載の少なくとも1つの抗菌組成物ならびに/または請求項28もしくは29に記載の少なくとも1つの医薬組成物を含むキット。
- 少なくとも1種の微生物の増殖を阻害および/または抑制する方法であって、前記微生物を、請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の少なくとも1つの多量体、ならびに/または請求項27もしくは29に記載の抗菌組成物と接触させることを含む方法。
- 請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の少なくとも1つの多量体、請求項27もしくは29に記載の少なくとも1つの抗菌組成物ならびに/または請求項28もしくは29に記載の少なくとも1つの医薬組成物を対象に投与することを含む、少なくとも1つの微生物感染症を治療する方法。
- 対象における少なくとも1種の微生物の増殖を阻害および/または抑制する方法であって、請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の少なくとも1つの多量体、請求項27もしくは29に記載の少なくとも1つの抗菌組成物ならびに/または請求項28もしくは29に記載の少なくとも1つの医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法。
- 抗菌組成物の製造のための請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の多量体の使用。
- 前記抗菌組成物が、対象における少なくとも1種の微生物の増殖を阻害および/または抑制するために用いられる請求項40に記載の使用。
- 微生物感染症の治療薬を製造するための請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の多量体の使用。
- 点眼用の組成物および/もしくは液剤ならびに/またはコンタクトレンズ用液剤の製造のための請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の多量体の使用。
- 器具をコーティングするための組成物を製造するための請求項1〜14、48〜49および51〜57のいずれか1項に記載の多量体の使用。
- 前記器具が医療器具である請求項44に記載の使用。
- 前記器具がカテーテル、針、シース、ステントまたは包帯である請求項44または45に記載の使用。
- 式[(U1)(U2)]n/2(C)n/2BmZ(式中、U1およびU2はそれぞれペプチドを含み、U1≠U2かつn=2xであり、x=0または正の整数であり、m=1または0である)で表されるペプチド多量体を製造する方法であって、
(i)少なくとも1つの固相を準備する工程;
(ii)固相に少なくとも1つの1番目のアミノ酸Zを結合させる工程;
(iii)必要に応じて、固相に結合させたZにアミノ酸Bを少なくとも1つ連結する工程;
(iv)ZまたはBに、異なる保護基で保護された基を少なくとも2つ含むアミノ酸Cを少なくとも1つ連結する工程;
(v)連結させたアミノ酸Cから第1の保護基を除去して、第1の反応側鎖を露出させる工程;
(vi)Cの第1の反応側鎖から、第1のペプチドU1の鎖を伸長させる工程;
(vii)連結させたアミノ酸Bから第2の保護基を除去して、少なくとも1つの第2の反応側鎖を露出させる工程;および
(viii)Cの第2の反応側鎖から、第2のペプチドU2の鎖を伸長させる工程
を含む方法。 - 式[(U1)(U2)]n/2(C)n/2BmZ(式中、U1およびU2はペプチド配列を含み、U1≠U2であり、CおよびBはそれぞれ、アミン基を少なくとも2つ有するアミノ酸を包含し、Zは任意のアミノ酸を包含し、n=2xであり、x=0または正の整数であり、m=1または0である)で表される単離ペプチド多量体。
- U1またはU2が、配列番号2またはそのフラグメントもしくは変異体を含む請求項48に記載の単離ペプチド多量体。
- 式U3U2CU1Z(式中、U1、U2およびU3はそれぞれペプチドを含み、Cは、アミン基を少なくとも2つ有するアミノ酸を包含し、Zは任意のアミノ酸を包含する)で表されるペプチドトリマーを製造する方法であって、
(i)少なくとも1つの固相を準備する工程;
(ii)固相に少なくとも1つの1番目のアミノ酸Zを結合させる工程;および
(iii)Zから、ペプチドU1の鎖を伸長させる工程
を含み、
(A)前記ペプチドトリマーが、式U3U2(C)U1Zで表されるヘテロペプチドである場合、
(iv)ペプチドU1のアミノ酸に、異なる保護基を有するアミノ酸Cを連結する工程;
(v)連結させたアミノ酸Cから第1の保護基を除去する工程;
(vi)アミノ酸Cから、ペプチドU2の鎖を伸長させる工程;
(vii)連結させたアミノ酸Cから第2の保護基を除去する工程;および
(viii)アミノ酸Cから、ペプチドU3の鎖を伸長させる工程
をさらに含み、
(B)U2=U3=U1かつC=Bであり、前記ペプチドトリマーが式(U1)2BU1Zを含む場合、
(iv)ペプチドU1のアミノ酸に、保護基を有するアミノ酸Bを連結する工程;
(v)連結させたアミノ酸Bから保護基を除去する工程;および
(vi)アミノ酸Bから、2つのペプチドU1の鎖を伸長させる工程
をさらに含み、
(C)U2=U3≠U1かつC=Bであり、前記ペプチドトリマーが式(U2)2BU1Zを含む場合、
(iv)ペプチドU1のアミノ酸に、保護基を有するアミノ酸Bを連結する工程;
(v)連結させたアミノ酸Bから保護基を除去する工程;および
(vi)アミノ酸Bから、少なくとも2つのペプチドU2の鎖を伸長させる工程
をさらに含む方法。 - 式U3U2CU1Z(式中、U1、U2およびU3はそれぞれペプチドを含み、Cは、アミン基を少なくとも2つ有するアミノ酸を包含し、Zは任意のアミノ酸を包含する)で表される単離ペプチドトリマー。
- アミノ酸Cで分岐している請求項51に記載の単離ペプチドトリマー。
- U1、U2またはU3がそれぞれ、配列番号2またはそのフラグメントもしくは変異体を含む請求項51または52に記載の単離ペプチドトリマー。
- U2=U3≠U1かつC=Bであり、前記ペプチドが(U2)2BU1Zを含む請求項51〜53のいずれか1項に記載の単離ペプチドトリマー。
- U1=U3≠U2であり、前記ペプチドが式U1U2CU1Zを含む請求項51〜53のいずれか1項に記載の単離ペプチドトリマー。
- U1=U2≠U3であり、前記ペプチドが式U3U1CU1Zを含む請求項51〜53のいずれか1項に記載の単離ペプチドトリマー。
- U1=U2=U3かつC=Bであり、前記ペプチドが式(U1)2BU1Zを含む請求項51〜53のいずれか1項に記載の単離ペプチドトリマー。
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