CN118555963A - 抗病毒肽和/或化合物的组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

提供了广谱抗病毒肽和包括治疗有效量的抗病毒肽以及药学上可接受的载剂的组合物。抗病毒组合物显示出强大的广谱抗病毒作用，而不会导致病毒抗性。抗病毒组合物可用于治疗由病毒感染引起的疾病，特别是呼吸道病毒，例如包膜冠状病毒(SARS‑CoV‑2、SARS‑CoV和MERS‑CoV)、大流行性甲型(H1N1)pdm09病毒、甲型禽流感(H7N9)病毒和无包膜鼻病毒。

Description

抗病毒肽和/或化合物的组合物及其使用方法

发明领域

本发明通常涉及广谱抗病毒肽和小分子，以及治疗抗病毒感染的方法。

发明背景

由于缺乏预先存在的免疫力，新型呼吸道病毒通常会引起严重的呼吸道感染并迅速传播。近二十年来，三种高致病性冠状病毒已经跨越物种屏障并引起人类疾病，包括2003年与蝙蝠相关的严重急性呼吸系统综合征(SARS)冠状病毒(CoV)(SARS-CoV)(Woo等人,Lancet 363,841-845(2004),Lau等人,Proc Natl Acad Sci U S A 102,14040-14045(2005))、自2012年的中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-CoV)(Chan等人,Clinicalmicrobiology reviews 28,465-522(2015),Yeung等人,Nat Microbiol 1,16004(2016))和最近的2019年新型冠状病毒(SARS-CoV-2)(Chan等人,Lancet 395,514-523(2020))。此外，2009年大流行性甲型流感(H1N1)pdm09病毒导致了21世纪的第一次流感大流行，并且甲型禽流感病毒(H7N9)在中国造成了大规模的人畜共患病暴发(To等人,Lancet Infect Dis13,809-821(2013),Cheng等人,Clinical microbiology reviews 25,223-263(2012))。由于缺乏有效的抗病毒药，尤其是针对冠状病毒的抗病毒药，这些呼吸道病毒与显著的发病率和死亡率相关联。此外，这些新出现的呼吸道病毒还造成了严重的经济和社会动荡。

COVID-2019爆发清楚地说明了广谱抗病毒药物的重要性。伴随着2019年12月报告了异常肺炎的爆发，中国CDC于2020年1月8日报告了SARS-CoV-2的身份(Li等人,N Engl JMed(2020))。目前尚无可靠的抗病毒药物或疫苗可用于SARS-CoV-2感染的治疗或预防。研究表明，SARS-CoV-2感染患者的抗体水平可能下降(Ibarrondo等人,N Engl J Med 383,1085-1087(2020),Guo等人,Front Immunol 11,1936(2020),Long等人,Nat Med 26,1200-1204(2020),Liu等人,Clin Microbiol Infect(2020),Sariol,&Perlman,Immunity 53,248-263(2020))，这表明SARS-CoV-2疫苗在不同个体之间保护的持续时间也可能不同。此外，有关再感染的报告提示，对SARS-CoV-2的免疫应答可能不足以保护某些患者免受SARS-CoV-2的再感染(To等人，Clin Infect Dis(2020))。抗体依赖性增强是SARS-CoV-2疫苗的另一个潜在副作用(Lee等人,Nat Microbiol(2020),Arvin等人,Nature 584,353-363(2020))。治疗COVID-19和其他冠状病毒感染迫切需要不依赖宿主对病毒的免疫应答的广谱抗病毒药物。因此，研究了针对SARS-CoV-2的广谱抗病毒肽(Xia等人,Cell Res30,343-355(2020)和FDA批准药物的再利用以抑制SARS-CoV-2(Riva等人,Nature(2020),Maisonnasse等人,Nature(2020),Gordon等人,Nature 583,459-468(2020))。

自COVID-19出现以来，已经开展了许多临床试验以再利用已批准的针对SARS-CoV-2的药物，包括氯喹、阿比多尔、卡莫司他、瑞德西韦、利巴韦林和洛匹那韦/利托那韦(Dong等人,Drug Discov Ther 14,58-60(2020))。氯喹可能干扰内吞途径以广泛抑制SARS-CoV-2(Wang等人,Cell Res(2020))、SARS-CoV(Vincent等人,Virol J 2,69(2005))、流感病毒、埃博拉病毒和其他体外病毒(Rebeaud&Zores,Front Med(Lausanne)7,184(2020))。然而，由于其潜在的心脏副作用和缺乏体内抗病毒活性(Maisonnasse等人,Nature(2020),Falzarano等人,Emerg Infect Dis 21,1065-1067(2015))，其在COVID-19患者中的临床疗效有限(Borba等人,JAMA Netw Open 3,e208857(2020),Erickson等人,Toxicol Commun 4,40-42(2020),Hashem等人,Travel Med Infect Dis 35,101735(2020)。在中国和俄罗斯临床可用的药物阿比多尔正在美国进行针对流感的III期试验。阿比多尔证明了对包括流感病毒、冠状病毒和埃博拉病毒在内的许多病毒的广谱体外抗病毒活性(Hulseberg等人,Journal of virology93(2019),Kadam,&Wilson,Proc Natl AcadSci U S A 114,206-214(2017))，其中对SARS-CoV-2的IC50为2-20μg ml-1(Wang等人,Cell Res(2020),Wang等人,Cell Discov 6,28(2020))。然而，阿比多尔的峰值血清浓度在施用常规药物剂量后5小时内低于2μg ml-1(Deng等人,Antimicrob Agents Chemother57,1743-1755(2013),Sun等人,Int J Clin Pharmacol Ther 51,423-432(2013))，这可能解释了阿比多尔在SARS-CoV-2患者中不确定的临床疗效(Zhu等人,J Infect 81,e21-e23(2020),Lian等人,Clin Microbiol Infect 26,917-921(2020),Li等人,Med(N Y)(2020))。甲磺酸卡莫司他(卡莫司他)，促进病毒进入细胞表面的TMPRSS2的抑制剂，已被证明抑制SARS-CoV、SARS-CoV-2和其他病毒(Hoffmann等人,Cell 181,271-280e278(2020),Zhou等人,Antiviral Res116,76-84(2015))。

有效的广谱抗病毒药物将改善患者的预后，并且甚至可以在新出现的病毒和特异性抗病毒药物的鉴定之前减少社区和医院的传播。针对HIV、丙型肝炎病毒和流感病毒，抗病毒药物的“一病一药”方法取得了成功(Vigant等人,Nat Rev Microbiol 13,426-437(2015))。然而，在新病毒得到鉴定或特异性抗病毒药物可用之前，迫切需要广谱抗病毒药物来对抗新出现和重新出现的新病毒爆发，如SARS-CoV-2。

本发明的一个目的是提供广谱抗病毒剂。

本发明的另一个目的是提供广谱抗病毒剂的组合物。

本发明的另一个目的是提供在有此需要的受试者中治疗病毒感染的方法。

发明概述

提供了抗病毒剂、含有抗病毒剂的组合物及其使用方法。抗病毒剂包括P9R(SEQID NO:2)，或衍生自P9R的P9R样肽，其特征在于它们“抑制内体酸化”和“肽-病毒结合”，如通过体外内体酸化和肽-病毒结合测定所确定的。在一些优选形式中，抗病毒剂是P9R。抗病毒组合物包括治疗有效量的抗病毒剂。

可将抗病毒组合物施用于有此需要的受试者，以治疗与病毒感染相关的症状。优选地，受试者感染了呼吸道病毒，更优选地，感染了需要内体酸化以进行病毒-宿主膜融合的pH依赖性病毒。实例包括但不限于包膜冠状病毒(SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV)、大流行性甲型(H1N1)pdm09病毒、甲型禽流感(H7N9)病毒和无包膜鼻病毒。

公开了抗病毒剂和抗病毒组合物。在一些形式中，抗病毒剂和组合物抑制细胞中的抗病毒复制。在一些形式中，抗病毒剂和组合物抑制病毒进入细胞。在一些形式中，抗病毒剂和组合物抑制病毒进入细胞和细胞内的抗病毒复制。

在一些形式中，抗病毒剂包含多价肽，其中多价肽包含三个或更多个拷贝的选自以下的肽的一种或组合：P9R(SEQ ID NO:2)和衍生自P9R的P9R样肽，其中组成多价肽的所述肽的至少三种从组成多价肽的一种或多种肽分支。

在一些形式中，多价肽包含六个或更多个拷贝的肽，其中组成多价肽的所述肽的至少六种从组成多价肽的一种或多种肽分支。在一些形式中，多价肽包含八个或更多个拷贝的肽，其中组成多价肽的所述肽的至少八种从组成多价肽的一种或多种肽分支。

在一些形式中，从组成多价肽的一种或多种肽分支的所述肽的至少三种从多价肽的中心点分支。在一些形式中，从组成多价肽的一种或多种肽分支的所述肽的至少六种从多价肽的中心点分支。在一些形式中，从组成多价肽的一种或多种肽分支的所述肽的至少八种从多价肽的中心点分支。在一些形式中，从组成多价肽的一种或多种肽分支的肽从多价肽的中心点分支。

在一些形式中，P9R样肽的特征在于P9R样肽抑制内体酸化并保留病毒结合，如通过体外内体酸化(任选地与对照相比)和肽-病毒结合测定所确定的。在一些形式中，组成多价肽的肽各自由P9R(SEQ ID NO:2)组成。

在一些形式中，组成多价肽的一种或多种肽具有至少5的净正电荷。在一些形式中，组成多价肽的肽各自具有至少5的净正电荷。在一些形式中，组成多价肽的一种或多种肽具有约5.6的净正电荷。在一些形式中，组成多价肽的肽各自具有约5.6的净正电荷。在一些形式中，组成多价肽的一种或多种肽具有5.6的净正电荷。在一些形式中，组成多价肽的肽各自具有5.6的净正电荷。

在一些形式中，抗病毒剂包含P9R(SEQ ID NO:2)，或衍生自P9R的P9R样肽。在一些形式中，P9R样肽的特征在于P9R样肽抑制内体酸化并保留病毒结合，如通过体外内体酸化(任选地与对照相比)和肽-病毒结合测定所确定的。在一些形式中，抗病毒剂由P9R(SEQ IDNO:2)组成。

在一些形式中，抗病毒剂具有至少5的净正电荷。在一些形式中，抗病毒剂具有约5.6的净正电荷。在一些形式中，抗病毒剂具有5.6的净正电荷。

在一些形式中，抗病毒组合物包含任何一种或多种所公开的抗病毒剂和药学上可接受的载剂。在一些形式中，抗病毒组合物包含治疗有效量的任何一种或多种所公开的抗病毒剂和药学上可接受的载剂。

在一些形式中，抗病毒组合物包含阿比多尔、氯喹和卡莫司他。

在一些形式中，组合物抑制受试者中的抗病毒复制。在一些形式中，组合物是单位剂型。在一些形式中，单位剂型选自片剂或胶囊。在一些形式中，组合物是适合于鼻内或肺部递送的形式。在一些形式中，单位剂型是可注射的，其中组合物进一步包含用于注射至人的药学上可接受的载剂。

还公开了在有此需要的受试者中治疗病毒感染的方法。在一些形式中，该方法包括向受试者施用有效量的任何公开的抗病毒剂或任何公开的抗病毒组合物。

在一些形式中，感染是由呼吸道病毒引起的。在一些形式中，感染是由pH依赖性病毒引起的，该病毒需要内体酸化以实现病毒-宿主膜融合。在一些形式中，感染是由寨卡病毒、肠道病毒-A7、埃博拉病毒、流感病毒、SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、甲型(H1N1)pdm09病毒、甲型禽流感(H7N9)病毒和无包膜鼻病毒引起的。

在一些形式中，组合物肠胃外或经口施用。在一些形式中，组合物鼻内施用或通过肺部施用来施用。

附图简要说明

图1A显示肽序列(P9(SEQ ID NO:1)；P9R(SEQ ID NO:2)；PA1(SEQ ID NO:3)；和P9RS(SEQ ID NO:4))和由InnovaGen的PepCalc分析的正电荷。图1B-1H显示P9R抑制细胞中2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)、MERS-CoV、SARS-CoV、H1N1病毒、H7N9病毒、鼻病毒、副流感3病毒的病毒复制。病毒与不同浓度的P9R或P9预混合，然后感染细胞。通过噬斑减少测定评估抗病毒效率。通过用肽处理的病毒的噬斑数除以用BSA处理的病毒的噬斑数来计算感染(％)。图1I显示用P9R或BSA(50-100μg ml^-1)处理时通过测量感染后24小时病毒上清液中的病毒RNA拷贝，P9R对病毒的有效抗病毒活性。图1J显示P9R在MDCK、Vero E6和A549细胞中的细胞毒性。当P9R的IC₅₀与P9相比时*表示P<0.05，**表示P<0.01。P值通过双尾学生t检验计算。数据表示为至少三次独立实验的平均值±SD。

图2A显示肽处理的MDCK细胞中内体酸化的红色荧光的定量。从10个随机显微镜视野计算红色荧光强度。图2B显示通过噬斑减少测定测量的25μg ml^-1的P9R、P9RS和PA1对SARS-CoV-2和甲型(H1N1)pdm09病毒的抗病毒活性。将肽处理的病毒的噬斑数(％)相对于BSA处理的病毒归一化。图2C显示P9R和PA1与SARS-CoV-2和甲型(H1N1)pdm09病毒的结合。通过ELISA和RT-qPCR检测病毒结合肽。与P9R相比时，**表示P<0.01。P值通过双尾学生t检验计算。

图3A显示P9R与SARS-CoV-2和甲型(H1N1)pdm09的结合可以被PA1减少。病毒用PA1或BSA预处理，然后通过RT-qPCR测量处理过的病毒与指定肽的结合。与BSA处理的病毒相比时，**表示P<0.01。(c)P9R可以抑制病毒RNP释放到核中。用BSA、P9R或巴弗洛霉素A1(BA1)预处理H1N1病毒，然后用处理过的病毒感染MDCK细胞。病毒NP(绿色)和细胞核(蓝色)的图像是在感染后3.5小时拍摄的。图3B-3D包括显示P9R可以广泛结合MERS-CoV、H7N9病毒和鼻病毒的数据。结合肽的病毒的相对RNA拷贝相对于结合P9R的病毒归一化。与P9R相比时，*表示P<0.05。**表示P<0.01。P值通过双尾学生t检验计算。图3E显示结合病毒和病毒蛋白的肽。对于与SARS-CoV结合的肽(左图)。SARS-CoV与指定的肽在ELISA板上孵育1小时。未结合的病毒被洗掉，并且结合的SARS-CoV通过RT-qPCR进行量化。将相对RNA拷贝(％)相对于与P9R结合的病毒RNA拷贝归一化。与H1N1 HA1蛋白结合的肽(中图)。与MERS-CoV S蛋白结合的肽(左图)。将肽包被在ELISA板上。通过ELISA测定测量与肽结合的H1N1 HA和MERS-CoV S蛋白。与P9R相比时，*表示P<0.05。**表示P<0.01。P值通过双尾学生t检验计算。

图4A显示P9R(50μg/剂)对被甲型(H1N1)病毒感染的小鼠的治疗功效与扎那米韦(50μg/剂)相同。在感染后6小时，将PBS、扎那米韦、PA1、P9R或P9鼻内接种至小鼠，并在接下来的一天内对小鼠再施用两剂。每组包括五只小鼠。图4B显示对应于(图4A)的受感染小鼠的体重变化。图4C显示与P9相比，低剂量P9R对感染甲型(H1N1)pdm09病毒的小鼠的效果。在感染后6小时，将PBS(n＝10)、P9-25(25.0μg/剂，n＝5)、P9-12.5(12.5μg/剂，n＝5)、P9R-25(25.0μg/剂，n＝10)和P9R-12.5(12.5μg/剂，n＝10)鼻内接种至小鼠，并在接下来的一天内对小鼠再施用两剂。图4D显示对应于(图4C)的受感染小鼠的体重变化。P值通过Gehan-Breslow-Wilcoxon检验计算。

图5A显示了扎那米韦和P9R的药物抗性测定的程序。甲型(H1N1)病毒在指定浓度的扎那米韦和P9R存在下传代。ND，未检测到，因为在P16之前生成了针对扎那米韦的高抗性H1N1病毒。图5B显示扎那米韦对亲本甲型(H1N1)病毒(P0)的抑制。扎那米韦对亲本H1N1的IC₅₀为35nM。图5C显示在扎那米韦存在下，扎那米韦针对传代的甲型(H1N1)病毒的抗病毒效率。图5D显示在P9R存在下，P9R针对传代的甲型(H1N1)病毒的抗病毒效率。传代病毒与扎那米韦(nM)或P9R(μg ml^-1)预混合用于感染。感染后24小时收集上清液。上清液中的病毒滴度由RT-qPCR确定。将相对复制(％)相对于未经处理的相应传代病毒归一化。数据表示为三次独立实验的平均值±SD。

图6A是单个P9R结合单个病毒颗粒和分支P9R(8P9R)将病毒交联在一起的示意图。图6B是显示8P9R和P9R与SARS-CoV-2和H1N1病毒结合的条形图。包被在ELISA板上的肽可以捕获病毒颗粒，然后通过RT-qPCR对其进行量化。P9RS是没有病毒结合能力的阴性对照肽。数据表示为三次独立实验的平均值±SD。图6C是显示对照肽和不同肽与SARS-CoV-2和H1N1的相对结合的条形图。SARS-CoV-2用指定的肽预处理以进行噬斑减少测定。数据表示为四次独立实验的平均值±SD。图6D是显示P9R和8P9R肽的SARS-CoV-2噬斑数(％)的条形图。SARS-CoV-2在病毒接种期间用指定的肽(25μg ml^-1)处理。在Vero-E6细胞的上清液中感染后24小时，通过RT-qPCR检测病毒RNA拷贝。数据表示为三次独立实验的平均值±SD。图6E是显示作为时间的函数的PFU/ml的线形图。SARS-CoV-2在感染后6小时用肽(50μg ml^-1)处理。在指定时间通过噬斑测定测量病毒滴度。数据表示为三次独立实验的平均值±SD。图6F是显示8P9R在火鸡红细胞(TRBC)中的溶血测定结果的条形图。用指定浓度的8P9R处理TRBC。将溶血(％)相对于Triton X-100处理的TRBC归一化。数据表示为三次独立实验平均值±SD。P值通过双尾学生t检验计算。*表示P<0.05。**表示P<0.01。图6G是显示PB缓冲液中P9R的抗病毒活性的条形图。SARS-CoV-2在30mM磷酸盐缓冲液(PB)中用指定浓度的P9R预处理。45分钟孵育后，使用噬斑减少测定来测量P9R的抗病毒活性。将P9R处理的病毒的噬斑数相对于未处理病毒的噬斑数归一化。数据表示为五次独立实验的平均值±SD。图6H是显示8P9R在Vero-E6中的细胞毒性的条形图。在含有1％ FBS培养基的DMEM中，在指定浓度的8P9R存在下培养Vero-E6细胞。24小时培养后，使用MTT测定测量细胞活力。数据表示为三次独立实验的平均值±SD。图6I是显示8P9R针对H1N1、副流感病毒3和人鼻病毒的抗病毒活性的条形图。H1N1、副流感病毒3和人鼻病毒与8P9R(25μg/ml)或PBS(模拟物)在室温下预混合45分钟。然后用处理过的流感病毒感染MDCK细胞。LLC-MK2细胞被处理过的副流感病毒感染。RD细胞被处理过的鼻病毒感染。H1N1的感染(％)是8P9R处理病毒的噬斑数相对于模拟物处理病毒的噬斑数归一化，副流感病毒3和鼻病毒的感染(％)是8P9R处理病毒的病毒RNA拷贝相对于PBS处理病毒的RNA拷贝归一化。数据表示为三个独立生物样品的平均值±SD。

图7A是显示Vero-E6细胞(n＝5)中8P9R对阿比多尔针对SARS-CoV-2的抗病毒活性的效果的线形图。病毒在指定浓度的阿比多尔(Ar)或Ar+8P9R(3.1μg ml^-1)或Ar+8P9R(1.6μg ml^-1)存在下感染细胞。图7B是显示与单独的阿比多尔(n＝4)相比，8P9R对阿比多尔的抗病毒活性的效果的条形图。SARS-CoV-2用指定的Ar-0.2(0.2μg ml^-1)、8P9R-3.1(3.1μg ml^-1)、Ar+8P9R或PBS(模拟物)处理。图7C是显示模拟物、8P9R和阿比多尔对SARS-CoV-2噬斑形成(PFU/ml)的效果的条形图。SARS-CoV-2(10⁶PFU ml^-1)用25μg ml^-1阿比多尔或8P9R处理(n＝3)。然后将病毒连续稀释以通过噬斑测定检测病毒滴度。图7D是显示阿比多尔、BA1和模拟物随感染后时间推移对SARS-CoV-2对相对病毒RNA拷贝(％)的效果的条形图。SARS-CoV-2在感染后的指定时间通过指定药物处理(n＝3)。在感染后24小时通过RT-qPCR测量病毒滴度(a、b和d)。数据表示为3-5次独立实验的平均值±SD。P值通过双尾学生t检验计算。图7E是显示8P9R对阿比多尔的抗病毒活性的效果的条形图。SARS-CoV-2在指定的阿比多尔(Ar-0.2，0.2μg ml^-1)、8P9R-1.6(1.6μg ml^-1)或Ar+8P9R的组合存在下培养。在感染后24小时通过RT-qPCR测量上清液中的病毒滴度。数据表示为四次独立实验的平均值±SD。P值通过双尾学生t检验计算。图7F是显示阿比多尔对8P9R的抗病毒活性的效果的条形图。SARS-CoV-2在指定的阿比多尔(Ar-12.5，12.5μg ml^-1)、8P9R-0.8(0.8μg ml^-1)或Ar+8P9R的组合存在下培养。在感染后24小时通过RT-qPCR测量上清液中的病毒滴度。数据表示为三次独立实验的平均值±SD。P值通过双尾学生t检验计算。图7G是显示阿比多尔对Vero-E6细胞中SARS-CoV-2的病毒附着的效果的条形图。SARS-CoV-2用阿比多尔(Ar，25μg ml^-1)或0.1％DMSO(模拟物)预处理，然后在4℃下加入Vero-E6细胞进行附着。一小时后，洗去未附着的病毒。通过RT-qPCR测量附着的病毒。数据表示为三次独立实验的平均值±SD。

图8A是显示与单独的阿比多尔(0.2μg ml^-1，Ar-0.2)相比，氯喹(Chl)对阿比多尔针对SARS-CoV-2的活性的效果的条形图(n＝4)。SARS-CoV-2用指定的Ar-0.2、Chl-3.1(3.1μg ml^-1)或Ar+Chl处理。图8B是显示与单独的阿比多尔(0.4μg ml，Ar-0.4)相比，氯喹(Chl)对阿比多尔针对SARS-CoV-2的活性的效果的条形图(n＝3)。SARS-CoV用指定的Ar-0.4、Chl-6.3(6.3μg ml^-1)或Ar+Chl处理。图8C是显示指定药物或药物组合在小鼠中针对SARS-CoV的抗病毒活性的条形图。小鼠用SARS-CoV接种(5×10³PFU)。在感染后8小时，给予小鼠8P9R(鼻内0.5mg kg^-1，n＝8)、阿比多尔(Ar，口服30mg kg^-1，n＝8)、氯喹(Chl，口服40mg kg^-1，n＝6)、卡莫司他(Cam，鼻内0.3mg kg-1,n＝5)、Ar+Chl(n＝6)、Ar+Cam(n＝6)、Chl+Cam(n＝6)、Ar+Chl+Cam(n＝5)和模拟物(n＝12)。在感染后48小时通过噬斑测定测量病毒载量。图8D-8E是显示8P9R(12.5μg ml^-1)、阿比多尔(12.5μg ml^-1)和氯喹(12.5μg ml^-1)在Vero-E6(8D,n＝4)和Calu-3(8E,n＝5)细胞中的抗病毒活性的条形图。在感染后24小时通过RT-qPCR测量细胞上清液中的病毒RNA拷贝。图8F是显示指定药物或药物组合在仓鼠中针对SARS-CoV-2的抗病毒活性的条形图。仓鼠用SARS-CoV-2接种(5×10³PFU)。在感染后8小时，给予仓鼠模拟物(n＝9)、8P9R(n＝4)、Ar+Chl+Cam(n＝6)、Chl+Cam(n＝6)、Ar+Cam(3)、Cam(n＝5)、Ar(n＝3)和Chl(n＝4)。在感染后48小时通过噬斑测定测量病毒载量。数据表示为平均值±SD。P值通过双尾学生t检验计算。图8G是显示卡莫司他对小鼠中SARS-CoV复制的效果的条形图。小鼠用SARS-CoV鼻内接种(2×10³PFU)。在感染后8小时，将卡莫司他(Cam：15mg kg^-1，n＝3)或模拟物(n＝3)口服接种至小鼠。在接下来的一天，再给予小鼠两剂。感染后2天收集肺组织。通过噬斑测定测量肺中的病毒载量。数据表示为平均值±SD。

发明详述

I.定义

如本文所用，“气溶胶”是指任何颗粒细雾的制备，其可以是溶液或混悬液，无论其是否使用推进剂产生。

“乳液”是含有均匀混合在一起的不可混溶组分的混合物的组合物。

如本文所用，“亲水的”是指具有容易与水相互作用的强极性基团的物质。

如本文所用，“疏水的”是指对水缺乏亲和力的物质；倾向于排斥和不吸水以及不溶于水或不与水混合。

如本文所用，“亲脂的”是指对脂质具有亲和力的化合物。

如本文所用，“肠胃外施用”是指通过消化道或非侵入性局部或区域途径以外的任何方法施用。

如本文所用，待治疗的“患者”或“受试者”是指人或非人动物。

如本文所用，“药学上可接受的”是指那些在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症的、与合理的收益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所用，“药学上可接受的盐”是指本文定义的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸盐或碱盐而被修饰。

如本文所用，“治疗有效”或“有效量”是指所用组合物的量是足以改善疾病或病症的一种或多种起因或症状的量。此类改善只需要减少或改变，而不一定要消除。如本文所用，术语“治疗有效量”、“治疗量”和“药学有效量”是同义词。本领域技术人员可以容易地确定合适的治疗量。

“受试者”或“患者”是指人、灵长类动物、非人灵长类动物、实验动物、农场动物、家畜或家养宠物。

II.组合物

提供了具有交联病毒以阻止病毒进入(由SARS-CoV-2的TMPRSS2介导)和减少内体酸化以抑制通过内吞途径的病毒进入的双重抗病毒机制的组合物。在一些优选的形式中，所公开的组合物包括有效的抗病毒肽P9R(NGAICWGPCPTAFRQIGNCGRFRVRCCRIR；SEQ ID NO:2)，衍生自小鼠β-防御素-4和P9(NGAICWGPCPTAFRQIGNCGKFKVRCCKIR；(SEQ ID NO:1)。机理研究表明，带正电荷的P9R通过与不同病毒结合然后抑制病毒宿主内体酸化以防止pH依赖性病毒的内体释放来广泛抑制病毒复制。P9R(不仅与病毒结合而且抑制内体酸化)、PA1(仅与病毒结合)和P9RS(仅抑制内体酸化)用于鉴定和确认碱性肽的新型抗病毒机制。碱性肽的抗病毒活性可以通过增加肽的正电荷来增强，并且需要结合病毒和抑制内体酸化。肽可以是单价的或多价的，具有例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个拷贝的抗病毒肽。

另外地或替代性地，组合物可以包括选自一种或多种小分子药物的两种或更多种活性剂，任选地与作为单肽或多价肽的P9R或其衍生物组合，它们一起可以抑制病毒如SAR-CoV-2的两种进入途径。

A.抗病毒活性剂

提供了抗病毒肽和小分子活性剂及其组合。

1.抗病毒肽

公开的抗病毒肽优选由P9R序列组成。然而，抗病毒肽可以包括衍生自P9R的肽，只要第21、23和28位的氨基酸是带正电荷的氨基酸即可。因此，该肽可以具有与P9R相同的氨基酸序列，其中第21、23和28位的精氨酸被带正电的氨基酸如赖氨酸或组氨酸取代。然而，必要的是P9R结构的任何修饰都确保产生的肽保留对内体酸化的抑制，并保留与P9R相同程度的病毒结合。因此，有用的P9R衍生肽(本文称为P9R样肽)具有“抑制内体酸化”和“病毒结合”的特性。如本申请的实施例所示，本领域普通技术人员有能力改变P9R中的氨基酸并测试所需的活性(抑制内体酸化和“病毒结合”)。

“病毒结合测定”包括以下步骤：将肽(每孔0.1μg)溶解在H₂O中并包被到ELISA板上，然后在4℃下孵育过夜。然后，在4℃下将2％ BSA添加到封闭板中过夜。对于病毒与肽的结合，将病毒在磷酸盐缓冲液中稀释，然后添加到ELISA板中，在室温下与包被的肽结合1小时。洗涤未结合的病毒后，结合的病毒被RNeasy微型试剂盒(Qiagen，Cat#74106)的RLT缓冲液裂解，用于病毒RNA提取。通过RT-qPCR测量结合病毒的病毒RNA拷贝。

“内体酸化测定”可以包括根据制造商的说明使用pH敏感染料(pHrodo红右旋糖，Invitrogen，Cat#P10361)检测内体酸化，制造商说明如前所述但稍作修改(Zhao等人,NatCommun 9,2358(2018))。首先，MDCK细胞用BSA(25.0μg ml^-1)、P9(25.0μg ml^-1)、P9R(25.0μg ml^-1)、PA1(25.0μg ml^-1)或P9RS(25.0μg ml^-1)在4℃下处理15分钟。其次，向MDCK细胞中加入100μg ml-¹的pH敏感染料和DAPI，然后在4℃下孵育15分钟。在拍摄图像之前，细胞在37℃下进一步孵育15分钟，然后用PBS洗涤细胞两次。最后，将PBS添加到细胞中，并立即使用共聚焦显微镜(例如，Carl Zeiss LSM 700，德国)拍摄图像。

因此，P9R衍生肽应具有至少5、优选至少5.6的总净正电荷，并且优选不包括如P9RS(SEQ ID NO:4)所示的氨基酸修饰。同样优选地，P9R衍生的肽不包括在C端精氨酸处引入额外的氨基酸残基。

P9R中的氨基酸取代以获得P9R样肽优选包括保守氨基酸取代。

保守氨基酸取代的实例包括那些在以下五组之一中的取代：1)小脂肪族、非极性或弱极性残基(Ala、Ser、Thr、Pro、Gly)；2)极性、带负电荷的残基及其酰胺(Asp、Asn、Glu、Gln)；极性、带正电荷的残基(His、Arg、Lys)；大的脂肪族非极性残基(Met、Leu、Ile、Val、Cys)；和大的芳香残基(Phe、Tyr、Trp)。非保守性氨基酸取代的实例是其中1)亲水性残基例如丝氨酰或苏氨酰由(或被)疏水性残基例如亮氨酰、异亮氨酰、苯丙氨酰、缬氨酰或丙氨酰取代；2)半胱氨酸或脯氨酸由(或被)任何其他残基取代；3)具有正电性侧链的残基例如赖氨酰、精氨酰或组氨酰由(或被)负电性残基例如谷氨酰或天冬氨酰取代；或4)具有大侧链的残基例如苯丙氨酸由(或被)没有侧链的残基例如甘氨酸取代。

然而，应当理解，可以使用任何氨基酸或氨基酸类似物在所述氨基酸位置进行取代。例如，可以用任何天然存在的氨基酸(例如，丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸)进行所述位置处的取代。

P9R衍生肽可以与SEQ ID NO:2具有例如70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性。

抗病毒肽可以是单价形式、多价形式或其组合。多价肽可以包括例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或更多个拷贝的抗病毒肽。多价形式可以是例如分支肽。分支肽通常包括一个或多个异肽键。异肽键是可以在例如一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基之间形成的酰胺键。这些连接基团中的至少一个是这些氨基酸之一的侧链的一部分。常见的分支策略包括在Asp/Glu、Lys和Ser/Thr侧链进行分支。例如，赖氨酸主链可以用作支架核心，以支持形成具有不同或相同肽序列的多达8或12个分支。参见例如，美国公布的申请号20180333481和Jones等人，Molecular Psychiatry,25:2994–3009(2020)。另外地或替代性地，侧链苄酯的官能团可用作酰肼的前体，其可用于通过天然化学连接或直接酰胺化组装分支肽(Liu等人,Meth.In Molec.Biology,2103:189-198(2019)DOI:10.1007/978-1-0716-0227-0_12)。基因编码标签也可用于使蛋白质分支成各种形状(Zhang等人,J.Am.Chem.Soc.,135,37,13988–13997(2013),DOI:10.1021/ja4076452)。另见Brunetti等人,Pept Sci.,110:e24089(2018)https://doi.org/10.1002/pep2.24089。通过将分支形成残基置于蛋白质链的不同位置，从业者可以控制多价肽的分支点和形状。

分支的多价肽可以由抗病毒肽序列的拷贝组成，特别是在肽序列已经包括合适的分支点的情况下。替代性地，多价形式的一些或所有肽可以包括一个或多个氨基酸插入或修饰以促进分支。

因此，在一些形式中，抗病毒剂包括多价肽，其中多价肽包括例如三、四、五、六、七、八个或更多个拷贝的选自以下的肽的一种或组合：P9R(SEQ ID NO:2)和衍生自P9R的P9R样肽。

在一些形式中，至少四种、五种、六种、七种、八种或更多种肽从包括多价肽的一种或多种肽形成多价肽分支。

在一些形式中，至少四种、五种、六种、七种、八种或更多种肽从形成在多价肽的中心点分支的多价肽的一种或多种肽分支。

多价P9R样肽的特征可以在于它们抑制内体酸化并保留病毒结合，如通过体外内体酸化(任选地与对照相比)和肽-病毒结合测定所确定的。

在一些形式中，形成多价肽的一种或多种肽或在一些情况下所有的肽具有至少5的例如约5.6或5.6的净正电荷。在一些特定形式中，形成多价肽的一种或多种肽或在一些情况下所有的肽各自包括或组成为P9R(SEQ ID NO:2)。

在一些形式中，形成该多价肽的一种或多种肽包括促进分支的一种或多种残基或基团的添加或修饰，包括但不限于具有Asp/Glu、Lys和Ser/Thr侧链，或能够形成异肽键的其他残基或修饰的氨基酸残基。在一些特定形式中，将此类残基添加或插入到一个或多个拷贝的SEQ ID NO:2或其衍生物中。添加、取代或其他修饰可以在肽的N端、C端或内部的一处或多处。

在一些形式中，多价肽包括或组成为三、四、五、六、七、八个或更多个拷贝的选自以下的肽的一种或组合：P9R(SEQ ID NO:2)和衍生自P9R的P9R样肽，由赖氨酸支架分支或以其他方式连接。

优选地，多价肽有效增加病毒的交联并且可以通过TMPRSS2介导的途径增强病毒在细胞表面的阻断，更优选地同时减少内体酸化以阻断通过内吞途径的病毒进入。在一些形式中，多价肽相对于其单价对应物在这些机制中的一种或多种中是有效的。

2.抗病毒组合

在一些形式中，所公开的组合物和方法包括两种或更多种活性剂。通常，组合使用可同时阻断病毒(例如，冠状病毒如SARS-CoV-2)的两条进入途径的抗病毒剂。ACE2和TMPRSS2在某些人细胞类型中单独表达或在其他细胞类型中共表达(Sungnak等人,Nat Med26,681-687(2020))，因此，在一些优选形式中，两种进入途径是ACE2介导和TMPRSS2介导的途径。

以下实施例2的实验结果表明，同时抑制通过TMPRSS2介导的内吞途径和表面融合途径的病毒进入的方法可以提高抗病毒效果。更具体地说，结果表明，内体酸化抑制剂(例如，8P9R或氯喹)可以显著增强阿比多尔(被发现可以抑制病毒-细胞膜融合)的抗病毒效率，以临床可达到的抗SARS-CoV-2和Vero-E6细胞(其中冠状病毒主要通过内吞途径进入细胞)中的SARS-CoV复制的浓度。不仅仅是累加机制的研究表明，8P9R或氯喹可以提高内体pH值，从而增强阿比多尔阻断刺突和ACE2介导的病毒-宿主细胞融合的效率。为了阻断冠状病毒的两条进入途径，将阿比多尔和氯喹与抑制TMPRSS2的卡莫司他组合使用，以防止SARS-CoV-2在细胞表面融合。结果显示对仓鼠的SARS-CoV-2和小鼠的SARS-CoV具有显著的抗病毒活性。该药物组合在治疗SARS-CoV-2和SARS-CoV动物模型中具有与双功能8P9R相似的抑制作用。相比之下，单独使用阿比多尔或氯喹在小鼠和仓鼠身上并未显示出抗病毒功效。鉴于这三种药物都是广谱抗病毒药物，这种组合可以在控制具有相似进入途径的呼吸道病毒感染方面发挥重要作用。双功能8P9R的鉴定和临床药物的三重组合表明，靶向冠状病毒的两种进入途径是减少SARS-CoV-2在体内复制的可行方法。

因此，在一些形式中，组合物和方法包括至少两种活性剂，其中组合的活性剂实现以下中的两个，最优选所有三个：减少内体酸化和/或升高内体pH、减少刺突和ACE2介导的病毒宿主细胞融合、以及减少TMPRSS2介导的病毒-宿主细胞融合。在一些形式中，两种或更多种活性剂包括阿比多尔与单价或多价P9R或其衍生物，或氯喹的组合，任选地进一步与卡莫司他组合。特别优选的组合是阿比多尔与单价或多价P9R或其衍生物的组合，任选进一步与卡莫司他组合，以及阿比多尔与氯喹和卡莫司他组合。

在一些形式中，两种或更多种活性剂的组合实现了比单独或分离施用单个药剂时更好的结果。例如，在一些形式中，通过组合实现的结果是单独组分实现的结果的部分或完全地累加。在大多数优选形式中，通过组合实现的结果大于单独组分实现的结果的累加。

在一些形式中，组合使用的一种或两种药剂的有效量低于单独施用时每种药剂的有效量。在一些形式中，一种或两种药剂在组合疗法中使用时的量低于单独使用时的治疗量。

阿比多尔已制成片剂、胶囊剂和颗粒剂，剂量为50mg和100mg。对于流感的治疗，两岁以上的儿童和成人已经使用，例如口服阿比多尔50mg至200mg，每天四次(每六小时一次)，持续五天(Huang等人,Cochrane Database Syst Rev.,2017(2):CD011489(2017))。为了在与流感患者直接接触期间进行预防，两岁以上的儿童和成人使用口服阿比多尔50mg至200mg，每天一次，持续10至14天。在治疗COVID-19的研究中，阿比多尔的预防剂量为200mg一天一次口服，治疗剂量为600mg一天一次口服(Yang等人,Frontiers in Public Health,8:249(2020)。

氯喹已被用于治疗COVID-19，其剂量和治疗方案范围很广，其中一些包括单日剂量最高达1,500mg和1,200mg(Karalis等人,Saf Sci.129:104842(2020))。示例性的方案是每天两次500mg，持续10-14天。

已提出每天600mg(200mg，三次)甲磺酸卡莫司他的剂量方案作为治疗SARS-CoV-2感染的疗法(Uno,Intern Emerg Med.,pg.1–2doi:10.1007/s11739-020-02345-9(2020),Bittmann等人,Biomed J Sci&Tech Res 27(3)(2020).BJSTR.MS.ID.004519)。

阿比多尔、氯喹和/或卡莫司他可以以已知的临床剂量施用，或者也可以在减少的剂量下有效。因此，在一些形式中，阿比多尔、氯喹和/或卡莫司他以已知的剂量和/或方案施用，例如本文讨论的那些，以及本文引用的参考文献中的那些或本领域已知的其他方式。在一些形式中，当以所公开的组合使用时，一种或多种药物的剂量低于本文讨论的和本文引用的参考文献中的或本领域已知的其他剂量和/或方案。

这些组合可以同时(例如，作为混合物)、单独但同时(例如，经由不同的静脉内管线进入同一受试者；一种药剂口服给药，而另一种药剂通过输注或注射等给药)、或顺序(例如，一种药剂先给药，第二种药剂随后给药)施用。

因此，组合疗法的治疗方案可以包括每种活性剂的一次或多次施用。在某些形式中，两种或更多种药剂以相同或不同的药物组合物同时施用。

在一些形式中，两种或更多种活性剂通常以两种或更多种不同的药物组合物顺序施用。不同的活性剂间隔数小时或数天施用。在施用后一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周或多于一周后，累加或多于累加的结果可能是明显的。

药剂的给药方案或周期可以完全或部分重叠，或者可以是连续的。在一些形式中，一种药剂的所有此类施用发生在第二种和/或第三种药剂的施用之前或之后。替代性地，一种或多种药剂的一种或多种剂量的施用可以在时间上交错。

每种药剂的有效量可以作为单一单位剂量(例如，作为剂量单位)或在有限时间间隔内施用的亚治疗剂量施用。此类单位剂量可以在有限的时间段内每天施用，例如最多3天，或最多5天，或最多7天，或最多10天，或最多15天或最多20天或最多25天，都是特别考虑的。

B.配制剂

本文所述的本文所公开的肽和其他活性剂可以配制用于肠内、肠胃外或肺部施用。在一些优选的形式中，肽和任选的其他活性剂被配制用于肺部施用。

所公开的活性剂包括例如单价和/或多价P9R(例如，8P9R)或由其衍生的肽、阿比多尔、氯喹和/或卡莫司他各自单独或以任何组合可以与被认为安全有效的一种或多种药学上可接受的载剂和/或赋形剂组合，并且可以在不引起不期望的生物学副作用或不需要的相互作用的情况下施用于个体。载剂是药物配制剂中除一种或多种活性成分外存在的所有组分。

活性剂还可以各自单独或以任何组合配制用作消毒剂，例如在医院环境中。

1.肺部配制剂

在一些形式中，一种或多种活性剂被配制用于肺部递送，如鼻内施用或口服吸入。

呼吸道是参与大气和血流之间气体交换的结构。肺是分支结构，最终以发生气体交换的肺泡结束。肺泡表面积在呼吸系统中是最大的，也是药物吸收发生的地方。肺泡被薄上皮覆盖，没有纤毛或粘液层，并分泌表面活性剂磷脂。呼吸道涵盖上呼吸道，包括口咽和喉，然后是下呼吸道，包括气管，然后是支气管和细支气管的分支。上气道和下气道称为传导气道。终末细支气管然后分成呼吸性细支气管，然后通向最终呼吸区、肺泡或深肺。深肺或肺泡是吸入的治疗性气雾剂用于全身药物递送的主要靶标。

已经注意到包括低分子量药物的治疗组合物的肺部施用，例如用于治疗哮喘的β-雄激素拮抗剂。其他在肺部有活性的治疗剂已经由肺部吸收进行全身施用和靶向施用。经鼻递送被认为是有前途的治疗施用技术，原因如下：由于上皮表面被大量微绒毛覆盖，鼻子具有较大的可用于药物吸收的表面积，上皮下层高度血管化，来自鼻子的静脉血直接通过进入全身循环，因此避免了药物在肝脏中通过首过代谢而损失，经鼻递送提供更低的剂量、更快地达到治疗性血液水平、更快地起效药理活性、更少的副作用，每cm3总血流量高，内皮基底膜多孔，并且易于进入。

用于肺部配制剂的载剂可分为用于干粉配制剂的那些和用于作为溶液施用的那些。用于将治疗剂递送至呼吸道的气雾剂是本领域已知的。气溶胶可以使用标准技术，如超声波处理或高压处理生产。对于经由上呼吸道的施用，可以将配制剂配制成缓冲或未缓冲的溶液，例如水或等渗盐水，或配制成悬浮液，用于作为滴剂或作为喷雾剂的鼻内施用。优选地，此类溶液或混悬液相对于鼻分泌物是等渗的并且具有大约相同的pH，范围例如从约pH 4.0至约pH 7.4或从pH 6.0至pH 7.0。缓冲液应该是生理相容的并且包括(仅举例而言)磷酸盐缓冲液。例如，代表性的鼻减充血剂描述为被缓冲至约6.2的pH。本领域技术人员可以容易地确定用于鼻腔和/或上呼吸道施用的无害水溶液的合适的盐含量和pH。

优选地，水溶液是水、含有盐和/或缓冲液的生理上可接受的水溶液如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、或任何其他可接受用于施用至动物或人的水溶液。此类溶液是本领域技术人员众所周知的并且包括但不限于蒸馏水、去离子水、纯水或超纯水、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)。其他合适的水性媒介物包括但不限于林格氏溶液和等渗氯化钠。水性混悬液可以包括混悬剂如纤维素衍生物、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和黄芪胶，以及润湿剂如卵磷脂。适用于水性混悬液的防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯。

作为低毒有机(即非水性)3类残留溶剂的溶剂，如乙醇、丙酮、乙酸乙酯、四氢呋喃、乙醚和丙醇，可用于配制剂。溶剂的选择基于其易于雾化配制剂的能力。溶剂不应与P9R(或P9R样肽)发生有害反应。应使用适当的溶剂来溶解化合物或形成P9R(或P9R样肽)的混悬液。溶剂应具有足够的挥发性以能够形成溶液或混悬液的气溶胶。可以根据期望添加额外的溶剂或雾化剂如氟利昂，以增加溶液或混悬液的挥发性。

在一些形式中，组合物可以含有少量的聚合物、表面活性剂或本领域技术人员熟知的其他赋形剂。在本文中，“少量”是指不存在可能影响或介导P9R(或P9R样肽)在肺中的摄取的赋形剂，并且存在的赋形剂以不会对P9R(或P9R样肽)在肺中的摄取产生不利影响的量存在。

由于其疏水特性，干脂粉可以直接分散在乙醇中。对于储存在有机溶剂如氯仿中的脂质，将期望量的溶液放入小瓶中，然后在氮气流下蒸发氯仿以在玻璃小瓶表面形成干燥的薄膜。当用乙醇复溶时，薄膜很容易膨胀。为了将脂质分子完全分散在有机溶剂中，对混悬液进行超声处理。也可以使用可重复使用的PARI LC Jet+雾化器(PARI RespiratoryEquipment,Monterey,CA)在无水乙醇中制备脂质的非水混悬液。

具有大粒径的干粉配制剂(“DPF”)具有改进的流动性特征，如更少的聚集、更容易的雾化和可能更少的吞噬作用。用于吸入疗法的干粉气雾剂通常以主要在小于5微米范围内的平均直径生产，尽管优选的范围是空气动力学直径在一到十微米之间。大“载剂”颗粒(不含药物)已与治疗性气雾剂共同递送，以帮助实现有效的雾化以及其他可能的好处。

可以使用单乳液和双乳液溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取、溶剂蒸发、相分离、简单和复杂凝聚、界面聚合以及本领域普通技术人员熟知的其他方法来制备聚合物颗粒。可以使用本领域已知的制备微球或微胶囊的方法制备颗粒。优选的制备方法是通过喷雾干燥和冷冻干燥，这需要使用含有表面活性剂的溶液，喷雾以形成期望尺寸的液滴，然后除去溶剂。

可以用合适的材料、表面粗糙度、直径和振实密度制备颗粒，用于局部递送至呼吸道的选定区域，如深肺或上呼吸道。例如，更高密度或更大的颗粒可用于上呼吸道递送。类似地，提供有相同或不同EGS的不同大小颗粒的混合物可以在一次施用中施用以靶向肺的不同区域。

用于肺部递送的配制剂包括单层磷脂囊泡、脂质体或脂蛋白颗粒。配制剂和制备此类含有核酸的配制剂的方法是本领域普通技术人员所熟知的。脂质体由各种供应商包括Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,Ala.)提供的市售磷脂构成。在一些形式中，脂质体可以包括对靶细胞表面上的受体特异的配体分子以将脂质体引导至靶细胞。

2.肠胃外配制剂

可以配制活性剂用于肠胃外施用。例如，肠胃外施用可以包括静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、玻璃体内、肿瘤内、肌肉内、皮下、结膜下、囊内、心包内、脐内、通过注射和通过输液施用至患者。

可以使用本领域已知的技术将肠胃外配制剂制备成水性组合物。通常，此类组合物可以制备为可注射配制剂，例如溶液或混悬液；适用于在注射前加入复溶介质以制备溶液或混悬液的固体形式；乳剂，如油包水(w/o)乳剂、水包油(o/w)乳剂及其微乳剂、脂质体或乳脂体。

载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、一种或多种多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、油类如植物油(例如，花生油、玉米油、芝麻油等)及其组合。适当的流动性可以例如通过使用包被如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持期望的粒度和/或通过使用表面活性剂来保持。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。

活性化合物作为游离酸或碱或其药理学上可接受的盐的溶液和分散体可以在水或另一种溶剂或分散介质中制备，该溶剂或分散介质适当地与一种或多种药学上可接受的赋形剂混合，包括但不限于表面活性剂、分散剂、乳化剂、pH调节剂、粘度调节剂及其组合。

合适的表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于含有羧酸根、磺酸根和硫酸根离子的那些。阴离子表面活性剂的实例包括长链烷基磺酸盐和烷基芳基磺酸盐的钠、钾、铵如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠如双-(2-乙基硫氧基)-磺基琥珀酸钠；和烷基硫酸盐如月桂基硫酸钠。阳离子表面活性剂包括但不限于季铵化合物，如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵、聚氧乙烯和椰子胺。非离子表面活性剂的实例包括单硬脂酸乙二醇酯、肉豆蔻酸丙二醇酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、聚甘油-4-油酸酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酰化物、PEG-150月桂酸酯、PEG-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、PEG-1000十六烷基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁基醚、401、硬脂酰单异丙醇酰胺和聚氧乙烯氢化牛油酰胺。两性表面活性剂的实例包括N-十二烷基-.β.-丙氨酸钠、N-月桂基-.β.-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻两性乙酸盐、月桂基甜菜碱和月桂基磺基甜菜碱。

配制剂可以含有防腐剂以防止微生物的生长。合适的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。配制剂还可以含有抗氧化剂以防止活性剂降解。

配制剂通常被缓冲至3-8的pH值，以便在重构时进行肠胃外施用。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。

水溶性聚合物常用于肠胃外施用的配制剂中。合适的水溶性聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖、羧甲基纤维素和聚乙二醇。

无菌可注射溶液可通过将所需量的P9R(或P9R样肽)掺入合适的溶剂或分散介质中以及根据需要使用上文所列的一种或多种赋形剂，然后过滤灭菌来制备。通常，分散体是通过将各种灭菌活性成分掺入无菌媒介物中制备的，媒介物含有基本分散介质和来自上文所列那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其他期望成分的粉末。粉末可以以此方式制备，使得颗粒本质上是多孔的，这可以增加颗粒的溶解。制备多孔颗粒的方法是本领域众所周知的。

(a)控制释放配制剂

本文所述的肠胃外配制剂可配制用于控制释放，包括立即释放、延迟释放、延长释放、脉冲释放及其组合。

i.纳米颗粒和微粒

对于肠胃外施用，可以将活性剂掺入提供活性剂的控制释放的微粒、纳米颗粒或其组合中。在配制剂含有两种或多种药物的形式中，药物可以配制成相同类型的控制释放(例如，延迟、延长、立即或脉冲)，或者药物可以独立配制成不同类型的释放(例如，立即和延迟、立即和延长、延迟和延长、延迟和脉冲等)。

例如，可以将活性剂掺入聚合物微粒中，从而提供药物的控制释放。药物的释放通过药物扩散出微粒和/或聚合物颗粒通过水解和/或酶促降解而降解来控制。合适的聚合物包括乙基纤维素和其他天然或合成的纤维素衍生物。

在水性环境中缓慢溶解并形成凝胶的聚合物，如羟丙基甲基纤维素或聚环氧乙烷，也可适合用作含药微粒的材料。其他聚合物包括但不限于聚酸酐、聚(酯酸酐)、聚羟基酸，例如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚-3-羟基丁酸酯(PHB)及其共聚物、聚-4-羟基丁酸酯(P4HB)及其共聚物、聚己内酯及其共聚物、以及它们的组合。

替代性地，可以将药物掺入不溶于水溶液或缓慢溶于水溶液但能够通过包括酶促降解、胆汁酸的表面活性剂作用和/或机械侵蚀的方式在胃肠道内降解的材料制备的微粒中。如本文所用，术语“缓慢溶于水”是指在30分钟的时间内不溶于水的材料。优选的实例包括脂肪、脂肪物质、蜡、蜡状物质及其混合物。合适的脂肪和脂肪物质包括脂肪醇(如月桂醇、肉豆蔻醇硬脂醇、鲸蜡醇或鲸蜡硬脂醇)、脂肪酸和衍生物，包括但不限于脂肪酸酯、脂肪酸甘油酯(甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯)和氢化脂肪。具体实例包括但不限于氢化植物油、氢化棉籽油、氢化蓖麻油、以商品名可得的氢化油、硬脂酸、可可脂和硬脂醇。合适的蜡和蜡状材料包括天然或合成蜡、碳氢化合物和普通蜡。蜡的具体实例包括蜂蜡、糖蜡、蓖麻蜡、巴西棕榈蜡、石蜡和小烛树蜡。如本文所用，蜡状材料定义为在室温下通常为固体且熔点为约30℃至300℃的任何材料。

在某些情况下，可能期望改变水渗透到微粒中的速率。为此，可以将速率控制(芯吸)剂与上文所列的脂肪或蜡一起配制。速率控制材料的实例包括某些淀粉衍生物(例如，蜡状麦芽糖糊精和转鼓干燥玉米淀粉)、纤维素衍生物(例如，羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素和羧甲基纤维素)、海藻酸、乳糖和滑石粉。此外，可以加入药学上可接受的表面活性剂(例如，卵磷脂)以促进此类微粒的降解。

不溶于水的蛋白质，如玉米蛋白，也可以用作形成含药微粒的材料。此外，水溶性蛋白质、多糖及其组合可以与药物一起配制成微粒，随后交联以形成不溶性网络。例如，环糊精可以与单个药物分子复合并随后交联。

ii.制备纳米颗粒和微粒的方法

可以通过已知的药物配制技术实现将药物包封或掺入到载剂材料中以产生含药微粒。在脂肪、蜡或蜡样材料中配制的情况下，载剂材料通常被加热到高于其熔化温度并且添加药物以形成包含悬浮于载剂材料中的药物颗粒的混合物、溶解在载剂材料中的药物、或其混合物。随后可以通过多种方法配制微粒，包括但不限于凝结、挤出、喷雾冷却或水分散工艺。在优选的工艺中，将蜡加热至高于其熔化温度，加入药物，并且随着混合物冷却，熔化的蜡-药物混合物在持续搅拌下凝固。替代性地，可以将熔化的蜡-药物混合物挤出并球化以形成丸剂或珠粒。这些工艺在本领域中是已知的。

对于某些载剂材料，可能期望使用溶剂蒸发技术来生产含药微粒。在这种情况下，药物和载剂材料共溶解在互溶剂中，并且随后可以通过多种技术生产微粒，包括但不限于在水或其他合适的介质中形成乳液、喷雾干燥或通过从散装溶液中蒸发掉溶剂并研磨所得材料。

在一些形式中，颗粒形式的药物均匀地分散在不溶于水或缓慢溶于水的材料中。为了最小化组合物中药物颗粒的尺寸，可以在配制之前研磨药物粉末本身以生成细颗粒。制药领域已知的气流粉碎工艺可用于此目的。在一些形式中，通过将蜡或蜡状物质加热至高于其熔点并在搅拌混合物的同时加入药物颗粒，将颗粒形式的药物均匀地分散在蜡或蜡状物质中。在这种情况下，可将药学上可接受的表面活性剂添加到混合物中以促进药物颗粒的分散。

颗粒也可以用一种或多种调释包衣包被。脂肪酶水解的固体脂肪酸酯可以喷涂到微粒或药物颗粒上。玉米蛋白是天然水不溶性蛋白质的实例。其可以通过喷涂或湿法造粒技术包被到含药微粒或药物颗粒上。除了天然不溶于水的材料外，一些消化酶底物可以用交联程序处理，从而形成不溶性网络。已经报道了许多通过化学和物理手段引发的交联蛋白质的方法。获得交联的最常见方法之一是使用化学交联剂。化学交联剂的实例包括醛类(戊二醛和甲醛)、环氧化合物、碳二亚胺和京尼平。除了这些交联剂外，氧化糖和天然糖也已用于交联明胶。交联也可以使用酶法来完成；例如，转谷氨酰胺酶已被批准为用于交联海鲜产品的GRAS物质。最后，交联可以通过物理方式，如热处理、紫外线照射和伽马照射引发。

为了产生围绕含药微粒或药物颗粒的交联蛋白质的涂层，可以将水溶性蛋白质喷涂到微粒上，然后通过上述方法之一进行交联。替代性地，可以通过凝聚相分离(例如，通过添加盐)将含药微粒微囊化在蛋白质内，然后交联。一些适合此目的的蛋白质包括明胶、白蛋白、酪蛋白和谷蛋白。

多糖也可以交联以形成水不溶性网络。对于许多多糖，这可以通过与交联聚合物主链的钙盐或多价阳离子反应来实现。果胶、海藻酸盐、右旋糖、直链淀粉和瓜尔胶在多价阳离子存在下发生交联。也可以形成带相反电荷的多糖之间的复合物；例如，果胶和壳聚糖可以经由静电相互作用复合。

(b)可注射/可植入配制剂

本文所述的活性剂可以掺入可注射/可植入的固体或半固体植入物中，例如聚合植入物。在一些形式中，一种或多种活性剂被掺入在室温下为液体或糊状物的聚合物中，但在与水性介质如生理流体接触时，表现出粘度增加以形成半固体或固体材料。示例性聚合物包括但不限于衍生自与羟基链烷酸共聚的至少一种不饱和羟基脂肪酸的共聚反应的羟基链烷酸聚酯。可以将聚合物熔化、与活性物质混合并浇注或注塑成装置。此种熔体制造需要聚合物的熔点低于待递送物质的温度，并且聚合物会降解或变得具有反应性。该装置也可以通过溶剂浇铸制备，其中聚合物溶解在溶剂中，药物溶解或分散在聚合物溶液中，然后蒸发溶剂。溶剂工艺要求聚合物可溶于有机溶剂。另一种方法是将聚合物和载有活性剂的药物或聚合物颗粒的混合粉末压塑成型。

替代性地，可以将活性剂掺入聚合物基质中并模塑、压缩或挤出成在室温下为固体的装置。例如，可以将活性剂掺入可生物降解的聚合物中，如聚酸酐、聚氢链烷酸(PHA)、PLA、PGA、PLGA、聚己内酯、聚酯、聚酰胺、聚原酸酯、聚磷腈、蛋白质和多糖例如胶原蛋白、透明质酸、白蛋白和明胶及其组合，并压缩成固体装置如圆盘，或挤出成装置如棒。

肽和小分子从植入物中的释放可以通过聚合物的选择、聚合物的分子量和/或聚合物的修饰来增加降解，如形成孔和/或掺入可水解的键。改变可生物降解聚合物的性质以改变化合物从植入物中的释放曲线的方法是本领域众所周知的。

3.肠内配制剂

合适的口服剂型包括片剂、胶囊剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和锭剂。可以使用本领域熟知的压缩或模塑技术制备片剂。可以使用本领域熟知的技术将明胶或非明胶胶囊制备成硬或软胶囊壳，其可以包封液体、固体和半固体填充材料。在配制剂用于涉及通过胃肠道转运的口服施用的形式中，优选对配制剂进行包衣以保护肽免受胃肠道酶的影响。

可以使用药学上可接受的载剂来制备配制剂。本文通常使用的“载剂”包括但不限于稀释剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、溶胀剂、填充剂、稳定剂及其组合。

载剂还包括包被组合物的所有组分，其可以包括增塑剂、颜料、着色剂、稳定剂和助流剂。

合适的包衣材料的实例包括但不限于纤维素聚合物，如乙酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯和羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯；聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、丙烯酸聚合物和共聚物以及以商品名(Roth Pharma,Westerstadt,德国)可商购的甲基丙烯酸树脂、玉米蛋白、虫胶和多糖。

此外，包衣材料可以含有常规载剂，如增塑剂、颜料、着色剂、助流剂、稳定剂、成孔剂和表面活性剂。

“稀释剂”，也称为“填充剂”，通常是增加固体剂型体积所必需的，以便为片剂的压制或珠粒和颗粒的形成提供实用的尺寸。合适的稀释剂包括但不限于二水合磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素、微晶纤维素、高岭土、氯化钠、干淀粉、水解淀粉、预糊化淀粉、二氧化硅、二氧化钛、硅酸铝镁和糖粉。

“粘合剂”用于赋予固体剂型粘合特性，从而确保片剂或珠粒或颗粒在剂型形成后保持完整。合适的粘合剂材料包括但不限于淀粉、预胶化淀粉、明胶、糖类(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖和山梨糖醇)、聚乙二醇、蜡、天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄芪胶、海藻酸钠、纤维素包括羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素和硅酸镁铝，以及合成聚合物如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚丙烯酸/聚甲基丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。

“润滑剂”用于促进片剂制备。合适的润滑剂的实例包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、山萮酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉和矿物油。

“崩解剂”用于促进剂型在施用后崩解或“分解”，通常包括但不限于淀粉、羟基乙酸淀粉钠、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、预胶化淀粉、粘土、纤维素、藻氨酸、树胶或交联聚合物如交联PVP(来自GAF Chemical Corp的XL)。

“稳定剂”用于抑制或延缓药物分解反应，包括例如氧化反应。合适的稳定剂包括但不限于抗氧化剂、丁基化羟基甲苯(BHT)；抗坏血酸、其盐类和酯类；维生素E、生育酚及其盐类；亚硫酸盐如焦亚硫酸钠；半胱氨酸及其衍生物；柠檬酸；没食子酸丙酯和丁基羟基茴香醚(BHA)。

(a)控制释放肠内配制剂

口服剂型，如胶囊剂、片剂、溶液剂和混悬剂，可以配制用于控制释放。例如，可以将活性剂配制成纳米颗粒、微粒及其组合，并封装在软或硬明胶或非明胶胶囊中或分散在分散介质中以形成口服混悬液或糖浆。颗粒可由药物和控制释放聚合物或基质形成。替代性地，药物颗粒可以在掺入最终剂型之前用一种或多种控制释放包衣进行包被。

在一些形式中，一种或多种活性剂分散在基质材料中，该基质材料在与水性介质例如生理流体接触时凝胶化或乳化。在凝胶化的情况下，基质溶胀捕获活性剂，活性剂通过基质材料的扩散和/或降解随时间缓慢释放。此类基质可以配制成片剂或硬胶囊和软胶囊的填充材料。

在还有一些形式中，一种或多种活性剂被配制成出售的口服剂型，例如片剂或胶囊，并且固体剂型包被有一种或多种控释包衣，例如延迟释放包衣或延长释放包衣。一种或多种包衣也可以含有一种或多种活性剂。

i.延长释放剂型

延长释放配制剂通常制备为本领域已知的扩散或渗透系统。扩散系统通常由两种类型的装置，储液器和基质组成，并且在本领域中是众所周知的和描述的。基质装置通常通过将药物与缓慢溶解的聚合物载剂一起压缩成片剂形式来制备。用于制备基质装置的三种主要材料是不溶性塑料、亲水性聚合物和脂肪化合物。塑料基质包括但不限于丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯和聚乙烯。亲水性聚合物包括但不限于纤维素聚合物如甲基和乙基纤维素、羟烷基纤维素如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和934、聚环氧乙烷及其混合物。脂肪化合物包括但不限于各种蜡，如巴西棕榈蜡和甘油三硬脂酸酯，以及蜡类物质，包括氢化蓖麻油或氢化植物油，或其混合物。

在某些优选形式中，塑料材料是药学上可接受的丙烯酸聚合物，包括但不限于丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙酯、甲基丙烯酸氰乙酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、甲基丙烯酸烷基胺共聚物聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸)(酸酐)、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚(甲基丙烯酸酐)和甲基丙烯酸缩水甘油酯共聚物。

在某些优选形式中，丙烯酸聚合物由一种或多种甲基丙烯酸铵共聚物组成。甲基丙烯酸铵共聚物在本领域中是众所周知的，并且在NF XVII中被描述为具有低季铵基含量的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的完全聚合的共聚物。

在一些优选形式中，丙烯酸聚合物是丙烯酸树脂漆，如可从Rohm Pharma以商品名商购的那种。在进一步优选的形式中，丙烯酸聚合物包含两种丙烯酸树脂漆的混合物，分别以商品名RL30D和RS30D商购自RohmPharma。RL30D和RS30D是具有低季铵基含量的丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的共聚物，铵基与剩余的中性(甲基)丙烯酸酯的摩尔比在RL30D中为1:20，在RS30D中为1:40。平均分子量为约150,000。S-100和L-100也是优选的。代码RL(高渗透性)和RS(低渗透性)是指这些药剂的渗透性。RL/RS混合物不溶于水和消化液。然而，形成以包括RL/RS混合物的多颗粒系统在水溶液和消化液中是可溶胀和可渗透的。

上述聚合物如RL/RS可以以任何期望比例混合在一起，以便最终获得具有期望溶出曲线的缓释配制剂。可以从例如100％RL、50％RL和50％RS、以及10％RL和90％RS中获得期望的缓释多颗粒系统。本领域技术人员将认识到也可以使用其他丙烯酸聚合物，如例如L。

替代性地，可以使用渗透系统或通过将半透包衣应用于剂型来制备延长释放配制剂。在后一种情况下，可以通过以合适的比例组合低渗透性和高渗透性包衣材料来实现期望的药物释放曲线。

具有上述不同药物释放机制的装置可以组合成包含单个或多个单元的最终剂型。多个单元的实例包括但不限于多层片剂和含有片剂、珠粒或颗粒的胶囊剂。可以通过在延长释放核心的顶部使用包衣或压缩工艺施加立即释放层，或在多单元系统如含有延长释放和立即释放珠粒的胶囊中的方式，来将立即释放部分添加到延长释放系统中。

含有亲水性聚合物的延长释放片剂通过本领域公知的技术制备，例如直接压片、湿法制粒或干法制粒。他们的配制剂通常掺入聚合物、稀释剂、粘合剂和润滑剂以及活性药物成分。常用的稀释剂包括惰性粉末状物质如淀粉、粉末状纤维素，尤其是结晶和微晶纤维素、糖类如果糖、甘露醇和蔗糖、谷物粉和类似的可食用粉末。典型的稀释剂包括例如各种类型的淀粉、乳糖、甘露醇、高岭土、磷酸钙或硫酸钙、无机盐如氯化钠和糖粉。粉状纤维素衍生物也是有用的。典型的片剂粘合剂包括淀粉、明胶和糖类(如乳糖、果糖和葡萄糖)等物质。也可以使用天然和合成树胶，包括阿拉伯胶、海藻酸盐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。聚乙二醇、亲水性聚合物、乙基纤维素和蜡也可用作粘合剂。片剂配制剂中需要润滑剂，以防止片剂和冲头粘在模具中。润滑剂选自滑石粉、硬脂酸镁和硬脂酸钙、硬脂酸和氢化植物油等光滑固体。

含蜡材料的延长释放片通常采用本领域已知的方法制备，例如直接混合法、凝结法和水分散法。在凝结法中，将药物与蜡材料混合并喷雾凝结或凝结并筛选和加工。

ii.延迟释放剂型

延迟释放配制剂可以通过用聚合物膜包衣固体剂型来制备，该聚合物膜不溶于胃的酸性环境，而溶于小肠的中性环境。

延迟释放剂量单位可以通过例如用选定的包衣材料包被药物或含药组合物来制备。含药组合物可以是例如掺入胶囊中的片剂、用作“包衣芯”剂型中内核的片剂、或多个含药珠、颗粒或颗粒剂，用于掺入片剂或胶囊。优选的包衣材料包括可生物侵蚀的、可逐渐水解的、可逐渐水溶的和/或可酶促降解的聚合物，并且可以是常规的“肠溶”聚合物。如本领域技术人员所理解的，肠溶聚合物在下胃肠道的较高pH环境中变得可溶或随着剂型通过胃肠道而缓慢侵蚀，而酶促降解的聚合物被存在于下胃肠道尤其是结肠中的细菌酶降解。用于实现延迟释放的合适包衣材料包括但不限于纤维素聚合物，如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、乙基纤维素、乙酸纤维素、邻苯二甲酸乙酸纤维素、偏苯三酸乙酸纤维素和羧甲基纤维素钠；丙烯酸聚合物和共聚物，优选由以下形成：丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或甲基丙烯酸乙酯，以及以商品名(Rohm Pharma；Westerstadt，德国)商购的其他甲基丙烯酸树脂，包括L30D-55和L100-55(可溶于pH 5.5及以上)、L-100(可溶于pH 6.0及以上)、S(可溶于pH 7.0及以上，由于更高的酯化度)和NE、RL和RS(具有不同渗透性和膨胀性的水不溶性聚合物)；乙烯基聚合物和共聚物如聚乙烯吡咯烷酮、乙酸乙烯酯、乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、乙酸乙烯巴豆酸共聚物和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；可酶促降解的聚合物，如偶氮聚合物、果胶、壳聚糖、直链淀粉和瓜尔胶；玉米蛋白和虫胶。也可以使用不同包衣材料的组合。也可以应用使用不同聚合物的多层包衣。

特定包衣材料的优选包衣重量可由本领域技术人员通过评估用不同量的各种包衣材料制备的片剂、珠粒和颗粒的单独释放曲线而容易地确定。材料、方法和应用形式的组合产生了期望的释放特性，这只能从临床研究中确定。

包衣组合物可以包括常规添加剂，如增塑剂、颜料、着色剂、稳定剂、助流剂等。通常存在增塑剂以降低包衣的脆性，并且通常相对于聚合物的干重占约10wt.％至50wt.％。典型增塑剂的实例包括聚乙二醇、丙二醇、三醋精、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、癸二酸二丁酯、柠檬酸三乙酯、柠檬酸三丁酯、乙酰柠檬酸三乙酯、蓖麻油和乙酰化甘油单酯。稳定剂优选用于稳定分散体中的颗粒。典型的稳定剂是非离子乳化剂，如失水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯和聚乙烯吡咯烷酮。建议使用助流剂以减少成膜和干燥过程中的粘附效应，并且通常占包衣溶液中聚合物重量的约25wt.％至100wt.％。一种有效的助流剂是滑石粉。也可以使用其他助流剂，如硬脂酸镁和单硬脂酸甘油酯。也可以使用二氧化钛等颜料。也可以将少量消泡剂如硅酮(例如，西甲硅油)添加到包衣组合物中。

III.使用方法

所公开的方法基于表明P9R对包膜SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV、甲型(H1N1)pdm09、甲型(H7N9)病毒和无包膜鼻病毒显示出非常广谱的抗病毒活性的研究。P9R在体内施用时可有效防止病毒攻击，正如其保护小鼠(在体内施用后)免受致命的甲型(H1N1)pdm09病毒攻击所证明的那样。即使甲型(H1N1)pdm09病毒在P9R存在下传代40代后，P9R也没有引起耐药病毒的出现。机理研究表明，P9R的抗病毒活性取决于与病毒的直接结合和对病毒宿主内体酸化的抑制，这提供了一个新概念，即病毒结合碱性肽可以广泛抑制pH依赖性病毒。

此外，双功能交联多价8P9R可以抑制SARS-CoV-2在细胞中的两条进入途径(内吞途径和TMPRSS2介导的表面途径)。内体酸化抑制剂(8P9R和氯喹)可以不只累加性地增强阿比多尔(刺突-ACE2融合抑制剂)在细胞中对抗SARS-CoV-2和SARS-CoV的活性。体内研究表明，8P9R或再利用的药物(阿比多尔、氯喹和TMPRSS2抑制剂卡莫司他)的组合，同时干扰冠状病毒的两条进入途径，可以显著抑制仓鼠中SARS-CoV-2的复制和小鼠中的SARS-CoV。在实验条件下，单独使用阿比多尔、氯喹或卡莫司他，其仅靶向冠状病毒的一种进入途径(Hoffmann等人,Cell 181,271-280e278(2020),Hoffmann等人,Nature(2020))，不能在体内抑制SARS-CoV-2和SARS-CoV。然而，以下实验表明，药物组合(阿比多尔、氯喹和卡莫司他)和双功能8P9R可以阻断冠状病毒的两条进入途径，是有前途且可实现的体内抑制SARS-CoV-2复制的方法。

因此，提供了用于治疗感染病毒的受试者的方法，通过向受试者施用含有有效量的单独的所公开的单价或多价抗病毒肽配制剂或与另外的活性剂(例如，阿比多尔、氯喹中或卡莫司他的一种或多种，或在没有抗病毒肽的情况下，阿比多尔、氯喹和卡莫司他的组合)的组合，以改善与病毒感染相关的一种或多种症状。示例性的优选治疗包括单独的P9R单价肽或P9R多价肽(例如，8P9R)或与阿比多尔的双重组合，以及与阿比多尔、氯喹和卡莫司他的三重组合的组合，尽管如上所讨论的其他组合也考虑在内。在一些优选的形式中，治疗有效抑制受试者中的病毒复制。可以通过将有效量的肽和/或其他活性剂经肠、通过肺部或鼻部施用或肠胃外(静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、玻璃体内、肿瘤内、肌肉内、皮下、结膜下、囊内、心包内、脐内、通过注射和通过输注)施用至受试者，用所公开的肽和/或其他活性剂治疗受试者。

病毒优选为呼吸道病毒，更优选为pH依赖性呼吸道病毒。呼吸道病毒是人类最常见的致病因子，对全世界尤其是儿童的发病率和死亡率具有重大影响。全世界大约五分之一的儿童死亡与急性呼吸道感染(ARI)有关，特别是在热带地区的贫困人口中，其中ARI病死率可能明显高于世界温带地区。八种人呼吸道病毒在所有年龄组中普遍传播，并被认为适合有效的人际传播；包括HRSV(人呼吸道合胞病毒)、HPIV(人副流感病毒)、HRV(人鼻病毒)、ADV(腺病毒)、HCoV(人冠状病毒)(HCoV-NL63、HCoV-HKU1)、SARS-CoV、HMP(人偏肺病毒)、HPIV(人副流感病毒)和HBoV(人博卡病毒)。HRSV内化被认为与pH无关，并且可以发生在血浆或内体膜中。

可以用公开的配制剂治疗的示例性病毒感染包括但不限于寨卡病毒、肠道病毒-A7、埃博拉病毒、流感病毒、HRSV、HPIV、HRV、ADV、HPIV、HCoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV、甲型(H1N1)pdm09、甲型(H7N9)病毒和无包膜鼻病毒。

以下非限制性实例进一步解释所公开和要求保护的组合物和方法。

实施例

实施例1：P9R和P9R相关肽

材料和方法

细胞和病毒培养

从ATCC(Manassas,VA,美国)获得的Madin Darby犬肾(MDCK,CCL-34)、Vero E6(CRL-1586)、RD(CCL136)、LLC-MK2(CCL-7)、A549(CCL-185)细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、100IU ml^-1青霉素和100μg ml^-1链霉素的Dulbecco基本必需培养基(DMEM)或MEM中培养。本研究使用的病毒株包括2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)(To等人,Clin InfectDis(2020))、SARS-CoV、MERS-CoV(hCoV-EMC/2012)、甲型/香港/415742/2009、甲型/香港/415742Md/2009(H1N1)(高毒力小鼠适应株)、甲型/安徽/1/2013(H7N9)(Zhao等人,Sci Rep6,22008(2016))、鼻病毒(To等人,J Clin Virol 77,85-91(2016))和人副流感病毒3(ATCC-C243)。对于体外实验，病毒在MDCK、Vero E6、RD和LLC-MK2细胞中培养。对于动物实验，H1N1病毒如前所述在鸡蛋中培养(Zheng等人,Proc Natl Acad Sci U S A 105,8091-8096(2008))。

多肽的设计与合成

P9、P9R、PA1和P9RS的设计如图1A所示并且由ChinaPeptide(中国上海)合成。所有肽的纯度>95％。通过HPLC和质谱法验证每种肽的纯度和质量。

噬斑减少测定

如前所述(Zhao等人,Nat Commun 9,2358(2018))，使用噬斑减少测定法测量肽的抗病毒活性。简而言之，将肽溶解在含有24.6mM Na₂HPO₄和5.6mM KH₂PO₄，pH为7.4的30mM磷酸盐缓冲液中。将肽或牛血清白蛋白(BSA，0.4–50.0μg ml^-1)与50PFU的冠状病毒(SARS-CoV-2、MERS-CoV和SARS-CoV)、流感病毒(H1N1病毒和H7N9病毒)、鼻病毒或副流感3室温下在磷酸盐缓冲液中预混合。1小时孵育后，将肽-病毒混合物转移至用于冠状病毒的VeroE6、用于流感病毒的MDCK、用于鼻病毒的RD或用于副流感病毒的LLC-MK2。感染后1小时，去除感染性培养基并向细胞中加入1％的低熔点琼脂。感染后2-4天使用4％福尔马林固定细胞。加入水晶蓝(0.1％)染色，并计数噬斑数。

抗病毒多周期生长测定

冠状病毒(SARS-CoV-2、MERS-CoV和SARS-CoV)、流感病毒(H1N1和H7N9病毒)和鼻病毒(0.005MOI)与P9R或BSA(50-100μg ml^-1)在磷酸盐缓冲液中预混合1小时。孵育后，将冠状病毒接种到Vero E6上。将流感病毒接种到MDCK细胞上。将鼻病毒接种到RD细胞上。1小时感染后，去除感染性培养基，并将补充有P9R或BSA(50-100μg ml^-1)的新鲜培养基添加到感染细胞中用于病毒和细胞培养。感染后24-30小时，收集细胞上清液用于检测病毒RNA拷贝。

细胞毒性测定

如前所述(Zhao等人,Sci Rep 6,22008(2016))，使用基于四唑的比色MTT测定通过检测50％细胞毒性浓度(CC₅₀)来确定肽的细胞毒性。简而言之，将细胞在补充有10％ FBS的MEM或DMEM中以每孔2×10⁴个细胞的初始密度接种在96孔细胞培养板中，并孵育过夜。去除细胞培养基，然后将补充有各种浓度的肽和1％ FBS的DMEM添加到每个孔中。在37℃下24小时孵育后，将MTT溶液(5mg ml^-1，每孔10μl)添加到每个孔中，以在37℃下孵育4小时。然后，向每个孔中加入100μl 10％ SDS的0.01M HCl溶液。在摇动的情况下在室温进一步孵育过夜后，使用VictorTM X3 Multilabel Reader(PerkinElmer,美国)在OD570处读取板。不含肽的细胞培养孔用作实验对照，且仅培养基用作空白对照。

肽-病毒结合测定

将溶解在H₂O中的肽(每孔0.1μg)包被到ELISA板上，并在4℃下孵育过夜。然后，使用2％ BSA在4℃下封闭板过夜。对于病毒与肽的结合，将病毒在磷酸盐缓冲液中稀释，然后添加到ELISA板中，以在室温下与包被的肽结合1小时。洗涤未结合的病毒后，将结合的病毒通过RNeasy微型试剂盒(Qiagen，Cat#74106)的RLT缓冲液裂解，以用于病毒RNA提取。通过RT-qPCR测量结合病毒的病毒RNA拷贝。

ELISA测定

ELISA测定如前所述进行(Zhao等人,Nat Commun 9,2358(2018))。将溶解在H₂O中的肽(每孔0.1μg)包被到ELISA板上，并在4℃下孵育过夜。然后，使用2％ BSA在4℃下封闭板过夜。对于HA和S结合，将溶液I缓冲液(Sino Biological Inc.,Cat^#11055-V08H4)中的150ng HA1或S与肽在37℃下孵育1小时。肽与HA1或S蛋白的结合能力通过与兔抗His-HRP(Invitrogen,Cat^#R93125,1:2,000)在室温下孵育30分钟来确定。通过添加50μl TMB单一溶液(Life Technologies,Cat^#002023)在37℃下15分钟对反应进行显色并用50μl 1MH₂SO₄终止反应。在ELISA读板器(Victor 1420Multilabel Counter；PerkinElmer)中在450nm处获得读数。

病毒RNA提取和RT-qPCR

根据制造商的说明，通过病毒RNA微型试剂盒(QIAGEN,Cat^#52906,美国)提取病毒RNA。如前所述进行实时RT-qPCR(Zhao等人,Nat Commun 9,2358(2018))。使用PrimeScriptII第一链cDNA合成试剂盒(Takara,Cat^#6210A)使用PCR系统9700(AppliedBiosystems，美国)将提取的RNA逆转录为cDNA。然后使用特定引物(表1)扩增cDNA，以使用480SYBR Green I Master(Roach，美国)检测SARS-CoV-2、MERS-CoV、SARS-CoV、H1N1、H7N9和鼻病毒。

表1.RT-qPCR引物

对于定量，准备相当于每个反应10¹至10⁶个拷贝的标准质粒的10倍系列稀释液以生成校准曲线。使用96系统(Roche,美国)进行实时qPCR实验。

内体酸化测定

根据如前所述的制造商的说明但稍作修改(Zhao等人,Nat Commun 9,2358(2018))用pH敏感染料(pHrodo红右旋糖，Invitrogen，Cat#P10361)检测内体酸化。首先，MDCK细胞用BSA(25.0μg ml^-1)、P9(25.0μg ml^-1)、P9R(25.0μg ml^-1)、PA1(25.0μg ml^-1)或P9RS(25.0μg ml^-1)在4℃下处理15分钟。其次，向MDCK细胞中加入100μg ml^-1的pH敏感染料和DAPI，然后在4℃下孵育15分钟。在拍摄图像之前，细胞在37℃下进一步孵育15分钟，然后用PBS洗涤细胞两次。最后，将PBS添加到细胞中，并立即使用共聚焦显微镜(Carl ZeissLSM 700，德国)拍摄图像。

细胞中肽与病毒结合的共定位测定

根据制造商的介绍，H1N1病毒用绿色Dio染料(Invitrogen，Cat#3898)标记。DIO标记的病毒用TAMRA标记的P9R和TAMRA标记的P9RS在室温下处理1小时。预冷MDCK细胞在冰上通过肽处理的病毒感染15分钟，然后移至37℃孵育15分钟。细胞用PBS洗涤两次，然后通过4％福尔马林固定1小时。核由DAPI染色，用于通过共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 700，德国)拍摄图像。

核蛋白(NP)免疫荧光测定。

NP染色如前所述进行(Zhao等人,Nat Commun 9,2358(2018))。将MDCK细胞接种在细胞培养载玻片上，并以用BSA(25.0μg ml^-1)、巴弗洛霉素A1(50.0nM)或P9R(25.0μg ml^-1)预处理的甲型(H1N1)pdm09病毒以1MOI感染。感染后3.5小时后，细胞用4％福尔马林固定1小时，然后用PBS中的0.2％ Triton X-100透化5分钟。用PBS洗涤细胞，然后在室温下用5％BSA封闭1小时。将细胞与小鼠IgG抗NP(Millipore，Cat#2817019，1:600)在室温下孵育1小时，然后用PBS洗涤，用于下一次与山羊抗小鼠IgG Alexa-488(Life Technologies，Cat#1752514,1:600)在室温下孵育1小时。最后，用PBS洗涤细胞并用DAPI染色。图像由共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 700，德国)拍摄。

P9R的NMR结构分析

将在0.5ml溶剂中新鲜制备的1mg ml^-1(0.29mM)P9R用于NMR研究。数据在H₂O/D₂O(19:1v/v)以及99.996％ D₂O中收集，其中内参为三甲基甲硅烷基丙酸。所有NMR谱均在Bruker AVANCE III 600MHz光谱仪(Bruker BioSpin，德国)或Bruker AVANCE III 700MHz光谱仪上在25℃下获取。记录二维¹H-¹H相关光谱(COSY)、总相关光谱(TOCSY)和核奥佛好塞(Overhauser)效应光谱(NOESY)谱用于共振分配。质子间距离约束衍生自2D NOESY谱，其中混合时间为300ms和500ms，使用自动NOE分配策略，然后进行手动检查。使用CCPNMRAnalysis 2.4.2(Skinner等人,J Biomol NMR 66,111-124(2016))提取NOE强度和化学位移，并作为Aria程序的输入。使用程序DANGLE(Cheung等人,J Magn Reson 202,223-233(2010))根据化学位移预测二面角。使用Aria 2.3程序迭代计算P9R的NMR溶液结构(Rieping等人,Bioinformatics 23,381-382(2007))。在组合的自动NOE分配和结构计算算法的八个迭代循环中的每一个循环中，使用距离约束使一百个随机构象异构体退火。最后一个迭代周期输出的最终上限距离约束经过了彻底的手动交叉检查和最终的水溶剂结构精制周期。从这些精制的100个结构中保留了10个能量最低的构象异构体用于统计分析。使用均方根偏差(RMSD)分析评估计算结构的收敛性。使用PROCHECK-NMR(Laskowski等人,JBiomol NMR 8,477-486(1996))通过表示Ramachandran二面角模式来评估最终聚合结构的主链二面角的分布。使用UCSF Chimera 1.13.1(Pettersen等人,J Comput Chem25,1605-1612(2004))实现了P9R的三维结构和静电表面电势的可视化。

小鼠中P9R的抗病毒分析

将10-12周龄的BALB/c雌性小鼠饲养在生物安全2级实验室中，并可随意获得标准颗粒饲料和水。所有实验方案均遵循经批准的生物安全2级动物设施的标准操作程序，并获得香港大学教学和研究中活体动物使用委员会的批准(Zheng等人,Proc Natl Acad Sci US A 105,8091-8096(2008))。小鼠适应性H1N1病毒用于小鼠的致死攻击。为了评估治疗效果，用3LD₅₀的病毒攻击小鼠，然后在病毒接种后六小时鼻内接种PBS、P9、P9R、PA1或扎那米韦。在接下来的一天，再给予H1N1攻击的小鼠两剂。监测生存和总体状况16天或直至死亡。

统计分析

通过GraphPad Prism 5分析小鼠的存活和统计学显著性。使用Stata统计软件通过双尾学生t检验计算其他结果的统计学显著性。当P<0.05时，结果被认为是显著的。

结果

小鼠β-防御素衍生肽P9R可广泛抑制冠状病毒和其他呼吸道病毒

内体酸化受质子经由液泡膜质子泵V-ATPase流入内体的影响(Huotari&Helenius,EMBO J 30,3481-3500(2011))。理论上，具有更强净正电荷的碱性肽会中和内体中的质子，从而抑制内体酸化。因此，为了改进先前的抗病毒肽P9(Zhao等人,Sci Rep 6,22008(2016))，带弱正电荷的氨基酸(组氨酸和赖氨酸)在21(H→R)、23(K→R)和28(K→R)位被精氨酸取代(图1A)以增加P9的净正电荷(+4.7)至P9R的电荷(+5.6)。在噬斑减少测定中，P9R对SARS-CoV-2的IC₅₀显著低于P9(0.9μg ml^-1对2.4μg ml^-1，P<0.01)(图1B)。此外，P9R对MERS-CoV、甲型(H1N1)pdm09病毒、甲型(H7N9)病毒和鼻病毒的抑制作用明显强于P9(图1c-1g)。然而，P9R和P9对副流感病毒3的IC₅₀更高(>25.0μg ml^-1)，可能是因为副流感病毒3的病毒生命周期不需要内体酸化(图1H)(Moscona,J Clin Invest 115,1688-1698(2005))。在多周期生长测定中，P9R将SARS-CoV-2、MERS-CoV和SARS-CoV的病毒复制抑制了1000倍(图1I)。对于甲型(H1N1)pdm09病毒、甲型(H7N9)病毒和鼻病毒，P9R可以抑制>20倍的病毒复制(图1I)。此外，对于MDCK、VeroE6和A549细胞，P9R的CC₅₀>300μμg ml^-1(图1J)。这些结果表明，具有更多正电荷的P9R比P9更有效地抑制新型冠状病毒SARS-CoV-2和其他包膜和非包膜呼吸道病毒。

正电荷的程度对于内体酸化的抑制和抗病毒活性至关重要

为了确定肽的净电荷是否影响内体酸化的抑制，内体酸化测定确定P9R(+5.6)可以比P9更显著地抑制活细胞中的内体酸化(数据未显示，图2A)，这与P9R比P9更强的抗病毒活性是一致的。此外，具有较少正电荷(+1.7)的肽PA1除了在C端有3个额外的酸性氨基酸外与P9具有相同的氨基酸序列，其无法抑制内体酸化(数据未显示和图2B)并丢失抗病毒活性(图2B)。因此，净正电荷的程度与内体酸化的抑制程度和抗病毒活性相关。

单独抑制宿主内体酸化不足以使带正电肽抑制病毒复制

为了确定抗病毒活性是否仅依赖于肽的正电荷，设计了与P9R(+5.6)具有相同正电荷的肽P9RS(+5.6)，但P9RS与P9R在30个氨基酸中的11个不同。活细胞中P9RS有效抑制宿主内体酸化至与P9R相似的程度(数据未显示和图2A)。然而，在噬斑减少测定中，即使以25μg ml^-1的P9RS处理病毒时，SARS-CoV-2和甲型(H1N1)pdm09病毒的噬斑数量也没有显著减少(图2B)。

为了研究为什么尽管P9RS能有效抑制宿主内体酸化，但未能抑制病毒复制，研究了肽与病毒之间的结合。使用ELISA-RT-qPCR测定，P9R和PA1可以有效结合SARS-CoV-2和甲型(H1N1)pdm09病毒，但P9RS不结合SARS-CoV-2和甲型(H1N1)pdm09病毒(图2C)。在H1N1感染的细胞中通过共聚焦显微镜进一步证实了P9R而不是P9RS与病毒结合的观察结果(数据未显示)。因此，带正电荷的肽P9R的抗病毒活性需要肽与病毒的直接相互作用。相反，没有与病毒结合能力的P9RS不能抑制病毒复制，即使其携带与P9R相同的正电荷并抑制宿主内体酸化。

P9R的广谱抗病毒活性依赖于靶向病毒以抑制病毒-宿主内体酸化

上述实验表明，P9R和P9RS可以抑制无病毒内体酸化(数据未显示和图2A)。然而，在不与病毒结合的情况下，P9RS无法抑制病毒复制。为了说明这一结果，另外的研究表明P9R和巴弗洛霉素A1可以有效抑制感染活细胞中的病毒宿主内体酸化，但P9RS不能抑制感染活细胞中的病毒宿主内体酸化(图3a)，即使P9R和P9RS均能抑制无病毒内体的内体酸化(数据未显示)。P9R对病毒-宿主内体酸化的有效抑制可能是由于P9R与病毒结合(数据未显示和图2C)，然后抑制病毒-宿主内体酸化(数据未显示)。缺乏与病毒的结合能力的情况下(数据未显示和图2E)，P9RS无法有效地进入具有病毒的内体以抑制病毒-宿主内体酸化，可能是因为内体中病毒的存在阻止了未结合的P9RS进入内体。当内体中没有病毒时，无病毒内体中存在空白空间，允许P9RS自由进入内体以防止内体酸化(数据未显示)。需要注意的是，与P9R具有相似序列的PA1可以有效结合SARS-CoV-2和甲型(H1N1)pdm09病毒(图2C)，但它显著丧失了对SARS-CoV-2和甲型(H1N1)pdm09病毒的抗病毒活性(图2B)。当用PA1预处理病毒时，P9R与SARS-CoV-2和甲型(H1N1)pdm09病毒的结合可以显著降低(图3A)。这表明PA1在病毒颗粒上具有与P9R相同的结合位点，但仅与病毒结合的肽不能对抗病毒活性作出解释。P9R与病毒结合是发挥抗病毒活性的第一步。与病毒结合后(数据未显示)，P9R可有效抑制病毒-宿主内体酸化(图数据未显示)，然后通过阻断RNP释放来抑制病毒复制(数据未显示)。

为了进一步证实P9R的广谱抗病毒活性是由于P9R与不同病毒和病毒蛋白的广泛结合，另外的研究表明P9R而不是P9RS也可以与MERS-CoV、甲型(H7N9)病毒、鼻病毒、SARS-CoV和病毒蛋白结合(图3B-3D和图3E)。这一结果进一步证实，如果带正电的P9R可以与病毒结合，则可以抑制pH依赖性内体病毒。

接下来，使用NMR光谱进行研究以确定P9R的结构。结果表明，P9R的溶液结构是柔性的，具有短的可变螺旋片和带正电荷的肽表面(数据未显示)。不受理论的限制，P9R可以广泛地结合不同的病毒，因为这些具有柔性连接的短α-螺旋片可以允许其调整其结构以适应不同病毒蛋白的结合口袋。总之，目前的研究证明了带正电荷的P9R需要靶向病毒然后阻止病毒宿主内体酸化以抑制pH依赖性病毒复制的新型抗病毒机制。

P9R处理在体内的功效

研究表明，P9R在体外的有效抗病毒活性依赖于与病毒的结合以及P9R的正电荷以抑制病毒-宿主内体酸化。为了进一步研究P9R在体内的抗病毒活性，在接下来的一天内感染甲型(H1N1)pdm09的小鼠在感染后6小时用另外两剂进行处理。在该模型中，80％的P9R处理小鼠存活，明显优于PBS处理组和PA1处理组(图4A)。P9R对感染小鼠的保护作用与扎那米韦处理组(80％)相同，并优于P9。从感染后第4天到第10天，P9R组的体重减轻明显少于PBS处理组和PA1处理组(图4B)。P9R(25μg/剂和12.5μg/剂)对受感染小鼠的低剂量保护和减少体重减轻进一步证明，与PBS处理组相比，P9R可以显著保护小鼠(图4C和4D)。P9R在体内的抗病毒活性优于P9(图4C，12.5μg/剂P<0.05)，这与在体外P9R的抗病毒活性显著优于P9一致。

在P9R存在下病毒连续传代后未出现针对P9R的抗性病毒

抗性突变体的出现时有发生(Zhao等人,Nat Commun 9,2358(2018))，尤其是使用新型聚合酶抑制剂巴洛沙韦(Hayden等人,N Engl J Med 379,913-923(2018))。为了确定P9R处理是否诱导病毒抗性，甲型(H1N1)pdm09病毒在P9R存在下在MDCK细胞中连续传代40次(图5A)。甲型(H1N1)pdm09病毒在扎那米韦存在下连续传代作为抗性测定的对照(图5A)。扎那米韦对亲本甲型(H1N1)pdm09病毒(P0)的IC₅₀为35nM(图5B)。在扎那米韦(100nM)存在下进行10次病毒传代和在扎那米韦(1000nM)存在下进行另外5次病毒传代后，2000nM和8000nM扎那米韦分别不能抑制P10和P15病毒复制(图5C)。这些表明，在扎那米韦存在下病毒传代10代后，病毒对扎那米韦产生了显著的抗性。然而，对于P9R，即使甲型(H1N1)pdm09病毒在P9R存在下传代(对于前10代P9R为5.0μg ml^-1，对于其余30代为50.0μg ml^-1)40代，P9R(5.0μg ml^-1)可有效抑制P30和P40病毒复制(图5D)。未检测到对P9R有明显药物抗性的病毒。这些结果表明P9R导致药物抗性病毒的可能性很低。

讨论

在这项研究中，鉴定了对包膜冠状病毒(SARS-CoV-2、SARS-CoV和MERS-CoV)、流感病毒和无包膜鼻病毒具有强效抗病毒活性的广谱抗病毒肽P9R。首先，研究表明，通过增加净正电荷以更有效地抑制内体酸化，可以显著增强P9R的抗病毒活性。其次，机理研究进一步证明了带正电荷的P9R可以与不同的呼吸道病毒结合以抑制病毒宿主内体酸化的新型抗病毒机制。PA1(仅与病毒结合)或P9RS(仅抑制内体酸化)未显示出抗病毒活性。机理研究表明，带正电荷的P9R通过与不同病毒结合然后抑制病毒宿主内体酸化以防止pH依赖性病毒的内体释放来广泛抑制病毒复制。P9R(不仅与病毒结合而且抑制内体酸化)、PA1(仅与病毒结合)和P9RS(仅抑制内体酸化)用于鉴定和确认碱性肽的新型抗病毒机制。第三，通过保护小鼠免受致命流感病毒的攻击，证明了P9R的体内抗病毒活性。碱性肽的抗病毒活性可以通过增加肽的正电荷来增强，并且需要结合病毒和抑制内体酸化。第四，连续传代病毒(40代)对P9R的易感性没有降低。

内体酸化是许多pH依赖性病毒生命周期中的关键步骤，其是广谱抗病毒靶点之一(Vigant等人,Nat Rev Microbiol 13,426-437(2015))。在这项研究中，随着P9R中正电荷的增加，其可以比P9更有效地抑制pH依赖性病毒。P9R中更多的正电荷使肽能够更有效地中和内体内的质子，从而抑制内体酸化。在先前的研究中，临床批准的具有抑制内体酸化活性的抗疟疾药物氯喹已被证明可以抑制肠道病毒-A7(Tan等人,Antiviral Res 149,143-149(2018))、寨卡病毒(Li等人,EBioMedicine 24,189-194(2017))和SARS-CoV-2(Wang等人,Cell Res 30,269-271(2020))。抗寄生虫药氯硝柳胺还通过干扰内体酸化来抑制流感病毒、鼻病毒和登革热病毒(Jurgeit等人,PLoS Pathog 8,e1002976(2012),Kao等人,PLoSNegl Trop Dis 12,e0006715(2018))。然而，研究人员证明氯喹在体内缺乏治疗流感病毒和埃博拉病毒的保护作用(Falzarano等人,Emerg Infect Dis 21,1065-1067(2015),Paton等人,Lancet Infect Dis 11,677-683(2011))。与这些通过干扰宿主内体酸化而不靶向病毒的药物不同，P9R通过与病毒结合然后抑制病毒-宿主内体酸化来抑制病毒复制，这使得P9R能够选择性且有效地抑制内体病毒。P9R对甲型(H1N1)感染小鼠的保护作用进一步证实了其体内抗病毒效率。

P9R的抗病毒活性需要结合病毒和抑制内体酸化。带较少正电荷的PA1不能抑制SARS-CoV-2和H1N1病毒，尽管其与病毒的结合能力和结合位点与P9R相似(图3b)。当对P9R进行多次取代以生成P9RS时，即使P9RS与P9R具有相同的正电荷并有效抑制宿主内体酸化，P9RS也失去了对所有测试病毒的结合能力和抗病毒活性。虽然不受理论的限制，但P9R与不同病毒蛋白的广泛结合机制可能是由于P9R具有带正电表面的柔性结构(图3h)。柔性结构可以允许P9R改变其结构以适应用于广泛特异性结合的靶向蛋白(Seppala等人,PLoS One10,e0136969(2015),Nakano等人,Sci Rep 5,13836(2015))，以及P9R的正电荷可以在结合带负电荷表面的病毒方面发挥作用(Seppala等人,PLoS One 10,e0136969(2015),Nakano等人,Sci Rep 5,13836(2015))。P9R中的五个半胱氨酸也可能影响基于结构的结合，因为先前的研究表明半胱氨酸取代可能影响防御素肽的结构和活性(Chandrababu等人,Biochemistry 48,6052-6061(2009),Liu等人,Chembiochem 9,964-973(2008))。

此外，与在扎那米韦存在下10次病毒传代后导致显著药物抗性病毒的扎那米韦相比，即使甲型(H1N1)pdm09病毒在P9R存在下传代40代，P9R也显示出极低的导致药物抗性病毒的风险。

总之，大多数高致病性新兴病毒是内体pH依赖性病毒。新出现和重新出现的病毒爆发提醒我们迫切需要广谱抗病毒药物。本研究提供了一种此类广谱抗病毒药物。

实施例2：多价P9R

材料和方法

细胞和病毒

从ATCC(Manassas,VA,美国)获得的Madin Darby犬肾(MDCK,CCL-34)、Vero E6(CRL-1586)、RD(HTB-55)、LLC-MK2(CCL-7)、A549(CCL136)细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)、100IU ml^-1青霉素和100μg ml^-1链霉素的Dulbecco基本培养基(用于Vero-E6细胞的DMEM)、MEM(用于MDCK、LLC-MK2和RD细胞)或DMEM-F12(用于Calu-3细胞)中培养。本研究使用的病毒株包括2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)(Chu等人,Lancet Microbe 1,e14-e23(2020))、SARS-CoV(Chu等人,Lancet Microbe 1,e14-e23(2020))、甲型/香港/415742/2009(Zhao等人,Virology 498,1-8(2016))、人副流感3(ATCC-C243)和临床分离的鼻病毒。

噬斑减少测定

肽(P9R、P9RS和8P9R)由ChinaPeptide合成。使用噬斑减少测定测量肽的抗病毒活性。简而言之，将肽溶解在PBS或含有24.6mM Na₂HPO₄和5.6mM KH₂PO₄，pH为7.4的30mM磷酸盐缓冲液(PB)中。对于冠状病毒的测定，将肽或牛血清白蛋白(BSA，0.2–25.0μg ml^-1)与50PFU的冠状病毒(SARS-CoV-2)在室温下在PBS或PB中预混合。孵育45-60分钟后，将肽-病毒混合物相应地转移到Vero-E6细胞中。对于流感病毒的测定，甲型(H1N1)pdm09病毒在室温下用8P9R(25μg/ml)或PBS(模拟物)处理45分钟，然后用处理过的病毒感染MDCK细胞。感染后1小时，去除感染性培养基并向细胞中加入1％的低熔点琼脂。感染后3天使用4％福尔马林固定细胞。加入水晶蓝(0.1％)染色，并计数噬斑数。

抗病毒多周期生长测定

在指定的感染后时间，SARS-CoV-2和SARS-CoV在存在药物或补充药物的情况下感染Vero-E6(0.005MOI)或Calu-3(0.05MOI)细胞。1小时感染后，去除感染性培养基，并向感染细胞中加入补充药物的新鲜培养基进行病毒培养。感染后24小时，收集感染细胞的上清液用于噬斑测定或RT-qPCR测定。

病毒RNA提取和RT-qPCR

根据制造商的说明，通过病毒RNA微型试剂盒(QIAGEN,Cat^#52906,美国)提取病毒RNA。使用PrimeScript II第一链cDNA合成试剂盒(Takara,Cat^#6210A)使用PCR系统9700(Applied Biosystems，美国)将提取的RNA逆转录为cDNA。然后使用特定引物(表2)扩增cDNA，使用480SYBR Green I Master(Roach,美国)检测SARS-CoV-2、SARS-CoV和副流感病毒3以及鼻病毒。对于定量，准备相当于每个反应10¹至10⁶个拷贝的标准质粒的10倍系列稀释液以生成校准曲线。使用96系统(Roche,美国)进行实时qPCR实验。

表2：引物

溶血测定

在PBS中两倍稀释的肽与火鸡红细胞在37℃下孵育1小时。PBS用作0％裂解对照，0.1％ Triton X-100用作100％裂解对照。将板以350g离心3分钟以沉淀未裂解的红细胞。用于测量血红蛋白释放的上清液通过450nm处的吸光度检测(如上所讨论)。

细胞毒性测定

肽的细胞毒性是通过使用基于四唑的比色MTT测定检测50％细胞毒性浓度(CC₅₀)来确定的(Zhao等人,Nat Commun 9,2358(2018))。Vero-E6细胞在补充有10％ FBS的DMEM中以每孔2×10⁴个细胞的初始密度接种在96孔细胞培养板中，并孵育过夜。去除细胞培养基，然后将补充有各种浓度的肽和1％ FBS的DMEM添加到每个孔中。在37℃下孵育24小时后，将MTT溶液(5mg ml^-1，每孔10μl)添加到每个孔中，在37℃下孵育4小时。然后，向每个孔中加入100μl 10％ SDS的0.01M HCl溶液。在室温下进一步摇动孵育过夜后，使用VictorTMX3 Multilabel Reader(PerkinElmer,美国)在OD570处读取板。不含肽的细胞培养孔用作实验对照，且仅培养基用作空白对照。

透射电子显微镜测定

为了确定8P9R对病毒颗粒的影响，用50μg ml^-1的8P9R、P9R或P9RS预处理SARS-CoV-2 1小时。病毒用福尔马林固定过夜，然后应用于连续碳网格。将网格转移到4％乙酸双氧铀中并孵育1分钟。去除溶液后，将网格在室温下风干。对于每个肽/DNA纳米颗粒，进行了三次独立的实验，以通过透射电子显微镜(FEI Tecnal G2-20 TEM)拍摄图像。

病毒荧光测定

为了鉴定8P9R对病毒的影响，H1N1病毒根据制造商的介绍用绿色Dio染料(Invitrogen，Cat#3898)预先标记。用8P9R、P9RS或P9R(25μg ml^-1)处理Dio标记的病毒45分钟。MDCK细胞被预处理的病毒感染1小时。病毒和细胞用4％福尔马林固定。细胞膜用膜染料Alexa 594(红色，Invitrogen，W11262)染色，细胞核用DAPI(蓝色)染色。通过共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 700，德国)确定病毒进入或未进入细胞膜。

内体酸化测定

根据制造商的说明但稍作修改(Zhao等人,Nat Commun 9,2358(2018))，使用pH敏感染料(pHrodo红右旋糖，Invitrogen，Cat#P10361)检测内体酸化。首先，MDCK细胞用BSA(25.0μg ml^-1)、8P9R(25.0μg ml^-1)、巴弗洛霉素A1(50.0nM)在4℃下处理15分钟。其次，向MDCK细胞中加入100μg ml^-1的pH敏感染料和DAPI，然后在4℃下孵育15分钟。在拍摄图像之前，细胞在37℃下进一步孵育15分钟，然后用PBS洗涤细胞两次。最后，将PBS添加到细胞中，并立即使用共聚焦显微镜(Carl Zeiss LSM 700，德国)拍摄图像。

刺突-ACE2介导的细胞融合测定

将SARS-CoV-2、pACE2-人或pGFP的pSpike转染到293T细胞中进行蛋白质表达。24小时后，为了触发刺突-ACE2介导的细胞融合，将293T-刺突-GFP细胞与293T-ACE2共培养并补充药物。293T-GFP细胞与293T-ACE2细胞共培养作为阴性对照。对于Huh-7细胞融合测定，将Huh-7细胞与293T-刺突-GFP共培养并补充药物。Huh-7细胞与293T-GFP细胞共培养作为阴性对照。共培养8小时后，每孔随机选取5个视野，用荧光显微镜拍摄细胞融合照片。

动物中的抗病毒测定

将BALB/c雌性小鼠(10月龄)和仓鼠(6周龄)饲养在生物安全2/3级实验室(饲养温度在22℃～25℃之间，暗/光循环)并随意获得标准颗粒饲料和水。所有实验方案均遵循经批准的生物安全2/3级动物设施的标准操作程序。动物伦理条例由香港大学教学和研究中活体动物使用委员会批准(Zheng等人,Proc Natl Acad Sci U S A 105,8091-8096(2008))。为了评估抗病毒活性，小鼠/仓鼠鼻内接种了SARS-CoV或SARS-CoV-2至肺部。感染后8小时，给予动物PBS、8P9R、阿比多尔、氯喹、卡莫司他或组合药物。在接下来的一天，再给予小鼠/仓鼠两剂。在感染后第2天通过噬斑测定测量小鼠/仓鼠肺中的病毒载量。

结果

8P9R对SARS-CoV-2、H1N1、副流感病毒3和人鼻病毒显示出强力的抗病毒活性

实施例1表明，广谱抗病毒肽P9R可以通过与病毒结合并抑制病毒-宿主内体酸化来抑制冠状病毒和流感病毒。实验经设计以确定分支P9R是否可以交联病毒(图6A)以增强抗病毒活性。首先，通过测量病毒与ELISA板结合的RNA拷贝来确定八分支P9R(8P9R)和单个P9R与SARS-CoV-2和H1N1病毒的结合能力，其中ELISA板上包被有肽。病毒RNA拷贝表明，与BSA和P9RS相比，8P9R可以有效地结合病毒并在ELISA板上捕获病毒颗粒(图6B)。当用肽预处理病毒(图6C)、在病毒接种期间(图6D)或感染后(图6E)处理病毒时，这种8P9R比P9R更有效地抑制SARS-CoV-2感染。8P9R在高盐条件(PBS)中显示出比P9R在PBS中的抗病毒活性(IC₅₀＝20.2μg ml^-1)更强的抗病毒活性(IC₅₀＝0.3μg ml^-1)(图6B)，即使P9R在低盐浓度的30mM磷酸盐缓冲液中显示出有效的抗病毒活性(IC₅₀＝0.9μg ml^-1)(图6G)。这与先前的报告一致，即防御素的抗微生物活性对高盐条件敏感(Gong等人,Arch Virol155,491-498(2010))。此外，当用200μg ml^-1的8P9R处理火鸡红细胞时，未观察到明显的溶血(图6F)，并且细胞毒性测定表明Vero-E6细胞中8P9R的TC₅₀高于200μg ml^-1(图6H)。病毒感染(％)显示8P9R有效抑制H1N1、副流感病毒3和人鼻病毒(图6I)，表明8P9R除了对冠状病毒外，还对呼吸道病毒具有广谱抗病毒活性。

8P9R针对病毒的双重功能活性

为了证明交联能力，拍摄TEM图像以显示8P9R可以交联SARS-CoV-2形成大病毒簇。相反，没有结合能力的肽P9RS(图6B)和单个P9R不交联病毒形成大病毒簇。用荧光标记的H1N1病毒进一步证实了这一结果。共聚焦图片显示，与P9RS或P9R处理相比，8P9R可以有效地交联聚集在细胞膜周围而没有进入的H1N1病毒。此外，证明了8P9R可以有效抑制内体酸化，这与内体酸化抑制剂巴弗洛霉素A1相似。这些结果表明8P9R的双重功能活性，其抑制病毒感染的内吞途径所需的内体酸化，并交联在细胞膜表面而没有进入的病毒。交联病毒可能通过TMPRSS2介导的途径在细胞表面影响SARS-CoV-2进入。因此，在后续部分中证实8P9R在Calu-3细胞中可以通过TMPRSS2介导的表面进入途径抑制SARS-CoV-2感染。

8P9R可以增强低浓度的阿比多尔抑制SARS-CoV-2

通过对来自COVID-19患者的临床样品进行病毒载量和测序的系列监测表明，SARS-CoV-2可以在超过一个月的时间检测到，并且偶尔检测到突变体(Koyama等人,BullWorld Health Organ 98,495-504(2020),Osman,Al Daajani,&Alsahafi,New MicrobesNew Infect 37,100748(2020))。这些发现表明，某些患者体内清除SARS-CoV-2的人体免疫应答的杀菌效率可能较低。因此，考虑重新利用在中国和俄罗斯可用的抗流感药物阿比多尔。阿比多尔显示出对冠状病毒(包括SARS-CoV-2和SARS-CoV)的体外抗病毒活性。然而，其在人体内相对较低的血清浓度(Deng等人,Antimicrob Agents Chemother57,1743-1755(2013),Sun等人,Int J Clin Pharmacol Ther 51,423-432(2013))可能导致其在患者中的抗病毒效果不佳(Lian等人,Clin Microbiol Infect 26,917-921(2020),Li等人,Med(NY)(2020))。结果表明，8P9R在低于阿比多尔正常IC₅₀(3.6μg ml^-1)的浓度下显著提高了阿比多尔的抗病毒效率(图7A)。重要的是，当阿比多尔本身不显示抗病毒活性时，8P9R可以提高低浓度(0.2μg ml^-1)下的阿比多尔的抗病毒活性(图7B和图7E)。该低浓度接近甚至低于人血清中阿比多尔的浓度。此外，结果证明协同活性是由于8P9R增强阿比多尔，而不是阿比多尔增强8P9R(图7F)，因为阿比多尔(12.5μg ml^-1)不能增强8P9R(0.8μg ml-1)以抑制SARS-CoV-2在Vero-E6细胞中的复制(图7F)。

8P9R增强阿比多尔针对SARS-CoV-2的协同机制

为了确定8P9R对阿比多尔抑制SARS-CoV-2的协同增强机制，首先阐明了阿比多尔略微减少病毒附着的能力(图7G)。接下来，当病毒(10⁶PFU ml^-1)用阿比多尔(25μg ml^-1)预处理，然后稀释至10,000倍用于噬斑测定时，阿比多尔不抑制SARS-CoV-2感染(图7C)。相反，8P9R即使稀释>1,000倍也能显著减少感染性病毒的数量，这表明8P9R的抗病毒活性取决于靶向病毒(图7C)，类似于P9R(Zhao等人,Nat Commun 11,4252(2020))。结果进一步表明，阿比多尔可以显著抑制病毒进入后的SARS-CoV-2复制，与巴弗洛霉素A1的添加实验相同，巴弗洛霉素A1是已知的宿主靶向抗病毒药物以抑制细胞内体酸化(图7D)。这些结果表明，阿比多尔针对SARS-CoV-2的主要靶标是宿主细胞，而不是病毒。接下来，阿比多尔被证明可有效抑制293T细胞(图7E)和Huh7细胞中的刺突-ACE2介导的细胞-细胞融合，这表明阿比多尔可抑制病毒-细胞膜融合。阿比多尔对SARS-CoV-2的融合抑制与阿比多尔可以阻断SARS-CoV-2在内溶酶体中释放的说法一致(Wang等人,Cell Discov 6,28(2020))。由于溶酶体是通过内吞途径的SARS-CoV-2感染的融合位置(Li,Annu Rev Virol 3,237-261(2016))并且内体酸化抑制剂氯化铵(Hoffmann等人,Cell 181,271-280e278(2020))、巴弗洛霉素A1和8P9R(125μg ml^-1)可以抑制刺突-ACE2介导的细胞膜融合(图7E)，据信内体/溶酶体中的pH会影响阿比多尔对刺突-ACE2介导的融合的抑制效率。与25μg ml^-1的单独的8P9R或阿比多尔相比，使用低浓度的8P9R组合低浓度的阿比多尔可以更有效地阻断刺突-ACE2介导的膜融合(图7E)。因此，8P9R协同增强阿比多尔而非阿比多尔协同增强8P9R的机制是由于8P9R抑制内体酸化，因此阿比多尔可以在较高pH环境下更有效地抑制病毒-细胞融合。

内体酸化抑制剂增强阿比多尔针对冠状病毒

为了进一步证实内体酸化抑制剂可以协同增强阿比多尔的抗病毒活性，并找到临床上可用的抑制SARS-CoV-2的药物，已确定氯喹，已知的提高内体pH值的药物，可以显著增强低浓度(0.2-0.4μg ml^-1)的阿比多尔在Vero-E6细胞中针对SARS-CoV-2(图8A)和SARS-CoV(图8B)的抗病毒活性。与单独的氯喹相比，补充有低浓度阿比多尔的氯喹可以抑制超过4倍的病毒复制(图8A-8B)。氯喹和阿比多尔的组合可以更有效地抑制刺突-ACE2介导的细胞-细胞膜融合，这进一步证实了提高内体/溶酶体中的pH的内体酸化抑制剂可以通过阻断病毒-细胞膜融合来增强阿比多尔的抗病毒活性。研究结果支持阿比多尔与氯喹组合使用以获得更好的抗病毒活性。

同时阻断冠状病毒的两条进入途径进行体内抗病毒治疗

为了测试体内的抗病毒效果，对10月龄的小鼠进行了SARS-CoV攻击，然后在感染后8小时对小鼠进行药物的初始施用。阿比多尔(25mg kg^-1)、氯喹(40mg kg^-1)或阿比多尔与氯喹的组合不能抑制SARS-CoV在小鼠肺部的复制(图8C)。双功能肽8P9R可显著抑制SARS-CoV在小鼠肺中的复制(图8C)。这可能表明单独抑制冠状病毒感染的内吞途径并不能有效抑制冠状病毒在体内的复制。结果显示(图8D)，阿比多尔和氯喹可显著抑制SARS-CoV-2在Vero-E6细胞(不含TMPRSS2(Matsuyama等人,Proc Natl Acad Sci U S A117,7001-7003(2020)))中的复制，但在Calu-3细胞中不能，在Calu-3细胞中，SARS-CoV-2依赖TMPRSS2介导的途径进入细胞(Hoffmann等人,Nature(2020))(图8E)。

然而，8P9R可显著抑制Vero-E6和Calu-3细胞中的SARS-CoV-2(图8D-8E)，这表明8P9R不仅抑制Vero-E6细胞中通过内吞途径的病毒感染，而且还抑制Calu-3细胞中通过TMPRSS2介导的途径的病毒进入。8P9R在Vero-E6、Calu-3细胞和小鼠模型中的强效抗病毒活性表明，同时阻断两种进入途径可能更有效地抑制冠状病毒在体内的复制。卡莫司他是TMPRSS2抑制剂，可显著抑制SARS-CoV-2在Calu-3细胞中的复制(Hoffmann等人,Cell181,271-280e278(2020))，但不能抑制Vero-E6细胞中的SARS-CoV-2复制和假型颗粒进入(Hoffmann等人,Cell 181,271-280e278(2020),Hoffmann等人,Nature(2020))。因此，SARS-CoV感染的小鼠接受了阿比多尔、氯喹和卡莫司他的组合治疗。这种组合在小鼠中显示出针对SARS-CoV的有效抗病毒活性(图8C)，类似于8P9R的抗病毒活性，而药物组合(阿比多尔和卡莫司他或氯喹和卡莫司他)或单独的卡莫司他与模拟物相比不能抑制病毒复制(图8C、图8G)。同时，通过用不同的药物组合治疗感染SARS-CoV-2的仓鼠，证实了这一体内结果。仓鼠肺中的病毒载量表明，与模拟物相比，8P9R或阿比多尔、氯喹和卡莫司他的三重组合可以显著抑制SARS-CoV-2复制(图8F)。单独的阿比多尔、氯喹或卡莫司他，以及卡莫司他与氯喹组合(图8F)不能显著抑制仓鼠体内的SARS-CoV-2复制。这些发现证实了单独的阿比多尔或氯喹治疗患者中SARS-CoV-2的临床功效有限。更重要的是，这些结果提供了使用内体酸化抑制剂(8P9R或氯喹)增强阿比多尔针对通过内吞途径的SARS-CoV-2感染的抗病毒活性的证据。此外，双功能8P9R或阿比多尔、氯喹和卡莫司他的三联药物组合可有效阻断冠状病毒的两条进入途径，转化为对体内病毒复制的显著减少。

讨论

在这项研究中，开发了双功能抗病毒肽8P9R，其可以交联病毒以阻断通过TMPRSS2介导的途径在细胞表面的病毒进入，同时抑制内体酸化以阻断通过内吞途径的病毒进入。证明了内体酸化抑制剂(8P9R和氯喹)增强阿比多尔针对通过内吞途径的SARS-CoV-2和SARS-CoV感染的活性的协同抗病毒机制。此外，阿比多尔、氯喹和卡莫司他(目前可用的临床药物)的三联组合被证明可以抑制仓鼠中的SARS-CoV-2复制和小鼠中的SARS-CoV复制。三联药物组合和8P9R均可在体内显著抑制SARS-CoV-2和SARS-CoV，这表明阻断冠状病毒感染的两条进入途径是治疗COVID-19的有前途的方法。

SARS-CoV-2和SARS-CoV可以通过TMPRSS2介导的途径或内吞途径感染宿主细胞。最近的研究表明，氯喹不会抑制SARS-CoV-2在Calu-3细胞中的复制(Hoffmann等人,Nature(2020))，卡莫司他也不会抑制SARS-CoV-2在Vero-E6细胞中的复制(Hoffmann等人,Cell181,271-280e278(2020),Hoffmann等人,Nature(2020))。通过使用多靶点药物或药物组合来阻断冠状病毒感染的两个进入途径可以更有效地抑制患者体内的病毒复制，因为不同的人体细胞可以分别或同时表达ACE2和TMPRSS2(Sungnak等人,Nat Med26,681-687(2020))。内体酸化抑制剂(氯喹和8P9R)被证明可以协同增强阿比多尔对SARS-CoV-2和SARS-CoV的抗病毒活性。据信，内体酸化抑制剂通过提高内体pH，可以增强阿比多尔阻断刺突-ACE2介导的膜融合的活性(图7E)，这与293T细胞中刺突-ACE2介导的假型颗粒的进入受pH(氯化铵)显著影响的发现一致(Hoffmann等人,Cell 181,271-280e278(2020))。然而，氯喹与阿比多尔的组合在仓鼠和小鼠中并未显示出针对SARS-CoV-2和SARS-CoV的抗病毒活性。可能的原因是氯喹和阿比多尔只能通过干扰内吞途径抑制SARS-CoV-2复制，而不能干扰TMPRSS2介导的途径(图8D-8E)。相比之下，8P9R可以在体内显著抑制冠状病毒。8P9R不仅通过防止内体酸化来阻断内吞途径，而且还交联细胞膜上的病毒颗粒以减少病毒通过TMPRSS2介导的途径进入。氯喹和卡莫司他的组合不能在体内显著抑制这两种病毒，这可能是由于氯喹在小鼠、仓鼠和雪貂中抑制通过内吞途径的病毒感染的边际抗病毒活性(Falzarano等人,Emerg Infect Dis 21,1065-1067(2015),Vigerust等人,InfluenzaOther Respir Viruses,1,189-192(2007))。在TMPRSS2缺陷型Vero-E6细胞中，阿比多尔与氯喹的组合可以更有效地抑制通过内吞途径的病毒感染(图8A-8B)。因此，阿比多尔、氯喹和卡莫司他的三重组合可以通过同时阻断两种进入途径，显著抑制SARS-CoV-2和SARS-CoV在仓鼠和小鼠中的复制(图8D)。此外，这些药物利用宿主因素干扰病毒复制，因此可能不太容易诱导药物抗性病毒突变体。

随着SARS-CoV-2在COVID-19大流行期间的广泛传播，病毒突变体的出现和恢复后抗体滴度的下降应该提醒我们再次感染的可能性。SARS-CoV-2和新出现的病毒迫切需要开发广谱抗病毒药物。在此，抗病毒肽8P9R被确定具有双重功能，可通过交联病毒以减少细胞表面的病毒进入(即SARS-CoV的TMPRSS2介导的进入途径)和通过干扰内体酸化以阻断通过内吞途径的病毒进入来抑制病毒感染。此外，数据支持用目前可用的广谱药物(阿比多尔、氯喹和卡莫司他)组合使用药物治疗来阻断SARS-CoV-2的两条进入途径，这也可能是其他呼吸道病毒的潜在疗法。

通过以下编号的段落可以进一步理解所公开的组合物和方法。

1.包含多价肽的抗病毒剂，其中所述多价肽包含三个或更多个拷贝的选自以下的肽的一种或组合：P9R(SEQ ID NO:2)和衍生自P9R的P9R样肽，其中组成所述多价肽的所述肽的至少三种从组成所述多价肽的一种或多种肽分支。

2.段落1的抗病毒剂，其中所述多价肽包含六个或更多个拷贝的肽，其中组成所述多价肽的所述肽的至少六种从组成所述多价肽的一种或多种肽分支。

3.段落1或2的抗病毒剂，其中所述多价肽包含八个或更多个拷贝的肽，其中组成所述多价肽的所述肽的至少八种从组成所述多价肽的一种或多种肽分支。

4.段落1-3中任一项的抗病毒剂，其中从组成所述多价肽的一种或多种肽分支的所述肽的至少三种从所述多价肽的中心点分支。

5.段落1-4中任一项的抗病毒剂，其中从组成所述多价肽的一种或多种肽分支的所述肽的至少六种从所述多价肽的中心点分支。

6.段落1-5中任一项的抗病毒剂，其中从组成所述多价肽的一种或多种肽分支的所述肽的至少八种从所述多价肽的中心点分支。

7.段落1-6中任一项的抗病毒剂，其中从组成所述多价肽的一种或多种肽分支的八种肽从所述多价肽的中心点分支。

8.段落1-7中任一项的抗病毒剂，其中所述P9R样肽的特征在于所述P9R样肽抑制内体酸化并保留病毒结合，如通过体外内体酸化(任选地与对照相比)和肽-病毒结合测定所确定的。

9.段落1-8中任一项的抗病毒剂，其中组成所述多价肽的肽各自由P9R(SEQ IDNO:2)组成。

10.段落1-9中任一项的抗病毒剂，其中组成所述多价肽的一种或多种肽具有至少5的净正电荷。

11.段落1-10中任一项的抗病毒剂，其中组成所述多价肽的肽各自具有至少5的净正电荷。

12.段落1-11中任一项的抗病毒剂，其中组成所述多价肽的一种或多种肽具有约5.6的净正电荷。

13.段落1-12中任一项的抗病毒剂，其中组成所述多价肽的肽各自具有约5.6的净正电荷。

14.段落1-13中任一项的抗病毒剂，其中组成所述多价肽的一种或多种肽具有5.6的净正电荷。

15.段落1-14中任一项的抗病毒剂，其中组成所述多价肽的肽各自具有5.6的净正电荷。

16.抗病毒剂，其包含P9R(SEQ ID NO:2)，或衍生自P9R的P9R样肽。

17.段落16的抗病毒剂，其中所述P9R样肽的特征在于所述P9R样肽抑制内体酸化并保留病毒结合，如通过体外内体酸化(任选地与对照相比)和肽-病毒结合测定所确定的。

18.段落16或17的抗病毒剂，其由P9R(SEQ ID NO:2)组成。

19.段落16-18中任一项的抗病毒剂，其中所述抗病毒剂具有至少5的净正电荷。

20.段落16-19中任一项的抗病毒剂，其中所述抗病毒剂具有约5.6的净正电荷。

21.段落16-20中任一项的抗病毒剂，其中所述抗病毒剂具有5.6的净正电荷。

22.组合物，其包含治疗有效量的段落1-21中任一项的抗病毒剂和药学上可接受的载剂。

23.抗病毒组合物，其包含阿比多尔、氯喹和卡莫司他。

24.段落22或23的组合物，其中所述组合物抑制受试者中的抗病毒复制。

25.段落22-24中任一项的组合物，其中所述组合物是单位剂型。

26.段落25的组合物，其中所述单位剂型选自片剂或胶囊。

27.段落22-24中任一项的组合物，其为适合鼻内或肺部递送的形式。

28.段落25的组合物，其中所述单位剂型是可注射的，其中所述组合物进一步包含用于注射至人的药学上可接受的载剂。

29.在有此需要的受试者中治疗病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的段落1-21中任一项的抗病毒剂或段落22-28中任一项的组合物。

30.段落29的方法，其中所述感染是由呼吸道病毒引起的。

31.段落29或30的方法，其中所述感染是由pH依赖性病毒引起的，所述病毒需要内体酸化以实现病毒-宿主膜融合。

32.段落29-31中任一项的方法，其中所述组合物肠胃外或口服施用。

33.段落29-31中任一项的方法，其中所述组合物鼻内施用或通过肺部施用来施用。

34.段落29-33中任一项的方法，其中所述感染是由寨卡病毒、肠道病毒-A7、埃博拉病毒、流感病毒、SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、甲型(H1N1)pdm09病毒、甲型禽流感(H7N9)病毒和无包膜鼻病毒引起的。

本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的发明的具体实施方案的许多等效物。这些等价物旨在由以下权利要求所涵盖。

应当理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而非旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。

必须注意，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。

在本说明书的整个描述和权利要求书中，词语“包含”和词语的变体，如“包括”和“含有”，意思是“包括但不限于”，并且不旨在排除例如其他添加剂、成分、整数或步骤。

“任选”或“任选地”是指随后描述的事件、情况或材料可以或可以不发生或存在，并且描述包括事件、情况或材料发生或存在的实例以及不发生或不存在的实例。

范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值，和/或“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，除非上下文另有明确说明，否则还具体考虑和认为公开从一个特定值和/或到另一个特定值的范围。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应理解该特定值形成另一个具体考虑的实施方案，除非上下文另有明确说明，否则该实施方案应被视为公开。将进一步理解，每个范围的端点都显著相关于另一个端点且独立于另一个端点，除非上下文另有明确说明。应当理解，包含在明确公开的范围内的所有单个值和值的子范围也被具体考虑并且应该被认为是公开的，除非上下文另有明确说明。最后，应当理解，所有范围都将所列举的范围称为范围和从包括第一端点到包括第二端点的单个数字的集合。在后一种情况下，应当理解，可以选择任何单个数字作为该范围所指的数量、值或特征的一种形式。以这种方式，范围描述了从(包括)第一端点到(包括)第二端点的一组数字或值，从中可以选择集合的单个成员(即单个数字)作为范围所指的数量、值或特征。无论在特定情况下是否明确公开了这些实施方案中的一些或全部，上述内容都适用。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员所通常理解的相同的含义。尽管与本文所述的那些相似或等效的任何方法和材料可以用于本方法和组合物的实践或测试，但特别有用的方法、装置和材料如所述。本文引用的出版物及其所引用的材料在此通过引用具体并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权因在先发明而早于此类公开。不承认任何参考构成现有技术。参考文献的讨论说明了作者的主张，申请人保留质疑引用文件的准确性和相关性的权利。将清楚地理解，尽管本文提到了许多出版物，但这种参考并不构成承认这些文件中的任何一个构成本领域公知常识的一部分。

尽管对材料、组合物、成分、步骤、技术等的描述可以包括许多选项和替代方案，但这不应被解释为也不是承认此类选项和替代方案彼此等价，或者尤其是显而易见的选择。因此，例如不同部分的列表并不表明列出的部分彼此之间是显而易见的，也不是对等价或显而易见性的承认。

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序列表

<110> 香港大学

<120> 抗病毒肽和/或化合物的组合物及其使用方法

<130> IP00996

<160> 19

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 30

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 1

Asn Gly Ala Ile Cys Trp Gly Pro Cys Pro Thr Ala Phe Arg Gln Ile

1 5 10 15

Gly Asn Cys Gly Lys Phe Lys Val Arg Cys Cys Lys Ile Arg

20 25 30

<210> 2

<211> 30

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 2

Asn Gly Ala Ile Cys Trp Gly Pro Cys Pro Thr Ala Phe Arg Gln Ile

1 5 10 15

Gly Asn Cys Gly Arg Phe Arg Val Arg Cys Cys Arg Ile Arg

20 25 30

<210> 3

<211> 33

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 3

Asn Gly Ala Ile Cys Trp Gly Pro Cys Pro Thr Ala Phe Arg Gln Ile

1 5 10 15

Gly Asn Cys Gly His Phe Lys Val Arg Cys Cys Lys Ile Arg Asp Glu

20 25 30

Asp

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 4

Asn Gly Ala His Ser Trp His Pro Asn Glu Thr His Phe Arg Gln Ile

1 5 10 15

His Asn Ser Gly Arg His Arg Val Arg Ser His Arg Ile Arg

20 25 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SARS-CoV-2 S-F

<400> 5

cctactaaat taaatgatct ctgctttact 30

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SARS-CoV-2 S-R

<400> 6

caagctataa cgcagcctgt a 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MERS-CoV NP-F

<400> 7

caaaaccttc cctaagaagg aaaag 25

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> MERS-CoV NP-R

<400> 8

gctcctttgg aggttcagac at 22

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SARS-CoV NP-F

<400> 9

accagaatgg aggacgcaa 19

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SARS-CoV NP-R

<400> 10

gctgtgaacc aagacgcagt attat 25

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1N1 M-F

<400> 11

cttctaaccg aggtcgaaac g 21

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H1N1 M-R

<400> 12

ggcattttgg acaaakcgtc ta 22

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H7N9 M-F

<400> 13

cttctaaccg aggtcgaaac g 21

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> H7N9 M-R

<400> 14

ggcattttgg acaaakcgtc ta 22

<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼻病毒5'UTR-F

<400> 15

agccygcgtg gckgcc 16

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 鼻病毒5'UTR-R

<400> 16

agccygcgtg gtgccc 16

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 探针

<400> 17

tccggcccct gaatgyggct aa 22

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副流感病毒3 HPIV3_Inner-F

<400> 18

agctatyact agyatctcag ggt 23

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 副流感病毒3 HPIV3_Inner-Rm

<400> 19

cccaatctga tccactgtgt 20

Claims (34)

1.包含多价肽的抗病毒剂，其中所述多价肽包含三个或更多个拷贝的选自以下的肽的一种或组合：P9R(SEQ ID NO:2)和衍生自P9R的P9R样肽，其中组成所述多价肽的所述肽的至少三种从组成所述多价肽的一种或多种肽分支。

2.权利要求1的抗病毒剂，其中所述多价肽包含六个或更多个拷贝的肽，其中组成所述多价肽的所述肽的至少六种从组成所述多价肽的一种或多种肽分支。

3.权利要求1或2的抗病毒剂，其中所述多价肽包含八个或更多个拷贝的肽，其中组成所述多价肽的所述肽的至少八种从组成所述多价肽的一种或多种肽分支。

4.权利要求1-3中任一项的抗病毒剂，其中从组成所述多价肽的一种或多种肽分支的所述肽的至少三种从所述多价肽的中心点分支。

5.权利要求1-4中任一项的抗病毒剂，其中从组成所述多价肽的一种或多种肽分支的所述肽的至少六种从所述多价肽的中心点分支。

6.权利要求1-5中任一项的抗病毒剂，其中从组成所述多价肽的一种或多种肽分支的所述肽的至少八种从所述多价肽的中心点分支。

7.权利要求1-6中任一项的抗病毒剂，其中从组成所述多价肽的一种或多种肽分支的肽从所述多价肽的中心点分支。

8.权利要求1-7中任一项的抗病毒剂，其中所述P9R样肽的特征在于所述P9R样肽抑制内体酸化并保留病毒结合，如通过体外内体酸化，任选地与对照相比，和肽-病毒结合测定所确定的。

9.权利要求1-8中任一项的抗病毒剂，其中组成所述多价肽的肽各自由P9R(SEQ IDNO:2)组成。

10.权利要求1-9中任一项的抗病毒剂，其中组成所述多价肽的一种或多种肽具有至少5的净正电荷。

11.权利要求1-10中任一项的抗病毒剂，其中组成所述多价肽的肽各自具有至少5的净正电荷。

12.权利要求1-11中任一项的抗病毒剂，其中组成所述多价肽的一种或多种肽具有约5.6的净正电荷。

13.权利要求1-12中任一项的抗病毒剂，其中组成所述多价肽的肽各自具有约5.6的净正电荷。

14.权利要求1-13中任一项的抗病毒剂，其中组成所述多价肽的一种或多种肽具有5.6的净正电荷。

15.权利要求1-14中任一项的抗病毒剂，其中组成所述多价肽的肽各自具有5.6的净正电荷。

16.抗病毒剂，其包含P9R(SEQ ID NO:2)，或衍生自P9R的P9R样肽。

17.权利要求16的抗病毒剂，其中所述P9R样肽的特征在于所述P9R样肽抑制内体酸化并保留病毒结合，如通过体外内体酸化，任选地与对照相比，和肽-病毒结合测定所确定的。

18.权利要求16或17的抗病毒剂，其由P9R(SEQ ID NO:2)组成。

19.权利要求16-18中任一项的抗病毒剂，其中所述抗病毒剂具有至少5的净正电荷。

20.权利要求16-19中任一项的抗病毒剂，其中所述抗病毒剂具有约5.6的净正电荷。

21.权利要求16-20中任一项的抗病毒剂，其中所述抗病毒剂具有5.6的净正电荷。

22.组合物，其包含治疗有效量的权利要求1-21中任一项的抗病毒剂和药学上可接受的载剂。

23.抗病毒组合物，其包含阿比多尔、氯喹和卡莫司他。

24.权利要求22或23的组合物，其中所述抗病毒剂抑制受试者中的抗病毒复制。

25.权利要求22-24中任一项的组合物，其中所述组合物是单位剂型。

26.权利要求25的组合物，其中所述单位剂型选自片剂或胶囊。

27.权利要求22-24中任一项的组合物，其为适合鼻内或肺部递送的形式。

28.权利要求25的组合物，其中所述单位剂型是可注射的，其中所述组合物进一步包含用于注射至人的药学上可接受的载剂。

29.在有此需要的受试者中治疗病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-21中任一项的抗病毒剂或权利要求22-28中任一项的组合物。

30.权利要求29的方法，其中所述感染是由呼吸道病毒引起的。

31.权利要求29或30的方法，其中所述感染是由pH依赖性病毒引起的，所述病毒需要内体酸化以实现病毒-宿主膜融合。

32.权利要求29-31中任一项的方法，其中所述组合物肠胃外或口服施用。

33.权利要求29-31中任一项的方法，其中所述组合物鼻内施用或通过肺部施用来施用。

34.权利要求29-33中任一项的方法，其中所述感染是由寨卡病毒、肠道病毒-A7、埃博拉病毒、流感病毒、SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、甲型(H1N1)pdm09病毒、甲型禽流感(H7N9)病毒和无包膜鼻病毒引起的。