JP2927539B2 - マガイニンペプチドの欠失アナログ - Google Patents
マガイニンペプチドの欠失アナログInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はマガイニンとして知られている生物学的活性
ペプチド群に関する。特に本出願は該ペプチド中の少な
くとも１残基がそのペプチド鎖から欠失したマガイニン
ペプチドのアナログに関する。このようなアナログは一
般に“欠失アナログ”と呼ばれる。
ペプチド群に関する。特に本出願は該ペプチド中の少な
くとも１残基がそのペプチド鎖から欠失したマガイニン
ペプチドのアナログに関する。このようなアナログは一
般に“欠失アナログ”と呼ばれる。
本発明の特徴に従がい、以下の一文字アミノ酸コード
およびペプチド中の各アミノ酸の位置を示す数字を用い
た構造式で表わされるマガイニンＩで： かつ15から23のアミノ酸のうちの少なくとも１つを欠失
するアミドまたはカルボキシ末端を有するマガイニンＩ
のペプチド欠失アナログを含む化合物が提供される。好
ましい態様ではアミノ酸残基15、16、18、19、21、22お
よび23のうちの少なくとも１つが欠失している。ある態
様においては少なくともアミノ酸残基18が欠失している
一方、他の態様では少なくともアミノ酸残基19が欠失し
ており、また別の態様においては少なくともアミノ酸残
基21を欠失している。好ましい態様ではアミノ酸残基1
8、19および21のうちのどれか１つのみが欠失してい
る。また別の好ましい態様にはアミノ酸残基21、22およ
び23が欠失しているもの、アミノ酸残基19乃至23が欠失
しているもの、アミノ酸残基18乃至23が欠失しているも
の、およびアミノ酸残基17乃至23が欠失しているものが
ある。これらの化合物はアミドまたはカルボキシ末端を
有するマガイニンＩの欠失アナログといい得る。
およびペプチド中の各アミノ酸の位置を示す数字を用い
た構造式で表わされるマガイニンＩで： かつ15から23のアミノ酸のうちの少なくとも１つを欠失
するアミドまたはカルボキシ末端を有するマガイニンＩ
のペプチド欠失アナログを含む化合物が提供される。好
ましい態様ではアミノ酸残基15、16、18、19、21、22お
よび23のうちの少なくとも１つが欠失している。ある態
様においては少なくともアミノ酸残基18が欠失している
一方、他の態様では少なくともアミノ酸残基19が欠失し
ており、また別の態様においては少なくともアミノ酸残
基21を欠失している。好ましい態様ではアミノ酸残基1
8、19および21のうちのどれか１つのみが欠失してい
る。また別の好ましい態様にはアミノ酸残基21、22およ
び23が欠失しているもの、アミノ酸残基19乃至23が欠失
しているもの、アミノ酸残基18乃至23が欠失しているも
の、およびアミノ酸残基17乃至23が欠失しているものが
ある。これらの化合物はアミドまたはカルボキシ末端を
有するマガイニンＩの欠失アナログといい得る。
これらの欠失アナログを以後マイナス記号（−）、ア
ミノ酸残基の１文字コードおよび配列中の残基位置を示
す下付きの数字で表わす。またマガイニンＩまたはIIも
参照する。
ミノ酸残基の１文字コードおよび配列中の残基位置を示
す下付きの数字で表わす。またマガイニンＩまたはIIも
参照する。
本発明の別の特徴に従がい、１文字アミノ酸コードと
ペプチド中の残基位置を示す各アミノ酸残基の下の数字
を用いた以下の構造式： であらわされるマガイニンIIで、かつアミノ酸残基15乃
至22の少なくとも１つの残基を欠失するアミドまたはカ
ルボキシ末端を有するマガイニンIIの欠失アナログも提
供される。好ましい態様ではアミノ酸残基15、18、19、
20、21、及び22の少なくとも１つが欠失している。ある
態様では少なくともアミノ酸残基18が欠失している。別
の態様では少なくともアミノ酸残基19が欠失している。
また別の態様では少なくともアミノ酸残基21が欠失して
いるか、または少なくともアミノ酸残基22が欠失してい
る。好ましい態様においてはアミノ酸残基18、19、21お
よび22のうちの各々１つのみが欠失している。これらの
化合物はアミド末端を有するマガイニンIIの欠失アナロ
グということができる。
ペプチド中の残基位置を示す各アミノ酸残基の下の数字
を用いた以下の構造式： であらわされるマガイニンIIで、かつアミノ酸残基15乃
至22の少なくとも１つの残基を欠失するアミドまたはカ
ルボキシ末端を有するマガイニンIIの欠失アナログも提
供される。好ましい態様ではアミノ酸残基15、18、19、
20、21、及び22の少なくとも１つが欠失している。ある
態様では少なくともアミノ酸残基18が欠失している。別
の態様では少なくともアミノ酸残基19が欠失している。
また別の態様では少なくともアミノ酸残基21が欠失して
いるか、または少なくともアミノ酸残基22が欠失してい
る。好ましい態様においてはアミノ酸残基18、19、21お
よび22のうちの各々１つのみが欠失している。これらの
化合物はアミド末端を有するマガイニンIIの欠失アナロ
グということができる。
先に述べたようにマガイニンＩおよびマガイニンIIの
欠失アナログはグラム陽性およびグラム陰性のバクテリ
アに対し有効であるがヒトの赤血球細胞に対する溶血作
用はわずかであることが分かっている。
欠失アナログはグラム陽性およびグラム陰性のバクテリ
アに対し有効であるがヒトの赤血球細胞に対する溶血作
用はわずかであることが分かっている。
本発明に従がいマガイニンＩまたはマガイニンIIペプ
チドの欠失アナログを含む化合物は抗生物質として有効
であり、バクテリア、菌類、ウィルスなどの微生物の増
殖を阻害または阻止するのに使用し得る。同様にこれら
の化合物はウィルスの増殖を阻害または阻止する抗ウィ
ルス剤として使用し得る。
チドの欠失アナログを含む化合物は抗生物質として有効
であり、バクテリア、菌類、ウィルスなどの微生物の増
殖を阻害または阻止するのに使用し得る。同様にこれら
の化合物はウィルスの増殖を阻害または阻止する抗ウィ
ルス剤として使用し得る。
このような化合物は精子の運動を阻害または阻止する
殺精子剤としても使用し得る。
殺精子剤としても使用し得る。
またこれらの化合物は腫瘍の増殖を阻害または阻止す
る抗腫瘍剤としても使用し得る。
る抗腫瘍剤としても使用し得る。
この化合物はグラム陽性およびグラム陰性細菌、菌
類、プロトゾア、などを含む多くの微生物に対して巾広
い強力な抗生活性を有する。これらの化合物はこれらの
化合物に対して感受性の生物によって引き起こされる微
生物感染を治療またはコントロールするのにも使用し得
る。
類、プロトゾア、などを含む多くの微生物に対して巾広
い強力な抗生活性を有する。これらの化合物はこれらの
化合物に対して感受性の生物によって引き起こされる微
生物感染を治療またはコントロールするのにも使用し得
る。
またこれらの化合物は微生物で汚染した物質の保存剤
または滅菌剤としても使用し得る。
または滅菌剤としても使用し得る。
本発明はいかなる理論によっても制限されることはな
いけれども予備的なNMR実験から、マガイニンIIの構造
は溶媒依存であり、水中でのランダムコイルからトリフ
ルオロエタノールなどのより疎水的溶媒におけるα−ヘ
リックスへの変化することが示されている。これらの結
果はマガイニンが種々の微生物の脂質膜に接する時α−
ヘリックス構造が誘導され得ることを示している。
いけれども予備的なNMR実験から、マガイニンIIの構造
は溶媒依存であり、水中でのランダムコイルからトリフ
ルオロエタノールなどのより疎水的溶媒におけるα−ヘ
リックスへの変化することが示されている。これらの結
果はマガイニンが種々の微生物の脂質膜に接する時α−
ヘリックス構造が誘導され得ることを示している。
一般に、マガイニンＩまたはマガイニンIIペプチドの
欠失アナログは全身投与される場合体重キログラム当り
約1mg乃至約500mgが投与される。局所的に投与される場
合このペプチドは約0.5％乃至５％の濃度のものが使用
される。
欠失アナログは全身投与される場合体重キログラム当り
約1mg乃至約500mgが投与される。局所的に投与される場
合このペプチドは約0.5％乃至５％の濃度のものが使用
される。
本発明に従がうマガイニンＩまたはマガイニンIIの欠
失アナログを含む化合物は広範囲の宿主の治療に使用し
得る。好ましい態様における宿主は動物であり、その動
物はヒトでもヒト以外の動物でもよい。
失アナログを含む化合物は広範囲の宿主の治療に使用し
得る。好ましい態様における宿主は動物であり、その動
物はヒトでもヒト以外の動物でもよい。
マガイニンＩまたはマガイニンIIの欠失アナログを含
む化合物は賦形剤、無毒性バッファ、または生理食塩水
などの無毒性医薬キャリヤーまたはベヒクルとともに広
範囲な医薬組成物に使用し得る。これらの医薬組成物は
局所的または全身的に使用され、かつ液体、固体、半固
体、注射液、錠剤、軟こう、ローション、ペースト、カ
プセルなど適当な形状で用いられる。またマガイニンＩ
またはマガイニンIIの欠失アナログを含む化合物は、プ
ロトゾア、ウィルスなどを含む有害微生物によって引き
起こされる感染をコントロールするのに有利と思われる
場合はアジュバント、プロテアーゼインヒビター、また
は適合する薬剤と組合せて使用し得る。
む化合物は賦形剤、無毒性バッファ、または生理食塩水
などの無毒性医薬キャリヤーまたはベヒクルとともに広
範囲な医薬組成物に使用し得る。これらの医薬組成物は
局所的または全身的に使用され、かつ液体、固体、半固
体、注射液、錠剤、軟こう、ローション、ペースト、カ
プセルなど適当な形状で用いられる。またマガイニンＩ
またはマガイニンIIの欠失アナログを含む化合物は、プ
ロトゾア、ウィルスなどを含む有害微生物によって引き
起こされる感染をコントロールするのに有利と思われる
場合はアジュバント、プロテアーゼインヒビター、また
は適合する薬剤と組合せて使用し得る。
本発明のマガイニンＩまたはIIの欠失アナログを含む
化合物はその抗生物有効量、および、または抗腫瘍有効
量、および、または抗ウィルス有効量および、または抗
微生物有効量、および、または殺精子量を宿主、特に動
物に投与し得る。
化合物はその抗生物有効量、および、または抗腫瘍有効
量、および、または抗ウィルス有効量および、または抗
微生物有効量、および、または殺精子量を宿主、特に動
物に投与し得る。
マガイニンＩおよびマガイニンIIならびに本発明のマ
ガイニンＩおよびマガイニンIIペプチドの欠失アナログ
（マガイニンＩおよびマガイニンII各々のアミド末端型
およびカルボキシ末端型の両型）は当業者によく知られ
ているペプチド合成の従来法合成し得る。特に固相法が
好ましい。
ガイニンＩおよびマガイニンIIペプチドの欠失アナログ
（マガイニンＩおよびマガイニンII各々のアミド末端型
およびカルボキシ末端型の両型）は当業者によく知られ
ているペプチド合成の従来法合成し得る。特に固相法が
好ましい。
ここで述べるペプチドは同時多重ペプチド合成法（SM
PS）で合成した。この方法は、ホーテン（Horghten）、
R.A.,“多数のペプチドの迅速固相合成の一般的方法：
各アミノ酸レベルでの抗原−抗体相互作用の特異性”、
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,pp 5131−5135（198
5）、およびホーテン（Horghten）、R.A.,等“同時多重
ペプチド合成：生物学的、免疫学的および方法論的研究
を目的とした多種ペプチドの迅速な大量合成“Peptide
Chemistry,pp.295−298（1987）に詳しく報告されてい
る。この方法により、完全な一連の欠失アナログを合成
し得る。
PS）で合成した。この方法は、ホーテン（Horghten）、
R.A.,“多数のペプチドの迅速固相合成の一般的方法：
各アミノ酸レベルでの抗原−抗体相互作用の特異性”、
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82,pp 5131−5135（198
5）、およびホーテン（Horghten）、R.A.,等“同時多重
ペプチド合成：生物学的、免疫学的および方法論的研究
を目的とした多種ペプチドの迅速な大量合成“Peptide
Chemistry,pp.295−298（1987）に詳しく報告されてい
る。この方法により、完全な一連の欠失アナログを合成
し得る。
以下に示す例を実施するための欠失アナログシリーズ
は23種のペプチドからなる。最初のペプチドはアミノ酸
残基１を欠失しており、第２ペプチドはアミノ酸残基２
を欠失しており、以下同様にして23番目のペプチドはア
ミノ酸残基23を欠失しているものである。このように一
連の欠失アナログはマガイニンＩおよびマガイニンIIの
両方について合成し得る。
は23種のペプチドからなる。最初のペプチドはアミノ酸
残基１を欠失しており、第２ペプチドはアミノ酸残基２
を欠失しており、以下同様にして23番目のペプチドはア
ミノ酸残基23を欠失しているものである。このように一
連の欠失アナログはマガイニンＩおよびマガイニンIIの
両方について合成し得る。
比較のためにアミド末端またはカルボキシ末端の完全
なマガイニンＩおよびマガイニンIIもSMPS法で合成す
る。また本発明の範囲にはマガイニンＩまたはマガイニ
ンII構造から１つ以上のアミノ酸残基が欠失したものも
合成し得ることが含まれる。このようなペプチドについ
ては例５で述べる。
なマガイニンＩおよびマガイニンIIもSMPS法で合成す
る。また本発明の範囲にはマガイニンＩまたはマガイニ
ンII構造から１つ以上のアミノ酸残基が欠失したものも
合成し得ることが含まれる。このようなペプチドについ
ては例５で述べる。
ここで本発明の図式について述べる。
第1a図はマガイニンＩまたはそのアナログおよび大腸
菌を含むサンプルに関する1/（光学密度変化）とペプチ
ドのマイクログラム数/mlのグラフである。
菌を含むサンプルに関する1/（光学密度変化）とペプチ
ドのマイクログラム数/mlのグラフである。
第1b図はマガイニンIIまたはそのアナログおよび大腸
菌を含むサンプルに関する1/（光学密度変化）とペプチ
ドのマイクログラム数/mlのグラフである。
菌を含むサンプルに関する1/（光学密度変化）とペプチ
ドのマイクログラム数/mlのグラフである。
第2a図はマガイニンＩまたはそのアナログおよびS.エ
ピデルミス（epidermis）を含むサンプルに関する1/
（光学密度変化）とペプチドのマイクログラム数/mlの
グラフである。
ピデルミス（epidermis）を含むサンプルに関する1/
（光学密度変化）とペプチドのマイクログラム数/mlの
グラフである。
第2b図はマガイニンIIまたはそのアナログおよびS.エ
ピデルミス（epidermis）を含むサンプルに関する1/
（光学密度変化）とペプチドのマイクログラム数/mlの
グラフである。
ピデルミス（epidermis）を含むサンプルに関する1/
（光学密度変化）とペプチドのマイクログラム数/mlの
グラフである。
第３図はlog（大腸菌1.0×106CFU/mlの10-2、10-3お
よび10-4希釈物由来のバクテリア数）と大腸菌をマガイ
ニンIIの−G18欠失アナログ（Ｏ）、マガイニンIIの−E
19欠失アナログ（−−−）、アミド末端マガイニンII またはコントロール（□）とインキュベーションした時
間のグラフである。
よび10-4希釈物由来のバクテリア数）と大腸菌をマガイ
ニンIIの−G18欠失アナログ（Ｏ）、マガイニンIIの−E
19欠失アナログ（−−−）、アミド末端マガイニンII またはコントロール（□）とインキュベーションした時
間のグラフである。
ここで本発明の例を示すが、これによって本発明の範
囲が限定されることはない。
囲が限定されることはない。
例１−ペプチド合成 マガイニンＩ、マガイニンIIおよびその欠失アナログ
のペプチド合成は同時多重ペプチド合成法を用いて行っ
た。全ての溶媒および試薬は分析用のもので精製せずに
使用した。標準的Ｎ−ｔ−Boc−保護アミノ酸を合成に
用いた。側鎖の保護にはベンジル（Ser、Gln）、2Cl−
Ｚ（Lys）（Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル基）、Nim−
DNP（His）およびスルホキシド（Met）を用いた。ペプ
チド合成はレジンパケット当り100mgのBoc−アミノ酸−
Pamレジンを用いてＣ末端カルボキシルペプチド（アプ
ライドバイオシステムズからPAMとして市販されてい
る、置換能0.56meq/gmのアミノポリスチレンのアミノア
シル−４−〔オキシメチル〕フェニル酢酸誘導体）を作
るかまたは100mgのメチルベンズヒドリルアミンレジン
（置換能0.65meq/ml）を用いてＣ−末端アミドペプチド
を作った。
のペプチド合成は同時多重ペプチド合成法を用いて行っ
た。全ての溶媒および試薬は分析用のもので精製せずに
使用した。標準的Ｎ−ｔ−Boc−保護アミノ酸を合成に
用いた。側鎖の保護にはベンジル（Ser、Gln）、2Cl−
Ｚ（Lys）（Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル基）、Nim−
DNP（His）およびスルホキシド（Met）を用いた。ペプ
チド合成はレジンパケット当り100mgのBoc−アミノ酸−
Pamレジンを用いてＣ末端カルボキシルペプチド（アプ
ライドバイオシステムズからPAMとして市販されてい
る、置換能0.56meq/gmのアミノポリスチレンのアミノア
シル−４−〔オキシメチル〕フェニル酢酸誘導体）を作
るかまたは100mgのメチルベンズヒドリルアミンレジン
（置換能0.65meq/ml）を用いてＣ−末端アミドペプチド
を作った。
合成後完全に保護されたペプチドレジンを0.5Mチオフ
ェーノールのDMF溶液で３回処理しヒスチジンからNim−
ジニトロフェニル基を除去した。最後のBoc基はTFＡで
除去し最終的HF処理の際のメチオニル残基のｔ−ブチル
化を回避した。高低HF操作を用いて切断した。タム（Ta
m）等J.Am.Chem.Soc.105,pp6442（1983）。Pam レジン
上で合成したペプチドに対してパケットにレジンを入れ
たまま、多重HF装置中０℃、２時間かけて低HF処理を行
った。MBHAレジンを用いて合成したペプチドに対しては
一般的反応容器中０℃、２時間かけて低HF処理を行っ
た。Pamレジンペプチドについては24個の反応容器中の
低HF混合物を水流ポンプ、ついで真空ポンプを用いて乾
燥させた。ジメチルスルフィド（低ステップ由来）およ
びHFを除去してから、このペプチドを−５℃〜０℃で30
分間〜１時間、高HF（10％アニソール）処理した。HFは
高流量の窒素ガスで蒸発させた。MBHAレジンの入ったバ
ッグを含む低HF反応容器は廃液容器中に低HF混合物中の
液体を注ぎ出すことで空にした。そのバッグを直ちに冷
エーテル、つづいてCH2Cl2、DMF、CH2Cl2、IPA、CH2Cl2
の順で洗浄した。このパケットを乾燥し、スキャベンジ
ャーとして0.7mlのアニソールを用い24連HF装置の各チ
ューブに入れた。−70℃で乾燥フッ化水素を凝縮させて
高HF処理を行った。反応は−10℃で１時間行ない、つづ
いて−５℃〜０℃で30分間行った。つぎに高流量の窒素
ガスでHFを除去した。最後に乾燥エーテルで洗浄するこ
とにより残存するカルボニウムイオンスキャベンジャー
を除去した。
ェーノールのDMF溶液で３回処理しヒスチジンからNim−
ジニトロフェニル基を除去した。最後のBoc基はTFＡで
除去し最終的HF処理の際のメチオニル残基のｔ−ブチル
化を回避した。高低HF操作を用いて切断した。タム（Ta
m）等J.Am.Chem.Soc.105,pp6442（1983）。Pam レジン
上で合成したペプチドに対してパケットにレジンを入れ
たまま、多重HF装置中０℃、２時間かけて低HF処理を行
った。MBHAレジンを用いて合成したペプチドに対しては
一般的反応容器中０℃、２時間かけて低HF処理を行っ
た。Pamレジンペプチドについては24個の反応容器中の
低HF混合物を水流ポンプ、ついで真空ポンプを用いて乾
燥させた。ジメチルスルフィド（低ステップ由来）およ
びHFを除去してから、このペプチドを−５℃〜０℃で30
分間〜１時間、高HF（10％アニソール）処理した。HFは
高流量の窒素ガスで蒸発させた。MBHAレジンの入ったバ
ッグを含む低HF反応容器は廃液容器中に低HF混合物中の
液体を注ぎ出すことで空にした。そのバッグを直ちに冷
エーテル、つづいてCH2Cl2、DMF、CH2Cl2、IPA、CH2Cl2
の順で洗浄した。このパケットを乾燥し、スキャベンジ
ャーとして0.7mlのアニソールを用い24連HF装置の各チ
ューブに入れた。−70℃で乾燥フッ化水素を凝縮させて
高HF処理を行った。反応は−10℃で１時間行ない、つづ
いて−５℃〜０℃で30分間行った。つぎに高流量の窒素
ガスでHFを除去した。最後に乾燥エーテルで洗浄するこ
とにより残存するカルボニウムイオンスキャベンジャー
を除去した。
つづいて10％の酢酸で粗ペプチドを抽出した後ベック
マン−アルテクモデル421HPLCシステムおよび２つのモ
デル110Aポンプを用いた分析用逆相カラム（ヴィダック
ODS25cm×4.6mm）によるRP−HPLCで分画した。溶媒系に
は流速1.0ml/minで、バッファA0.05％TFA/H2O、および
バッファＢ、0.05％TFA/CH3CNを用いた。ペプチドは日
立100−20スペクトロフォトメーターを用い215nmで検出
した。
マン−アルテクモデル421HPLCシステムおよび２つのモ
デル110Aポンプを用いた分析用逆相カラム（ヴィダック
ODS25cm×4.6mm）によるRP−HPLCで分画した。溶媒系に
は流速1.0ml/minで、バッファA0.05％TFA/H2O、および
バッファＢ、0.05％TFA/CH3CNを用いた。ペプチドは日
立100−20スペクトロフォトメーターを用い215nmで検出
した。
このペプチドの精製はCH3CNと0.05％TFAで作った溶出
勾配を用いたヴィダックC18（22mm×25cm）10μｍパッ
キングカラムの逆相HPLCで行った。アミノ酸分析は定常
的（沸騰）6NHCl中での100℃、24時間のペプチドの加水
分解につづくベックマン6300分析機で行った。これらの
分析値は理論値の±10％の範囲にあった。
勾配を用いたヴィダックC18（22mm×25cm）10μｍパッ
キングカラムの逆相HPLCで行った。アミノ酸分析は定常
的（沸騰）6NHCl中での100℃、24時間のペプチドの加水
分解につづくベックマン6300分析機で行った。これらの
分析値は理論値の±10％の範囲にあった。
例２−抗微生物検定 抗微生物検定は96穴組織培養プレートで行った。LB培
地（大腸菌（Escherichia coli）およびスタフィロコッ
カス エピデルミス（Staphylococcus epidermis））ま
たはYTB培地（カンディダ・アルビカンス（Candida alb
icans））に懸濁した所定の微生物を各ウェル中でイン
キュベートした。ペプチドまたはそれらの欠失アナログ
（１×PBS、pH7.0に溶解した）を加えて各ウェルの最終
的細胞密度を1.0×106コロニー形成単位（CFU）/mlとし
た。使用した最終的ペプチド濃度は各々100μg/ml、75.
0μg/ml、50μg/ml、25μm/ml、および10μm/mlであっ
た。しかしC.アルビカンス（albicans）に対しては500
μg/mlまでの濃度を用いた。
地（大腸菌（Escherichia coli）およびスタフィロコッ
カス エピデルミス（Staphylococcus epidermis））ま
たはYTB培地（カンディダ・アルビカンス（Candida alb
icans））に懸濁した所定の微生物を各ウェル中でイン
キュベートした。ペプチドまたはそれらの欠失アナログ
（１×PBS、pH7.0に溶解した）を加えて各ウェルの最終
的細胞密度を1.0×106コロニー形成単位（CFU）/mlとし
た。使用した最終的ペプチド濃度は各々100μg/ml、75.
0μg/ml、50μg/ml、25μm/ml、および10μm/mlであっ
た。しかしC.アルビカンス（albicans）に対しては500
μg/mlまでの濃度を用いた。
ウェルへのペプチドの添加を時間ゼロとする。６時間
後にプレートをタイターテク・マルチスキャン装置に入
れOD620を測定した。このプレートおよび最初の接種物
を37℃でインキュベートした。
後にプレートをタイターテク・マルチスキャン装置に入
れOD620を測定した。このプレートおよび最初の接種物
を37℃でインキュベートした。
プレート当り５個のウェルには培地のみを入れた。一
方別の５個のウェルには培地と細胞を入れた。これらの
コントロールは培地汚染の可能性の除外および微生物の
非阻害増殖の尺度に用いた。大腸菌またはS.エピデルミ
ス（epidermis）に関する上述の種々の濃度のペプチド
またはその欠失アナログを含むウェルの1/（光学密度変
化）の値を第１図および第２図に示した。第１図はマガ
イニンＩまたはその欠失アナログ、またはマガイニンII
またはその欠失アナログと大腸菌を含むウェルに関する
1/（光学密度変化）の測定値のグラフである。第1a図は
マガイニンＩ（Ｘで示されている）およびその欠失アナ
ログに関するグラフであり（アミノ酸残基23を欠失する
欠失アナログはテストしなかった）、第1b図は、マガイ
ニンII（Ｘ示されている）およびの欠失アナログに関す
るグラフである。両グラフともＺは培地＋細胞のコント
ロールである。
方別の５個のウェルには培地と細胞を入れた。これらの
コントロールは培地汚染の可能性の除外および微生物の
非阻害増殖の尺度に用いた。大腸菌またはS.エピデルミ
ス（epidermis）に関する上述の種々の濃度のペプチド
またはその欠失アナログを含むウェルの1/（光学密度変
化）の値を第１図および第２図に示した。第１図はマガ
イニンＩまたはその欠失アナログ、またはマガイニンII
またはその欠失アナログと大腸菌を含むウェルに関する
1/（光学密度変化）の測定値のグラフである。第1a図は
マガイニンＩ（Ｘで示されている）およびその欠失アナ
ログに関するグラフであり（アミノ酸残基23を欠失する
欠失アナログはテストしなかった）、第1b図は、マガイ
ニンII（Ｘ示されている）およびの欠失アナログに関す
るグラフである。両グラフともＺは培地＋細胞のコント
ロールである。
第２図はマガイニンＩまたはマガイニンIIまたはそれ
らの欠失アナログとS.エピデルミス（epidermis）を含
むウェルに関する1/（光学密度変化）の測定値のグラフ
である。第2a図はマガイニン１（Ｘで示されている）お
よびその欠失アナログに関するグラフであり（アミノ酸
残基23を欠失する欠失アナログはテストしていない）、
第2b図はマガイニンII（Ｘで示されている）およびその
欠失アナログに関するグラフである。両グラフともＺは
培地＋細胞のコントロールである。マガイニンＩおよび
マガイニンIIおよびそれらの欠失アナログに関して測定
した1/（光学密度変化）の測定値は大腸菌およびS.エピ
デルミス（epidermis）に対するそれらの効果の測定値
と相関関係がある。
らの欠失アナログとS.エピデルミス（epidermis）を含
むウェルに関する1/（光学密度変化）の測定値のグラフ
である。第2a図はマガイニン１（Ｘで示されている）お
よびその欠失アナログに関するグラフであり（アミノ酸
残基23を欠失する欠失アナログはテストしていない）、
第2b図はマガイニンII（Ｘで示されている）およびその
欠失アナログに関するグラフである。両グラフともＺは
培地＋細胞のコントロールである。マガイニンＩおよび
マガイニンIIおよびそれらの欠失アナログに関して測定
した1/（光学密度変化）の測定値は大腸菌およびS.エピ
デルミス（epidermis）に対するそれらの効果の測定値
と相関関係がある。
ペプチドの活性度は欠失アナログの阻害的増殖をコン
トロール細胞の非阻害的増殖と６時間以上に渡って比較
することにより決定した。それらのペプチドおよびそれ
らの欠失アナログ各々の増殖阻害効果を以下の第１表に
示した。第１表にリストしてあるM1CはＣ末端カルボキ
シル型（カルボキシル末端）マガイニンＩであり、一
方、M2AはＣ末端アミド型（アミド末端）マガイニンII
である。各M1CまたはM2Aの後の文字および数字コードは
マガイニンＩ（カルボキシル末端）またはマガイニンII
（アミド末端）の特定の欠失アナログから欠失したアミ
ノ酸残基を示している。
トロール細胞の非阻害的増殖と６時間以上に渡って比較
することにより決定した。それらのペプチドおよびそれ
らの欠失アナログ各々の増殖阻害効果を以下の第１表に
示した。第１表にリストしてあるM1CはＣ末端カルボキ
シル型（カルボキシル末端）マガイニンＩであり、一
方、M2AはＣ末端アミド型（アミド末端）マガイニンII
である。各M1CまたはM2Aの後の文字および数字コードは
マガイニンＩ（カルボキシル末端）またはマガイニンII
（アミド末端）の特定の欠失アナログから欠失したアミ
ノ酸残基を示している。
また粗マガイニンＩおよびマガイニンIIならびに粗欠
失アナログ調製物の抗微生物活性は実験誤差の範囲で精
製したマガイニンＩおよびマガイニンIIならびにそれら
の欠失アナログの活性と同じであった。
失アナログ調製物の抗微生物活性は実験誤差の範囲で精
製したマガイニンＩおよびマガイニンIIならびにそれら
の欠失アナログの活性と同じであった。
先の第１表ならびに第１図および第２図に示されてい
るよるようにＮ末端領域（アミノ酸１〜14）にペプチド
欠失を有するアナログは大腸菌およびS.エピデルミス
（epidermis）に対するペプチドの活性が減少してい
る。マガイニンＩまたはマガイニンIIからのグリシン
（アミノ酸18）またはグルタミン酸（アミノ酸19）の欠
失はそれらの相対的阻害濃度で比較したときマガイニン
ＩおよびマガイニンIIの両方に関して最も活性の高い欠
失アナログを与えた。C.アルビカンス（albicans）に関
し100μg/mlではどの欠失アナログも活性を示さなかっ
たが、400μg/mlでテストした場合、アラニン（アミノ
酸15）が欠失したマガイニンＩの欠失アナログは低いが
有意な活性を示した。
るよるようにＮ末端領域（アミノ酸１〜14）にペプチド
欠失を有するアナログは大腸菌およびS.エピデルミス
（epidermis）に対するペプチドの活性が減少してい
る。マガイニンＩまたはマガイニンIIからのグリシン
（アミノ酸18）またはグルタミン酸（アミノ酸19）の欠
失はそれらの相対的阻害濃度で比較したときマガイニン
ＩおよびマガイニンIIの両方に関して最も活性の高い欠
失アナログを与えた。C.アルビカンス（albicans）に関
し100μg/mlではどの欠失アナログも活性を示さなかっ
たが、400μg/mlでテストした場合、アラニン（アミノ
酸15）が欠失したマガイニンＩの欠失アナログは低いが
有意な活性を示した。
全配列をもつマガイニンＩとマガイニンIIを比較する
とＣ末端アミドを有するペプチドはＣ末端カルボキシ型
のものより活性が高いことが分った。ペプチド濃度25μ
g/mlのマガイニンＩアミド型に関する大腸菌の増殖阻害
は100％であった。しかし、25μg/mlの対応するカルボ
キシ型の増殖阻害はわずか70％であった。マガイニンII
のアミドおよびカルボキシ型に関する大腸菌に対する抗
微生物活性の差はより有意でった。第１表に示すように
マガイニンのＣ末端カルボキシ型は50μg/mlの濃度で10
0％阻害を示したがマガイニンIIのアミド型が100％阻害
を示す濃度は25μg/mlであった。
とＣ末端アミドを有するペプチドはＣ末端カルボキシ型
のものより活性が高いことが分った。ペプチド濃度25μ
g/mlのマガイニンＩアミド型に関する大腸菌の増殖阻害
は100％であった。しかし、25μg/mlの対応するカルボ
キシ型の増殖阻害はわずか70％であった。マガイニンII
のアミドおよびカルボキシ型に関する大腸菌に対する抗
微生物活性の差はより有意でった。第１表に示すように
マガイニンのＣ末端カルボキシ型は50μg/mlの濃度で10
0％阻害を示したがマガイニンIIのアミド型が100％阻害
を示す濃度は25μg/mlであった。
（例３）微生物死滅の速度論 アミド末端マガイニンII、グリシン（アミノ酸18）欠
失アミド末端マガイニンIIおよびグルタミン酸（アミノ
酸19）欠失アミド末端マガイニンIIの溶解ペプチド調製
物を大腸菌（1.0×106CFU/ml）の入った試験管に最終ペ
プチド濃度25μg/mlとなるように加えた。第３図に示し
たように添加後15、30、45および60分の時点で各チュー
ブから10.0μを採取し、LB培地で14倍に希釈した。各
時点でのバクテリア数は10-2、10-3および10-4希釈物1
0.0μをプレーティングして測定した。各時点の各希
釈物のバクテリア数の対数値を計算し、第３図のグラフ
にプロットした。培地のみおよびペプチドなしの２つの
コントロールをインキュペプチドおよび細胞を含むチュ
ーブとともにインキュベートした。使用したチューブお
よび寒天プレートのインキュベーションは37℃で行っ
た。
失アミド末端マガイニンIIおよびグルタミン酸（アミノ
酸19）欠失アミド末端マガイニンIIの溶解ペプチド調製
物を大腸菌（1.0×106CFU/ml）の入った試験管に最終ペ
プチド濃度25μg/mlとなるように加えた。第３図に示し
たように添加後15、30、45および60分の時点で各チュー
ブから10.0μを採取し、LB培地で14倍に希釈した。各
時点でのバクテリア数は10-2、10-3および10-4希釈物1
0.0μをプレーティングして測定した。各時点の各希
釈物のバクテリア数の対数値を計算し、第３図のグラフ
にプロットした。培地のみおよびペプチドなしの２つの
コントロールをインキュペプチドおよび細胞を含むチュ
ーブとともにインキュベートした。使用したチューブお
よび寒天プレートのインキュベーションは37℃で行っ
た。
第３図に示されているように、マガイニンIIの−G18
または−E19欠失アナログとインキュベートした場合、
大腸菌の増殖は速やかに停止した。各々の場合、ペプチ
ド調製物添加後15分以内に全ての大腸菌は死滅した。大
腸菌を完全に死滅させることに関し、完全な配列のアミ
ド末端型マガイニンIIは−G18および−E19欠失アナログ
よりも非常に時間がかかった。このようにアミド末端型
マガイニンIIの−G18および−E19欠失アナログは大腸菌
について非常に高い細胞溶解を行ない得る。
または−E19欠失アナログとインキュベートした場合、
大腸菌の増殖は速やかに停止した。各々の場合、ペプチ
ド調製物添加後15分以内に全ての大腸菌は死滅した。大
腸菌を完全に死滅させることに関し、完全な配列のアミ
ド末端型マガイニンIIは−G18および−E19欠失アナログ
よりも非常に時間がかかった。このようにアミド末端型
マガイニンIIの−G18および−E19欠失アナログは大腸菌
について非常に高い細胞溶解を行ない得る。
（例４）ヒト赤血球の溶血 マガイニンおよびそれらの欠失アナログの溶血活性を
ヒトの赤血球を用いて調べた。10μの血液をPBS等張
バッファ（pH7）に懸濁し、ついでペプチドを添加して
全容量を1mlとした。このサスペンジョンを緩やかに混
合し37℃で30分間インキュベートした。ついで、このサ
ンプルを1000gで５分間遠心し、その上清をペレットか
ら分離して414nmの光学密度を測定した。100％の溶血は
純水中でヒト赤血球を破壊することによ測定した。この
結果を以下の第２表に示す。
ヒトの赤血球を用いて調べた。10μの血液をPBS等張
バッファ（pH7）に懸濁し、ついでペプチドを添加して
全容量を1mlとした。このサスペンジョンを緩やかに混
合し37℃で30分間インキュベートした。ついで、このサ
ンプルを1000gで５分間遠心し、その上清をペレットか
ら分離して414nmの光学密度を測定した。100％の溶血は
純水中でヒト赤血球を破壊することによ測定した。この
結果を以下の第２表に示す。
先の第２表に示したようにアミド末端型マガイニンII
は50μg/mlで２％の溶血を起したが、カルボキシ末端型
マガイニンＩは50μg/mlの濃度で１％の溶血を示した。
マガイニンＩおよびマガイニンIIとも25μg/mlの濃度で
はヒトの赤血球の溶解は起こさなかった。マガイニンＩ
およびマガイニンII両方の−G18および−E19欠失アナロ
グは例２の抗微生物検定で示された最小阻害濃度である
10μg/mlで溶血活性を示さなかった。
は50μg/mlで２％の溶血を起したが、カルボキシ末端型
マガイニンＩは50μg/mlの濃度で１％の溶血を示した。
マガイニンＩおよびマガイニンIIとも25μg/mlの濃度で
はヒトの赤血球の溶解は起こさなかった。マガイニンＩ
およびマガイニンII両方の−G18および−E19欠失アナロ
グは例２の抗微生物検定で示された最小阻害濃度である
10μg/mlで溶血活性を示さなかった。
また第２表に示されているようにマガイニンＩの欠失
アナログ中アミノ酸15乃至22のいずれか１つが欠失して
いるものは100および75μg/mlの濃度で溶血活性の減少
が見られた。50μg/mlではマガイニンＩの欠失アナログ
中アミノ酸16、18、19、20、21または22のいずれか１つ
が欠失しているものに溶血活性の減少が見られた。マガ
イニンIIの欠失アナログについても100、75および50μg
/mlの濃度でアミノ酸16、17、19、20、21または22のい
ずれか１つが欠失しているものに溶血活性の減少が見ら
れた。
アナログ中アミノ酸15乃至22のいずれか１つが欠失して
いるものは100および75μg/mlの濃度で溶血活性の減少
が見られた。50μg/mlではマガイニンＩの欠失アナログ
中アミノ酸16、18、19、20、21または22のいずれか１つ
が欠失しているものに溶血活性の減少が見られた。マガ
イニンIIの欠失アナログについても100、75および50μg
/mlの濃度でアミノ酸16、17、19、20、21または22のい
ずれか１つが欠失しているものに溶血活性の減少が見ら
れた。
したがってマガイニンＩおよびIIのこれらの欠失アナ
ログはマガイニンＩおよびマガイニンIIよりもヒトの赤
血球の溶血を起こさないことが分った。つまりマガイニ
ンＩまたはマガイニンIIよりも大きい抗微生物活性を示
すが、赤血球の溶血活性は小さい特定の欠失アナログを
用いることが望ましい。
ログはマガイニンＩおよびマガイニンIIよりもヒトの赤
血球の溶血を起こさないことが分った。つまりマガイニ
ンＩまたはマガイニンIIよりも大きい抗微生物活性を示
すが、赤血球の溶血活性は小さい特定の欠失アナログを
用いることが望ましい。
（例５）多重ペプチド欠失を有するマガイニンＩのアミ
ド末端型欠失アナログに関する大腸菌の有効な増殖阻害 先に述べた同時多重ペプチド合成法を用いてアミド末
端型マガイニンＩの欠失アナログを合成した。この例で
使用するために合成したペプチドはアミノ酸残基23を欠
失しているもの、アミノ酸残基22および23を欠失してい
るもの、アミノ酸残基21、22および23を欠失しているも
の、および同様にしてアミノ酸残基17乃至23を欠失して
いるものまでのペプチドである。
ド末端型欠失アナログに関する大腸菌の有効な増殖阻害 先に述べた同時多重ペプチド合成法を用いてアミド末
端型マガイニンＩの欠失アナログを合成した。この例で
使用するために合成したペプチドはアミノ酸残基23を欠
失しているもの、アミノ酸残基22および23を欠失してい
るもの、アミノ酸残基21、22および23を欠失しているも
の、および同様にしてアミノ酸残基17乃至23を欠失して
いるものまでのペプチドである。
つぎに各ペプチドを組織培養ペプチドのウェル中、LB
培地に懸濁した大腸菌とインキュベートした。欠失アナ
ログを添加する際（１×PBS、pH7.0に溶解したもの）、
各ウェルには最終細胞密度1.0×106コロニー形成単位/m
lのものが入っている。ウェルへのペプチドの添加時を
時間ゼロとする。採用した最終ペプチド濃度は100μg/m
l、75.0μg/ml、50.0μg/mlおよび25μg/mlである。こ
のペプチドを大腸菌と37℃で６時間インキュベートし
た。６時間後にこのプレートをタイターテク・マルチス
キャン装置に入れOD620を測定した。
培地に懸濁した大腸菌とインキュベートした。欠失アナ
ログを添加する際（１×PBS、pH7.0に溶解したもの）、
各ウェルには最終細胞密度1.0×106コロニー形成単位/m
lのものが入っている。ウェルへのペプチドの添加時を
時間ゼロとする。採用した最終ペプチド濃度は100μg/m
l、75.0μg/ml、50.0μg/mlおよび25μg/mlである。こ
のペプチドを大腸菌と37℃で６時間インキュベートし
た。６時間後にこのプレートをタイターテク・マルチス
キャン装置に入れOD620を測定した。
ペプチドの活性度は６時間に渡り大腸菌の増殖を阻害
する相対能力に関し本来の配列のものと欠失アナログを
比較することにより測定した。各ペプチドの効果的増殖
阻害を以下の第３表にリストした。第３表において各ペ
プチドの末端にある“B"マガイニンＩ欠失アナログのア
ミド末端を示している。
する相対能力に関し本来の配列のものと欠失アナログを
比較することにより測定した。各ペプチドの効果的増殖
阻害を以下の第３表にリストした。第３表において各ペ
プチドの末端にある“B"マガイニンＩ欠失アナログのア
ミド末端を示している。
先に述べたようにマガイニンＩおよびマガイニンIIの
両方ともα−ヘリックス構造をとっていると推定され
る。ペプチドの構造と生物学的活性の関係を決定するの
にいくつかの方法が使われている。本発明はいかなる理
論によっても制限を受けることはないが、構造−活性の
関係を研究するより一般的な基礎を提供する１つの方法
はこのペプチド鎖中の単一アミノ酸残基の欠失によるも
のである。ペプチド鎖に沿ったアミノ酸残基の欠失はこ
のペプチド鎖のバッグボーンを短縮し、したがって側鎖
を新しい空間的配向への導くことから、α−ヘリックス
が誘導される場合そのようなアナログは新しい構造をと
らざるを得ない。したがってより安定な両親媒性構造を
取りやすくするようにバッグボーンを短縮する欠失は生
物学的に活性なペプチドを設計する上で重要な因子とな
り得る。ペプチドの構造と動力学を測定するための物理
学的方向はたくさんあるが、明らかに、これらの分子に
行ない得る最も重要なテストはそれらの生物学的活性に
関するものである。
両方ともα−ヘリックス構造をとっていると推定され
る。ペプチドの構造と生物学的活性の関係を決定するの
にいくつかの方法が使われている。本発明はいかなる理
論によっても制限を受けることはないが、構造−活性の
関係を研究するより一般的な基礎を提供する１つの方法
はこのペプチド鎖中の単一アミノ酸残基の欠失によるも
のである。ペプチド鎖に沿ったアミノ酸残基の欠失はこ
のペプチド鎖のバッグボーンを短縮し、したがって側鎖
を新しい空間的配向への導くことから、α−ヘリックス
が誘導される場合そのようなアナログは新しい構造をと
らざるを得ない。したがってより安定な両親媒性構造を
取りやすくするようにバッグボーンを短縮する欠失は生
物学的に活性なペプチドを設計する上で重要な因子とな
り得る。ペプチドの構造と動力学を測定するための物理
学的方向はたくさんあるが、明らかに、これらの分子に
行ない得る最も重要なテストはそれらの生物学的活性に
関するものである。
マガイニンＩとマガイニンIIと欠失アナログとの比較
はマガイニンＩとマガイニンIIのＮ末端がそれらの抗微
生物活性に重要であることを示している。例２および第
１表に示されているように残基１〜14の欠失はどれもが
抗生作用に関しネガチィブな効果を有していることが分
った。もしマガイニンペプチドが微生物の脂質膜と接触
して両親媒的構造をとるならそれらのペプチドが本来の
バッグボーンを維持する必要性および、または構造的配
置を示す必要性があると考えられる。しかし、マガイニ
ンＩおよびマガイニンIIアミド型の一連の欠失アナログ
によって示される抗微生物性はわずかに異なっている。
このことはマガイニンIIのより大きい活性を示した以前
の報告と一致しているようである。ザスロフ（Zaslof
f）,M.,Proc.Notl.Acad.Sci.84,pp 5449−5453（198
7）。ここで示されているデータによって証明されてい
るようにマガイニンＩおよびマガイニンII中のセリン
（アミノ酸残基８）、アラニン（アミノ酸残基９）、グ
リシン（アミノ酸残基13）または効果は小さいがグリシ
ン（アミノ酸残基３）の欠失は第１表に示されているよ
うに大腸菌に対して異なった活性を示した。S.エピデル
ミス（epidermis）についてはマガイニンＩおよびマガ
イニンIIのＮ末端欠失アナログ（残基１−14）間に抗微
生物活性に関する実質的差はなかった。
はマガイニンＩとマガイニンIIのＮ末端がそれらの抗微
生物活性に重要であることを示している。例２および第
１表に示されているように残基１〜14の欠失はどれもが
抗生作用に関しネガチィブな効果を有していることが分
った。もしマガイニンペプチドが微生物の脂質膜と接触
して両親媒的構造をとるならそれらのペプチドが本来の
バッグボーンを維持する必要性および、または構造的配
置を示す必要性があると考えられる。しかし、マガイニ
ンＩおよびマガイニンIIアミド型の一連の欠失アナログ
によって示される抗微生物性はわずかに異なっている。
このことはマガイニンIIのより大きい活性を示した以前
の報告と一致しているようである。ザスロフ（Zaslof
f）,M.,Proc.Notl.Acad.Sci.84,pp 5449−5453（198
7）。ここで示されているデータによって証明されてい
るようにマガイニンＩおよびマガイニンII中のセリン
（アミノ酸残基８）、アラニン（アミノ酸残基９）、グ
リシン（アミノ酸残基13）または効果は小さいがグリシ
ン（アミノ酸残基３）の欠失は第１表に示されているよ
うに大腸菌に対して異なった活性を示した。S.エピデル
ミス（epidermis）についてはマガイニンＩおよびマガ
イニンIIのＮ末端欠失アナログ（残基１−14）間に抗微
生物活性に関する実質的差はなかった。
重要なアミノ酸残基の欠失によるＮ末端マガイニンＩ
アナログのヘリックス性の破壊はそれらの微生物膜との
相互作用能の減少から予測し得る。一般にマガイニンII
のＮ末端欠失アナログはマガイニンＩアナログのＮ末端
欠失に見られる活性の減少は起こさずこれを保持し得
る。Ｎ末端領域における唯一の差はマガイニンIIにおけ
るグリシンのリジンによる置換なので、強いα−ヘリッ
クス誘導残基であるリジンはマガイニンIIの安定化に関
する重要なアミノ酸であると考えられる。
アナログのヘリックス性の破壊はそれらの微生物膜との
相互作用能の減少から予測し得る。一般にマガイニンII
のＮ末端欠失アナログはマガイニンＩアナログのＮ末端
欠失に見られる活性の減少は起こさずこれを保持し得
る。Ｎ末端領域における唯一の差はマガイニンIIにおけ
るグリシンのリジンによる置換なので、強いα−ヘリッ
クス誘導残基であるリジンはマガイニンIIの安定化に関
する重要なアミノ酸であると考えられる。
両タイプのアナログのＣ末端領域についてはアミノ酸
残基欠失後の活性を維持する傾向はより大きい。しかし
Ｃ末端アナログは大腸菌およびS.エピルデルミス（epid
ermis）に対して活性の失なわせるＮ末端とは反対にい
くらかの種選択性を示す。マガイニンＩおよびマガイニ
ンIIの両Ｃ末端における欠失アナログで処理した場合大
腸菌はS.エピデルミス（epidermis）より感受性が高
い。
残基欠失後の活性を維持する傾向はより大きい。しかし
Ｃ末端アナログは大腸菌およびS.エピルデルミス（epid
ermis）に対して活性の失なわせるＮ末端とは反対にい
くらかの種選択性を示す。マガイニンＩおよびマガイニ
ンIIの両Ｃ末端における欠失アナログで処理した場合大
腸菌はS.エピデルミス（epidermis）より感受性が高
い。
マガイニンII中の疎水性残基であるフェニルアラニン
（アミノ酸残基16）またはバリン（アミノ酸残基17）は
大腸菌およびS.エピデルミス（epidermis）の両種に対
する抗微生物活性を減少させる最も重要な修正であると
考える。合成マガイニンＩのイソロイシン20欠失アナロ
グをテストしたときS.エピデルミス（epidermis）に対
する活性は見られなかったが大腸菌の増殖の完全な阻害
には75μg/mlのイソロイシン20の欠失アナログが必要で
あった。マガイニンＩおよびマガイニンIIの両方におい
てそれらの位置に疎水性残基が保存される必要がある。
フェニルアラニン16、バリンまたはイソロイシン20の欠
失に関するより低いまたは完全な抗微生物活性のロスは
マガイニンペプチドがバクテリア膜のリポ多糖と相互作
用する上でこれらのアミノ酸から提供される疎水性を必
要とすることを示している。もっともこの理論が本発明
の範囲を制限することはない。カルボキシ末端領域にお
けるマガイニンＩとマガイニンIIのわずかな差は部位22
のより疎水白Ｎ（アスパラギン）に対するＫ（リジン）
残基の置換である。先の結論はマガイニンIIがマガイニ
ンＩより活性が高い理由を説明している。この結論を支
持する他の観測はＣ末端アミドを有するマガイニンの実
質的により高い活性である。
（アミノ酸残基16）またはバリン（アミノ酸残基17）は
大腸菌およびS.エピデルミス（epidermis）の両種に対
する抗微生物活性を減少させる最も重要な修正であると
考える。合成マガイニンＩのイソロイシン20欠失アナロ
グをテストしたときS.エピデルミス（epidermis）に対
する活性は見られなかったが大腸菌の増殖の完全な阻害
には75μg/mlのイソロイシン20の欠失アナログが必要で
あった。マガイニンＩおよびマガイニンIIの両方におい
てそれらの位置に疎水性残基が保存される必要がある。
フェニルアラニン16、バリンまたはイソロイシン20の欠
失に関するより低いまたは完全な抗微生物活性のロスは
マガイニンペプチドがバクテリア膜のリポ多糖と相互作
用する上でこれらのアミノ酸から提供される疎水性を必
要とすることを示している。もっともこの理論が本発明
の範囲を制限することはない。カルボキシ末端領域にお
けるマガイニンＩとマガイニンIIのわずかな差は部位22
のより疎水白Ｎ（アスパラギン）に対するＫ（リジン）
残基の置換である。先の結論はマガイニンIIがマガイニ
ンＩより活性が高い理由を説明している。この結論を支
持する他の観測はＣ末端アミドを有するマガイニンの実
質的により高い活性である。
マガイニンＩおよびマガイニンIIそのものと比べて低
い赤血球の溶血作用を示す欠失アナロググリシン18およ
びグルタミン酸19の高い抗微生物活性はこれら２つのア
ナログを臨床的応用への良い候補者としている。両マガ
イニンのグリシン18欠失アナログによって示される強い
抗微生物活性はヘリックス形成に関して能力の低いグリ
シンの欠失で説明し得る。一方、ほとんどポジティブに
帯電しているペプチドかネガティブに帯電しているアミ
ノ酸残基グルタミン酸19の欠失が問題となる。おそらく
このネガティブに帯電したアミノ酸残基の除去はバクテ
リアのネガティブに帯電しているリポ多糖層との相互作
用を容易にしているのであろう。本来のマガイニンと比
べた活性の増加および赤血球溶解の減少はこの欠失アナ
ログを臨床的応用において非常に重要なものとしてい
る。またメチオニンを欠失した欠失アナログでこのペプ
チドのよりよい安定性と保存性が得られた。
い赤血球の溶血作用を示す欠失アナロググリシン18およ
びグルタミン酸19の高い抗微生物活性はこれら２つのア
ナログを臨床的応用への良い候補者としている。両マガ
イニンのグリシン18欠失アナログによって示される強い
抗微生物活性はヘリックス形成に関して能力の低いグリ
シンの欠失で説明し得る。一方、ほとんどポジティブに
帯電しているペプチドかネガティブに帯電しているアミ
ノ酸残基グルタミン酸19の欠失が問題となる。おそらく
このネガティブに帯電したアミノ酸残基の除去はバクテ
リアのネガティブに帯電しているリポ多糖層との相互作
用を容易にしているのであろう。本来のマガイニンと比
べた活性の増加および赤血球溶解の減少はこの欠失アナ
ログを臨床的応用において非常に重要なものとしてい
る。またメチオニンを欠失した欠失アナログでこのペプ
チドのよりよい安定性と保存性が得られた。
上述の内容から本発明の多くの修正形および変化形が
可能である。つまり以下の請求の範囲内で特に述べられ
ている事以外でも本発明を実施し得る。
可能である。つまり以下の請求の範囲内で特に述べられ
ている事以外でも本発明を実施し得る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 国際公開88／6597（ＷＯ，Ａ１) Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．２（1988）ｐ．81− 86 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉ ｃ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．85，Ｎｏ．３ （1988）ｐ．910−913 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (34)
- 【請求項１】１文字アミノ酸コードを用い、かつ各アミ
ノ酸の下の数字でペプチド中の残基の位置を示した以下
の構造式： で表されるマガイニンＩで、アミノ酸15乃至22のうち少
なくとも１つが欠失したアミド末端型またはカルボキシ
末端型マガイニンＩの欠失アナログ。 - 【請求項２】アミノ酸15、16、18、19、21および22のう
ちの少なくとも１つが欠失した請求の範囲第１項記載の
マガイニンＩの欠失アナログ。 - 【請求項３】少なくともアミン酸18が欠失した請求の範
囲第２項記載のマガイニンＩの欠失アナログ。 - 【請求項４】少なくともアミノ酸19が欠失した請求の範
囲第２項記載のマガイニンＩの欠失アナログ。 - 【請求項５】少なくともアミノ酸21が欠失した請求の範
囲第２項記載のマガイニンＩの欠失アナログ。 - 【請求項６】少なくともアミノ酸22が欠失した請求の範
囲第２項記載のマガイニンＩの欠失アナログ。 - 【請求項７】アミノ酸18のみが欠失した請求の範囲第３
項記載のマガイニンＩの欠失アナログ。 - 【請求項８】アミノ酸19のみが欠失した請求の範囲第４
項記載のマガイニンＩの欠失アナログ。 - 【請求項９】アミノ酸21のみが欠失した請求の範囲第５
項記載のマガイニンＩの欠失アナログ。 - 【請求項１０】アミド末端型マガイニンＩの欠失アナロ
グである請求の範囲第１項記載のマガイニンＩの欠失ア
ナログ。 - 【請求項１１】カルボキシ末端型マガイニンＩの欠失ア
ナログである請求の範囲第１項記載のマガイニンＩの欠
失アナログ。 - 【請求項１２】請求の範囲第１項に記載される構造式で
表されるマガイニンＩにおいて、アミノ酸21、22および
23が欠失したアミド末端型またはカルボキシ末端型マガ
イニンＩの欠失アナログ。 - 【請求項１３】請求の範囲第１項に記載される構造式で
表されるマガイニンＩにおいて、アミノ酸19、20、21、
22および23が欠失したアミド末端型またはカルボキシ末
端型マガイニンＩの欠失アナログ。 - 【請求項１４】請求の範囲第１項に記載される構造式で
表されるマガイニンＩにおいて、アミノ酸18、19、20、
21、22および23が欠失したアミド末端型またはカルボキ
シ末端型マガイニンＩの欠失アナログ。 - 【請求項１５】請求の範囲第１項に記載される構造式で
表されるマガイニンＩにおいて、アミノ酸17、18、19、
20、21、22および23が欠失したアミド末端型またはカル
ボキシ末端型マガイニンＩの欠失アナログ。 - 【請求項１６】１文字アミノ酸コードを用い、かつ各ア
ミノ酸の下の数字でペプチド中の残基の位置を示した以
下の構造式： で表されるマガイニンIIで、アミノ酸15乃至22のうち少
なくとも１つが欠失したアミド末端型またはカルボキシ
末端型マガイニンIIの欠失アナログ。 - 【請求項１７】アミノ酸15、18、19、20、21及び22のう
ち少なくとも１つが欠失した請求の範囲第16項記載のマ
ガイニンIIの欠失アナログ。 - 【請求項１８】少なくともアミノ酸18が欠失した請求の
範囲第17項記載のマガイニンIIの欠失アナログ。 - 【請求項１９】少なくともアミノ酸19が欠失した請求の
範囲第17項記載のマガイニンIIの欠失アナログ。 - 【請求項２０】少なくともアミノ酸21が欠失した請求の
範囲第17項記載のマガイニンIIの欠失アナログ。 - 【請求項２１】少なくともアミノ酸22が欠失した請求の
範囲第17項記載のマガイニンIIの欠失アナログ。 - 【請求項２２】アミノ酸18のみが欠失した請求の範囲第
18項記載のマガイニンIIの欠失アナログ。 - 【請求項２３】アミノ酸19のみが欠失した請求の範囲第
19項記載のマガイニンIIの欠失アナログ。 - 【請求項２４】アミノ酸21のみが欠失した請求の範囲第
20項記載のマガイニンIIの欠失アナログ。 - 【請求項２５】アミノ酸22のみが欠失した請求の範囲第
21項記載のマガイニンIIの欠失アナログ。 - 【請求項２６】アミド末端型マガイニンIIの欠失アナロ
グである請求の範囲第16項記載のマガイニンIIの欠失ア
ナログ。 - 【請求項２７】請求の範囲第１項記載のマガイニンＩの
欠失アナログを含有する抗微生物剤。 - 【請求項２８】請求の範囲第１項記載のマガイニンＩの
欠失アナログを含有する抗ウィルス剤。 - 【請求項２９】請求の範囲第１項記載のマガイニンＩの
欠失アナログを含有する抗腫瘍剤。 - 【請求項３０】請求の範囲第１項記載のマガイニンＩの
欠失アナログ含有する殺精子剤。 - 【請求項３１】請求の範囲第16項記載のマガイニンIIの
欠失アナログを含有する抗微生物剤。 - 【請求項３２】請求の範囲第16項記載のマガイニンIIの
欠失アナログを含有する抗ウィルス剤。 - 【請求項３３】請求の範囲第16項記載のマガイニンIIの
欠失アナログを含有する抗腫瘍剤。 - 【請求項３４】請求の範囲第16項記載のマガイニンIIの
欠失アナログを含有する殺精子剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US281,981 | 1988-12-09 | ||
| US07/281,981 US4962277A (en) | 1988-12-09 | 1988-12-09 | Deletion analogues of magainin peptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04502159A JPH04502159A (ja) | 1992-04-16 |
| JP2927539B2 true JP2927539B2 (ja) | 1999-07-28 |
Family
ID=23079584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2501857A Expired - Lifetime JP2927539B2 (ja) | 1988-12-09 | 1989-12-05 | マガイニンペプチドの欠失アナログ |
Country Status (9)
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|---|---|
| US (1) | US4962277A (ja) |
| EP (1) | EP0451190B1 (ja) |
| JP (1) | JP2927539B2 (ja) |
| KR (1) | KR0149015B1 (ja) |
| AT (1) | ATE121755T1 (ja) |
| CA (1) | CA2004991C (ja) |
| DE (1) | DE68922405T2 (ja) |
| ES (1) | ES2071815T3 (ja) |
| WO (1) | WO1990006129A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| SE469132B (sv) * | 1989-06-16 | 1993-05-17 | Kabigen Ab | Polypeptider och farmaceutisk komposition innehaallande denna |
| US5912231A (en) * | 1989-07-07 | 1999-06-15 | Scripps Clinic And Research Foundation | Substitution analogues of magainin peptides |
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| US5585353A (en) * | 1990-02-02 | 1996-12-17 | The Rockefeller University | Antibiotic peptides containing D-amino acids |
| US5792831A (en) * | 1990-02-08 | 1998-08-11 | Magainin Pharmaceuticals Inc. | Analogues of magainin peptides containing D-amino acids |
| US5459237A (en) * | 1990-02-08 | 1995-10-17 | Magainin Pharmaceuticals Inc. | Peptide compositions and uses therefor |
| US5221664A (en) * | 1990-04-23 | 1993-06-22 | Magainin Pharmaaceuticals Inc. | Composition and treatment with biologically active peptides and toxic cations |
| US5208220A (en) * | 1990-06-27 | 1993-05-04 | Magainin Pharmaceuticals, Inc. | Composition and treatment with biologically active peptides and antibiotics which inhibit DNA gyrase |
| ATE308562T1 (de) * | 1990-08-10 | 2005-11-15 | Virtual Drug Dev Inc | Antimikrobielle peptide wirksam gegen pflanzenpathogene, ihre verwendung und auf sie bezogene nachweismethoden |
| US5235038A (en) * | 1991-01-22 | 1993-08-10 | Torry Pines Institute For Molecular Studies | Deletion and substitution analogues of melittin peptide |
| WO1992017195A1 (en) * | 1991-04-08 | 1992-10-15 | Magainin Pharmaceuticals, Inc. | Novel peptide compositions and uses therefor |
| US5225399A (en) * | 1991-04-15 | 1993-07-06 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Antimicrobial amphiphilic peptides |
| US5239059A (en) * | 1991-05-10 | 1993-08-24 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Ion-channel forming peptides |
| EP0671930A4 (en) * | 1991-07-25 | 1996-02-07 | Magainin Pharma | PROPHYLAXIS AND TREATMENT OF HEALTH DAMAGE TO DENTAL HYGIENE BY BIOLOGICALLY ACTIVE PEPTIDES. |
| US5885965A (en) * | 1991-11-01 | 1999-03-23 | Periodontix, Inc. | Anti-fungal D-amino acid histatin-based peptides |
| AU5081193A (en) * | 1992-08-31 | 1994-03-29 | Magainin Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of gynecological malignancies with biologically active peptides |
| US5424290A (en) * | 1992-10-26 | 1995-06-13 | Magainin Pharmaceuticals Inc. | Biologically active peptides and uses therefor |
| JPH08507749A (ja) * | 1992-12-03 | 1996-08-20 | マガイニン ファーマシューティカルズ，インク． | 皮膚悪性疾患の生物学的活性を有するペプチドによる治療 |
| US5847047A (en) * | 1993-06-22 | 1998-12-08 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Antimicrobial composition of a polymer and a peptide forming amphiphilic helices of the magainin-type |
| PT725629E (pt) * | 1993-10-25 | 2000-11-30 | Liposome Co Inc | Defensinas em lipossomas |
| US6010861A (en) * | 1994-08-03 | 2000-01-04 | Dgi Biotechnologies, Llc | Target specific screens and their use for discovering small organic molecular pharmacophores |
| US5688489A (en) * | 1995-09-15 | 1997-11-18 | Resolution Pharmaceuticals, Inc. | Non-receptor mediated imaging agents |
| CN114634553B (zh) * | 2022-04-27 | 2024-03-08 | 贵州医科大学 | 阳离子肽c9及其应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
1988
- 1988-12-09 US US07/281,981 patent/US4962277A/en not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-12-05 KR KR1019900701723A patent/KR0149015B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-12-05 EP EP90901287A patent/EP0451190B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-05 WO PCT/US1989/005499 patent/WO1990006129A1/en active IP Right Grant
- 1989-12-05 DE DE68922405T patent/DE68922405T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-12-05 ES ES90901287T patent/ES2071815T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-05 JP JP2501857A patent/JP2927539B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-12-05 AT AT90901287T patent/ATE121755T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-12-08 CA CA002004991A patent/CA2004991C/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．２（１９８８）ｐ．８１−８６ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｉｃ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８５，Ｎｏ．３（１９８８）ｐ．９１０−９１３ |
Also Published As
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|---|---|
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| DE68922405T2 (de) | 1996-01-04 |
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| ES2071815T3 (es) | 1995-07-01 |
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| CA2004991A1 (en) | 1990-06-09 |
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