JPH0449244A - 抗糖尿病剤、動物用抗糖尿病剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明は、抗糖尿病剤、動物用抗ｗＰＸＩｆ病剤に関す
る。

［従来の技術］ 糖尿病は、高血糖を特徴とする人畜共通の疾患である。

大以外の家畜での発生は稀であるが、猫、牛、乳牛、馬
、羊、豚等での発生も報告されている。

糖尿病は、急性的には０渇、冬服、多食、全身倦怠感、
体重減少等の症状を引き起こし、皮膚、尿路、気道なと
の感染症を惹起し、ケト−シス、昏睡に進展させる。慢
性化すると網膜症、腎症、神経障害を合併しやすくなる
。糖尿病性網膜症は失明の最大原因であり、糖尿病性腎
症は寿命を縮め、糖尿病性神！！障害は患者を苦しめる
。

膵臓にあるランゲルハンス島のβ細胞から分泌されるイ
ンスリンは物質代謝の調節に重要な役割を果たしており
、組織でのグルコースの取り込みや酸化、グルコースの
グリコゲン、脂肪への転換を促進し、その結果として血
糖を低下させている。

従って、何らかの原因でインスリンの分泌量が低下する
か、その作用が阻害されると血糖値が上昇して糖尿病に
至る。人間の場合、臨床的には、１回の測定であれ、血
糖値が全血静脈血１８０ｍｇ／ｄλ、全血毛細管血２０
０　ｍ　ｇ　／　ｄ　ＩＬ、血漿静脈血２００　ｍ　ｇ
　／　ｄ　ｔ、血漿毛細管血２２０ｍｇ／ｄｌ１以上で
あれば糖尿病と判断される［１９８７年に南江堂から発
行された、赤沼安夫編集のＣ０ＭＭ−０Ｎ　　ＤＩＳＥ
ＡＳＥ　　５ＥＲＩＥＳＮｏ、１　ｒ糖尿病」の１頁］
。

糖尿病は基本的にＩ型とＩＩ型とに大別される。

■型糖尿病は、ウィルス感染や自己免疫機序により惹起
された膵島炎に起因するインスリン分泌能の低下を基盤
として発症し、従って、治療にインスリン投与を必要と
するインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）に至ることが
多い病型である。

ＩＩ型糖尿病は、遺伝的要素の上に肥満、過食、老化、
薬剤等の環境因子が加わった結果、末梢細胞でのインス
リンの作用が阻害されて発症し、通常は緩徐に進行して
、治療にインスリン投与を必ずしも必要としないインス
リン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）にととまる病型であ
る０人間の場合、疫学的にはＮＩＤＤＭが糖尿病の約９
０％を占めている。

今日、糖尿病の治療方法としては、人間の場合も家畜の
場合も食事療法、運動療法、経口血糖降下剤、インスリ
ン注射療法が病状に応して適宜朝み合わされて用いられ
ている。いずれも体内のインスリン作用が発揮され、全
身の代謝異常が改善され、良好な状態が継続されること
を期待して適用されている。

経口血糖降下剤はＩＤＤＭには無効であり、ＮＩＤＤＭ
で食事療法と運動療法のみては血糖値が十分低下しない
場合にのみ適用されている。現在使用されている経口血
糖降下剤にはスルホニル尿素剤（ＳＵ）とビグアナイド
剤（Ｂ　Ｇ）の２種があり、ＳＵ剤が主流で、ＢＧ剤は
補助的に使用されている。

［発明が解決しようとする課Ｂ］ ＳＵ剤には、しかし、！篤かつ遷延性の低血糖症を惹起
するという重大な問題点があり、しかも、この低血糖症
は過剰投与のみならず、不規則な食事、運動、肝Ｗ＆障
害、腎臓障害、他剤との併用によっても引き起こされる
ので、使用が極めて困難である。加えて、胃１１１Ｆｔ
害、肝機能障害、肝性ポルフィリン症、過敏症状、血液
疾患等の副作用がある［１９８６年に履用書店から発行
された、日本公定書協会監修の「第１１改正日本薬局方
解説書」のＣ−６９〜Ｃ−７０頁］。又、犬の糖尿病に
はほとんど無効であり、しかも大に対しては肝要性が強
い［１９Ｂ９年に養賢堂から出版された吐山豐秋著「家
畜薬理学」の２４８頁コ。

ＢＧ剤はＳＵ剤の効果が不十分な場合や、副作用のため
にＳＵ剤が使用できない場合や、インスリン療法が不可
能な場合に限って使用されている薬剤である。これは、
ＢＧが乳酸アシド−シスという重篤な合併症を引き起こ
すことがあるので、その使用に厳しい制限がつけられて
いることによる。［１９８６年に講談社から発行された
、日本糖尿病学会扁集の「糖尿病の臨床」の７１−１３
１頁コ。又、ＢＧ剤は人間のみに投与されている［前掲
の「家畜薬理学」の２４８頁］。

かかる現状に鑑み、本発明は、抗糖尿病効果が高くて副
作用が少なく、従って化学療法係数が高く、かつ、生産
コストが低く、しかも、経口、経皮、注射での投与が可
能な、大量に供給可能な新規な抗糖尿病剤、動物用抗糖
尿病を提供するために完成されたものである。

［ｆｆ題を解決するための手段］ 本発明により、ＬＰＳを含む抗糖尿病剤、動物用抗糖尿
病剤が提供される。この抗糖尿病剤、動物用抗糖尿病剤
には、 インビトロで培養されるマクロファージのＴＮＦ産生能
を活性化するＬＰＳのマクロファージ活性化能を指標と
し、 縦軸に、そのＬＰＳｌを添加しないときのマクロファー
ジのＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化能を０
％、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大かつ一定の値
（本明細書の他の箇所においては、「最大恒量」と称す
）にする時のＬＰＳのマクロファージ活性化能を１００
％とするマクロファージ活性化能（％）を表し、横軸に
、そのＬＰＳのリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対数
尺で表すシグモイド曲線を描くとき、 マクロファージ活性化能のＥＤｓＩＩを与えるリムラス
テスト陽性ＬＰＳ含有量が０．４〜１１００ｎ／培養液
ｍａであるＬＰＳの少なくとも１種が含まれる。

ここで「少なくとも１種を含む」とは、本発明のＬＰＳ
は各別に使用できることはもちろん、その意図される用
途が阻害されない限り、それらの２種以上を任意に絹み
合わせて、又、更には他のいずれの物質とも鞘み合わせ
て使用できることを意味する。

「マクロファージ」は、免疫担当細胞の一種であり、動
物体内のほとんと全ての細織に分布し、粒子状の異物や
体内の老廃細胞などを捕食して消化する大型のアメーバ
状細胞の総称である。「ＴＮＦＪは、マクロファージに
より産生される腫瘍障害因子（Ｔｕｍｏｒ　　Ｎｅｃｒ
ｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ）の総称でありＥｌ　９８５年に
発行された　ザ　ジャーナル　オブ　バイオロジカルケ
ミストリー（Ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ　　ｏｆＢ　ｉ
　ｏ　１．Ｃｈｅｍ、　、２６０．２３４！５〜２３５
４頁］、マクロファージの活性が高まるにつれてその産
生量は増していく。

「リムラステスト」は、１９６８年にレヴイン（Ｌｅｖ
ｉｎ）により創案された、カブトガニ血球抽出液と発色
合成基質を用いたエンドトキシン定量法である。

本発明の抗糖尿病剤、動物用抗糖尿病剤の活性成分とし
て使用できるＬＰＳは特にその採取源、生産方法、精製
方法を限定されることはない０例えば、細菌や植物から
採取されるＬＰＳであっても、或は合成リピドＡのよう
な合成品でありてもよい、なお、水閘＊１、特にその特
許請求の範囲において、採取源は特に名称で特定された
そのものに限定されることなく、その採取源の成長、保
存、流通の過程て付着、共存するＩＩＭその他の全ての
ものが含まれる。例えば、［小麦ＬＰＳＪと特定された
場合には、小麦そのものから採取されたＬＰＳのみなら
ず、小麦の成長、保存、流通の過程で付着、共存する細
菌その他の全てのものが含まれるものと理解されたい。

なぜならば、特に寄生植物、寄生ｖｉ物という間係が解
明されているもの以外にも、特定の植物、動物、菌界生
物、地衣界生物に、それらにより付着、共存を許された
ものが棲息している例が多く存在し得ることは当業界で
良く知られていることであるからである。

これらＬＰＳのうちから、本発明の抗糖尿病剤、動物用
抗糖尿病剤の活性成分として使用できるＬＰＳを選択す
るには、 インビトロで培養されるマクロファージのＴＮＦ産生能
を活性化するＬＰＳのマクロファージ活性化能を指標と
し、 縦軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロファージ
のＴＮＦ産生置装与えるマクロファージ活性化能を０％
、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大恒量にする時の
ＬＰＳのマクロファージ活性化能を１００％とするマク
ロファージ活性化能（％）を表し、横軸に、そのＬＰＳ
のリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対数尺で表すシグ
モイド曲線を描くとき、 マクロファージ活性化能のＥＤ５０を与えるリムラステ
スト陽性ＬＰＳ含有量が０．４〜１０００ｎ／培養液ｍ
ｉであるものを選択すればよい。

リムラステスト陽性繕ＭＩＩＬＰＳ 従来より知られている大腸菌ＬＰＳ、百日咳菌ＬＰＳ、
リビトＡ等が該当する。

大腸菌ＬＰｓは、例えば、米国デイフコ（Ｄ−１ｆｃｏ
＞社から市販されている。

百日咳菌ＬＰＳは、例えば、フナコシ薬品から市販され
ている。又、公知の百日咳菌、例えば、東浜株Ｉ相菌の
死菌体から、例えば、下記文献記載の公知方法によりｒ
Ｉ４１！することもできる。

ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）等著の［ジエイ、イミ
ュノル（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ　１．）　、？４４．５５　
（１９５５）； ウエストファル（Ｗｅ−ｓｔｐｈａｌ）等著の「ツェト
、ナツールフォルシュ（Ｚ、Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ）
Ｊ、７６．１４８　（１９５２）。

リピドＡは、例えば、第一化学薬品から市販されている
。

リムラステスト陽性Ｍ＃ｆｉＬＰＳ 原料植物として使用できるものを下記に例示する。なお
、本明細書に記載した植物が帰属する科名、厘毛は、次
の文献の記載を照合して決定された。

裸子植物、単子葉類、双子葉類、シダ植物、ソウ類：昭
和５７年（正編）、昭和５８年（続＆りに北隆館から発
行されたｒ原色園芸植物大図１１Ａ）の記載を照合して
所属を決定した。但し、「燕麦」は、昭和４５年に女子
栄養大学出版部から発行された「食用植物図説」と、昭
和６８年に至文京から発行された「新日本植物誌顕花篇
」の記載を照合し、「裸麦」は、昭和４６年に東京同文
會院から発行された「総合食品事典」の記載を照合し、
「鳩麦」、「カラスビシャク」、「ジャノヒゲ」、「ウ
コン」、「マタタビ」、「アマチャヅル」、「ドクダミ
」、「胡椒」、ｒトウガラシ」、「ダイウィキョウ」、
「ダイダイ」、「クズ」、「ナンキンカンゾウ」、「オ
タネニンジン」、「ボウフウ」、「オオツ゛ソラフジ」
、「ウンカリフ・ヒルスタＪは、昭和６３年に北隆館か
ら発行された「原色牧野和漢薬草大図鑑」の記載を照合
し、「アボガド」は、昭和５３年に財団法人農林統計協
会から発行された熱帯農業技術叢書第１５号「ブラジル
の果実」の記載を照合し、「カイワレダイコン」は、昭
和５９年に北隆館から発行された「原色園芸植物大図鑑
」の記載を照合し、「ニクズク」は、昭和４４年に履用
書店から発行された「図説熱帯植物集成」の記載を照合
し、「クロレラ」は、財団法人日本健康食品協会が昭和
６１年に公示した、「クロレラ規格基準」の記載を照合
して所属を決定した。

Ｍ類：昭和６２年に保育社から発行された「原色日本新
菌類図鑑」の記載を照合して所属を決定した。但し、酵
母は、昭和３７年に技報堂から発行された「微生物学ハ
ンドブック」の記載を照合し、「冬虫夏草」は、前掲の
「原色牧野和漢薬草大図鑑」の記載を照合して所属を決
定した。

本発明で使用できる原料植物は、例えば、裸子植物、単
子葉類、双子葉類、シダ植物、ソウ類、菌類の植物であ
り、これらは個別に或は混合して使用できる。

裸子植物としては、例えば、マツ科マツ属植物であるマ
ツを使用できる。

里子葉類植物としては、例えば、イネ科イネ属植物であ
るイネ、イネ科コムギ属植物である小麦、イネ科オオム
ギ属植物である大麦、裸麦、イネ科カラス麦属植物であ
る烏麦、燕麦、イネ科ササ属植物であるクサ笹、イネ科
ジュズダマ属Ｍｅである鳩麦、アヤメ科アヤメ属植物で
あるアヤメ、ユリ科ネキ属植物であるニンニク、ユリ科
キジカクシ属植物であるアスパラガス、ユリ科ジャノヒ
ゲ属植物であるシャツヒケ、ショウガ科ショウカ属植物
であるミョウガ、ショウガ科ウコン属植物であるウコン
、サトイモ科ハンゲ属植物であるカラスビシャクを使用
できる。

双子葉類植物としては、マメ科ダイズ属植物である大豆
、マメ科インゲンマメ属植物である小豆、マメ科ソラマ
メ属植物であるそら豆、マメ科クズ属植物であるクズ、
マメ科カンゾウ属植物であるナンキンカンゾウ、ナス科
ナスＩｘＭ物であるジャガイモ、トウガラシ、ナス科ト
マト属植物であるトマト、ナス科トウガラシ属植物であ
るトウガラシ、バラ科ビワ属植物であるビワ、バラ科サ
クラ属植物であるモモ、クスノキ科アボガト属植物であ
るアボガト、クルミ科クルミ属植物であるクル；、ウリ
科トウナス属植物であるカボチャ、ウリ科アマチャヅル
属植物であるアマチャヅル、アブラナ科ダイコン属植物
であるカイヮしダイコン、マタタビ科マタタビ属植物で
あるマタタビ、トクダミ科ドクダミ属植物であるドクダ
ミ、コシヨウ科コシヨウ属植物である胡椒、シキミ科シ
キミ属植物であるダイウィキョウ、ニクズク科ニクズク
属植物であるニクズク、ミカン科ミカン属植物であるダ
イダイ、ウコギ科オタネニンジン属植物であるオタネニ
ンジン、セリ科サポシュニコビア属植物であるボウフウ
、ツヅラフジ科オオツヅラフジ属植物であるオオツヅラ
フジ、アカネ科カギカズラ属植物であるウンカリア・ヒ
ルスタを使用できる。

シダ植物としては、例えば、トクサ科トクサ属植物であ
るスギナ、ゼンマイ科ゼンマイ属植物であるゼンマイを
使用できる。

ソウ類植物としては、例えば、カッソウ類植物、紅ソウ
類植物、緑ソウ類植物、ランソウ類植物を使用できる。

カッソウ類植物としては、例えば、コンブ科ワカメ属植
物であるワカメ、コンブ科コンブ属植物であるコンブ、
ホンダワラ科ヒジキ属植物であるヒジキを使用できる。

紅ソウ類植物としては、例えば、ウシヶノリ科アマノリ
属植物であるアサクサノリを使用できる。緑ソウ類植物
としては、例えば、オオシスティス科クロレラ属植物で
あるクロしうを使用できる。

Ｍｇ植物としては、例えば、担子Ｍ類植物、子ノウ菌類
植物を使用できる。担子Ｍｇ植物としては、例えば、ヒ
ラタケ科マツオウジ属植物である椎茸、キシメジ科エノ
キタケ属植物であるエノキ茸、キシメジ科シメジ属植物
であるシメジ、タコウキン科マイタケ属植物であるマイ
茸、サルノコシカケ科ポリポラス属植物であるアワビ茸
、ハラタケ科ハラタケ属植物であるマツシュルーム、キ
クラゲ科キクラゲ属植物であるキクラゲ、モエギタケ科
スギタケ属植物であるナメコを使用できる。

子ノウ菌類植物としては、例えば、エンドミセタセア科
サツカロミセス属植物であるパン酵母、醸造用酵母を使
用できる。醸造用酵母にはビール酵母、清酒酵母、葡萄
酒酵母、醤油酵母、味噌酵母等の他、サツカロミセス　
セレヴイシドに属する多くの酵母（例えば、ウィスキー
や老酒の製造に使用される酵母）が含まれる。又、バッ
カクキン科ノムシタケ属植物である冬虫夏草も使用でき
る。

以上に述べた原料植物中のリムラステスト陽性ＬＰＳの
検出、含量測定は、例えば、生化学工業株式会社からト
キシカラーシステムという名称で市販されている試薬セ
ットを使用して実施できる。

即ち、原料植物を同システムのＬＳ−１セツトと合わせ
て発色させ、その発色の強さを、同じく同セットのＥｔ
−２セツトを使用して作成した検量線と対比させればよ
い。

植物源ＬＰＳは、以下に述べる方法で分離、精製できる
。

■原料植物を必要に応して適宜細切、乾燥、粉砕した後
に蒸留水によく懸濁し、上清を回収する。

例えば、原料植物が穀類の種子である場合は、種皮をつ
けたまま、或は、種皮を除いた後に簡単に砕くか、又は
、食用に供せられている程度の粉末になるまで粉砕し、
得られた粉末に水を加えて分散液とし、攪拌した後に沈
降物を静置又は遠心分離により除去するか、粉末に水を
加えて練って得られるトウをミキサー中でゆるやかに水
洗し、沈降物を除去すればよい。

原料植物がクロレラである場合には、まず細胞膜を破砕
し、エタノール洗浄により脂溶性物質を除去した後に水
抽出するとよい。

この水抽出の際の原料植物の粒度、水の温度、液性、添
加量、攪拌の速度、時間、遠心分離の際の条件等は特に
制限する必要はなく、原料植物の種類に応して適宜調整
すればよい。又、抽出水の温度は高い方がＬＰＳの採取
量、純度ともに高い傾向があるが、操作の便宜上、原料
植物に含まれる澱粉の糊化を招来しない５０℃以下とす
ることが好ましい。又、水の添加量は、原料植物の種類
、粒度により異なるが、穀類種子の場合にはその割合が
７０　Ｗ　／　Ｖ％以下、望ましくは２０〜５０ｗ／Ｖ
％程度とすると操作上便宜である。更に、攪拌の速度は
、起泡を引き起こさない程度のものとすることが好まし
い。なお、この段階の操作迄で、本発明のリムラステス
ト陽性植物ＬＰＳの純度は、リムラステスト活性データ
から判断して、例えば小麦種子の場合には約３０倍に上
昇する。

以下、穀類種子を原料として使用する場合を例にとり説
明するが、いわゆる当業者であれば、以下の記載を参考
にして、他植物から夾雑する糖、蛋白等を除去してリム
ラステスト陽性ＬＰＳを高純度で回収する方法を実施す
ることは極めて容易である。

■純度を更に上げるためには、上記■で得られた上清を
常法に従って限外濾過に付して分子量５０００以下の両
分を除去すればよい。

■得られた乾燥品を、５０　ｍ　ｇ　／　ｍ　９＋にな
るように蒸留水に懸濁し、遠心分離操作に付して上溝を
回収する。

■この上清を氷水で冷却し、酸を添加して酸性にすると
沈殿が生じる。この際使用する酸は特定のものである必
要はなく、例えば、トリクロロ酸ｒｔａ＜以下、ＴＣＡ
と称す）、過塩素酸、トリフルオロ酢酸、酢酸、ジクロ
ロ酢酸を使用できる。

■次いで、遠心分離操作に付して沈殿を回収して蒸留水
で洗浄し、再度遠心分離操作に付して沈殿を回収する。

■沈殿を蒸留水に懸濁し、沈殿が溶解するまでアルカリ
を加える。この際使用するアルカリも特定のものである
必要はなく、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム
、アンモニア、炭酸ナトリウム、酢酸ナトリウムを使用
できる。沈殿の溶解時に塩基性がｐＨ１１より大きくな
ると目的のＬＰＳが失活するので注意が必要である。

■次いて酸を加えてｐＨ８としてから３７℃に加温し、
更に酸を加えて酸性にすると沈殿が生ずるので、３７℃
に保温した遠心分離器を使用して遠心分離操作に付す。

なお、この際使用する酸も特定のものである必要はない
。

■上溝を回収して氷冷し、４℃で再び遠心分離操作に付
す′ ■上清を回収し、アルカリを添加して中和し、常法に従
って限外濾過で濃縮する。この際使用するアルカリも特
定のものである必要はない。

［相］次いで常法に従ってゲル濾過に付して、リムラス
テスト陽性画分を回収して併せる。ゲル濾適用の担体と
しては、例えばセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　
　Ｇ−７５、Ｇ−１００、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃ
ｒｙｌ）Ｓ−２００、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓ
ｅ）６Ｂ　［以上は米国ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａＩｎｃ、）製コ、バイオゲル（Ｂｊｏｇｅｌ）Ｐ
−１００［米国バイオラット（ＢｉｏｒａｄＩｎｃ、）
社製コ、トーヨーバールＨＷ−５０、ＨＷ−５５（東洋
曹達工業社製）を使用できる。

緩衝液はｐＨ３〜ｌＯのものならいずれてもよい。

例えば、トリス−ＨＣｕ又はリン酸緩衝液を使用できる
。

０次いてこの両分に蛋白分解酵素を加え、３７℃で２時
間以上インキュベーションして残存蛋白質を分解し、得
られた酵素処理液を常法に従って限外濾過により濃縮す
る。なお、この際に使用する蛋白分解酵素も特定なもの
である必要はなく、例えば、Ｖ８プロテアーゼ、キモト
リプシン、トリプシン、サーモライシンを単独で、或は
任意に絹み合わせて使用できる。市販品としては、例え
ば、プロナーゼＥ（科研化学社）、プロテイネースＫ（
メルク社）を使用できる。

０次いでこの両分を常法に従って、例えば、米国ファル
マシア社製のＦＰＬＣシステムでファルマシア社製のモ
ノＱ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、Ｑ−セフ
ァ０−ス（Ｓｅｐｈａ−ｒｏｓｅ）を使用して陰イオン
交換クロマトグラフィーに付してリムラステスト陽性画
分を得る。

０次いて、常法に従って脱塩のためにゲル濾過に付して
リムラステスト陽性画分を回収する。

以上の操作により、小麦種子の場合には、当初のリムラ
ス活性の約２０％が回収され、純度的９５％のＩＩＩ！
標品が得られる。又、段階■終了時の純度に比へ約１０
００倍の純度（小麦種子の場合）になる。

以上の方法によって得られたリムラステスト陽性植物Ｌ
ＰＳはそのまま、或いは任意の程度に濃縮した形で提供
できる。又、保存性を高めるために、凍結乾燥や噴霧乾
燥なとの任意の手段により乾燥粉末として提供すること
もできる。これらはいずれも常法で生産できる。

ＬＰＳがマクロファージのインビトロＴＮＦ産生動物体
内にＴＮＦを産生きせるためには、産生前駆（ブライミ
ング）段階と産生開始（トリガリング）段階とが必要で
あることは、カーズウエル（Ｃ’ａ　ｒ　ｓｗｅ　Ｉ　
Ｉ　）らにより、プロシーディング　オブ　ナショナル
　アカデミ−サイエンスオブ　ニーニスニー［Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、、７２．３６６６〜３６
７０頁（１９７５年）］に報告されている。

ブライミング段階開始のために投与される薬剤が「ブラ
イマー」　（内因性ＴＮＦ産生促進剤）であり、トリガ
リング段階開始のために投与される薬剤が「トリガー」
　（内因性ＴＮＦ産生剤）である。

ＬＰＳがマクロファージのインビトロＴＮＦ産生能を活
性化する能力を測定するには、マウスのマクロファージ
腹腔常在細胞を採取し、これにブライマーとしての絹み
換えマウスＩＦＮ−γを添加し、次いで、トリガーとし
てのＬＰＳを添加し、そのＴＮＦ活性を測定すればよい
。

ＴＮＦ活性は、Ｌ−９２９細胞［プロシーディング　オ
プ　ナショナル　アカデミ−サイエンス　オブ　ニーニ
スニー　７２、３６６６〜３６７０頁］に対する細胞毒
性を基にして、次のようにして測定する。

Ｌ９２９１１胞を、５％仔牛脂児血清を加えたイーグル
ミニマムエッセンシャル培地（以下、ＭＥＭ培地と表す
）で育成し、８Ｘ１（１個の１胞が１００μλの同上培
地に含まれる様にし、９６穴の平底プレートで育種する
。育種条件は３７℃、２時間、５％ＣＯ２，１００％Ｈ
２０であり、通常の細胞培養に用いられる方法でよい。

その漫、アクチノマイシンＤを培地中に終濃度１μｇ／
ｍｌＬとなるように加え、培養液の液量を１５０μλと
する。即座に、検体を適当にＭＥＭ培地で稀釈したもの
を５０μ免加える（この際稀釈率を適宜調製し、ＥＤｓ
＠を求める事ができる）。更に、最終液量２００μλと
なったＬ９２９細胞を上記条件で１８時間培養する。

細胞障害活性を測定するには、まず全培地を除去し、つ
いて０．１％クリスタルバイオレットを含む１％メチル
アルコール溶液を加えて固定染色する。クリスタルバイ
オレットは全有核細胞を染色するが、死細胞は染色後に
プレート底面より水洗で除去されるので、生存細胞の結
果から細胞障害活性を直接測定できる。この姿色度を０
Ｄｓ９ｅｎａでの吸光度を指標として測定し、対照群に
対する染色度と比較する事で細胞障害活性を測定する。

活性の定義は次の様に行う。

Ｌ９２９１１胞が５０％生存できる検体の稀釈率（Ｎ）
を求める。対照としてウサギＴＮＳ　［腫瘍障害血清（
Ｔｕｍｏｒ　　ＮｅｃｒｏｓｉｓＳｅｔｕｍ）］を使用
し、このウサギＴＮＳの活性ｎ（単位／　ｍ　ｌ）を２
．４Ｘ１０６単位／ｍｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを用いて決
定する。このウサギＴＮＳのＥＤｓｅを与える稀釈率（
Ｃ）を求める。

検体活性（単位／　ｍ　ＩＬ）は　−　×　ｎ　て計算
する。

提供できる剤の製造方法 本発明の抗すュウマチ剤は、常法の製剤技術により、散
剤、顆粒剤、火剤、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、液
剤、貼付剤、軟膏剤、リニメント剤、ローション剤、串
刺、注射剤等の形態て提供てきる。又、動物用としては
、更に、飼料添加剤、プレミックス製剤、飲水添加剤と
して調製することもできる。飼料添加剤とする′場合に
は、粉剤か顆粒剤とすることが好ましい。又、プレミッ
クス製剤とは、飼料との混合を容易にするためにＲ粉な
との飼料成分て希釈されたものを指す。本発明の抗すュ
ウマチ剤を飼料添加剤、プレミックス製剤として添加で
きる飼料は市販されている飼料のいずれでもよい。又、
ミネラル、ビタミン、アミノ酸等の飼料添加物を含む飼
料であってもよい。

これら製剤には、所望ならば、保存性、均質性を保持す
るために、常法により、賦形剤、保存剤、緩衝剤等の添
加剤を加えることもてきる。更に、矯味剤、矯臭剤、着
色剤を含めることもてきる。

賦形剤としては、例えば、乳糖、デンプンを使用できる
、保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル
、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロ
ピル等のパラオキシ安息香酸エステル類、デヒドロ酢酸
ナトリウム、フェノール、メチルパラヘン、エチールパ
ラベン、プロピルパラベン等を使用できる。緩衝剤とし
ては、例えば、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩等が使用
できる。

以下、製造例、実施例、実験例により本発明を例示する
。

製造例１（小麦ＬＰＳの製造） ■小型ニーダに、１．０９％の灰分を含む硬質小麦粉（
アメリカ又はカナダ産のハードレットスプリング）（３
，１２０ｇ）を入れ、２．０３λの蒸留水を加えて１０
分間練ってトウとした。１５分間の静置後に１０２の水
を加えてゆるやかに攪拌してデンプン乳液を洗い出し、
同時に可溶性成分を溶出させた。この溶出液を５℃の冷
蔵庫中で１２時間静置した後、デンプン等の沈降部を除
去した。上澄み液を凍結乾燥して２０１．１ｇの粉末を
得た（粉末Ａ）。

更に、残留ドウに５艷の蒸留水を加えてゆるやかに攪拌
し、以下、上記と同様に処理して４０゜１ｇの粉末を得
た（粉末日）。

■これら粉末Ａ、Ｂを米国アミコン社製限外濾過機ＨＦ
−Ｌａｂｌに供し、分子量画分５，０００については中
空系カートリッジＨＦ−ＬａｂｌＰＭ５を、分子量画分
１０，０００については中空系カートリッジＨＦ−Ｌａ
ｂｌＰＭｌｏを取り付けて限外濾過を行った［温度５〜
１０℃０人圧２５ｐｓ　ｉ　（１，７６ｋｇ／ｃｍ２）
、比圧１５ｐｓ　ｉ　（１，０６ｋｇ／ｃｍ２）コ、そ
の結果に基づき、各部分を次のように命名した。

粉末Ａ：分子量５，０００以下の部分をａ１分子量５，
０００以上の部分をａ２ 粉末Ｂ：分子量５，０００以下の部分をｂ１分子量５，
０００以上の部分をｂ２ 粉末Ａ：分子量１０，０００以下の部分をａ３分子ｍｘ
ｏ、ｏｏｏ以上の部分を３４ 粉末Ｂ：分子量１０，０００以下の部分をｂ３３分子量
１，０００以上の部分をｂ４ これら各両分を後記実験例１に詳述する方法に準拠して
リムラステストに付したら、分子量５゜０００以上の画
分には多量のリムラステスト陽性成分が存在するが、分
子量５，０００以下の画分にはほとんど存在しないこと
が確認された。

■上記粉末ａ２の３０ｇを１交三角フラスコに入れ、６
００ｍ−蒸留水を注いて、６０分閘ススタラーで攪拌し
た後、日立冷却高速遠心機５ＣＲ−２０Ｂ　（ローター
ＲＰＲ１６を事前に４℃に冷却しておいた）で４℃で遠
心分離操作（１０，０００ｇＸ１０分）に付して上清を
回収した。

■この上清を１込三角フラスコに入れ、水冷下（液温的
２℃）、スターラーで攪拌しながら、事前に２℃に冷却
してあった１００％ＴＣＡ水溶液２０．５ｍＱ、ｆｅ滴
下し、滴下終了後氷水中に１０分間放置した。

■次いて前記と同様にして４℃で遠心分離操作（１０，
０００ｇＸ１０分）に付して沈殿を回収し、氷水中で冷
却下、３００ｍ１の蒸留水と共に５００ｍ１Ｌ（７）ビ
ーカーに入れて懸濁し、氷水中で冷却し、前記と同様に
して４℃で遠心分離操作（１０，０００ｇＸ１Ｏ分）に
付して沈殿を回収した。

■この沈殿を１２ビーカーに入れ、蒸留水５００　ｍ　
ｆｔで懸濁し、ＩＮ水酸化ナトリウム溶液約３゜５ｍ１
Ｌを使用して中和（ｐＨ７）し、ついて、氷水中で冷却
しながら、ＩＮ水酸化ナトリウム溶液約２　ｍ　ｆＬを
添加して０．０２Ｎ水酸化ナトリウム溶液になるように
して沈殿を溶解した。

■ＩＮ塩酸約１．５ｍ隻を加えてｐＨ８とノ、次いで１
００ｍ１Ｌの蒸留水を加えた後に１λ三角フラスコに移
して３７℃のインキュヘーター内で３０分間ゆっくり振
盪した。

■１００％ＴＣＡ水溶液３０　ｍ　ｌを加えて混合した
後、３７℃のインキュヘーター内で１０分間ゆっくり振
盪してから、約３７℃に保温した遠心分離器トミーＣＤ
１００Ｒ（トミー精器社製）を使用して遠心分離操作（
３，０００ｇＸ１０分）に付した。

■上清を回収して水冷し、４℃で遠心分ｌ１１操作（１
０，０００ｇＸ１０分）に付した。

［相］上清を回収してＩＯＮ水酸化ナトリウム溶液約３
．６ｍ隻て中和してｐＨ７とし、限外濾過器（東洋濾紙
ＵＨＰ−１５０、フィルター：　ＵＫ−１０、Ｎ２圧：
４．０ｋｇ／ｃｍ２）で濃縮した。

■得られた濃縮液６０　ｍ　ＩＬを、セファ０−ス（Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂカラム［米国ファルマシア社（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　Ｉｎｃ、）！１゜カラムサイズ
：　５　ｃ　ｍ　（内径）Ｘ１００ｃｍ（２良）］を使
い、ゲル濾過［緩衝液：１０ｍＭトリス−ＨＣｌ／］　
ＯｍＭＮａＣａ（ｐＨ７，５）、流速：６０ｍλ／時］
に付して、各２０ｍ隻の画分を得た。

＠初めから４３番目から５６番目迄の両分２８０ｍ１Ｌ
を併せ、プロナーゼＥ（科研化学社）４５０μｇを加え
、振［Ｌ３７℃に２時間保温した後に、限外濾過器（東
洋濾紙ＵＨＰ−６２、フィルター：　ＵＫ−１０、Ｎ２
圧：４．Ｏｋｇ／ｃｍ２）で濃縮した。ン欠いて、ファ
ルマシ７社製ＦＰＬＣシステム（カラム：モノＱＨＲ１
０／１０）を使って陰イオン交換クロマトグラフィーに
付した。即ち、ｌ　Ｏｍ　Ｍ　）リス−ＨＣｚ　（ｐ　
Ｈ７。

５）と１０ｍＭのＮａＣλを含む！１衝液で試料をカラ
ムに付した後、上記緩衝液でＮａＣｌ量が１６５ｍＭに
増加された組成を持つ緩衝液（２００ｍｌＬ）でカラム
を洗った。次いて、ＮａＣλ濃度を、１６５ｍＭからＩ
ＭのＮ　ａ　ＣＩＬ１１度勾配になるように増加させな
がら全量４００ｍ１Ｌで目的ＬＰＳを溶出させ、各２ｍ
１Ｌの画分を回収した。リムラステスト陽性が確認され
た、濃度勾配をかけてから５〜８番目の両分を併せて゛
、ＬＰＳ純度約９２％の８ｍ１Ｌ［ＬＰＳ　：　３．０
３ｍｇ　（リムラステストによる大腸菌ＬＰＳ換算値で
ある。以下のＬＰＳ量も全てこの換算値である）、糖：
０．２３　ｍ　ｇ　、蛋白：０．０４ｍｇ）を回収した
。

０次いてその８ｍ５Ｌを、セファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）Ｇ−２５Ｃカラム、２．０ｃｍ（内径）Ｘ２０
．２ｃｍ　（６６ｍｌ）］を使ってゲル濾過（緩衝液二
本）に付して各３　ｍ　ｌの両分を回収した。リムラス
テスト陽性の確認された第９〜１２番目の両分を併せて
、ＬＰＳ純度約９５％の１２ｍ１（ＬＰＳ　：　２．７
ｍｇ、糖＝０゜１８ｍｇ、蛋白：０．０３ｍｇ）を回収
した。糖はフェノール−硫酸法で、蛋白はローリ−法で
測定した。なお、この画分は、陰イオン交換クロマトグ
ラフィーにより酸性であることを確認した。

又、ＳＤＳゲル電気泳動法による分子量は６，０００〜
１０，０００だった。

０上記画分を一８０℃で凍結後に恒量になるまで凍結乾
燥し、重量を測定したら９．７５ｍｇあった。（以下、
この凍結乾燥標品を小麦ＬＰＳと称す） この小麦ＬＰＳのリムラス活性を後記実験例１記載の方
法で測定したら２．７ｍｇに相当するので、その比活性
は ２．７÷０．７５＝３．６ になる。

また、夾雑物として存在し得る単独の艶は、以上の精製
により実質下金て除去されたと考えられるので、検出さ
れた塘は全て、小麦ＬＰＳを構成している糖と考えられ
る。従って、この段階での小麦ＬＰＳの純度を重量に基
ついて計算すると、蛋白＝０．０３ｍｇ ＬＰＳ＝０．７５−０．０３＝０．７２ｍｇだから、 ０．７２÷０．７５Ｘ１００＝９６　（％）である。

小麦ＬＰＳの物性 ■分子量 小麦ＬＰＳを蒸留水に溶解して１ｍｇ／ｍｌＬ溶液を調
製し、その４μｌを１．５ｍ隻のトレフチューブに入れ
た。これに、別途、１ｍＭのＥＤＴＡに２．５％ＳＤＳ
、５％メルカプトエタノール、１０　ｍ　Ｍ　）リス塩
酸（ｐＨ８，０）を加えてｌＷｍしたＳＤＳ処理液１μ
禿を加え、この混液を３分間沸騰水に浸した。ファルマ
シア社製のファストシステム（Ｐｈａｓｔ　　Ｓｙｓｔ
ｅｍ）を使用し、電極との間に５ＤＳ−バッファー　ス
トリップ（Ｂｕｆｆｅｒ　　５ｔｒｉｐ）（ファルマシ
ア社製）が介在せられた１μｔの上記混液をゲル［ファ
ルマシア社製の）７スト　ゲル　グラデイエン）（Ｐｈ
ａｓｔ　　　　Ｇｅｌ　　　　　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　　
　　８−２５）に塗付し、最大電圧２５０ｖ、最大電流
１０ｍＡにセットして泳動を開始させた。泳動終了後、
クマシー染色と銀染色における挙動を観察した。

クマシー染色では、染色液としてファルマシア製の０．
１％ファスト　ゲル　ブルー　（Ｐｈ−ａｓｔ　　Ｇｅ
ｌ　　Ｂｌｕｅ）　　Ｒを、脱色液として、メタノール
：酢＊：蒸留水（容量比３：１：６）混液を使用し、次
の順序で染色・脱色を行った。

１）５０℃で８分閏染色 ２）５０℃で５閉放脱色 ３）５０℃で８分閏染色 ４）５０℃で１０分間脱色 ５）５０℃で５分間保護（グリセａ−ル、酢酸、蒸留水
の容量比５：１０：８５混液） ６）乾燥 銀染色は、次の順序で行った。

Ｉ）５０℃で２分間、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留
水の容量比５：１：４混液）で処理２）５０℃で２分間
、洗浄液（エタノール、酢酸、蒸留水の容量比１０：５
：８５混液）で処理３）５０℃で４分間、洗浄液（エタ
ノール、酢酸蒸留水の容量比１０：５：８５混液）で処
理４）５０℃で６分間、増感液（８，３％グルタルジア
ルデヒド）で処理 ５）５０℃で３分間、洗浄液（エタノール、酢酸蒸留水
の容量比１０：５：８５混ｆｆ）で処理６）５０℃で５
分間、洗浄液（エタノール、酢酸蒸留水の容量比１０：
５：８５混液）で処理７〕５０℃で２分間、洗浄液（脱
イオン水）で処理 ８）５０℃で２分間、洗浄液（脱イオン水）て処理 ９７４０℃で１３分間、０．２５ｗ／ｖ％硝酸銀て処理 １０１３０℃で３０秒間、洗浄ｌａ＋（脱イオン水）で
処理 １１１３０℃で３０秒間、洗浄液（脱イオン水）で処理 １２１３０℃で３０秒間、現像ｆ（０，０４ｖ／ｖ％ホ
ルムアルデヒ）”＋２．５ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム洗浄
液）で処理 １３１３０℃で４分間、現像液（０，０４ｖ／ｖ％ホル
ムアルデヒド＋２．５ｗ／ｖ％炭酸ナトリウム洗浄液）
で処理 １４１５０℃で２分前、反応停止液（δ％Ｖ　／　Ｖ％
酢酸）で処理 １５１５０℃で３分間、保護液（酢酸、グリセロール、
蒸留水の容量比１０：８：８５混液）で処理 ！６１乾燥 ＬＰＳは銀染色に染まるが、クマシー染色には染まらな
い性質を利用して染色帯を観察したら、分子ｍ８，００
０の位置に小麦ＬＰＳの主要梁色帯が検出された。

［相］リン含有量 チェンートリバラ（Ｃｈｅｎ−Ｔｏｒ　１ｂａｒａ）法
［チェン等著、「アナリティカル　リミストリ（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃａｌ　　Ｃｈｅｍｉｓ−ｔｒｙ’）　、ｖｏ
　１．２Ｂ、１７５６〜１７５Ｂ頁（１９５６年）に準
拠して次の通りに行った。

小麦ＬＰＳを蒸留水に溶解して、２５μｇの小麦ＬＰＳ
を含む２０μ免の溶液をｖ４ｕｂ、小試験管に入れた。

２０μ党の５０　ｖ　／　ｖ％硫酸を添加し、１６０℃
で２時間加熱した。次いて、２０μ（の１０　ｖ　／　
ｖ％過塩素酸を添加した後にガスバーナーで１分間加熱
して灰化させた。その後に０゜５ｍ１Ｌの蒸留水、次い
て０．５ｍｌの反応試薬（１ｍ　ｌ（０６Ｎ　１ｌＩＥ
酸、２ｍ−蒸留水、２ｍ１Ｌ（７）２．５Ｖ　／　Ｗ％
モリブデン酸アンモニウム及び１ｍｌの１０ｖ／ｗ％の
７スコルビン酸を混合して調製し、その０．５ｍｇｋを
使用）を添加して室温で３０分間放置した後に、８２０
ｎｍでの吸光度（ＯＤ　１１２１１ｏ−）を測定した。

なお、検量線作製用の試料としては、リン酸二水素カリ
ウム（和光純薬社１１＞を蒸留水で希釈し、リン重量と
してそれぞれ２．５μｇ、１μｇ、０．２５μｇ、Ｏμ
ｇを含む０．５ｍλの溶液を調製して使用した。なお、
リン１ｇはリン酸二本葉カリウム４．３９ｇに相当する
。得られた結果を次表１に示す。

表　　１ 注：小麦ＬＰＳのデータは、無機リンの混入（例えば、
リンｌｌ！緩衝液に由来する）による誤差を避けるため
に、加熱処理をしていない対照のデータを減じた値であ
る。

小麦ＬＰＳの分子量を８，０００と仮定し、上表の結果
に基づいてその１分子当たりのリン数を次式により計算
すると１〜４になる。

２５Ｘ１０−　　　３２ 上記実験でリン数が１〜４と変動している原因の１つと
しては、Ｉｌ製段階でのモノフォスフオニステラーゼの
混入により、リン酸が脱離したことも考えられる。

Ｏヘキソサミン含有量 エルソンーモルガン（Ｅｌｓｏｎ−Ｍａｒ　−ｇａｎ）
法（東京化学同人出版「生化学実験講座」Ｎｏ、４の３
７７〜３７９頁）に準拠して次の通りに行った。

小麦ＬＰＳを蒸留水に溶解して１ｍｇ／ｍａの溶液を調
製し、その１００μλをスクリューキャップ付きスピッ
ツ（イヮキガラス社！りに入れ、これに１００μ１（７
）８ＮＨＣＩＬを添加しＴ１１０’Ｃて１６時間加熱し
た。４ＮＮａＯＨを約２００μ琵添加してｐＨ７とした
。その１００μ交を分取し、別のスクリューキャップ付
きスピッツに入れ、２００μｔの下記試薬Ａを加えた後
に、１０５℃で１．５時間加熱し、次いて流水で冷却し
た。次いて、１００μ（を分取し、６７０μ艷の９６％
エタノールを加え、更に、６７μ２の下記試薬Ｂを加え
た後に室温で１時間放置し、５３５μｍで吸光度を測定
した。検量線作製用試料としては０．２０〜２００μｇ
　／　ｍ　ＩＬ（７）　Ｎ−アセチル　グルコサミン（
和光純薬社製）を使用した。

（試薬Ａ）７５μ兜のアセチルアセトンと２．５ｍ１Ｌ
の１．２５Ｎ炭酸ナトリウムを混合して調製。

（試薬Ｂ）１．６ｇのｐ−ジメチルベンズアルデヒドと
３０ｍ５Ｌ（Ｄａ塩酸と３０　ｍ　ｌ（Ｄ　９６％エタ
ノールを混合して調製。

結果、小麦ＬＰＳのへキソサミン数は６±２７分子（仮
定分子量８，０００）だった。

０脂肪酸含有量 ９０μ良の小麦ＬＰＳ蒸留水溶液（１ｍ　ｇ　／ｍλ）
に１０μ兜の内部標準（０，５５ｍＭのマルガリンＭ）
を加えた。１．０ｍｆＬの０．５Ｍナトリウムメチラー
トを加えて脂ＦＪ酸エステルの加水分解とエステル化を
行った。室温で１時間放置後に９６０μｔの０．５ＮＨ
Ｃ＆を加えて中和した。

これに２ｍ−ヘキサンを加えて１５分間激しく攪拌した
。次いて、１，０００ｇで５分間遠心分離を行いヘキサ
ン層を分取した。窒素ガスでヘキサンを蒸発させて、約
２０μ鱈こなるまで濃縮した。

このサンプルをガスクロマトグラフィー［本体：島津社
製のＧＣ８ＡＰＦ、キャピラリーカラム：カナダのスペ
ルコ（Ｓｐｅｌｃｏ）社１！ＦＳＣＡＰ　　５ｐ２３３
０、キャリヤーガス：窒素］に付して脂肪酸量を測定し
た。脂肪酸量測定の基準としては、第一化学薬品社製の
合成リピドＡである大！ｌＩＭ型ＬＡ−１５−ＰＰ　（
分子量２，０００で、１分子中の脂肪酸数は６であるこ
とが知られている）を用いた。

結果、小麦ＬＰＳの脂肪酸数は６±２７分子（仮定分子
ｊ１８，０００）であると推定された。

上記ガスクロマトグラフィーで観察されたチャートを添
付図面第１〜３図に示す、第１図は小麦ＬＰＳの、第２
図は大ｌｉＩ菌ＬＰＳの、第３図は百日咳１ｒＬＰｓの
チャートである。

第１〜３図において、図示されている主要ピーク番号に
対応する保持時間（分）は次の通りであった・ 第１図：　ピーク番号　　保持時間（分）１　　　　　
　　２．４５０ ２　　　　　　　２．７５８ 第２図：　ピーク番号 第３図：　ピーク番号 保持時間（分） ２．４１７ ２．７４２ 保持時間（分） ２．４３３ ３．０２８ 第１〜３図の比較により、小麦ＬＰＳのチャートは大Ｂ
ｉ＠Ｌ　Ｐ　Ｓのチャートに似ているが、百日咳１ｉｉ
ＬＰｓのものとは大まく異なることは明白である。

＠ＫＤＯ含有量 ＫＤＯ（２−ケト−３−デオキシオクトネート）含有量
をジフェニルアミン法［シャビ　アール（Ｓｈａｂｙ　
　Ｒ，）等著、アナリティ力ルバイオケム（Ａｎａｌｙ
ｊｉｃａｌ　　Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、）、５８　（１）、１２３−１２９頁（１９
７４年）コに準拠して次の通りに行った。

５００ｍｇのジフェニルアミン、５ｒｒｌＬのエタノー
ル、４５ｍλの氷酢酸、５０　ｍ　ＩＬの濃塩酸（全て
和光純薬社ｐｇ＞を合わせてＫＤＯ検出試薬を調製した
。その５００μ鬼に、１．０５ｍｇ／ｍλの小麦ＬＰＳ
を含む蒸留水２５０μ鬼を合わせ、１００℃の沸騰水浴
中で３０分間加熱後に冷水（２３℃）中で３０分間冷却
し、ついで日立分光光度計３２０を使って４２０．４７
０．６３０．６５０ｇｍでの紫外部吸収を測定した（そ
れぞれＡ　４２θ、ＡＪ７［１，Ａ６３ｅ、Ａ６５＠と
する）。標準試料としては、１２７ｇｇ／ｍｌのＫＤＯ
アンモニウム塩［米国シグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）社！！
］を含む蒸留水２５０μ免を使用した。

検体試料、標準試料それぞれシこついて、次式の値を求
めた。

Ｓ　＝　Ａ　４２１１　　Ａ　ｔ７＠＋　Ａ　６３１１
−Ａａｓｌ！検体試料の値（ＳＴ）は０．３７９、標準
試料のｆｌｌ（Ｓｓ）は０．２９４であった。この値の
比較により、小麦ＬＰＳには５±１モル／分子量８千の
ＫＤＯが含まれると推定された。

製造例２（クロレラＬＰＳの製造） ■細胞膜破砕クロレラ（■マンナンツーズ社製）３０ｇ
を、洗浄液が緑色に着色しなくなる１でエタノールで洗
浄した。

■この洗浄残渣２６ｇを１００ｍｇ／ｍｌの濃度で蒸留
水に溶かし、４５℃で２時間振盪後に遠心分離操作（４
℃、１０，０００ｇＸ３０分）に付した。

■上清を回収し、東洋濾紙Ｎ００２で濾過し、次いて蒸
留水で抽出した。

■抽出液２９０ｍ１を下記条件で陰イオン交換クロマト
グラフィーに付した。

カラム：Ｑ−セファ０−ス（φ３ｃｍＸ２３ｃｍ、容量
的１８０ｍ１Ｌ） 緩衝剤：１０ｍＭ）リス−ＨＣ１Ｌ（ｐＨ７，５）、Ｎ
ａＣｌ濃度勾配：１０ｍＭ、４００ｍＭ、１Ｍ 流速：　１００〜２００ｍ１１／時 温度：室温 ■素通りした画分３１０ｍ１Ｌをグルコアミラーゼで処
理して澱粉を分解した（ｐＨ５，０，４０℃、約２時間
）、Ｒ粉の分解は、ヨウ素澱粉反応で着色が生しないこ
とにより確認した。

■遠心分離（１０，０００ｇＸ１０分）に付して上清を
回収し、１ＯＮＮａＯＨ１液て中和してｐＨ７とし、分
子量２０万カツトのポアサイズを有するウルトラフィル
ターを使って限外濾過して、分解物の除去及び濃縮を行
った。

■得られた濃縮液３０ｍｌをファルマシア社製ＦＰＬＣ
システム（カラム：モノＱＨＲ１０／１０）を使って陰
イオン交換クロマトグラつイーに付した。即ち、１０ｍ
Ｍ）リス−ＨＣｌと１０ｍＭのＮａＣ化を含む緩衝液（
ｐＨ７，５）で試料をカラムに付した後、上記緩衝液で
ＮａＣｌ量が１６５ｍＭに増加された組成をした液（２
００ｍＯてカラムを洗）た。次いて、目的ＬＰＳを溶出
するため、１６５ｍＭからＩＭのＮａＣｌ濃度勾配にな
るようにＮａＣｌ濃度を増加させながら全量４００　ｍ
　ｌてカラムを洗い、各２　ｍ　ｆＬの両分を回収した
。リムラステスト陽性が確認された、濃度勾配をかけて
から５〜８番目の両分を併せた。

■次いでその８ｍ１Ｌを、セファデックス（Ｓｅ、ｐｈ
ａｄｅｘ）Ｇ−２５［カラム＝２．０ｃｍ（内径）Ｘ２
０．２　ｃｍ　（６６ｒｎａ）］を使ってゲル濾過（緩
衝液：水）に付して各３　ｍ　ＩＬの画分を回収した。

リムラステスト陽性の確認された第９〜１２番目の画分
を併せて１２ｍ１を回収した（ＬＰＳ　：　１４．３ｍ
ｇ、糖：２．０ｍｇ。

蛋白：０．５３ｍｇ）、ＬＰＳは後記実験例１記載の方
法で、糖はフェノール−硫酸法で、蛋白はローリ−法で
測定した。

■上記画分を一８０℃で凍結後に恒量になるまで凍結乾
燥し、重量を測定したら５．８ｍｇあった。（以下、こ
の凍結乾燥標品をクロレラＬＰＳと称す） このクロレラＬＰＳのリムラス活性は１４．３ｍｇに相
当するので、その比活性は １４．３÷５．８＝２．５ になる。

また、以上の精製で、夾雑物として存在し得る単独の糖
は実質止金て除去されたと考えられるので、検出された
糖は全て、クロレラＬＰＳを構成している糖と考えられ
る。従って、この段階でのクロレラＬＰＳの純度を重量
に基づいて計算すると、 蛋白＝０．５３ｍｇ ＬＰＳ＝５．８−０．５３＝５．２７ｍｇだから、 ５．２７÷５．８Ｘ１００＝９１　（％）である。

クロレラＬＰＳの物性 製造例１に記載の方法と同様にして、次の値が得られた
。

分子量＝４０，０００〜９０，０００ リン数＝４±ｌ／分子量１万 ヘキソサミン数＝７±１／分子量１万 脂肪酸数＝６±】／公刊１万 ＫＤＯ数＝数子２±１７ 千葉県血清研究所から人手した試験用百日咳菌液（２．
０Ｘ１０１８細胞／　ｍ　ＩＬ）を死菌体として用いた
。

上記死菌体を２５ｍｇ（乾燥重量）／ｍｌＬとなるよう
に滅菌水に懸濁した。これに等量の９０％熱フェノール
液（６８〜７０℃）を添加し、６８℃で１時間ｌｔｉ盪
しながら抽出した。８，０００ｇ、４℃で２０分間遠心
分離して水層を分取した。残りのフェノール層に、上記
水層と等量の滅菌水を加えて同様の抽出を行った。得ら
れた水層を先の水層と合わせて流水中で一晩透析後に、
ロータリーエバポレータで１／１０に濃縮した。これを
８゜０００ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清を分
取し、酢酸ナトリウムを少量加え、０〜４℃の冷エタノ
ールを６倍量加えて一２０℃で一晩放置した。４，００
０ｇ、４℃で３０分間遠心分離して回収した沈殿物をエ
タノールで２回、次いでアセトンで１回遠心洗浄し、ア
スピレータで乾燥させた。

残さを、２０ｍｇ／ｍｌＬとなるように蒸留水に懸濁し
、米国ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）社製のソニファイ
ア１８５型で超音波処理（出力コントロール５．１５分
、室温）に付した。次いて２゜５００ｇ、４℃で１０分
間遠心分離し、上清を分取した。

この上清を４℃で、米国シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製の核
酸分解酵素ＤＮａｓｅ　　Ｔ、ＲｎａｓｅＡて１５〜１
６時間処理した（最終的には１０μｇ／ｍｌのＤＮａｓ
ｅ　　　Ｉ　と、２０４ｇ／ｍｌのＲｎａｓｅＡを使用
した）。更に同し１度の核酸分解酵素を加えて３７℃で
２時閏加温した。次いで２．５００ｇ、４℃で１０分間
遠心分離し、上溝を分取した。

この上清を米国ゲルマン（Ｇ　ｅ　ｌ　ｍ　ａ　ｒ＋　
）　？ｆのアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）を使い
、孔径０．２μｍで濾過した。濾液を分子篩にかけ［樹
脂：米国ファルマシア（Ｐｂａｒｍａｃ　ｉ　ａ）社製
セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂ、カラムサイ
ズ＝内径５　ｃ　ｍ　Ｘ長さ１００ｃｍ、緩衝液＝１０
ｍＭのトリス−ＨＣｔ、１０ｍＭのＮａｃｌ（ｐＨ７，
５）　、流速＝約３ｍｌ／ｃｍ２／時）、生化学工業社
製のＬＳ−１キツトを用いてリムラス活性陽性画分を調
べて合わせ、上記ゲルマン社のアクロディスクを使い、
孔径０．２μｍで濾過した。濾液をイオン交換にかけ［
装置：米国ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ）社製
ＦＰＬＣ５樹脂：米国ファルマシア社製モノＱ　　ＨＲ
１０／１０、緩衝液＝　１０ｍＭのトリス−ＨＣＩＬ十
１０ｍＭのＮａＣ１（ｐＨ７，５）で１５分洗浄し、次
いで、ＮａＣＩＬ量を１６５ｍＭに増加して３０分洗浄
し、次いて、２０分かけて、ＮａＣ（量がｆ６５ｍＭか
らＩＭの濃度勾配になるようにＮａＣＩＬ量を増加ざぜ
ながら洗浄し、次いて、ＩＭのＮ　ａ　Ｃａｌて３０洗
浄する、流速＝　２　ｍ　Ｅｈ１分］、生化学工業社製
のＬＳ−１キツトを用いてリムラス活性場性画分を謂べ
て合わせた。

合わせた画分をカラムで脱塩し［樹脂：米国ファルマシ
ア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製セファデックスＧ−２５
フアイン（ｆｉｎｅ）−カラムサイズ＝内径２ｃｍＸ長
ざ２５ｃｍ、溶出液＝蒸留水］、次いて凍結乾燥した。

この凍結乾燥標品（４，５０ｍｇ）に混入している可能
性の最も高い物質は核酸である。そこで、紫外吸収曲線
（２００〜４００ｎｍ）をとり、２６０ｎｍでの吸光度
を求めた。吸光度１のときの核酸濃度が５０μｇ／ｍｆ
ｋであることを用いて上記吸光度から核酸濃度を算出し
たら１％以下であった。又、ＳＤＳ電気泳動ては蛋白質
は明確には検出されなかった。従って、検出感度を考慮
すると、上記凍結乾燥標品に混入している蛋白質は高々
０〜３％と推定される。従って、上記７１　Ｊｉｉ！ｉ
屹燥標品の純度は９６％以上と推定された。

製造例】に記載の方法と同様にして測定されたこの百日
咳ＭＬＰＳの物性は次の通りであった。

百日咳１ｆＬＰｓの物性 分子ｆｆ１＝８，０００＋１，０００．９．０００±１
，０００ （１１数妓察されたクマシー染色帯のうち、染色強度が
Ｊｕ高の２つの染色帯の値である。） リン数＝δ／分子ｆ８千 ヘキソサミン数＝１６±２／分子１８千脂肪酸数＝５７
分子ｔ８千 ＫＤＯ数＝２±１７分子ｆｆ１８千 なお、製造例１に記載の方法と同様にして測定された大
１１１ｉｉｉＬＰｓ［米国デイフコ（Ｄｊｆｃｏ）社製
０１２８二Ｂ８］の物性は次の通りであった。

大腸菌ＬＰＳの物性 分子量＝３０．０００±５，０００ （階段状に連続したクマシー染色帯のうち、染色強度が
最高のものの値である。）リン数＝１２／分子量３万 ヘキソサミン数＝４５±６７分子量３万脂肪酸数＝１８
／分子量３万 ＫＤＯ数＝５±１７分子量３万 以下は、本発明のＬＰＳを含む製剤の処方例である。な
お、ＬＰＳ量は、リムラステストによる大腸菌ＬＰＳ換
算量である。

実施例２（内用液剤） クロレラＬＰＳ ｍｇ ＊ａ水 １００ｍ　　化 実施例３（軟膏剤） 小麦ＬＰＳ ０．１ｇ 精製ラノリン ０ｇ １　０００ｇ 実施例４（注射剤） 小麦ＬＰＳ ０．５ｍｇ 実施例１（錠剤） 小麦ＬＰＳ　　　　　　　　　Ｏ，０４ｇ６％ＨＰＣ乳
糖　　　　　　　１７８ｇステアリン酸タルク　　　　
　　　８ｇバレイショデンブン　　　　　　１４ｇ以上
を混和し、打錠して、０．１ｍｇの小麦ＬＰＳを含む０
．５ｇの錠剤４００個を調製した。

合計 １０００ｍ　交 実験例１（リムラステスト陽性植物ＬＰＳの定量）各種
植物に含まれるリムラステスト陽性ＬＰＳの定量を、生
化学工業株式会社のトキシカラーシステムを使って行っ
た。

■９６穴の平底または丸底プレートに注射用蒸留水を１
穴当たり１８０〃Ｑ入れた。試料２０μλ（試料が固体
の場合には注射用蒸留水に溶解して調製した）をプレー
トの穴の１つに加えた。プレートミキサーで攪拌しなが
らピペッティングを行って１０倍希釈液をｙｉ製した。

（以後、順次希釈試料を２０μ免ずつとり、同様に処理
することで１００倍、１０００倍、・・・とｌＯ倍希釈
系列液を調製できる。また、注射用蒸留水と試料の量比
を変えることにより希釈率は任意に設定できる。）■内
部標準として１．５μｇ／ｍｆＬの大腸菌ＬＰＳ溶液の
１００，０００倍希釈液を調製し、希釈やリムラステス
ト発色が正常であることを確認した。

■上記■の１０倍希釈液３５μ２を別のプレートの穴に
とり、生化学工業株式会社のトキシカラーシステムのＬ
Ｓ−１セツト３５μ北を添加し、３７℃で３０分間放置
した。ついて１０５μλの１Ｍ酢酸水を加えて攪拌して
反応を停止させた。

この試料液の波長４１５ｎｍての吸光度を、９６穴用吸
光度計プレートリーダーＭＴＰ−１００（コロナ電気株
式会社製）て測定した。パックグランドとしては蒸留水
を、検量線作成用としては４２ｐｇ／ｍｌＬの生化学工
業株式会社のトキシカラーシステムのＥＴ−１セツトを
使用して検量線を作成し、この検量線を基準にして各試
料中のリムラステスト陽性ＬＰＳの定量を行った。（試
料が蒸留水である場合の吸光度を０とした。）なお、こ
の方法で前記ＬＳ−１セットを使用した場合には１０〜
４５ｐｇ／ｍＱ、の範囲内て発色に定量性があることが
確認されたので、この範囲に入らないときは、希釈率を
変えて再実験した。

希釈試料の定量値は、 （検量線から読み取った値＞Ｘ＜希釈率）で計算した。

得られた結果を、固体試料の場合にはｎｇ／ｇ単位で、
液体試料の場合にはｎｇ／ｍλ単位で次表１に示す。

なお、表中の試料の欄の会社名、地名等は、当該試料の
入手先、産地をさす。かかる記載がない品はスーパース
トアー忠実屋の神奈川県津久井郡中野軒店で購入した品
で、 製造者が不明なものを 指す。

表　　１ 試料（固体） 裸子植物 松の実（真南貿易） 単子葉類 硬質系小麦種子（千葉製粉） 硬質系小麦種子（千葉製粉） （分子量５０００以上） 硬質系小麦粉（千葉製粉） 小麦ふすま（千葉製粉） （分子量５０００以上） 小麦胚芽（千葉製粉） 小麦胚芽（千葉製粉） （分子量５０００以上） 玄米 米粉（日の本穀粉） リムラステスト陽性 ＬＰＳ量　（ｎ　　） ２　。

１、　０００．　０００ ７、　５００ １、　６００ ＜１０，０００ １、　１００ （分子量５０００以上） 米ぬか 米ぬか（分子量５０００以上） コーンフラワー（大洋飼料） （分子量５０００以上） コーングリッツ（大洋飼料） （分子量５０００以上） コーン（和光食糧） クマ笹（開本物産） アヤメ（種子） ニンニク（鱗茎） アスパラガス（芽） ミョウガ（花房） ヨクイニン（ウチダ和漢薬） （原植物は鳩麦） ハンゲ（松浦薬業） （原植物はカラスビシャク） バクモントウ（栃木天海堂） （原植物はジャノヒゲ） ３１、　０００．　０００ ２９、　０００ ５００、　０００ ＜０．３ ！２０ １５、　０００ ３、　３００ ４、　５００ ４１、　０００ ２、　３００ ５、　５００ ４　。

ターメリック（エスピー食品）　　１９５，０００（原
植物はウコン） 双子葉類 大豆（王女食品）　　　　　　　　　　　１５０大豆（
はくれん）（分子量５０００以上）４００丹波黒大豆（
和光食糧）８５ 小豆（和光食糧）　　　　　　　　　　　４５０小豆（
和光食糧） （分子量５０００以上）　　３６，０００，０００ひた
し豆（和光食糧）　　　　　　　　　８００大正金時（
和光食糧）　　　　　　　　　５５０大福豆（和光量１
Ｍ）　　　　　　　　　　　３５０そら豆（生）　　　
　　　　　　　　　　７５０ジヤガイモ（はくれん） （分子量５０００以上）　　　　　　　・〈０．３ビワ
（種子）　　　　　　　　　　　　　　８００アボガド
（種子）　　　　　　　　　　　　９５０モモ（種子）
　　　　　　　　　　　　４．−５００クルミ（種子）
　　　　　　　　　　　１，９００ソラ豆（種子）　　
　　　　　　　　　　７５０カポチヤ（種子） トマト（生の実） カイワレダイコン（根を除く） マタタビ〈丸久物産） アマチャズル（Ｋ、に、桜井） ドクダミ（湿潤重量当たり） （帝京大学薬用植物園） 胡擢（白）（エスピー食品） トウガラシ（真南貿易） 六角（真南貿易） ナツメグ（ライオン） （原植物はニクズク） トウヒ（ウチダ和漢薬） （原植物はダイダイ） カッコン（栃木天海堂） （原植物はクズ） ナンキンカンゾウ（ウチダ和漢薬） オタネニンジン（ウチダ和漢薬） ボウフウ（栃木天海堂） １０゜ １０　。

５０　。

４０　。

７３　。

８、　０００ ３、　０００ １Ｂ、０００ ４５、　０００ ５０、　０００ カンボウイ（栃木大海り　　　　６００．０００（原植
物はオオツヅラフジ） チョウトウコラ（ウチダ和漢薬）　　　７，０００（Ｊ
ｉ！植物はウンカリア・ヒルスタ）八味地黄丸（カネボ
ウ薬品）　　　　１７，０００小柴胡濶（ツムラ）　　
　　　　　　　１３．０００五苓湯（ツムラ）　　　　
　　　　　　１２，０００猪苓？ＩＡ　＜”）ム−ｙ＞
　　　　　　　　　　１４．０００十全大補８Ｉ（ツム
ラ）　　　　　　　　８．０００八味地黄丸（ツムラ）
　　　　　　　　８，０００ローヤルゼリー　　　　　
　　　　　１，０００［ペキン　ローヤル　ゼリー （Ｐｅｋｉｎ　　Ｒｏｙａｌ　　Ｊｅｌｌｙ）ハチミツ
（加藤美峰園本舖）　　　　　　８００シダ植物 スギナ（湿潤重量当たり）　　　　　　　７００（帝京
大学薬用植物ｍ） ゼンマイ（開本物産）　　　　　　　１０，０００ソウ
類 わかめ（三陸天然品）　　　　　　　１１，０００わか
め芽株（巖谷健康食品） ひしき（生） 芽ひじき（小善本店） コブ（ヤマトタカハシ） アサクサノリ（乾燥相ノリ） クロレラ （■ヘルスタージャパンＹＳ） クロレラ （■マンナンフーズＹＳ） 菌類 椎茸（下仁田産） えのき茸（長野県中懸重） しめしく勢多郡宮城町） まいたけ（大利根） あわび茸（羽生） マツシュルーム きくらげ ナメコ エビオス（アサヒビール社製 ビール酵母） ２００　。

８５゜ １０５　。

２３５　。

１３０　。

１、　９００．　０００ １、　０００．　０００ １６、　０００ ２０、　０００ ４０、　０００ ２０５、　０００ ｓ、　　ｏｏ。

２０、　０００ ？５．　０００ ２１、　０００ ２５０、　０００ 冬虫夏草　　　　　　　　　　　２４０，０００その他 官印ナチュレヨーグルト（■１印）５．．０００グリコ
ビフイズスヨーグルト（■グリコ）５０リムラステスト
陽性 試料（液体） ＬＰＳ量　（ｎ　　） ビール キリン　ファインビルスナー ラガービール ハートランド ファイントラフト アサヒ　スーパーイースト ワイン サントリー　　サントネージュ（白） （赤） ジートル（アップル） １、　１５０ １、　２５０ ］、　　５５０ １．４００ 日本酒 大間−級（大関酒造） 黄桜二級（黄桜酒造） ２　、４ １．７ 大寒吟醸二級（玉泉堂酒造） 玄米酒 日々−献（大間酒造） 薬味酒 陶陶酒デルカップ（陶陶酒本舖） 宝焼耐（宝酒造） その他 キヨーレオビン（湧水製薬） ニンニク抽出液（湧水製薬） グロスキュー（クロレラ工業） 大麦健康メツコール（韓国・−和） サクａンハーブ液（エーザイ） ヘチマ水（自家製） パイオアルゲン（クロレラ工業） パンシロン内服液（ロート製薬） ユンケルファンティー（佐原製薬） コリホグス（小林製薬） ツディ（工具） ミオＤコーワ１００（コ〜ワ） ２、　　１ １．２ 〈　２　、０ ６、　０００ ２、　０００ １、　０００ リゲイン（工具）　　　　　　　　　　　　　９０ブレ
ン５０（第一製薬）　　　　　　　　　７ソルマツク（
大ＩＩｉ！薬）　　　　　　　　　　　６０−ゼリーゴ
ールド（中外製薬）　　　　　　５バスビタン３０（基
盤製薬）　　　　　　　　５チオビタ（大冨製薬）　　
　　　　　　　５未満リボビタン（大正製薬）　　　　
　　　　５未満アスパラゴールド（田辺製薬）　　　　
　５未満実験例２（マクロファージのインビトロＴＮＦ
産生能を活性化する際のＥＤ５０を与えるリムラステス
ト陽性ＬＰＳの含有量が０゜ ４〜１１００ｎ／培養液ｍｆしてあるＬＰＳの選択方法
） ９週齢の、平均体重２９ｇの各群３匹のオスのＣ３Ｈ／
Ｈｅマウスのマクロファージ腹腔常在細胞２００μ１Ｂ
２Ｘ１’０５個〉／穴を９６穴の平底プレートに入れ、
ブライマーとしての朝換えマウスＩＦＮ−ｒ　（１００
単位／　ｍ　ｌ）を各式に１０μ鼠宛加えた。別途、各
種ＬＰＳ源を６５℃の熱水（ｇ／ｍλ）で５時間抽出し
て：ＩＩ製した抽出液を各種希釈し、その１０μ（／穴
をブライマー投与の３時間後にトリガーとして加えた。

２時間培養後に遠心分離操作に付した（３０００ｇ、２
０分）。各式から得られた１３０μ交の、ＴＮＦ活性は
Ｌ９２９！Ｉ胞に対する毒性に基づいて測定し、又、リ
ムラステスト陽性ＬＰＳ含有量は生化学工業株式会社の
トキシカラーシステムを使用して測定した。

測定値を、縦軸にＴＮＦ産生量（単位／培養液ｍｆＬ）
を、横軸（対数尺）に対応リムラステスト陽性ＬＰＳ含
有量（ｎｇ／培養液ｍｌ）を表す座標にプロットし、プ
ロットされた各点から推定されるシグモイド曲線を描い
た。トリガーを投与しなかった場合のＴＮＦ産生量を与
える各トリガーのマクロファージ活性化能を０％とし、
トリガー投与の効果として増大するＴＮＦ産生量が最大
恒量に達したときの各トリガーのマクロファージ活性化
能を１００％とし、その５０％に相当するマクロファー
ジ活性化能を与えるリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を
曲線から読み取フた。

マクロファージ活性化能とリムラステスト陽性ＬＰＳ含
有量との相間関係が上記条件を満たしたＬＰＳ採取源の
結果を次の表２に示す。表中て、ｒＴＮＦ」はＴＮＦ産
生量（単位／培！Ｉ液ｍ１Ｌ）を、「活性化能」はマク
ロファージ活性化能（％）を、ｒＬＰｓ」はリムラステ
スト陽性ＬＰＳ含有量（ｎ　ｇ／培養液ｍｕ）を表す。

なお、トリガー無添加時のＴＮＦ産生量は０．７５単位
／ｍｌＬであったので、ＴＮＦ産生量が０．７５単位／
　ｍ　ＩＬ以下である場合をマクロファージ活性化能０
％とし、マクロファージ活性化能（％）は次式により計
算した。

艮−２＝ 表２に示された結果を第４〜７図に示す。

第４〜７図において、縦軸はマクロファージ活性化能（
％）を表し、横軸（対数尺）はリムラステスト陽性ＬＰ
Ｓ含有徽（ｎ　ｇ／培養液ｍｌ）を表している。

第４図において、○はターメリックの、・は力ンボーイ
の、口はコンブの、■はアサクサノリのデータをボす。

第５図において、○はワカメ芽株エキスの、口は芽ヒジ
キの、■はエビオスのデータを示す。

第６図において、○は冬虫夏草の、・はワカメ芽株の、
口はクロレラのデータを示す。

第７図において、○は大腸菌ＬＰＳの、・は小麦ＬＰＳ
の、口は百日咳菌ＬＰＳの、■はリピドＡのデータを示
す。

実験例３（糖尿病予防効果の測定） １０匹の６週齢、平均体重２５ｇの■型糖尿病のモデル
動物であるＮＯＤマウス（ソフトサイエンス社発行、京
極方久編「難病疾患のモデルと動物実験Ｊ、１４０〜１
４８頁、１９８４年）の雄に週１回合計７回、３μｇず
つの小麦ＬＰＳを生理的食塩水に溶解して静注した。対
照群７匹には生理的食塩水のみを静注した。２００週齢
達した時にテステーブ（■塩野義製薬販売）を使用して
糖尿の有無をを検査した。結果、対照群では７匹中３匹
に糖尿が検出されたく発症率４３％）が、小麦ＬＰＳて
は１匹も糖尿は検出されなかった。

実験例４（糖尿病治療効果の測定） インスリン投与を続けているにもかかわらす尿糖値が士
〜＋＋と評価されている７０才の男性に、製造例１て生
産された粉末Ａａ２を１ｍｇ／ｍｕ（リムラステスト陽
性ＬＰＳ量で１８ｇ　／　ｍλ）含む５０　ｗ　／　ｖ
％グリセリン液（グリセリン：水＝１　：　１）を入浴
後に足の裏、大腿部の内側、耳の付は根の後ろに合計約
１０ｃｃｍ付さｔたら、塗付開始１０日月頃から尿糖値
の評価は−になり、以後約５か月間その状態が継続して
いる。

投与量、投与間隔、毒性値 本発明のＬＰＳを抗糖尿病剤動物用抗糖尿病剤として投
与するさいの量、投与間隔は、当然、担当医師或いは獣
医師の厳重な管理下、投与対象の年齢、症状、体重、投
与効果を勘案して個別に決定されるが、人間の成人（６
０ｋ　ｇ）で、経口投与で１１１　ｇ　〜１００　ｍ　
ｇ、静脈投与で１０ｎｇ〜１　ｍ　ｇ　、経皮投与で１
１００ｎ〜１　ｍ　ｇが１日１回の投与量の一応の目安
となる。なお、動物では、牛、馬等の大型動物は上記の
量の６０分の１を体重１ｋｇ当たりの量の目安とし、豚
、犬、猫等の中型、小型の動物ではその２倍量を体重１
ｋｇ当たりの量の目安とし、鶏等の鳥類では更にその２
倍量を体重１ｋｇ当たりの量の目安とし投与できる。

又、小麦ＬＰＳ（１！造例１）、クロレラＬＰＳ（ＩＩ
造例２）、大腸菌ＬＰＳ　［米国デイフコ（Ｄｉｆｃｏ
）社製０１２Ｂ：８８）、百日咳菌ＬＰＳ（製造例３）
の毒性値ＬＤｓ＠（１群２匹の雄ＢＡＬＢ／Ｃマウス、
平均体重４５ｇ、における平均値）は次の通りであった
。

［発明の効果］ 本発明により、抗糖尿病効果が高くて副作用が少なく、
従って化学療法係数が高く、生産コストが低く、しかも
、経口、経皮、注射での投与が可能な、大量に供給可能
な新規な抗糖尿病剤、動物用抗糖尿病剤が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、小麦ＬＰＳをガスクロマトグラフィーにかけ
て得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピーク
を図示したチャートである。 第２図は、大腸菌ＬＰＳをガスクロマトグラフィーにか
けて得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピー
クを図示したチャートである。 第３図は、百日咳菌ＬＰＳをガスクロマトグラフィーに
かけて得られる、分子中における脂肪酸の存在を示すピ
ークを図示したチャートである。 第４〜７図は、マクロファージ活性化能とリムラステス
ト陽性ＬＰＳ含有量との相間間係が本発明の条件を満た
している各種ＬＰＳの当該相関間係を示すグラフである
。 第４〜７図において、縦軸はマクロファージ活性化能（
％）を表し、横軸（対数尺ンはリムラステスト陽性ＬＰ
Ｓ含有量（ｎｇ／培養液ｍ１Ｌ）を表している。 第４図において、Ｏはターメリックの、・はカンボーイ
の、口はコンブの、■はアサクサノリのデータを示す。 第５図において、○はワカメ芽株エキスの、・は芽ヒジ
キの、口はエビオスのデータを示す。 第６図において、○は冬虫夏草の、・はワカメ芽株の、
口はクロレラのデータを示す。 第７図において、○は大腸菌ＬＰＳの、・は小麦ＬＰＳ
の、口は百日咳菌ＬＰＳの、■二よりビトＡのデータを
示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ＬＰＳを含む抗糖尿病剤であり、 インビトロで培養されるマクロファージのＴＮＦ産生能
   を活性化するＬＰＳのマクロファージ活性化能を指標と
   し、 縦軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロファージ
   のＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化能を０％
   、マクロファージのＴＮＦ産生量を最大恒量にする時の
   ＬＰＳのマクロファージ活性化能を１００％とするマク
   ロファージ活性化能（％）を表し、横軸に、そのＬＰＳ
   のリムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対数尺で表すシグ
   モイド曲線を描くとき、 マクロファージ活性化能のＥＤ＿５＿０を与えるリムラ
   ステスト陽性ＬＰＳ含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養
   液ｍｌであるＬＰＳの少なくとも１種を含む抗糖尿病剤
   。 （２）ＬＰＳが、植物から得られるＬＰＳ、細菌から得
   られるＬＰＳ及びリピドＡからなる群から選択される、
   請求項１記載の抗糖尿病剤。 （３）植物が裸子植物、単子葉類植物、双子葉類植物、
   シダ植物、ソウ類植物、菌類植物及びそれらの混合物か
   らなる群から選択されるものである、請求項２記載の抗
   糖尿病剤。（４）裸子植物がマツ科マツ属植物である、
   請求項３記載の抗糖尿病剤。 （５）マツ科マツ属植物がマツである、請求項４記載の
   抗糖尿病。 （６）単子葉類植物がイネ科のイネ属植物、コムギ属植
   物、オオムギ属植物、カラス麦属植物、ササ属植物、ジ
   ュズダマ属植物、アヤメ科のアヤメ属植物、ユリ科のネ
   ギ属植物、キジカクシ属植物、ジャノヒゲ属植物、ショ
   ウガ科のショウガ属植物、ウコン属植物、サトイモ科ハ
   ンゲ属植物及びそれらの混合物からなる群から選択され
   るものである、請求項３記載の抗糖尿病剤。 （７）イネ科イネ属植物がイネである、請求項６記載の
   抗糖尿病剤。 （８）イネ科コムギ属植物が小麦である、請求項６記載
   の抗糖尿病剤。 （９）イネ科オオムギ属植物が大麦、裸麦及びそれらの
   混合物からなる群から選択されるものである、請求項６
   記載の抗糖尿病剤。 （１０）イネ科カラス麦属植物が烏麦、燕麦及びそれら
   の混合物からなる群から選択される、請求項６記載の抗
   糖尿病剤。 （１１）イネ科ササ属植物がクサ笹である、請求項６記
   載の抗糖尿病剤。 （１２）イネ科ジュズダマ属植物が鳩麦である、請求項
   ６記載の抗糖尿病剤。 （１３）アヤメ科アヤメ属植物がアヤメである、請求項
   ６記載の抗糖尿病剤。 （１４）ユリ科ネギ属植物がニンニクである、請求項６
   記載の抗糖尿病剤。 （１５）ユリ科キジカクシ属植物がアスパラガスである
   、請求項６記載の抗糖尿病剤。 （１６）ユリ科ジャノヒゲ属植物がジャノヒゲである、
   請求項６記載の抗糖尿病剤。 （１７）ショウガ科ショウガ属植物がミョウガである、
   請求項６記載の抗糖尿病剤。 （１８）ショウガ科ウコン属植物がウコンである、請求
   項６記載の抗糖尿病剤。 （１９）サトイモ科ハンゲ属植物がカラスビシャクであ
   る、請求項６記載の抗糖尿病剤。（２０）小麦から得ら
   れるＬＰＳが次の物性を有するものである、請求項８記
   載の抗糖尿病剤。 分子量：８，０００±１，０００（ＳＤＳ電気泳動法） リン数：１以上／分子量８千 ヘキソサミン数：６±２／分子量８千 脂肪酸数：６±２／分子量８千 ＫＤＯ数：５±１／分子量８千 （２１）双子葉類植物がマメ科のダイズ属植物、インゲ
   ンマメ属植物、ソラマメ属植物、クズ属植物、カンゾウ
   属植物、ナス科のナス属植物、トマト属植物、トウガラ
   シ属植物、バラ科のビワ属植物、サクラ属植物、クスノ
   キ科アボガド属植物、クルミ科クルミ属植物、ウリ科の
   トウナス属植物、アマチャヅル属植物、アブラナ科ダイ
   コン属植物、マタタビ科マタタビ属植物、ドクダミ科ド
   クダミ属植物、コショウ科コショウ属植物、シキミ科シ
   キミ属植物、ニクズク科ニクズク属植物、ミカン科ミカ
   ン属植物、ウコギ科オタネニンジン属植物、セリ科サポ
   シュニコビア属植物、ツヅラフジ科オオツヅラフジ属植
   物、アカネ科カギカズラ属植物及びそれらの混合物から
   なる群から選択されるものである、請求項３記載の抗糖
   尿病剤。 （２２）マメ科ダイズ属植物が大豆である、請求項２１
   記載の抗糖尿病剤。 （２３）マメ科インゲンマメ属植物が小豆である、請求
   項２１記載の抗糖尿病剤。 （２４）マメ科ソラマメ属植物がそら豆である、請求項
   ２１記載の抗糖尿病剤。 （２５）マメ科クズ属植物がクズである、請求項２１記
   載の抗糖尿病剤。 （２６）マメ科カンゾウ属植物がナンキンカンゾウであ
   る、請求項２１記載の抗糖尿病剤。 （２７）ナス科ナス属植物がジャガイモ、トウガラシ及
   びそれらの混合物からなる群から選択されるものである
   、請求項２１記載の抗糖尿病剤。 （２８）ナス科トマト属植物がトマトである、請求項２
   １記載の抗糖尿病剤。 （２９）ナス科トウガラシ属植物がトウガラシである、
   請求項２１記載の抗糖尿病剤。 （３０）バラ科ビワ属植物がビワである、請求項２１記
   載の抗糖尿病剤。 （３１）バラ科サクラ属植物がモモである、請求項２１
   記載の抗糖尿病剤。 （３２）クスノキ科アボガド属植物がアボガドである、
   請求項２１記載の抗糖尿病剤。 （３３）クルミ科クルミ属植物がクルミである、請求項
   ２１記載の抗糖尿病剤。 （３４）ウリ科トウナス属植物がカボチャである、請求
   項２１記載の抗糖尿病剤。 （３５）ウリ科アマチャヅル属植物がアマチャヅルであ
   る、請求項２１記載の抗糖尿病剤。 （３６）アブラナ科ダイコン属植物がカイワレダイコン
   である、請求項２１記載の抗糖尿病剤。 （３７）マタタビ科マタタビ属植物がマタタビである、
   請求項２１記載の抗糖尿病剤。 （３８）ドクダミ科ドクダミ属植物がドクダミである、
   請求項２１記載の抗糖尿病剤。 （３９）コショウ科コショウ属植物が胡椒である、請求
   項２１記載の抗糖尿病剤。 （４０）シキミ科シキミ属植物がダイウイキョウである
   、請求項２１記載の抗糖尿病剤。（４１）ニクズク科ニ
   クズク属植物がニクズクである、請求項２１記載の抗糖
   尿病剤。 （４２）ミカン科ミカン属植物がダイダイである、請求
   項２１記載の抗糖尿病剤。 （４３）ウコギ科オタネニンジン属植物がオタネニンジ
   ンである、請求項２１記載の抗糖尿病剤。 （４４）セリ科サポシュニコビア属植物がボウフウであ
   る、請求項２１記載の抗糖尿病剤。 （４５）ツヅラフジ科オオツヅラフジ属植物がオオツヅ
   ラフジである、請求項２１記載の抗糖尿病剤。 （４６）アカネ科カギカズラ属植物がウンカリア・ヒル
   スタである、請求項２１記載の抗糖尿病剤。 （４７）シダ植物がトクサ科トクサ属植物、ゼンマイ科
   ゼンマイ属植物及びそれらの混合物からなる群から選択
   されるものである、請求項３記載の抗糖尿病剤。 （４８）トクサ科トクサ属植物がスギナである、請求項
   ４７記載の抗糖尿病剤。 （４９）ゼンマイ科ゼンマイ属植物がゼンマイである、
   請求項４７記載の抗糖尿病剤。 （５０）ソウ類植物がカッソウ類植物、紅ソウ類植物、
   緑ソウ類植物、ランソウ類植物及びそれらの混合物から
   なる群から選択されるものである、請求項３記載の抗糖
   尿病剤。 （５１）カッソウ類植物がコンブ科のワカメ属植物、コ
   ンブ属植物、ホンダワラ科ヒジキ属植物及びそれらの混
   合物からなる群から選択されるものである、請求項５０
   記載の抗糖尿病剤。 （５２）コンブ科ワカメ属植物がワカメである、請求項
   ５１記載の抗糖尿病剤。 （５３）コンブ科コンブ属植物がコンブである、請求項
   ５１記載の抗糖尿病剤。 （５４）ホンダワラ科ヒジキ属植物がヒジキである、請
   求項５１記載の抗糖尿病剤。 （５５）紅ソウ類植物がウシケノリ科アマノリ属植物で
   ある、請求項５０記載の抗糖尿病剤。 （５６）ウシケノリ科アマノリ属植物がアサクサノリで
   ある、請求項５５記載の抗糖尿病剤。 （５７）緑ソウ類植物がオオシスティス科クロレラ属植
   物である、請求項５０記載の抗糖尿病剤。 （５８）オオシスティス科クロレラ属植物がクロレラで
   ある、請求項５７記載の抗糖尿病剤。 （５９）クロレラから得られるＬＰＳが次の物性を有す
   るものである、請求項５８記載の抗糖尿病剤。 分子量＝４０，０００〜９０，０００（ＳＤＳ電気泳動
   法） リン数＝４±１／分子量１万 ヘキソサミン数＝７±１／分子量１万 脂肪酸数＝６±１／分子量１万 ＫＤＯ数＝２±１／分子量１万 （６０）菌類植物が担子菌類植物、子ノウ菌類植物及び
   それらの混合物からなる群から選択されるものである、
   請求項３記載の抗糖尿病剤。 （６１）担子菌類植物がヒラタケ科マツオウジ属植物、
   キシメジ科のエノキタケ属植物、シメジ属植物、タコウ
   キン科マイタケ属植物、サルノコシカケ科ポリポラス属
   植物、ハラタケ科ハラタケ属植物、キクラゲ科キクラゲ
   属植物、モエギタケ科スギタケ属植物及びそれらの混合
   物である、請求項６０記載の抗糖尿病剤。 （６２）ヒラタケ科マツオウジ属植物が椎茸である、請
   求項６１記載の抗糖尿病剤。 （６３）キシメジ科エノキタケ属植物がエノキ茸である
   、請求項６１記載の抗糖尿病剤。（６４）キシメジ科シ
   メジ属植物がシメジである、請求項６２記載の抗糖尿病
   剤。 （６５）タコウキン科マイタケ属植物がマイ茸である、
   請求項６１記載の抗糖尿病剤。 （６６）サルノコシカケ科ポリポラス属植物がアワビ茸
   である、請求項６１記載の抗糖尿病剤。 （６７）ハラタケ科ハラタケ属植物がマッシュルームで
   ある、請求項６１記載の抗糖尿病剤。 （６８）キクラゲ科キクラゲ属植物がキクラゲである、
   請求項６１記載の抗糖尿病剤。 （６９）モエギタケ科スギタケ属植物がナメコである、
   請求項６１記載の抗糖尿病剤。 （７０）子ノウ菌類植物がエンドミセタセア科サッカロ
   ミセス属植物、バッカクキン科ノムシタケ属植物及びそ
   れらの混合物である、請求項６０記載の抗糖尿病剤。 （７１）エンドミセタセア科サッカロミセス属植物が、
   パン酵母、醸造用酵母及びそれらの混合物である、請求
   項７０記載の抗糖尿病剤。 （７２）バッカクキン科ノムシタケ属植物が冬虫夏草で
   ある、請求項７０記載の抗糖尿病剤。 （７３）細菌が大腸菌、百日咳菌及びそれらの混合物か
   らなる群から選択されるものである、請求項３記載の抗
   糖尿病剤。 （７４）大腸菌から得られるＬＰＳが次の物性を有する
   ものである、請求項７３記載の抗糖尿病剤。 分子量＝３０，０００±５，０００（ＳＤ Ｓ電気泳動法） リン数＝１２／分子量３万 ヘキソサミン数＝４５±６／分子量３万 脂肪酸数＝１８／分子量３万 ＫＤＯ数＝５±１／分子量３万 （７５）百日咳菌から得られるＬＰＳが次の物性を有す
   るものである、請求項７３記載の抗糖尿病剤。 分子量＝６，０００±１，０００ ９，０００±１，０００ （ＳＤＳ電気泳動法） リン数＝５／分子量８千 ヘキソサミン数＝１６±２／分子量８千 脂肪酸数＝５／分子量８千 ＫＤＯ数＝２±１／分子量８千 （７６）ＬＰＳを含む動物用抗糖尿病剤であり、インビ
   トロで培養されるマクロファージのＴＮＦ産生能を活性
   化するＬＰＳのマクロファージ活性化能を指標とし、縦
   軸に、そのＬＰＳを添加しないときのマクロファージの
   ＴＮＦ産生量を与えるマクロファージ活性化能を０％、
   マクロファージのＴＮＦ産生量を最大恒量にする時のＬ
   ＰＳのマクロファージ活性化能を１００％とするマクロ
   ファージ活性化能（％）を表し、横軸に、そのＬＰＳの
   リムラステスト陽性ＬＰＳ含有量を対数尺て表すシグモ
   イド曲線を描くとき、 マクロファージ活性化能のＥＤ＿５＿０を与えるリムラ
   ステスト陽性ＬＰＳ含有量が０．４〜１００ｎｇ／培養
   液ｍｌであるＬＰＳの少なくとも１種を含む動物用抗糖
   尿病剤。