JPH04330017A - 安定化ｆｇｆ組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は熱、酸および／またはた
んぱく質分解性環境における線維芽細胞成長因子（ＦＧ
Ｆ）を安定化させる方法に関し、ＦＧＦとシュークロー
スオクタスルフェート（ＳＯＳ）の塩、特にアルミニウ
ム塩（シュークラルフェート、ｓｕｃｒａｌｆａｔｅ）
もしくはカリウム塩とを結合もしくは複合体とさせるこ
とによってＦＧＦを安定化させる方法に関する。本発明
はまた、ＳＯＳおよびＦＧＦを含有するＦＧＦ−安定化
組成物に関するものである。この組成物はＦＧＦ応答性
の病気の処置、例えば消化器官の傷や潰瘍性の状態の処
置に用いることができるものである。本発明はまたＳＯ
Ｓを種々の診断薬剤における診断薬キットの一成分とし
て用いることに関するものである。更に、本発明はＦＧ
Ｆの精製にＳＯＳを使用することに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】消化器官の潰瘍性疾患は、このものは一
般的に消化性潰瘍として引用されるが、消化器官の内皮
において欠陥がある疾患である。このタイプの欠陥は通
常、塩酸とペプシンとの結合作用によって生ずるもので
ある。定義として、消化性潰瘍は少なくとも粘膜下組織
に浸透しているものを言い、より表面的な病巣はびらん
と称される。消化性潰瘍は胃、十二指腸もしくは食道を
含む消化器官の多くの部位、外科的に引き起こされる吻
合の部位、メッケル（Ｍｅｃｋｅｌ）の憩室、そしてま
れには上部空腸において生ずることがある。

【０００３】２０年前には、消化性潰瘍の治療としては
、ベッドで休んでいるか、ただもう食事制限をするか、
制酸剤を飲むか、および／または影響を受けている領域
の外科的除去からなるものであった。最近では、消化性
潰瘍の治療にＨ２受容体アンタゴニスト（拮抗剤）が使
われるようになった。最も普通に使用される２つのＨ２
受容体アンタゴニストとして、ラニチジン（ｒａｎｉｔ
ｉｄｉｎｅ）およびシメチジン（ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ
）があり、両者は胃酸分泌を阻害することによって治療
的に作用するものである。これら２つのアンタゴニスト
の効果および望ましくない副作用については、例えばト
ーマスらによりクリニックス　　イン　　ガストロエン
テロロジー（Ｃｌｉｎｉｃｓ　　ｉｎ　　Ｇａｓｔｒｏ
ｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ），１３巻，第２号，５０１−５
２９頁において精力的に研究されている。

【０００４】これらのアンタゴニストによる治療は広く
行なわれておりまた比較的成功しているが、多くの消化
性潰瘍はＨ２受容体アンタゴニスト療法に反応しない。 例えば、その理由ははっきりしていないのであるが、十
二指腸潰瘍の約２０から３０％は、シメチジンもしくは
ラニチジンのいずれかによる治療後４から６週間後経っ
ても治癒しない。その上、潰瘍性状態の再発もしくは回
帰は、Ｈ２受容体アンタゴニストの場合には珍らしいこ
とではないのである。

【０００５】シュークラルフェートもまた副作用が非常
に少ない潰瘍治療剤として使われてきた。シュークラル
フェートは、ｉ）ペプシンおよび胆汁酸の吸収、ｉｉ）
胃粘膜による粘液分泌および重曹分泌の消化性刺激とい
った細胞保護活性、ｉｉｉ）増殖領域（ｐｒｏｌｉｆａ
ｃｔｉｖｅ　　ｚｏｎｅ）に対する損傷に対する保護、
ｉＶ）血管の完全性の保護、といった事を含めた消化管
保護および修復／治療の多岐にわたる機構に影響を及ぼ
すと考えられている。シュークラルフェートがいかにし
てただれや潰瘍を阻止するか、またどのようにしてそれ
が潰瘍の治癒を促進するのかについては多くのことが分
かってきているが、この薬の長期にわたる治療作用の解
明については多くのことが分かっていないのである。

【０００６】線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は強力な脈
管形成因子であることが、なかんずく傷修復における新
血管形成（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を
担っていることが示されてきた。ＦＧＦには２つのタイ
プ、即ち酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）および塩
基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）がある。しかしａ
ＦＧＦおよびｂＦＧＦは酸および／または熱に不安定で
ある。即ち、消化性潰瘍の治療におけるような酸性およ
び／または熱条件下でのＦＧＦの使用に際しては、その
治療的価値を最大限にするためにこのような環境に対し
てその薬の安定化を計ることが要求されるしかしながら
、最近、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８９０３４６７（
１９９０年３月８日出願）において、これは参考のため
にここに挙げるのであるが、ｉ）グリコサミノグリカン
、グルカンスルフェートおよび硫酸化シクロデキストリ
ン、ｉｉ）Ｈ２受容体アンタゴニストのような抗分泌剤
、ｉｉｉ）細胞保護剤、およびｉＶ）制酸剤といったも
のと組み換えＦＧＦとの組合せを含むある種の酸−耐性
ＦＧＦ組成物が開示されている。これらの新規な組成物
は、このものがさらされている酸および／または熱環境
がなかったらＦＧＦが強力な治療剤であるような病気の
治療に非常に有効であるものとして記載されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、消化管
の状態や傷等の治療においてその診断力および治療力が
発揮することができるように、ＦＧＦをさらに安定化さ
せるための新しい方法を見出す必要性が続いているので
ある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明はＦＧＦを安定化
させる方法を提供するものであり、その方法は、ＦＧＦ
とシュークロースオクタスルフェート（ＳＯＳ）の塩、
特にアルミニウム塩（シュークラルフェート、ｓｕｃｒ
ａｌｆａｔｅ）もしくはカリウム塩とを結合もしくは複
合体とさせることによってＦＧＦを安定化させるもので
ある。ここで使用されている“ＳＯＳ”はシュークロー
スオクタスルフェート（ＳＯＳ）の塩、例えばアルミニ
ウム塩（シュークラルフェート、ｓｕｃｒａｌｆａｔｅ
）もしくはカリウム塩を含むものであるが、これらに限
定されるものではない。本発明の安定化ＦＧＦ組成物は
ＦＧＦ応答性である何らかの病気を、特に酸性もしくは
熱環境にあるようなもしくは蛋白分解性の因子が存在す
る環境にあるような病気を実質的にもっている哺乳動物
を治療するために用いることができる。殊に、本発明の
組成物は患者に有効量のＦＧＦとＳＯＳの組合せを、薬
剤学的に許容し得る担体、賦形剤もしくは希釈剤と共に
投与することにより、消化管の潰瘍病を治療するために
用いることができる。この組成物はまた、このものがな
ければ蛋白分解性の薬剤がＦＧＦの治療的価値を阻害す
るような傷の治療に有用である。

【０００９】本発明の他の観点によれば、ＳＯＳはＦＧ
Ｆに対して高い親和性を有することが見出されたので、
ＦＧＦが存在することおよび／またはその量が重要であ
るような診断への応用に有用である他、ＦＧＦの精製に
おいても有用なものである。

【００１０】本発明は哺乳動物におけるＦＧＦ治療法に
反応する病気の治療および／または予防のための新規な
安定化ＦＧＦ組成物を提供するものである。本発明はま
た、ＦＧＦの存在および／またはＦＧＦの量が明らかに
されなければならないような或る種の診断への適用と同
様に、ＦＧＦを精製する方法を提供するものである。

【００１１】ＦＧＦ応答性病気を治療する方法は、その
最も簡単な形態としては、有効量の安定化ＦＧＦ組成物
もしくはその薬剤学的に許容し得る塩を哺乳動物に投与
するものであり、この安定化ＦＧＦ組成物はＳＯＳをＦ
ＧＦと配合して含有するものである。

【００１２】例えば、消化管の種々の潰瘍性病気は、有
効量の安定化ＦＧＦ組成物を哺乳動物に投与するこによ
って処置される。この潰瘍性病気としては局部的回腸炎
、潰瘍性大腸炎および消化性潰瘍（十二指腸もしくは胃
）などがある。

【００１３】本発明の安定化ＦＧＦ組成物は、酸性、熱
および／または蛋白分解性の環境がなければＦＧＦ治療
法に反応するような、哺乳動物における他の症状を治療
するために用いることができる。例えば膀胱癌の放射線
治療もしくは化学治療においては該器官組織の潰瘍がし
ばしば生ずるものであり、この潰瘍はもしＦＧＦが膀胱
において見られるような酸性環境に安定であるならＦＧ
Ｆで治療できるものである。傷はまた、本発明の安定化
ＦＧＦ組成物に反応するような酸性および／または蛋白
分解性の環境をつくり出すことがある。酸、熱もしくは
蛋白分解性の環境が存在し、もしこのような環境が存在
しなければＦＧＦ治療に応答するような他の症状は当業
者には自明のものであり、次のようなものを包含するも
のである。ｉ）組織損傷、火傷、傷、外科手術後の組織
、血栓症、動脈硬化症；ｉｉ）骨折のような筋−骨格（
ｍｕｓｃｕｌｏ−ｓｋｅｌｅｔａｌ）異常、靱帯および
アキレス腱の治療、腱炎および滑液嚢炎、小さな火傷、
切り傷、裂傷、床ずれなどの皮膚の異常、糖尿病におい
て見られるような回復の遅い慢性的な潰瘍や虚血および
心筋梗塞時の組織修復のような肌の異常；およびｉｉｉ
）糖尿病性網膜症や血管新生緑内障を含む眼の網膜症、
乾癬および水晶体後線維増殖を含む皮膚の疾患、慢性の
炎症、リウマチ性関節炎、および血管腫（ｈｅｍａｎｇ
ｉｏｍａｓ）や血管繊維増殖のようなある種の良性およ
び悪性腫瘍の成長のように高度に血管新生性である或る
種の新生腫瘍、そして固型癌といったものである。

【００１４】本発明の安定化ＦＧＦ組成物はＳＯＳとａ
ＦＧＦもしくはｂＦＧＦとの組成物であることができる
。本発明を実施する際に有用なａＦＧＦおよびｂＦＧＦ
は、ヒト、ウシ、サル、ブタおよびウマのような哺乳動
物を含む多数の起源に由来することができる。

【００１５】好ましい安定化ＦＧＦ組成物は、ＦＧＦ成
熟蛋白質の２５，６９，８７および９２のアミノ酸残基
に存在する４つのシステインの内の１もしくはそれ以上
がセリンに変換されていることによってミューテーショ
ンが誘導されている精製された組換え型ヒト塩基性ＦＧ
Ｆ（ｒｈｂＦＧＦ）蛋白質のような改変ＦＧＦ（ムテイ
ン）を含有するものである。ヒトｂＦＧＦを構成するア
ミノ酸の番号付けに当っては、Ｎ−末端のＰｒｏが第１
番目のアミノ酸となる。最も好ましいＦＧＦはｒｈｂＦ
ＧＦムテインＣＳ２３であって、このものの構造は妹尾
ら、バイオケミカル　　アンド　　バイオフィジカル　
　リサーチ　　コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，　１５１，
Ｎｏ．２，７０１−７０８（１９８８）；および米国特
許出願第１６１，１２３号（１９８８年２月１８日出願
）このものはヨーロッパ公開２８１，８２２　　Ａ２に
相当；に十分に述べられている。この開示は参考のため
にここに記載されているものである。本発明を実施する
ために使用することができ、またこれらの文献にも記載
されている他のムテインとしては、アミノ酸が追加され
ていたり、構成アミノ酸が削除されていたり、また置換
されていたりするものが包含される。

【００１６】本発明による安定化ＦＧＦ組成物は、酸、
熱および蛋白分解性環境において高度に安定であること
が見出された。天然の哺乳動物のＦＧＦおよび上記のよ
うにして耐酸性であるように組換えにより改変されたＦ
ＧＦは、その毒性が非常に低い。

【００１７】ＦＧＦを安定化するために用い得るシュー
クロースオクタスルフェートの２つの好ましい形態はＳ
ＯＳカリウム塩およびＳＯＳアルミニウム塩（シューク
ラルフェート）である。好ましい安定化されたＦＧＦ組
成物を製造するに当ってどちらの形のシュークロースオ
クタスルフェートを用いるかは、投与経路、溶解のため
に必要とされる条件等を含んだ多くの因子次第である。 消化管の病気の治療のために、好ましいＳＯＳはＳＯＳ
アルミニウム塩である、というのはこのものは血流中に
吸収されないからである。

【００１８】本発明の安定化ＦＧＦ組成物の好ましい投
与経路は同様に、治療される状態および患者にとっての
都合を含めた多くの因子に依っている。例えば、放射線
治療もしくは化学療法によって引き起こされた膀胱の潰
瘍性の傷を治療するために用いられるときは、この安定
化ＦＧＦ組成物は尿道内カテーテルによって投与するこ
とができる。消化管の潰瘍性傷を治療するに当っては、
好ましい投与経路は経口であって、例えば錠剤、カプセ
ル剤、ハッカドロップもしくはチューイングガムによる
。消化管の病気のための他の投与経路としては直腸経由
で浣腸や注射による。

【００１９】投与のための安定化ＦＧＦ組成物の製造は
常法によって行われる。例えば錠剤やカプセルは薬剤学
的に許容し得る担体（例えばラクトース、コーンスター
チ、軽質無水ケイ酸、微結晶性セルロース、シュークロ
ース）、結合剤（例えばアルファ型でんぷん、メチルセ
ルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプ
ロピルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチルセルロ
ース、ポリビニルピロリドン）、崩壊剤（例えばカルボ
キシメチルセルロースカルシウム、でんぷん、低置換ヒ
ドロキシプロピルセルロース）、界面活性剤（例えばＴ
ｗｅｅｎ　　８０（Ｋａｏ−Ａｔｌａｓ）、Ｐｌｕｒｏ
ｎｉｃ　　Ｆ６８（旭電化、日本）；ポリオキシエチレ
ン−ポリオキシプロピレン共重合体）、抗酸化剤（例え
ばＬ−システイン、亜硫酸ナトリウム、アスコルビン酸
ナトリウム）、潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウ
ム、タルク）等の添加剤を使用することによって製造さ
れる。

【００２０】直腸製剤もまた常法で製造され、例えば油
性の基剤を用いてつくられ、この油性基剤としては高級
脂肪酸グリセライド（例えば天然カカオ脂、Ｗｉｔｅｐ
ｓｏｌｓ（半合成基剤、（ダイナマイト　　ノーベル、
ドイツ連邦共和国））、中級脂肪酸グリセライド（例え
ばＭｉｇｌｙｏｌｓ（ダイナマイト　　ノーベル））ま
たは植物油（例えばゴマ油、大豆油、コーン油、綿実油
、オリーブ油）がある。

【００２１】この組成物が注射可能な水溶液に調剤され
るとき、この溶液は水性溶剤（例えば蒸留水、生理的食
塩水、リンゲル液）もしくは油性溶剤（例えばゴマ油、
オリーブ油）のような溶剤を用いた常法により製造され
る。所望により１もしくはそれ以上の添加剤を加えるこ
とができる。このような添加剤として、溶解補助剤（例
えばサリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、緩衝剤
（例えばクエン酸ナトリウム、グリセリン）、等張化剤
（例えばグルコース、転化糖）、安定化剤（例えばヒト
血清アルブミン、ポリエチレングリコール）、防腐剤（
例えばベンジルアルコール、フェノール）または鎮痛剤
（例えばベンザルコニウムクロライド、プロカイン塩酸
塩）が挙げられる。ＳＯＳのカリウム塩はその溶解性の
故に静脈内投与に使用されるのが好ましい。

【００２２】この組成物が固体製剤に調剤されるときに
は、この製剤は例えば希釈剤（例えば蒸留水、生理食塩
水、グルコース）、賦形剤（例えばカルボキシメチルセ
ルロース（ＣＭＣ）、アルギン酸ナトリウム）、防腐剤
（例えばベンジルアルコール、ベンザルコニウムクロラ
イド、フェノール）、または鎮痛剤（例えばグルコース
、グルコン酸カルシウム、プロカイン塩酸塩）を用いて
通常の方法により製造される。シュークラルフェートを
用いるのが好ましい。

【００２３】本組成物のＦＧＦ成分の量は、Ｈ２−遮断
薬のような他の薬剤に比べてかなり少量であり、そして
その量は治療される病状、単独で使用されるかそれとも
抗分泌剤，細胞保護剤および制酸剤と共に用いられるか
といったこと、そしてその患者によって摂取されている
食物の量といった多くの因子に左右される。

【００２４】例えば人間の大人の患者の消化管の潰瘍病
を治療する場合、経口的に投与される該組成物のＦＧＦ
蛋白質成分の量は、一般的には１日当り約０．１μｇと
３０ｍｇの間、好ましくは約０．１μｇと１０ｍｇの間
、更に好ましくは１日当り約１．０μｇと３ｍｇの間で
あり、最も好ましくは１日当り約１０μｇと３００μｇ
の間である。経口投与のためには、１０μｇから１５０
μｇのｒｈｂＦＧＦムテインＣＳ２３もしくはその塩を
シュークラルフェート（一般的には約１０ｍｇから１０
００ｍｇのシュークラルフェート）と共に、薬剤学的に
許容し得る担体、希釈剤もしくは他の好適な賦形剤と一
緒にして錠剤もしくはカプセルとして調剤することがで
きる。このような調剤は、投与量が好ましい範囲内にな
るようにして日に１〜４回投与することができる。

【００２５】消化性潰瘍や潰瘍性大腸炎のようなより下
部の消化管のある種の病気に対しては、本安定化ＦＧＦ
組成物は、酸やペプシンのような消化性酵素から該組成
物を更に保護するためにヒドロキシプロピルメチルセル
ロースフタレート、セルロースアセテートフタレートも
しくはメタクリル酸共重合体のような腸溶性共重合体で
被覆するのが好ましい。この被覆された組成物は消化管
のような胃腸管を通りその治療的価値は最適なものとな
る。

【００２６】該安定化ＦＧＦ組成物のＦＧＦ成分を安定
化させるために使用されるＳＯＳの量は溶解性を含めた
多数の因子によって決まってくる。人間に与えられるシ
ュークラルフェートの量は本発明に従って一般的に使用
される量で示される。例えば、経口投与に対しては約０
．１〜６ｇ／日の間（好ましくはいくつかの投与回数に
分ける）の量が、該安定化組成物のＦＧＦ成分と組合せ
て用いることができる。

【００２７】本発明のＳＯＳ組成物は他の塩の形である
こともできる。使用することのできる他の塩は薬剤学的
に許容し得るカチオン、例えばナトリウム、アンモニウ
ム、トリメチルアンモニウム等が挙げられる。

【００２８】ＦＧＦ蛋白質成分を水性媒体中硫酸化ジサ
ッカライドと接触させるとき、ＦＧＦ蛋白質成分に対す
るＳＯＳの割合は重量で約１対１から１０，０００対１
の間までの範囲である。

【００２９】水性媒体中のＳＯＳ濃度は好ましくは約０
．４ｍｇ／ｍｌから４００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは
約０．４ｍｇ／ｍｌから４０ｍｇ／ｍｌの範囲である。 この水性媒体中のＦＧＦ濃度は好ましくは約１ｎｇ／ｍ
ｌから５０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｎｇ
／ｍｌから５００ｎｇ／ｍｌの範囲である。

【００３０】該ＦＧＦ蛋白質成分を水性媒体中でＳＯＳ
と接触させるためには、これらの物質を水性媒体中で単
に混合すればよい。この水性媒体としては、蒸留水、生
理的食塩水、グルコース溶液、リン酸塩緩衝液およびト
リヒドロキシメチル−アミノメタン−ＨＣｌ緩衝液のよ
うな緩衝剤を用いるのが好ましい。この安定化ＦＧＦ組
成物は分離したり回収したりすることなくそのまま用い
ることができる。

【００３１】上記の方法によって高度に安定化されたＦ
ＧＦ組成物が得られ、この組成物はヒト、ラット、モル
モット、イヌ、マウス等の哺乳動物を治療するために安
全に使用することができる。

【００３２】何らかの理論に束縛されたくはないが、シ
ュークラルフェート（ＳＯＳのアルミニウム塩）の胃潰
瘍および十二指腸潰瘍に対する治療効果は、徐放性担体
としておよび内因性ｂＦＧＦの安定化剤として作用し得
るその能力にかかっている。本発明によれば、シューク
ラルフェートは正常な粘膜および細胞外基質からｂＦＧ
Ｆを抽出し、このものを生理学的に活性な形で潰瘍床も
しくは消化管の他の傷ついた領域に運ぶと考えられてい
る。これまでに、多量のｂＦＧＦが細胞外基質に貯蔵さ
れることが示されていた（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ　　ら、
プロシージングスオブ　　ザ　　ナショナル　　アカデ
ミー　　オブ　　サイエンス（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．）（Ｕ
ＳＡ）６４：２２９２−２２９６（１９８７）およびＦ
ｏｌｋｍａｎ　　ら、アメリカン　　ジャーナル　　オ
ブ　　パソロジー（Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．）１
３０：３９３−４００（１９８８））。これは、耐酸性
ｂＦＧＦの外部からの投与が誘導された慢性的十二指腸
潰瘍の迅速な回復に役立つというより早い時期の報告と
合致している（Ｓｚａｂｏら、ダイジェスティブ　　デ
ィジージズ　　アンド　　サイエンシズ（Ｄｉｇ．Ｄｉ
ｓ．Ｓｃｉ．）：３４：１３２３（１９８９）および上
記と関連したＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ／０３４６７を参
照されたい）。すなわち本発明によれば、該ＳＯＳ安定
化ＦＧＦは傷、火傷、潰瘍の回復等における生理学的活
性を延長させることができると考えられる。

【００３３】本発明の他の実施態様によれば、シューク
ラルフェートに対する親和性を有するＦＧＦのような化
合物を試料から分離、精製し同定する方法を提供するも
のである。

【００３４】一般的に、この方法はＦＧＦ（もしくはシ
ュークラルフェートと結合あるいは錯体をつくる他の化
合物）を含有する試料をその成分としてＳＯＳを含有す
るカラムと接触させることを包含するものである。この
試料中に存在するＦＧＦはどのようなものもこのカラム
のシュークラルフェート成分と結合するであろう。この
ＦＧＦは該カラムから適当な高濃度の塩もしくは酢酸等
の酸を用いて溶出させることができる。

【００３５】この実施態様の別のやり方としては、ＦＧ
ＦはＰＣＴ出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ８８／０１６６０（
国際公開Ｎｏ．ＷＯ８９／０８１４４）（参考のために
記載）に記載された型の両親和性カラムと接触させるこ
とができ、この場合シュークラルフェートは該両親和性
カラムのヘパリン成分と置き換えて考えられる。

【００３６】好ましい１つの態様としては、シュークラ
ルフェートセファロースカラムはシュークラルフェート
とセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、登録商標）ビー
ズ（ファルマシア　　ファイン　　ケミカルズ、スウェ
ーデン）とを重量比約１対１０の割合で混合することに
よって行われる。

【００３７】本発明を行なうに当って使用し得る溶出液
は、標準的な親和性カラムが用いられているか、両親和
性カラムが用いられているかに依るであろう。一般的に
、食塩のような高濃度の塩の溶液が、標準的な親和性カ
ラムからＦＧＦを溶出するために用いられる。他の溶出
液としては酢酸などがある。好ましい溶出液は普通には
、生理的食塩水およびｐＨを約７に保持するような好適
な緩衝剤を含有する水溶液である。好ましい緩衝剤組成
物は約１０ｍＭの濃度のＴｒｉｓである。両親和性カラ
ムとしては上で挙げたＰＣＴ出願で検討されているよう
なものが、またそこで記載されている溶出液が用いられ
る。

【００３８】本発明の他の実施態様としては、シューク
ラルフェートとＦＧＦの種々の診断系への適用である。 例えば、尿中のヘパリン結合性内皮細胞成長活性の量は
膀胱癌では増加している（Ｃｈｏｄａｋ，Ｇ．Ｗ．ら、
キャンサー　　リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅｓ．）
４５：６９０−６９４，１９８５；および４６；５５０
７−５５１０，１９８６）。すなわち、ＳＯＳを一定量
のびん中で使用するとその試料中に存在するその活性を
安定化させ、また癌指示薬としてのＦＧＦの感受性およ
び信頼性を上げさせるものである。

【００３９】同様に、脊髄液中のＦＧＦが脳腫瘍の発生
率と関係づけられてきた。上記のように、脊髄液中に存
在するＦＧＦを安定化することによってこの癌定量の感
受性および信頼性を増大させるためにＳＯＳを用いるこ
ともできよう。

【００４０】最も簡単な形態としては、このような定量
法は、ＦＧＦを含有しているのではないかと疑われる試
料液をＳＯＳと接触させ、この液のＳＯＳとＦＧＦの複
合体について分析するものである。この方法はＢＡＬＢ
／ｃマウス３Ｔ３細施のＤＮＡ中への〔Ｈ３〕チミジン
の取り込みを測定する（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ　　ら、プ
ロシージングス　　オブ　　ナショナル　　アカデミー
　　オブ　　サイエンス（ＰＮＡＳ）８２；８０５−８
０９，１９８５）ことによって行われ、この文献の記載
は参考のためにここに引用されている。

【００４１】ＳＯＳはまた種々の組織培養中に見出され
るＦＧＦを安定化させる際にも有効であり、試験管内で
４００μｇ／ｍｌの濃度までは細胞に対して非毒性であ
ることが見出された。すなわち、ＳＯＳは該組織培養の
細胞に対して内因性のどのようなＦＧＦをも安定化させ
るために組織培養の一成分として加えることができる。

【００４２】

【作用】ＦＧＦとシュークロースオクタスルフェート（
ＳＯＳ）の塩、特にアルミニウム塩（シュークラルフェ
ート、ｓｕｃｒａｌｆａｔｅ）もしくはカリウム塩とを
結合もしくは複合体とさせることによってＦＧＦを安定
化させる。このＳＯＳ−安定化ＦＧＦ組成物はＦＧＦ単
独では不安定な熱、酸、蛋白質分解性の環境において、
ＦＧＦ応答性の病気の処置、例えば消化器官の傷や潰瘍
性の状態の処置に用いることができる。

【００４３】

【実施例】次に続く実施例１および２で使用されている
組換え型ヒト塩基性ＦＧＦ（ｒｈｂＦＧＦ）は、ＥＰ−
２３７，９６６号の実施例１、３、６もしくは８に記載
された方法で形質転換体エシェリキア　　コリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）Ｋ１２　　ＭＭ２９４
／ｐＴＢ６６９（ＩＦＯ　　１４５３２，ＦＥＲＭＢＰ
−１２８１）を用いて製造することができる。

【００４４】次の実施例１で使用されるｒｈｂＦＧＦム
テインＣＳ２３は、上で挙げたバイオケミカル　　アン
ド　　バイオフィジカル　　リサーチ　　コミュニケー
ションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　ａｎｄ　　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓｉｃａｌ　　ＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎ
ｉｃａｔｉｏｎｓ）１５１巻、７０１−７０８頁（１９
８８）、および米国特許出願第１６１，１２３号（ＥＰ
−２８１，８２２　　Ａ２に相当）の参考例１および２
、および実施例１、６、７および２４に記載された方法
で形質転換体エシェリキア　　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　　ｃｏｌｉ）　　ＭＭ２９４／ｐＴＢ７６２（
ＩＦＯ　　１４６１３，ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６４５）
を用いて製造された。

【００４５】続く実施例は、更に本発明を詳細に説明し
本発明を容易に理解され易くするものであるが、これら
は本発明に制限を加えるものではない。

【００４６】

【実施例１】　　シュークラルフェートによるＦＧＦの
安定化 Ａ．熱に対する安定化 ０．２５μｇのヒトｂＦＧＦを２０μｇのＢＳＡを含有
するＴｒｉｓ緩衝液５０μｌ中で撹拌してＦＧＦを含有
する溶液を調製した。この溶液を６０℃で１０分間２ｍ
ｇのＳＯＳカリウム塩の存在下あるいは非存在下にイン
キュベートした。インキュベーション終了時に、ＢＳＡ
（１ｍｇ／ｍｌ）を含有するＴｒｉｓ緩衝液でｂＦＧＦ
試料を２０倍に希釈し、実質的にＫｌａｇｓｂｒｕｎ　
　らの報告〔プロシージングス　　オブ　　ナショナル
　　アカデミー　　オブ　　サイエンス（ＰＮＡＳ）８
２；８０５−８０９，（１９８５）（この記載は参考の
ためにここに引用されている）〕に記載されたようにし
て、ＢＡＬＢ／ｃマウス３Ｔ３細胞のＤＮＡ中への〔Ｈ
３〕チミジンの取り込みを測定することによって細胞成
長因子活性を測定した。

【００４７】図１から判るように、ＳＯＳカリウム塩は
ＦＧＦを高温に対して安定にさせる。４℃の対照温度に
おいて得られる該活性が白ぬきの棒で表わされている。

【００４８】Ｂ．酸に対する安定化 ０．５μｇのヒトｂＦＧＦを２０μｇのＢＳＡを含有す
る６０μｌの１．５Ｍ酢酸中で撹拌してＦＧＦを含有す
る溶液を調製した。約２．２のｐＨを有するこの溶液を
３７℃で３０分間２ｍｇのＳＯＳカリウム塩の存在下あ
るいは非存在下にインキュベートした。インキュベーシ
ョン終了時に、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を含有するＴｒ
ｉｓ緩衝液でｂＦＧＦ試料を２０倍に希釈し、上記のよ
うにして細胞成長因子活性を測定した。しかしながら、
酸性条件下ではこのｂＦＧＦ試料は不溶性となるので、
遠心分離により清澄化した。この上清液と、ペレットを
ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍｌ）を含有するＴｒｉｓ緩衝液中に
溶解して得られた試料との両者について細胞成長因子活
性を測定した。

【００４９】図２から分かるように、カリウム塩は胃腸
管で見られるような酸性環境に対してＦＧＦを安定化さ
せるのである。対照のｐＨ（ｐＨ　　７）で得られる該
活性が白ぬきの棒で表わされる。

【００５０】Ｃ．蛋白分解因子に対する安定化ｒｈｂＦ
ＧＦムテインＣＳ２３溶液（２００μｇ／ｍｌ）をペプ
シン（４μｇ／ｍｌ）の存在下、シュークラルフェート
と共にｐＨ２．３で３７℃においてインキュベートした
。シュークラルフェートはモル比１：１０で添加した。 得られた分裂促進活性をウシ胎児心臓内皮細胞ＡＴＣＣ
　　ＣＲＬ　　１３９５を用いて測定した。

【００５１】図３から判るように、シュークラルフェー
トはｒｈｂＦＧＦムテインＣＳ２３をペプシンの蛋白質
分解効果から守っている。

【００５２】実施例２　　ＦＧＦシュークラルフェート
の親和性 Ａ．ヘパリン親和性クロマトグラフィーファルマシア製
の高速液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）システムを
用いて、ＦＧＦのシュークラルフェートに対する親和性
を次のように示した：２．５μｇのｂＦＧＦを、０．１
ｍｇのＢＳＡを含有する０．１ｍｌの食塩液中に溶解し
た液をＴＳＫ−ＧＥＬヘパリン５ＰＷカラム（内径３．
５ｃｍ×８ｍｍ、Ｔｏｓｏｈａａｓ、フィラデルフィア
、ペンシルバニア）に負荷した。このカラムを０．６Ｍ
　　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７
（Ｔｒｉｓ緩衝液）であらかじめ平衡化した。負荷後、
このカラムを０．６Ｍ　　ＮａＣｌ含有のＴｒｉｓ緩衝
液１０ｍｌで洗浄した。結合した活性成分を２Ｍ　　Ｎ
ａＣｌもしくは７８ｍＭのＳＯＳカリウム塩を含有する
Ｔｒｉｓ緩衝液４ｍｌで０．５ｍｌ／分の割合で溶出し
た。溶出液を１ｍｌづつ分画し、実施例１に記載された
ようにして細胞成長因子活性を測定した。

【００５３】図４に示されるようにＳＯＳカリウム塩は
７８ｍＭにおいてヘパリン−セファロースカラムからｂ
ＦＧＦを解離する。これは更に、ＳＯＳによって回収さ
れた分裂促進活性が２Ｍ　　ＮａＣｌによって回収され
たものと少なくとも同等であったことを示す（図４、上
図）。以前の研究でｂＦＧＦは固定化ヘパリンにしっか
りと結合するので高濃度のＮａＣｌ（例えば１．５Ｍ）
で溶出できるであろうことが示されていた（Ｓｈｉｎｇ
ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２３：１２９６−
１２９８（１９８４）およびＫｌａｇｓｂｕｒｎら、前
出を参照されたい）ことからして、ｂＦＧＦはヘパリン
と比べて同等もしくはそれより大なる親和性を有すると
言えるようである。

【００５４】Ｂ．シュークラルフェートセファロースク
ロマトグラフィー ０．１ｇのシュークラルフェートと０．８ｍｌ（床容積
）のセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア）を０．６
Ｍ　　ＮａＣｌ中で混合することによって、シュークラ
ルフェート−セファロースカラムを製造した。２μｇの
ｂＦＧＦを０．１ｍｇのＢＳＡを含有する食塩液０．２
ｍｌに溶解した液を該シュークラルフェートカラムに負
荷した。このカラムを０．６Ｍ　　ＮａＣｌ含有のＴｒ
ｉｓ緩衝液１０ｍｌで洗浄し、続いてｉ）０．６から３
ＭのＮａＣｌ勾配、ｉｉ）２０ｍｌの３Ｍ　　ＮａＣｌ
、および　ｉｉｉ）３０ｍｌの１．５Ｍ酢酸（ｐＨ２．
２）を用いて１５ｍｌ／時間の割合で溶出した。溶出液
を２ｍｌづつ分画した。各分画の一定量を希釈後Ｔｒｉ
ｓ緩衝液で中和し、実施例１のようにして細胞成長因子
活性を測定した。

【００５５】図５から判るように、シュークラルフェー
トをセファロースカラムと混合してカラムを形成したと
き、３ＭまでのＮａＣｌの勾配では、予め該カラムに負
荷させていたｂＦＧＦを溶出することはできなかった。 生理学的に活性なｂＦＧＦを１．５Ｍ酢酸（ｐＨ２．２
）を用いて該カラムから回収し、実施例１のようにして
細胞成長因子活性によりその活性を測定した。この実施
例は、液体試料からＦＧＦを精製するためにシュークラ
ルフェートが有用であることを示すばかりでなく、シュ
ークラルフェートに対するＦＧＦの強い親和性を示すも
のである。

【００５６】

【発明の効果】本発明のＳＯＳ−安定化組成物は、ＦＧ
Ｆ単独では不安定な熱、酸、蛋白質分解性の環境におい
て、ＦＧＦ応答性の病気の処置、例えば消化器官の傷や
潰瘍性の状態の処置に有効であり、またＳＯＳを種々の
診断薬剤に診断薬キットの一成分として用いることがで
き、ＦＧＦの精製にも使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＯＳ添加および無添加の場合の、ｂＦＧＦに
対する高温の影響を示すグラフである。

【図２】ＳＯＳ添加および無添加の場合の、ｂＦＧＦに
対する酸の影響を示すグラフである。

【図３】シュークラルフェート添加および無添加の場合
の、ｒｈｂＦＧＦムテインＣＳ２３に対するペプシンの
影響を示すグラフである。

【図４】ＳＯＳのｂＦＧＦに対する親和性を示したグラ
フである。ヘパリンからｂＦＧＦを遊離させるＳＯＳの
能力を、２Ｍ　　ＮａＣｌと比較して示してある。

【図５】シュークラルフェート−セファロース（登録商
標）カラムを用いて液体試料からｂＦＧＦを精製した際
のグラフである。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】シュークロースオクタスルフェート（ＳＯ
   Ｓ）で安定化したＦＧＦ組成物。
2. 【請求項２】ＳＯＳがアルミニウム塩もしくはカリウム
   塩である請求項１記載のＦＧＦ組成物。
3. 【請求項３】組成物のＦＧＦ成分が天然のＦＧＦもしく
   は組換え型ＦＧＦからなる群から選ばれるものである、
   請求項１もしくは２記載のＦＧＦ組成物。
4. 【請求項４】組換え型ＦＧＦがｒｈｂＦＧＦムテインＣ
   Ｓ２３を含有する、請求項３記載のＦＧＦ組成物。
5. 【請求項５】ＦＧＦおよびＳＯＳを薬剤学的に許容し得
   る担体、賦形剤もしくは希釈剤と共に含有する薬剤組成
   物。
6. 【請求項６】ＳＯＳ対ＦＧＦの割合が重量で約１：１か
   ら１０，０００：１までの間である、請求項５記載の薬
   剤組成物。
7. 【請求項７】有効量のＳＯＳ−安定化ＦＧＦ組成物を含
   有する、ＦＧＦ応答性の病気に対する治療剤。
8. 【請求項８】ＦＧＦ応答性の病気が消化管の潰瘍症であ
   る請求項７記載の治療剤。
9. 【請求項９】ａ）液体試料をＳＯＳと接触させ、ついで
   ｂ）この液体試料における安定化ＦＧＦの存在を分析す
   ることを包含する、液体試料中のＦＧＦの存在を検出す
   る方法。
10. 【請求項１０】ａ）液体試料をＳＯＳを含有するカラム
    と接触させ、ついで ｂ）このカラムを、ＦＧＦを溶出する溶出液と接触させ
    ることを包含する、液体試料からＦＧＦを分離する方法
    。
11. 【請求項１１】組織培養の成分としてＳＯＳを組合わせ
    ることを包含する、組織培養におけるＦＧＦの安定化方
    法。