JPH04315051A

JPH04315051A - 特異結合反応用支持体及び特異結合測定方法

Info

Publication number: JPH04315051A
Application number: JP8012491A
Authority: JP
Inventors: Toru Makino; 徹牧野
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1991-04-12
Filing date: 1991-04-12
Publication date: 1992-11-06
Anticipated expiration: 2016-01-31
Also published as: JP3131459B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫反応用支持体及び
この免疫反応用支持体を用いた免疫測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、極めて特異的な生化学反応である
抗原−抗体反応を用いた免疫学的診断が行われており、
例えば、各種のアレルゲン、Ｂ型肝炎表面（ＨＢｓ）抗
体・抗原、癌腫瘍マーカーの測定に応用されている。こ
のような抗原−抗体反応を利用した各種測定には、例え
ば、ラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと記す）やエ
ンザイムイムノアッセイ（以下、ＥＩＡと記す）、蛍光
イムノアッセイ（以下、ＦＩＡと記す）のような免疫測
定方法が用いられている。

【０００３】しかし、上記のような免疫測定方法では、
抗原または抗体に何らかの標識をつける必要があるため
手間がかかる。また、必要に応じて、ＢＦ分離を行なわ
なければならないため、測定操作が繁雑である。特に、
ＲＩＡでは、標識として放射性元素を使用するため取扱
いが難しい。また、これらの免疫検定方法を自動化する
ことは困難であり、自動化のための装置も大型になって
しまう。

【０００４】さらに、これらの免疫測定方法では、測定
し得る被測定物質の濃度範囲が非常に狭い。例えば、従
来のＥＩＡ法における、マウスＩｇＧ抗原の濃度と吸光
度の関係を示す特性図を図５に示す。

【０００５】図５から明らかなように、マウスＩｇＧ抗
原の濃度が１０−６〜２×１０−５ｍｇ／ｍｌの範囲内
でのみ、マウスＩｇＧ抗原濃度と吸光度との関係を検量
線化することができる。このため、高濃度の被測定試料
を測定するためには、測定可能な濃度範囲まで被測定試
料を稀釈する必要があり、測定作業が繁雑になる欠点が
あった。

【０００６】これに対して、抗体または抗原を固相化し
た金属等の固体表面上で免疫反応を行った後、その表面
の反射率、屈折率等を測定して、固体表面に結合した抗
原または抗体の密度を測定することにより、ドライケミ
カル的に免疫測定を行う方法が試みられている。このよ
うな方法によって、作業時間を短縮でき、かつ操作の自
動化に伴う測定装置を容易に簡略化することが可能であ
る。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述の
ような固相化した抗原または抗体を使用した免疫測定方
法では、抗体または抗原を均一に固相化することが困難
である。このため、固体表面に形成された抗原−抗体か
らなる膜の厚さを直接測定した場合には、膜厚と抗原濃
度との関係を検量線化することができなかった。また、
表面の反射率及び屈折率の変化を測定する場合には、そ
れらの変化量がわずかなために感度が悪い等の欠点があ
った。

【０００８】本発明の目的は、かかる点に鑑みてなされ
たものであり、操作が簡単でかつ短時間で測定できると
共に、高感度で免疫測定を行うことができる免疫反応用
支持体及び免疫測定方法を提供するものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、シリコン基板
上に１０００ないし１９００オングストローム（以下、
Ａと記す）の膜厚を有する酸化シリコン被膜が形成され
た支持体上にリガンドを固相化したことを特徴とする免
疫反応用支持体である。

【００１０】また、本発明は、シリコン基板上に１００
０ないし１９００Ａの膜厚を有する酸化シリコン被膜が
形成された支持体上にリガンドを固相化してなる免疫反
応用支持体に被測定試料を接触させて、該被測定試料中
の測定対象物質と該リガンドとを反応させる工程と、前
記免疫反応用支持体と同一の支持体からなり、かつ前記
リガンドを固相化していない対照用支持体に、直線偏光
を所定の入射角で入射させる工程と、該対照用支持体で
反射した第１の反射光を前記直線偏光の入射角と同一の
入射角で、前記測定対象物質と反応させた前記免疫反応
用支持体に入射させる工程と、　　前記免疫反応用支持
体で反射した第２の反射光のうち楕円偏光成分を測定す
る工程とを具備することを特徴とする免疫測定方法であ
る。

【００１１】ここで、測定対象物質と反応させた免疫反
応用支持体を水洗し、次いで付着した水滴を除去した後
、免疫反応測定に供することもできる。

【００１２】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１３】本発明の免疫反応用支持体に用いられるシ
リコン基板としては、表面が精密に研磨されたＳｉ単結
晶基板を使用できる。Ｓｉ単結晶基板は、容易に入手可
能であり、均一な表面を容易に得ることができる点で優
れている。

【００１４】このシリコン基板上に被覆する酸化シリコ
ン被膜の膜厚は、１０００ないし１９００Ａの範囲内が
好ましい。なぜならば、酸化シリコン被膜の膜厚が前記
範囲内にある場合には、吸光度スペクトルのピークが可
視光領域（波長３００ｎｍ〜８００ｎｍ）内に現れるか
らである。また、酸化シリコン被膜の膜厚の誤差範囲は
１０Ａ以下であることが好ましい。

【００１５】また、シリコン基板の上への酸化シリコン
被膜の形成は、例えば、熱酸化等の半導体装置の製造で
用いられる周知の方法により行うことができる。

【００１６】本発明の免疫反応用支持体に用いられるリ
ガンドは、リガンド−レセプター反応を行う物質である
。例えば、抗原−抗体反応の一成分であり、特異親和性
物質のことである。例えば、抗原、抗体、ＤＮＡ、ＲＮ
Ａ、ペプチド等を例示することができる。このような各
種リガンドの中から測定対象物質に適したリガンドを選
択して使用する。

【００１７】このようなリガンドの支持体上への固相化
は、通常の無機物質へのリガンドの固相化方法に従って
行うことができる。例えば、まず、酸化シリコン被膜を
有するシリコン基板を、ＮＨ４　ＯＨ：Ｈ２　Ｏ２：Ｈ
２　Ｏの混合液中で煮沸した後、窒素ガス還流下で３０
０℃〜７００℃で数時間加熱する。さらに、冷却後Ｐ２
　Ｏ５　粉末等の乾燥剤中で水分を除去する。このよう
に前処理を行った酸化シリコン被膜に、シランカップリ
ング剤によりアミノ基を化学的に導入する。この後、架
橋剤として、例えばグルタルアルデヒドを酸化シリコン
被膜に導入されたアミノ基に結合させる。このように調
製した支持体上に必要なリガンドを作用させることより
、リガンドのアミノ基とグルタルアルデヒドが結合して
、リガンドが酸化シリコン被膜上に固相化される。さら
に必要があれば、例えば、牛血清アルブミンでブロッキ
ングを行っても良い。

【００１８】ここで、シランカップリング剤としては、
特公昭第５０−１１４４８号公報に開示されているよう
な、下記一般式（Ｉ）で示されるシランカップリング剤
を使用することができる。

【００１９】（Ｙ´Ｒ´）ｎ　ＳｉＲ４−ｎ　　　・・・・（Ｉ）（
式中、Ｙ´は、アミノ、カルボニル、カルボキシ、イソ
シアノ、ジアゾ、イソチオシアノ、ニトロソ、スルフヒ
ドリル、ハロカルボニルからなる群から得らればれた基
、Ｒは、低級アルコキシ、フエノキシおよびハロからな
る群から選ばれた基、Ｒ´は、低級アルキル、低級アル
キルフエニルおよびフエニルからなる群から選ばれた基
、ｎは１〜３の値を持つ整数である。）このようなシラ
ンカップリング剤の具体例としては、γ−アミノプロピ
ル−トリエトキシシラン、Ｎ−β−アミノエチル−γ−
アミノプロピル−トリメトキシシラン、Ｎ−β−アミノ
エチル−（α−メチル−γ−アミノプロピル）−ジメト
キシメチルシランのようなアミノ−機能的脂肪族シラン
である。

【００２０】また、シランカップリング剤を使用したリ
ガンドの固相化の他にも、ポリエチレンイミンを化学的
共有結合で酸化シリコン被膜表面に導入し、グルタルア
ルデヒドで架橋することによりリガンドを固相化する方
法（特開昭第６２−２２６８０９号公報、特開昭６２−
２９８７６３号公報等）によって、リガンドを固相化す
ることもできる。

【００２１】また、本発明の免疫測定方法において対照
用支持体としては、免疫反応用支持体と同一の膜厚の酸
化シリコン被膜を有するシリコン基板からなる支持体で
あって、リガンドを固相化していないものを使用するこ
とができる。また、測定対象物質と反応させていない免
疫反応用支持体であって、同一の膜厚の酸化シリコン被
膜を有するものを使用することもできる。しかしながら
後者は、酸化シリコン被膜の表面にリガンドを全く同一
の状態で固相化することが困難であり、対照用支持体と
しては前者の方が好ましい。

【００２２】また、免疫反応用支持体で反射した第２の
反射光のうちの楕円偏光成分の測定方法としては、例え
ば、反射型分光光度計による吸光度スペクトルの測定や
、ＣＣＤカメラ、ホトマルチプライヤーまたはフォトダ
イオードにより光電変換して楕円偏光成分の光量を測定
する方法がある。

【００２３】

【作用】本発明の免疫反応用支持体によれば、シリコン
基板上に酸化シリコン被膜を形成することにより、容易
に均一な表面が得られると共に、酸化シリコン被膜の膜
厚を容易に制御することができる。また、酸化シリコン
被膜の膜厚を１０００ないし１９００Ａにすることによ
って、吸光度スペクトルのピークが可視光領域内に現れ
る。これにより、光源として白色光を放射するものを使
用すれば足りる。また、ＣＣＤカメラ、ホトマルチプラ
イヤーやフォトダイオード等で楕円偏光成分の光量を測
定する場合にも適当である。

【００２４】また、本発明の免疫測定方法によれば、対
照用支持体に所定の入射角で入射された直線偏光は、対
照用支持体の表面状態に依存して偏光され、楕円偏光の
第１の反射光となる。この第１の反射光を、直線偏光と
同一の入射角で免疫反応用支持体に入射させると、対照
用支持体と免疫反応用支持体の表面状態が同一である場
合には、第１の反射光は再び直線偏光に戻る。しかし、
対照用支持体と免疫反応用支持体の表面状態が異なる場
合には、その差異が楕円偏光成分として第２の反射光内
に現れる。従って、この楕円偏光成分を測定することに
よって、固相化されたリガンドに結合した測定対象物質
を含む免疫反応用支持体の表面の状態を、対照用支持体
の表面との差として正確に把握することができる。

【００２５】

【実施例】以下、本発明の実施例について、本発明をヒ
トＩｇＧ抗原の測定に適用した場合を例にとって詳細に
説明する。

【００２６】図１は、本発明の免疫反応用支持体の一例
を示す説明図である。図中１１は、シリコン単結晶基板
である。シリコン単結晶基板１１の表面上には、膜厚１
５００Ａの酸化シリコン被膜１２が形成されている。

【００２７】このような構成からなる支持体本体１３の
表面上には、抗ヒトＩｇＧ抗体１４が固相化されている
。抗ヒトＩｇＧ抗体１４の固相化は次のようにして行っ
た。まず、支持体本体１３を、ＮＨ４　ＯＨ：Ｈ２　Ｏ
２　：Ｈ２　Ｏ＝１：１：４の溶液中で３０分間煮沸し
た。次に、支持体本体１３を蒸留水で洗浄した後、エタ
ノールで水分を除去した。続いて、窒素ガス（流量１．
０ｍｌ／分）還流下、３００℃で３時間加熱した。支持
体本体１３を冷却した後、窒素ガス還流下、Ｐ２　Ｏ５
　粉末の入ったデシケーター中で３０分間放置した。

【００２８】このようにして前処理を施した支持体本体
１３を、１容量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ンのトルエン溶液に２時間浸漬した。次に、支持体本体
１３をメタノール溶液中で３０秒ずつ２回超音波洗浄器
にかけた。このようにして、酸化シリコンとγ−アミノ
プロピルトリエトキシシランが結合して、酸化シリコン
被膜１２にアミノ基が導入された。

【００２９】その後、支持体本体１３を１容量％グルタ
ルアルデヒド溶液中に２時間浸漬した。次いで、１容量
％ツイン２０の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）
で、支持体本体１３を洗浄した。洗浄後の支持体本体１
３を、濃度１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌで抗ヒ
トＩｇＧ抗体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２０
）に溶解した抗ヒトＩｇＧ抗体溶液に、４℃で一昼夜、
または室温（２５℃）で８時間浸漬した。次いで、抗ヒ
トＩｇＧ抗体が固相化された支持体本体１３を、１容量
％ツイン２０の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）
で洗浄した後、さらに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７
．２）で洗浄した。そして、１重量％牛血清アルブミン
の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）溶液に１時間
浸漬した後、再び、１容量％ツイン２０の１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）及び１０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ＝７．２）で順次洗浄した。

【００３０】このようにして調製された免疫反応用支持
体１５を用いて、次のようにして、ヒトＩｇＧ抗原の測
定を行った。まず、ヒトＩｇＧ抗原を含む被測定溶液に
、免疫反応用支持体１５を３０分間浸漬して、ヒトＩｇ
Ｇ抗原を支持体本体１３の上に固相化された抗ヒトＩｇ
Ｇ抗体に結合させる。この後、このヒトＩｇＧ抗原と反
応させた免疫反応用支持体１５を蒸留水で洗浄して、さ
らにその表面に付着した水分を窒素ガスを噴射して除去
する。

【００３１】上述のようなヒトＩｇＧ抗原と反応させた
免疫反応用支持体１５の表面で偏光が反射した際の偏光
状態の変化を次のようにして測定する。このような偏光
状態の変化の測定には、図２に示すような対照用支持体
を対照として使用するエリプソメータを使用した。

【００３２】図中２１は、白色光２２を放射する光源で
ある。光源２１から放射された白色光２２は、偏光子２
３を経て−４５°の直線偏光２４に偏光される。この直
線偏光２４を入射角θで対照用支持体２５に入射させる
。対照用支持体２５としては、表面上に膜厚１５００Ａ
の酸化シリコン被膜が形成されたシリコン単結晶基板を
使用した。

【００３３】入射された直線偏光２４は、対照用支持体
２５の表面状態に依存して楕円偏光されて反射し、第１
の反射光２６となる。この後、第１の反射光２６を、直
線偏光２４の入射角θと同一の入射角θで、測定対象物
質と反応させた免疫反応用支持体２７の表面に入射させ
る。このとき、対照用支持体２５と免疫反応用支持体２
７とは、その入射面が相互に直角になるように配置され
ている。このため、第２の反射光２８の偏光方向が９０
°回転され、第２の反射光２８は＋４５°の直線偏光と
なる。

【００３４】このように第１の反射光２６を、入射角θ
で免疫反応用支持体２７に入射させると、対照用支持体
２５と免疫反応用支持体２７の表面状態が同一であれば
、第１の反射光２６は再び直線偏光に戻り、第２の反射
光２８は直線偏光のみになる。しかし、免疫反応用支持
体２７の表面状態は、対照用支持体２５とは異なり、酸
化シリコン被膜１２上に抗ヒトＩｇＧ抗体１４が固相化
されており、さらに被測定試料中のヒトＩｇＧ抗原が結
合している。このため、このような表面状態の差異が、
第２の反射光２８の中に楕円偏光成分として現れる。そ
して、免疫反応用支持体２７の単位面積当たりの、結合
するヒトＩｇＧ抗原の密度が高くなるほど、第２の反射
光２８のうちの楕円偏光成分が多くなる。

【００３５】このような楕円偏光成分を含む第２の反射
光２８を、第２の反射光の中の直線偏光成分（＋４５°
偏光）に対して直角をなす偏光方向を有する検光子２９
に導入する。すると、第２の反射光２８のうち＋４５°
の直線偏光成分は検光子２９を透過せず、楕円偏光成分
だけが検光子２９で透過する。このようにして楕円偏光
成分を検出器３０で検出する。検出器３０としては、例
えば、反射型分光光度計を使用して、吸光度スペクトル
を測定できる。また、検出器３０として、ＣＣＤカメラ
、ホトマルチプライヤー等を使用し、楕円偏光成分の光
量を測定することもできる。

【００３６】以上説明した如く、本発明の免疫測定方法
によれば、免疫反応用支持体２７の上に固相化された抗
ヒトＩｇＧ抗体１４に結合した抗ヒトＩｇＧ抗原の密度
を、対照用支持体２５の表面との差として正確に把握す
ることができる。

【００３７】試験例上述の免疫測定方法に従って、ヒトＩｇＧ抗原の濃度が
０，０．１，１．０，１０，１００，１０００ｎｇ／ｍ
ｌである各種ヒトＩｇＧ抗原標準溶液に夫々免疫測定用
支持体を３０分間浸漬し、ヒトＩｇＧ抗原を作用させた
各試料検体１〜６について、波長４００ｎｍ〜８００ｎ
ｍにおける吸光度スペクトルを測定した結果を図３に示
す。なお、図３中、横軸は直線偏光２４の波長（単位ｎｍ）
を示し、縦軸は吸光度を示す。また、図３中、特性線Ｉ
〜ＶＩは、夫々各試料検体１〜６についてのスペクトル
を示すものである。

【００３８】図３から明らかな如く、各試料検体１〜６
についての吸光度スペクトルは、いずれも約６５０ｎｍ
にピークを持ち、そのピークにおける吸光度は、ヒトＩ
ｇＧ抗原標準溶液のヒトＩｇＧ抗原濃度が高いほど大き
い値を示した。これにより、免疫反応用支持体上に多く
ヒトＩｇＧ抗原が結合しているほど、言い換えれば、免
疫反応用支持体の単位面積当たりの結合するヒトＩｇＧ
抗原の密度が高いほど、ピークでの吸光度が高くなるこ
とが確認された。

【００３９】また、各試験検体１〜６の波長６５０ｎｍ
における吸光度と、各試験検体１〜６に対応するヒトＩ
ｇＧ抗原標準溶液のヒトＩｇＧ抗原濃度とから作成した
検量線を、図４に示す。なお、図４中、横軸はヒトＩｇ
Ｇ抗原濃度（単位ｎｇ／ｍｌ）を示し、縦軸は、波長６
５０ｎｍにおける吸光度を示す。

【００４０】図４から明らかな如く、ヒトＩｇＧ抗原濃
度と波長６５０ｎｍにおける吸光度との関係を、ヒトＩ
ｇＧ抗原濃度０．１〜１０００ｎｇ／ｍｌの広い濃度範
囲にわたって検量線化することができる。従って、ヒト
ＩｇＧ抗原濃度が比較的高濃度の被測定試料についても
、この被測定試料を稀釈する必要がない。このため、測
定操作に要する時間を、従来の免疫測定方法よりも短縮
することができる。また、稀釈工程が不要であるため、
測定装置を自動化する場合にも装置を容易に簡略化する
ことができる。

【００４１】

【発明の効果】以上説明した如くに、本発明の免疫反応
用支持体及び免疫測定方法によれば、ＦＩＡまたはＥＩ
Ａのような従来の免疫測定方法に比べ、簡単な操作で、
かつ短時間で免疫測定を行うことができると共に、測定
感度を容易に高かめることができる等の効果を奏するも
のである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の免疫反応用支持体の一例を示す説明図
。

【図２】本発明の免疫測定方法に使用するエリプソメー
タの概要を示す説明図。

【図３】本発明の免疫測定方法の試験例に従って測定さ
れた試料検体の吸光度スペクトルを示す特性図。

【図４】同試験例におけるヒトＩｇＧ抗原濃度と吸光度
の関係を示す検量線を示す特性図。

【図５】従来のＥＩＡ法におけるマウスＩｇＧ抗原濃度
と吸光度の関係を示す検量線を示す特性図。

【符号の説明】

１１…シリコン単結晶基板、１２…酸化シリコン膜、１
３…支持体本体、１４…抗ヒトＩｇＧ抗体、１５…免疫
反応用支持体、２１…光源、２２…白色光、２３…偏光
子、２４…直線偏光、２５…対照用支持体、２６…第１
の反射光、２７…免疫反応支持体、２８…第２の反射光
、２９…検光子、３０…検出器。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　シリコン基板上に１０００ないし１９
００Ａの膜厚を有する酸化シリコン被膜が形成された支
持体上にリガンドを固相化したことを特徴とする免疫反
応用支持体。
【請求項２】　　シリコン基板上に１０００ないし１９
００Ａの膜厚を有する酸化シリコン被膜が形成された支
持体上にリガンドを固相化してなる免疫反応用支持体に
被測定試料を接触させて、該被測定試料中の測定対象物
質と該リガンドとを反応させる工程と、前記免疫反応用
支持体と同一の支持体からなり、かつ前記リガンドを固
相化していない対照用支持体に、直線偏光を所定の入射
角で入射させる工程と、該対照用支持体で反射した第１
の反射光を前記直線偏光の入射角と同一の入射角で、前
記測定対象物質と反応させた前記免疫反応用支持体に入
射させる工程と、　　前記免疫反応用支持体で反射した
第２の反射光のうち楕円偏光成分を測定する工程とを具
備することを特徴とする免疫測定方法。
【請求項３】　　測定対象物質と反応させた免疫反応用
支持体を水洗し、次いで付着した水滴を除去した後に免
疫反応測定に供することを特徴とする請求項２記載の免
疫測定方法。