JP3115901B2

JP3115901B2 - 特異親和性反応測定方法

Info

Publication number: JP3115901B2
Application number: JP03080125A
Authority: JP
Inventors: 徹牧野
Original assignee: Olympus Optic Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1991-04-12
Filing date: 1991-04-12
Publication date: 2000-12-11
Anticipated expiration: 2015-12-11
Also published as: JPH04315052A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、特異親和性反応用支持
体を用いた特異親和性反応測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、極めて特異的な生化学反応である
抗原−抗体反応を用いた免疫学的診断が行われており、
例えば、各種のアレルゲン、Ｂ型肝炎表面（ＨＢｓ）抗
体・抗原、癌腫瘍マーカーの測定に応用されている。こ
のような抗原−抗体反応を利用した各種測定には、例え
ば、ラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと記す）やエ
ンザイムイムノアッセイ（以下、ＥＩＡと記す）、蛍光
イムノアッセイ（以下、ＦＩＡと記す）のような免疫測
定方法が用いられている。

【０００３】しかし、上記のような免疫測定方法では、
抗原または抗体に何らかの標識をつける必要があるため
手間がかかる。また、必要に応じて、ＢＦ分離を行なわ
なければならないため、測定操作が繁雑である。特に、
ＲＩＡでは、標識として放射性元素を使用するため取扱
いが難しい。また、これらの免疫検定方法を自動化する
ことは困難であり、自動化のための装置も大型になって
しまう。

【０００４】さらに、これらの免疫測定方法では、測定
し得る被測定物質の濃度範囲が非常に狭い。例えば、従
来のＥＩＡ法における、マウスＩｇＧ抗原の濃度と吸光
度の関係を示す特性図を図６に示す。図６から明らかな
ように、マウスＩｇＧ抗原の濃度が１０^-6〜２×１０^-5
mg／mlの範囲内でのみ、マウスＩｇＧ抗原濃度と吸光度
との関係を検量線化することができる。このため、高濃
度の被測定試料を測定するためには、測定可能な濃度範
囲まで被測定試料を稀釈する必要があり、測定作業が繁
雑になる欠点があった。

【０００５】これに対して、抗体または抗原を固相化し
た金属等の固体表面上で免疫反応を行った後、その表面
の反射率、屈折率等を測定して、固体表面に結合した抗
原または抗体の密度を測定することにより、ドライケミ
カル的に免疫測定を行う方法が試みられている。このよ
うな方法によって、作業時間を短縮でき、かつ操作の自
動化に伴う測定装置を容易に簡略化することが可能であ
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述の
ような固相化した抗原または抗体を使用した免疫測定方
法では、抗体または抗原を均一に固相化することが困難
である。このため、固体表面に形成された抗原−抗体か
らなる膜の厚さを直接測定した場合には、膜厚と抗原濃
度との関係を検量線化することができなかった。また、
表面の反射率及び屈折率の変化を測定する場合には、そ
れらの変化量がわずかなために感度が悪い等の欠点があ
った。

【０００７】本発明の目的は、かかる点に鑑みてなされ
たものであり、操作が簡単でかつ短時間で測定できると
共に、より高感度で特異親和性反応測定を行うことがで
きる特異親和性反応用支持体及び特異親和性反応測定方
法を提供するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】シリコン基板上に酸化
シリコン被膜が形成された支持体上にリガンドを固相化
してなる免疫反応用支持体に被測定試料を接触させて、
該被測定試料中の測定対象物質と該リガンドとを反応さ
せる工程と、前記免疫反応用支持体に金コロイド抗体
を、前記測定対象用物質と同時にまたは前記測定対象物
質を反応させた後に反応させる工程と、前記測定対象物
質及び前記金コロイド抗体と反応させた前記免疫反応用
支持体を洗浄する工程と、前記免疫反応用支持体に直線
偏光を所定の入射角で人射させる工程と、前記免疫反応
用支持体で反射した反射光に基づいて測定対象物を測定
する工程とを具傭することを特徴とする免疫測定方法。

【０００９】以下、本発明を免疫測定で行った例を詳細
に説明する。

【００１０】本発明の免疫測定方法に用いられる免疫反
応用支持体は、シリコン基板上に酸化シリコン被膜が形
成された支持体上にリガンドを固相化したものである。

【００１１】このシリコン基板としては、表面が精密に
研磨されたＳｉ単結晶基板を使用することができる。Ｓ
ｉ単結晶基板は、容易に入手可能であり、均一な表面を
容易に得ることができる点で優れている。

【００１２】このシリコン基板上に被覆する酸化シリコ
ン被膜の膜厚は、１０００ないし１９００オングストロ
ーム（以下、Ａと記す）の範囲内が好ましい。なぜなら
ば、酸化シリコン被膜の膜厚が前記範囲内にある場合に
は、吸光度スペクトルのピークが可視光領域（波長３０
０ｎｍ〜８００ｎｍ）内に現れるからである。また、酸
化シリコン被膜の膜厚の誤差範囲は１０Ａ以下であるこ
とが好ましい。

【００１３】また、シリコン基板の上への酸化シリコン
被膜の形成は、例えば、熱酸化等の半導体装置の製造に
おいて用いられる周知の方法により行うことができる。

【００１４】本発明の免疫反応用支持体に用いられるリ
ガンドは、リガンド−レセプター反応を行う物質であ
る。例えば、抗原−抗体反応の一成分であり、特異親和
性物質のことである。例えば、抗原、抗体、ＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ、ペプチド等を例示することができる。このような
各種リガンドの中から測定対象物質に適したリガンドを
選択して使用する。

【００１５】このようなリガンドの支持体上への固相化
は、通常の無機物質へのリガンドの固相化方法に従って
行うことができる。例えば、まず、酸化シリコン被膜を
有するシリコン基板を、ＮＨ₄ＯＨ：Ｈ₂Ｏ₂：Ｈ₂Ｏ
の混合液中で煮沸した後、窒素ガス還流下で３００℃〜
７００℃で数時間加熱する。さらに、冷却後Ｐ₂Ｏ₅粉
末等の乾燥剤中で水分を除去する。このように前処理を
行った酸化シリコン被膜に、シランカップリング剤によ
りアミノ基を化学的に導入する。この後、架橋剤とし
て、例えばグルタルアルデヒドを酸化シリコン被膜に導
入されたアミノ基に結合させる。このように調製した支
持体上に必要なリガンドを作用させることより、リガン
ドのアミノ基とグルタルアルデヒドが結合して、リガン
ドが酸化シリコン被膜上に固相化される。さらに必要が
あれば、例えば、牛血清アルブミンでブロッキングを行
っても良い。

【００１６】ここで、シランカップリング剤としては、
特公昭第５０−１１４４８号公報に開示されているよう
な、下記一般式（Ｉ）で示されるシランカップリング剤
を使用することができる。

【００１７】（Ｙ´Ｒ´）_nＳｉＲ_4-n ・・・・（Ｉ）（式中、Ｙ´は、アミノ、カルボニル、カルボキシ、イ
ソシアノ、ジアゾ、イソチオシアノ、ニトロソ、スルフ
ヒドリル、ハロカルボニルからなる群から得らればれた
基、Ｒは、低級アルコキシ、フエノキシおよびハロから
なる群から選ばれた基、Ｒ´は、低級アルキル、低級ア
ルキルフエニルおよびフエニルからなる群から選ばれた
基、ｎは１〜３の値を持つ整数である。）このようなシ
ランカップリング剤の具体例としては、γ−アミノプロ
ピル−トリエトキシシラン、Ｎ−β−アミノエチル−γ
−アミノプロピル−トリメトキシシラン、Ｎ−β−アミ
ノエチル−（α−メチル−γ−アミノプロピル）−ジメ
トキシメチルシランのようなアミノ−機能的脂肪族シラ
ンである。

【００１８】また、シランカップリング剤を使用したリ
ガンドの固相化の他にも、ポリエチレンイミンを化学的
共有結合で酸化シリコン被膜表面に導入し、グルタルア
ルデヒドで架橋することによりリガンドを固相化する方
法（特開昭第６２−２２６８０９号公報、特開昭６２−
２９８７６３号公報等）によって、リガンドを固相化す
ることもできる。

【００１９】また、本発明の免疫測定方法において使用
する金コロイド抗体としては、固相化されたリガンド或
いは測定対象物質に特異的に結合する金コロイド抗体、
または、固相化されたリガンド及び測定対象物質の両方
に結合する金コロイド抗体を使用することができる。ま
た、金コロイドの粒径は、２０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲
内が好ましい。なぜならば、２０ｎｍ未満の金コロイド
では、本発明の効果を十分に発揮し得ないからであり、
１００ｎｍを越える金コロイドでは、シリコン基板上に
形成された膜の膜厚が後述するエリプソメータの測定可
能な膜厚の最大値を越えてしまうからである。

【００２０】金コロイド抗体と免疫反応用支持体との反
応は、測定対象物質と免疫反応用支持体とを反応させた
後に行わせても良いし、金コロイド抗体と測定対象物質
を同時に免疫反応用支持体に反応させても良い。前者の
場合には金コロイド抗体として、測定対象物質に特異的
に結合するものを使用して、所謂サンドイッチ法により
免疫測定を行うことができる。また、後者の場合には、
サンドイッチ法によって反応を一度で済ませたり（特開
昭５７−１６３５５、特開昭５７−５００８４５参
照）、金コロイド抗体として固相化されたリガンドと特
異的に結合するものを使用し、リガンドに対して測定対
象物質及び金コロイド抗体を競合させて反応させること
もできる。

【００２１】また、本発明の免疫測定方法において用い
られる対照用支持体としては、免疫反応用支持体と同一
膜厚の酸化シリコン被膜を有するシリコン基板からなる
支持体であって、リガンドを固相化していないものを使
用することができる。測定対象物質と反応させていない
免疫反応用支持体であって、同一膜厚の酸化シリコン被
膜も使用できる。しかしながら後者は、酸化シリコン被
膜の表面にリガンドを全く同一の状態で固相化すること
は困難であり、対照用支持体としては前者の方が好まし
い。

【００２２】また、免疫反応用支持体で反射した第２の
反射光のうちの楕円偏光成分の測定方法としては、例え
ば、反射型分光光度計による吸光度スペクトルの測定
や、ＣＣＤカメラ、ホトマルチプライヤーまたはフォト
ダイオードにより光電変換して楕円偏光成分の光量を測
定する方法がある。

【００２３】

【作用】本発明の免疫測定方法によれば、対照用支持体
に所定の入射角で入射された直線偏光は、対照用支持体
の表面状態に依存して偏光され、楕円偏光の第１の反射
光となる。第１の反射光を、直線偏光と同一の入射角で
免疫反応用支持体に入射させると、対照用支持体と免疫
反応用支持体の表面状態が同一である場合には、第１の
反射光は再び直線偏光に戻る。しかし、対照用支持体と
免疫反応用支持体との表面状態が異なる場合には、その
差異が楕円偏光成分として第２の反射光の中に現れる。
従って、この楕円偏光成分を測定することによって、固
相化されたリガンドに結合した測定対象物質を含む免疫
反応用支持体の表面の状態を、対照用支持体の表面との
差として正確に把握することができる。さらに、被測定
物質に比較して粒径が大きい金コロイド抗体を、固相化
されたリガンド及びリガンドに結合した測定対象物質の
少なくとも一方に結合させることにより、免疫反応用支
持体と対照用支持体との表面状態の差が顕著になる。こ
れにより、測定される楕円偏光成分の光量が大きくな
る。

【００２４】

【実施例】以下、本発明の実施例について、本発明をヒ
トＩｇＧ抗原の測定に適用した場合を例にとって詳細に
説明する。

【００２５】実施例１図１は、免疫反応用支持体の一例を示す説明図である。
図中１１は、シリコン単結晶基板である。シリコン単結
晶基板１１の表面上には、膜厚１１００Ａの酸化シリコ
ン被膜１２が形成されている。

【００２６】このような構成からなる支持体本体１３の
表面上には、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体１４が固相化され
ている。ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体１４の固相化は次のよ
うにして行った。まず、支持体本体１３を、ＮＨ₄Ｏ
Ｈ：Ｈ₂Ｏ₂：Ｈ₂Ｏ＝１：１：４の溶液中で３０分間
煮沸した。次に、支持体本体１３を蒸留水で洗浄した
後、エタノールで水分を除去した。続いて、窒素ガス
（流量１．０ml／分）還流下、３００℃で３時間加熱し
た。支持体本体１３を冷却した後、窒素ガス還流下、Ｐ
₂Ｏ₅粉末の入ったデシケーター中で３０分間放置し
た。

【００２７】このようにして前処理を施した支持体本体
１３を、１容量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ンのトルエン溶液に２時間浸漬した。次に、支持体本体
１３をメタノール溶液中で３０秒ずつ２回超音波洗浄器
にかけた。このようにして、酸化シリコンとγ−アミノ
プロピルトリエトキシシランが結合して、酸化シリコン
被膜１２にアミノ基が導入された。

【００２８】その後、支持体本体１３を１容量％グルタ
ルアルデヒド溶液中に２時間浸漬した。次いで、１容量
％ツイン２０の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）
で、支持体本体１３を洗浄した。洗浄後の支持体本体１
３を、濃度１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／mlで抗ヒト
ＩｇＧ抗体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２０）
に溶解したヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体溶液に、４℃で一昼
夜、または室温（２５℃）で８時間浸漬した。次いで、
ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体が固相化された支持体本体１３
を、１容量％ツイン２０の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
＝７．２）で洗浄した後、さらに１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ＝７．２）で洗浄した。そして、１重量％牛血清
アルブミンの１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）溶
液に１時間浸漬した後、再び、１容量％ツイン２０の１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）及び１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）で順次洗浄した。

【００２９】このようにして調製された免疫反応用支持
体１５を用いて、次のようにしてヒトＩｇＧ抗原の測定
を行った。まず、ヒトＩｇＧ抗原を含む被測定溶液に、
免疫反応用支持体１５を３０分間浸漬した。

【００３０】この後、直径３０ｎｍの金コロイドを結合
した抗ヒトＩｇＧ抗体からなる金コロイド抗体（Ｂｉｏ
ｃｅｌｌ社製ＧｏｌｄＣｏｎｊｕｇａｔｅｓ）のリン
酸緩衝溶液に、室温で１時間浸漬した。

【００３１】このように免疫反応用支持体１５に被測定
溶液及び金コロイド抗体の溶液を作用させると、図１に
示す如く、まず、ヒトＩｇＧ抗原１６が、酸化シリコン
被膜１２上に固相化されたヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体１４
に結合する。次いで、金コロイド抗体１７が、ヒトＩｇ
Ｇ抗原１６に結合して、所謂、サンドイッチ構造１８が
形成される。

【００３２】上述のようにヒトＩｇＧ抗原１６及び金コ
ロイド抗体１７と反応させた免疫反応用支持体１５を蒸
留水で洗浄して、さらにその表面に付着した水分を窒素
ガスを噴射して除去した。

【００３３】このようにして、ヒトＩｇＧ抗原１６及び
金コロイド抗体１７と反応させた免疫反応用支持体１５
の表面で偏光が反射する際におこる偏光状態の変化を、
次のようにして測定した。この測定には、図２に示す如
く、対照用支持体を対照として使用するエリプソメータ
を使用した。

【００３４】図中２１は、白色光２２を放射する光源で
ある。まず、白色光２２は、偏光子２３を経て−４５°
の直線偏光２４に偏光される。この直線偏光２４を入射
角θで対照用支持体２５に入射させる。対照用支持体２
５としては、表面上に膜厚１１００Ａの酸化シリコン被
膜が形成されたシリコン単結晶基板を使用した。

【００３５】入射された直線偏光２４は、対照用支持体
２５の表面状態に依存して楕円偏光されて反射し、第１
の反射光２６となる。この後、第１の反射光２６を、直
線偏光２４の入射角θと同一の入射角θで、測定対象物
質及び金コロイド抗体と反応させた免疫反応用支持体２
７の表面に入射させる。このとき、対照用支持体２５と
免疫反応用支持体２７とは、その入射面が相互に直角に
なるように配置されている。このため、第２の反射光２
８の偏光方向が９０°回転され、第２の反射光２８は＋
４５°の直線偏光となる。

【００３６】このように第１の反射光２６を、入射角θ
で免疫反応用支持体２７に入射させると、対照用支持体
２５と免疫反応用支持体２７の表面状態が同一であれ
ば、第１の反射光２６は再び直線偏光に戻り、第２の反
射光２８は直線偏光のみになる。しかし、免疫反応用支
持体２７の表面状態は、対照用支持体２５とは異なり、
ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体１４及び上述のサンドイッチ構
造１８が形成されている。このため、第１の反射光２６
は楕円偏光される。さらに、このサンドイッチ構造１８
は、被測定溶液中のヒトＩｇＧ抗体１６の濃度が高いほ
ど、多く形成される。従って、被測定溶液中のヒトＩｇ
Ｇ抗体１６の濃度が高くなるほど、第２の反射光２８中
の楕円偏光成分は多くなる。

【００３７】このような楕円偏光成分を含む第２の反射
光２８を、第２の反射光の中の直線偏光成分（＋４５°
偏光）に対して直角をなす偏光方向を有する検光子２９
に導入する。すると、第２の反射光２８のうち＋４５°
の直線偏光成分は検光子２９を透過せず、楕円偏光成分
だけが検光子２９で透過する。このようにして楕円偏光
成分を検出器３０で検出する。検出器３０としては、例
えば、反射型分光光度計を使用して、免疫反応用支持体
２７についての吸光度スペクトルを測定できる。また、
検出器３０として、ＣＣＤカメラ、ホトマルチプライヤ
ー等を使用し、楕円偏光成分の光量を測定することもで
きる。

【００３８】上述のような免疫測定方法によれば、被測
定溶液中のヒトＩｇＧ抗原１６の濃度に対応して、免疫
反応用支持体１５の表面上に固相化されたヒツジ抗ヒト
ＩｇＧ抗体１４に、ヒトＩｇＧ抗原１６が結合する。そ
して、結合したヒトＩｇＧ抗原１６に、ヒトＩｇＧ抗原
１６と比較して極めて大きい粒径を有する金コロイド抗
体１７が結合して、サンドイッチ構造１８を形成する。
このため、単にヒトＩｇＧ抗体１６が結合している免疫
反応用支持体１５の表面よりも、第２の反射光２８の中
の楕円偏光成分が多くなる。これにより、結合するヒト
ＩｇＧ抗体１６の粗密に対応した、第２の反射光中の楕
円偏光成分の割合の変化が極めて大きくなる。この結
果、被測定溶液中のヒトＩｇＧ抗体の測定をより高感度
で行うことができた。

【００３９】試験例以下、本発明の免疫測定方法の効果を確認するために行
った試験例について説明する。上述の免疫測定方法に従
って、ヒトＩｇＧ抗原の濃度が０，０．１，１．０及び
１０ng／mlである各種ヒトＩｇＧ抗原標準溶液に夫々免
疫測定用支持体を３０分間浸漬し、ヒトＩｇＧ抗原を作
用させた各試料検体１〜４について、波長４００ｎｍ〜
８００ｎｍにおける吸光度スペクトルを測定した。この
結果を図３に示す。なお、図３中、横軸は直線偏光２４
の波長（単位ｎｍ）を示し、縦軸は吸光度を示す。ま
た、図３中、特性線Ｉ〜IVは、夫々各試料検体１〜４に
ついての吸光度スペクトルを示すものである。

【００４０】図３から明らかな如く、各試料検体１〜４
についての吸光度スペクトルは、いずれも約５８０ｎｍ
にピークを持ち、そのピークにおける吸光度は、ヒトＩ
ｇＧ抗原標準溶液のヒトＩｇＧ抗原濃度が高いほど大き
い値を示した。これにより、免疫反応用支持体上に多く
ヒトＩｇＧ抗原が結合しているほど、言い換えれば、免
疫反応用支持体の単位面積当たりの結合するヒトＩｇＧ
抗原の密度が高いほど、ピークでの吸光度が高くなるこ
とが確認された。

【００４１】また、各試験検体１〜４についての波長５
８０ｎｍにおける吸光度と、各試験検体１〜４に対応す
るヒトＩｇＧ抗原標準溶液のヒトＩｇＧ抗原濃度とから
作成した検量線を図４に示す。なお、図４中、横軸はヒ
トＩｇＧ抗原濃度（単位ｎｇ／ml）を示し、縦軸は、波
長５８０ｎｍにおける吸光度を示す。

【００４２】図４から明らかな如く、ヒトＩｇＧ抗原濃
度と波長５８０ｎｍにおける吸光度との関係を、ヒトＩ
ｇＧ抗原濃度が０．１〜１０ng／mlの広い濃度範囲にわ
たって検量線化することができた。従って、ヒトＩｇＧ
抗原濃度が比較的高濃度の被測定試料についても、この
被測定試料を稀釈する必要がない。このため、測定操作
に要する時間を、従来の免疫測定方法よりも短縮するこ
とができる。また、稀釈工程が不要であるため、測定装
置を自動化する場合にも装置を容易に簡略化することが
できる。

【００４３】実施例２金コロイド抗体として、粒径３０ｎｍの金コロイドが結
合した抗ヒツジＩｇＧ抗体からなる金コロイド抗体を使
用した以外は、実施例１の免疫測定方法と同様の手順に
より、ヒトＩｇＧ抗体の定量を行った。

【００４４】この場合には、図５に示す如く、まず、ヒ
トＩｇＧ抗原１６が、固相化されたヒツジ抗ヒトＩｇＧ
抗体１４に結合し、次いで、金コロイド抗体５１が、ヒ
トＩｇＧ抗原１６が結合していないヒツジ抗ヒトＩｇＧ
抗体１４に結合する。従って、被測定溶液中のヒトＩｇ
Ｇ抗原１６が多いほど、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体１４に
結合するヒトＩｇＧ抗原の密度が高くなる。しかし、こ
れとは逆に、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体１４に結合する金
コロイド抗体５１の密度は低くなる。この結果、被測定
溶液中のヒトＩｇＧ抗原１６の濃度が低いほど、第２の
反射光２８中の楕円偏光成分が多くなり、被測定溶液中
のヒトＩｇＧ抗原１４の濃度が高くなるほど、楕円偏光
成分が少なくなる。さらに、実施例１と同様に、金コロ
イド抗体５１は、ヒトＩｇＧ抗原１６と比較して極めて
大きい粒径を有しているので、金コロイド抗体５１の密
度の変化によって、第２の反射光２８の中の楕円偏光成
分の割合も極めて大きく変化する。この結果、被測定溶
液中のヒトＩｇＧ抗体１６の測定をより高感度で行うこ
とができた。

【００４５】実施例３免疫反応用支持体の表面に、被測定試料と金コロイド抗
体溶液とを同時に反応させる以外は、実施例２と同様の
手順でヒトＩｇＧ抗体の定量を行った。

【００４６】この場合には、被測定試料中のヒトＩｇＧ
抗体と金コロイド抗体とは、互いに競合して、免疫反応
用支持体の表面に固相化されたヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体
に結合する。従って、実施例２と同様に、被測定溶液中
のヒトＩｇＧ抗原が多いほど、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体
に結合するヒトＩｇＧ抗原の密度が高くなるが、これと
は逆に、ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体に結合する金コロイド
抗体の密度は低くなる。この結果、被測定溶液中のヒト
ＩｇＧ抗原の濃度が低いほど、第２の反射光中の楕円偏
光成分が多くなり、被測定溶液中のヒトＩｇＧ抗原の濃
度が高くなるほど、楕円偏光成分が少なくなる。この結
果、実施例２と同様に、金コロイド抗体の密度変化から
被測定溶液中のヒトＩｇＧ抗体の測定をより高感度で行
うことができた。

【００４７】

【発明の効果】以上説明した如くに、本発明の特異親和
性反応用支持体及び特異親和性反応測定方法によれば、
ＦＩＡまたはＥＩＡのような従来の特異親和性反応測定
に比べ、簡単な操作で、かつ短時間で特異親和性反応測
定を行うことができると共に、粒径が酸化シリコン被膜
の膜厚に応じて適切な粒径の金コロイド試薬を使用する
ことによって、測定感度を容易に高めることができる等
の効果を奏するものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の免疫測定方法の一実施例での免疫反応
用支持体の表面状態を示す説明図。

【図２】本発明の免疫測定方法に使用するエリプソメー
タの概要を示す説明図。

【図３】本発明の免疫測定方法の試験例に従って測定さ
れた試料検体の吸光度スペクトルを示す特性図。

【図４】同試験例におけるヒトＩｇＧ抗原濃度と吸光度
の関係を示す検量線を示す特性図。

【図５】本発明の免疫測定方法の他の実施例での免疫反
応用支持体の表面状態を示す説明図。

【図６】従来の免疫測定方法におけるマウスＩｇＧ抗原
の濃度と吸光度の関係を示す特性図。

【符号の説明】

１１…シリコン単結晶基板、１２…酸化シリコン膜、１
３…支持体本体、１４…ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体、１５
…免疫反応用支持体、１６…ヒトＩｇＧ抗原、１７…金
コロイド抗体、２１…光源、２２…白色光、２３…偏光
子、２４…直線偏光、２５…対照用支持体、２６…第１
の反射光、２７…免疫反応支持体、２８…第２の反射
光、２９…検光子、３０…検出器。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/543 595 G01N 21/21 G01N 33/551

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】シリコン基板上に１０００〜１９００オ
ングストロームの膜厚を有する酸化シリコン被膜が形成
された支持体上にリガンドを固相化してなる特異親和性
反応用支持体に被測定試料を接触させて、該被測定試料
中の測定対象物質と該リガンドとを反応させる工程と、
前記特異親和性反応用支持体に、粒径２０〜１００ｎｍ
の金コロイド粒子で且つリガンド及び／又は測定対象物
質に特異的に結合する金コロイド試薬を、前記測定対象
用物質と同時にまたは前記測定対象物質を反応させた後
に反応させる工程と、前記測定対象物質及び前記金コロ
イド試薬と反応させた前記特異親和性反応用支持体を洗
浄する工程と、前記特異親和性反応用支持体に直線偏光
を所定の入射角で入射させる工程と、前記特異親和性反
応用支持体で反射した反射光に基づいて測定対象物を測
定する工程とを具備することを特徴とする特異親和性反
応測定方法。
【請求項２】シリコン基板上に１０００〜１９００オ
ングストロームの膜厚を有する酸化シリコン被膜が形成
された支持体上にリガンドを固相化してなる特異親和性
反応用支持体に被測定試料を接触させて、該被測定試料
中の測定対象物質と該リガンドとを反応させる工程と、
前記特異親和性反応用支持体に、粒径２０〜１００ｎｍ
の金コロイド粒子で且つリガンド及び／又は測定対象物
質に特異的に結合する金コロイド試薬を、前記測定対象
用物質と同時にまたは前記測定対象物質を反応させた後
に反応させる工程と、前記測定対象物質及び前記金コロ
イド試薬と反応させた前記特異親和性反応用支持体を洗
浄する工程と、前記特異親和性反応用支持体と同一の支
持体からなり、かつ前記リガンドを固相化していない対
照用支持体に、直線偏光を所定の入射角で入射させる工
程と、該対照用支持体で反射した第１の反射光を前記直
線偏光の入射角と同一の入射角で、前記測定対象物質及
び前記金コロイド試薬と反応させた前記特異親和性反応
用支持体に入射させる工程と、前記特異親和性反応用支
持体で反射した第２の反射光のうち楕円偏光成分を測定
する工程とを具備することを特徴とする特異親和性反応
測定方法。