JP3131459B2 - 特異結合反応用支持体及び特異結合測定方法 - Google Patents
特異結合反応用支持体及び特異結合測定方法Info
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- JP3131459B2 JP3131459B2 JP03080124A JP8012491A JP3131459B2 JP 3131459 B2 JP3131459 B2 JP 3131459B2 JP 03080124 A JP03080124 A JP 03080124A JP 8012491 A JP8012491 A JP 8012491A JP 3131459 B2 JP3131459 B2 JP 3131459B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、特異結合反応用支持体
及びこの特異結合反応用支持体を用いた特異結合測定方
法に関する。
及びこの特異結合反応用支持体を用いた特異結合測定方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、医学的見地で種々の特異結合反
応、とりわけ、極めて特異的な生化学反応である抗原−
抗体反応を用いた免疫学的診断が行われており、例え
ば、各種のアレルゲン、Ｂ型肝炎表面（ＨＢｓ）抗体・
抗原、癌腫瘍マーカーの測定に応用されている。このよ
うな抗原−抗体反応を利用した各種測定には、例えば、
ラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと記す）やエンザ
イムイムノアッセイ（以下、ＥＩＡと記す）、蛍光イム
ノアッセイ（以下、ＦＩＡと記す）のような免疫測定方
法が用いられている。
応、とりわけ、極めて特異的な生化学反応である抗原−
抗体反応を用いた免疫学的診断が行われており、例え
ば、各種のアレルゲン、Ｂ型肝炎表面（ＨＢｓ）抗体・
抗原、癌腫瘍マーカーの測定に応用されている。このよ
うな抗原−抗体反応を利用した各種測定には、例えば、
ラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと記す）やエンザ
イムイムノアッセイ（以下、ＥＩＡと記す）、蛍光イム
ノアッセイ（以下、ＦＩＡと記す）のような免疫測定方
法が用いられている。
【０００３】しかし、上記のような免疫測定方法では、
抗原または抗体に何らかの標識をつける必要があるため
手間がかかる。また、必要に応じて、ＢＦ分離を行なわ
なければならないため、測定操作が繁雑である。特に、
ＲＩＡでは、標識として放射性元素を使用するため取扱
いが難しい。また、これらの免疫検定方法を自動化する
ことは困難であり、自動化のための装置も大型になって
しまう。
抗原または抗体に何らかの標識をつける必要があるため
手間がかかる。また、必要に応じて、ＢＦ分離を行なわ
なければならないため、測定操作が繁雑である。特に、
ＲＩＡでは、標識として放射性元素を使用するため取扱
いが難しい。また、これらの免疫検定方法を自動化する
ことは困難であり、自動化のための装置も大型になって
しまう。
【０００４】さらに、これらの免疫測定方法では、測定
し得る被測定物質の濃度範囲が非常に狭い。例えば、従
来のＥＩＡ法における、マウスＩｇＧ抗原の濃度と吸光
度の関係を示す特性図を図５に示す。
し得る被測定物質の濃度範囲が非常に狭い。例えば、従
来のＥＩＡ法における、マウスＩｇＧ抗原の濃度と吸光
度の関係を示す特性図を図５に示す。
【０００５】図５から明らかなように、マウスＩｇＧ抗
原の濃度が１０-6〜２×１０-5mg／mlの範囲内でのみ、
マウスＩｇＧ抗原濃度と吸光度との関係を検量線化する
ことができる。このため、高濃度の被測定試料を測定す
るためには、測定可能な濃度範囲まで被測定試料を稀釈
する必要があり、測定作業が繁雑になる欠点があった。
原の濃度が１０-6〜２×１０-5mg／mlの範囲内でのみ、
マウスＩｇＧ抗原濃度と吸光度との関係を検量線化する
ことができる。このため、高濃度の被測定試料を測定す
るためには、測定可能な濃度範囲まで被測定試料を稀釈
する必要があり、測定作業が繁雑になる欠点があった。
【０００６】これに対して、抗体または抗原を固相化し
た金属等の固体表面上で免疫反応を行った後、その表面
の反射率、屈折率等を測定して、固体表面に結合した抗
原または抗体の密度を測定することにより、ドライケミ
カル的に免疫測定を行う方法が試みられている。このよ
うな方法によって、作業時間を短縮でき、かつ操作の自
動化に伴う測定装置を容易に簡略化することが可能であ
る。
た金属等の固体表面上で免疫反応を行った後、その表面
の反射率、屈折率等を測定して、固体表面に結合した抗
原または抗体の密度を測定することにより、ドライケミ
カル的に免疫測定を行う方法が試みられている。このよ
うな方法によって、作業時間を短縮でき、かつ操作の自
動化に伴う測定装置を容易に簡略化することが可能であ
る。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述の
ような固相化した抗原または抗体を使用した免疫測定方
法では、抗体または抗原を均一に固相化することが困難
である。このため、固体表面に形成された抗原−抗体か
らなる膜の厚さを直接測定した場合には、膜厚と抗原濃
度との関係を検量線化することができなかった。また、
表面の反射率及び屈折率の変化を測定する場合には、そ
れらの変化量がわずかなために感度が悪い等の欠点があ
った。
ような固相化した抗原または抗体を使用した免疫測定方
法では、抗体または抗原を均一に固相化することが困難
である。このため、固体表面に形成された抗原−抗体か
らなる膜の厚さを直接測定した場合には、膜厚と抗原濃
度との関係を検量線化することができなかった。また、
表面の反射率及び屈折率の変化を測定する場合には、そ
れらの変化量がわずかなために感度が悪い等の欠点があ
った。
【０００８】本発明の目的は、かかる点に鑑みてなされ
たものであり、操作が簡単でかつ短時間で測定できると
共に、高感度で特異結合測定を行うことができる特異結
合反応用支持体及び特異結合測定方法を提供するもので
ある。
たものであり、操作が簡単でかつ短時間で測定できると
共に、高感度で特異結合測定を行うことができる特異結
合反応用支持体及び特異結合測定方法を提供するもので
ある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、シリコン基板
上に１０００ないし１９００オングストローム（以下、
Ａと記す）の膜厚を有する酸化シリコン被膜が形成され
た支持体上にリガンドを固相化したことを特徴とする特
異結合反応用支持体である。
上に１０００ないし１９００オングストローム（以下、
Ａと記す）の膜厚を有する酸化シリコン被膜が形成され
た支持体上にリガンドを固相化したことを特徴とする特
異結合反応用支持体である。
【００１０】また、本発明は、シリコン基板上に１００
０ないし１９００Ａの膜厚を有する酸化シリコン被膜が
形成された支持体上にリガンドを固相化してなる特異結
合反応用支持体に被測定試料を接触させて、該被測定試
料中の測定対象物質と該リガンドとを反応させる工程
と、前記特異結合反応用支持体と同一の支持体からな
り、かつ前記リガンドを固相化していない対照用支持体
に、直線偏光を所定の入射角で入射させる工程と、該対
照用支持体で反射した第１の反射光を前記直線偏光の入
射角と同一の入射角で前記測定対象物質と反応させた前
記特異結合反応用支持体に入射させる工程と、前記特異
結合反応用支持体で反射した第２の反射光のうち楕円偏
光成分を測定する工程とを具備することを特徴とする特
異結合測定方法である。
０ないし１９００Ａの膜厚を有する酸化シリコン被膜が
形成された支持体上にリガンドを固相化してなる特異結
合反応用支持体に被測定試料を接触させて、該被測定試
料中の測定対象物質と該リガンドとを反応させる工程
と、前記特異結合反応用支持体と同一の支持体からな
り、かつ前記リガンドを固相化していない対照用支持体
に、直線偏光を所定の入射角で入射させる工程と、該対
照用支持体で反射した第１の反射光を前記直線偏光の入
射角と同一の入射角で前記測定対象物質と反応させた前
記特異結合反応用支持体に入射させる工程と、前記特異
結合反応用支持体で反射した第２の反射光のうち楕円偏
光成分を測定する工程とを具備することを特徴とする特
異結合測定方法である。
【００１１】ここで、測定対象物質と反応させた特異結
合反応用支持体を水洗し、次いで付着した水滴を除去し
た後、特異結合反応測定に供することもできる。
合反応用支持体を水洗し、次いで付着した水滴を除去し
た後、特異結合反応測定に供することもできる。
【００１２】以下、本発明の特異結合反応のうち、免疫
反応を測定する場合について詳細に説明する。
反応を測定する場合について詳細に説明する。
【００１３】本発明の特異結合反応用支持体に用いられ
るシリコン基板としては、表面が精密に研磨されたＳｉ
単結晶基板を使用できる。Ｓｉ単結晶基板は、容易に入
手可能であり、均一な表面を容易に得ることができる点
で優れている。
るシリコン基板としては、表面が精密に研磨されたＳｉ
単結晶基板を使用できる。Ｓｉ単結晶基板は、容易に入
手可能であり、均一な表面を容易に得ることができる点
で優れている。
【００１４】このシリコン基板上に被覆する酸化シリコ
ン被膜の膜厚は、１０００ないし１９００Ａの範囲内が
好ましい。なぜならば、酸化シリコン被膜の膜厚が前記
範囲内にある場合には、吸光度スペクトルのピークが可
視光領域（波長３００ｎｍ〜８００ｎｍ）内に現れるか
らである。また、酸化シリコン被膜の膜厚の誤差範囲は
１０Ａ以下であることが好ましい。
ン被膜の膜厚は、１０００ないし１９００Ａの範囲内が
好ましい。なぜならば、酸化シリコン被膜の膜厚が前記
範囲内にある場合には、吸光度スペクトルのピークが可
視光領域（波長３００ｎｍ〜８００ｎｍ）内に現れるか
らである。また、酸化シリコン被膜の膜厚の誤差範囲は
１０Ａ以下であることが好ましい。
【００１５】また、シリコン基板の上への酸化シリコン
被膜の形成は、例えば、熱酸化等の半導体装置の製造で
用いられる周知の方法により行うことができる。
被膜の形成は、例えば、熱酸化等の半導体装置の製造で
用いられる周知の方法により行うことができる。
【００１６】本発明の特異結合反応用支持体に用いられ
るリガンドは、リガンド−レセプター反応を行う物質で
ある。例えば、抗原―抗体反応の一成分であり、特異親
和性物質のことである。例えば、抗原、抗体、ＤＮＡ、
ＲＮＡ、ペプチド等を例示することができる。このよう
な各種リガンドの中から測定対象物質に適したリガンド
を選択して使用する。
るリガンドは、リガンド−レセプター反応を行う物質で
ある。例えば、抗原―抗体反応の一成分であり、特異親
和性物質のことである。例えば、抗原、抗体、ＤＮＡ、
ＲＮＡ、ペプチド等を例示することができる。このよう
な各種リガンドの中から測定対象物質に適したリガンド
を選択して使用する。
【００１７】このようなリガンドの支持体上への固相化
は、通常の無機物質へのリガンドの固相化方法に従って
行うことができる。例えば、まず、酸化シリコン被膜を
有するシリコン基板を、ＮＨ4 ＯＨ：Ｈ2 Ｏ2：Ｈ2 Ｏ
の混合液中で煮沸した後、窒素ガス還流下で３００℃〜
７００℃で数時間加熱する。さらに、冷却後Ｐ2 Ｏ5 粉
末等の乾燥剤中で水分を除去する。このように前処理を
行った酸化シリコン被膜に、シランカップリング剤によ
りアミノ基を化学的に導入する。この後、架橋剤とし
て、例えばグルタルアルデヒドを酸化シリコン被膜に導
入されたアミノ基に結合させる。このように調製した支
持体上に必要なリガンドを作用させることより、リガン
ドのアミノ基とグルタルアルデヒドが結合して、リガン
ドが酸化シリコン被膜上に固相化される。さらに必要が
あれば、例えば、牛血清アルブミンでブロッキングを行
っても良い。
は、通常の無機物質へのリガンドの固相化方法に従って
行うことができる。例えば、まず、酸化シリコン被膜を
有するシリコン基板を、ＮＨ4 ＯＨ：Ｈ2 Ｏ2：Ｈ2 Ｏ
の混合液中で煮沸した後、窒素ガス還流下で３００℃〜
７００℃で数時間加熱する。さらに、冷却後Ｐ2 Ｏ5 粉
末等の乾燥剤中で水分を除去する。このように前処理を
行った酸化シリコン被膜に、シランカップリング剤によ
りアミノ基を化学的に導入する。この後、架橋剤とし
て、例えばグルタルアルデヒドを酸化シリコン被膜に導
入されたアミノ基に結合させる。このように調製した支
持体上に必要なリガンドを作用させることより、リガン
ドのアミノ基とグルタルアルデヒドが結合して、リガン
ドが酸化シリコン被膜上に固相化される。さらに必要が
あれば、例えば、牛血清アルブミンでブロッキングを行
っても良い。
【００１８】ここで、シランカップリング剤としては、
特公昭第５０−１１４４８号公報に開示されているよう
な、下記一般式（Ｉ）で示されるシランカップリング剤
を使用することができる。
特公昭第５０−１１４４８号公報に開示されているよう
な、下記一般式（Ｉ）で示されるシランカップリング剤
を使用することができる。
【００１９】 （Ｙ´Ｒ´）n ＳｉＲ4-n ・・・・（Ｉ） （式中、Ｙ´は、アミノ、カルボニル、カルボキシ、イ
ソシアノ、ジアゾ、イソチオシアノ、ニトロソ、スルフ
ヒドリル、ハロカルボニルからなる群から得らればれた
基、Ｒは、低級アルコキシ、フエノキシおよびハロから
なる群から選ばれた基、Ｒ´は、低級アルキル、低級ア
ルキルフエニルおよびフエニルからなる群から選ばれた
基、ｎは１〜３の値を持つ整数である。）このようなシ
ランカップリング剤の具体例としては、γ−アミノプロ
ピル−トリエトキシシラン、Ｎ−β−アミノエチル−γ
−アミノプロピル−トリメトキシシラン、Ｎ−β−アミ
ノエチル−（α−メチル−γ−アミノプロピル）−ジメ
トキシメチルシランのようなアミノ−機能的脂肪族シラ
ンである。
ソシアノ、ジアゾ、イソチオシアノ、ニトロソ、スルフ
ヒドリル、ハロカルボニルからなる群から得らればれた
基、Ｒは、低級アルコキシ、フエノキシおよびハロから
なる群から選ばれた基、Ｒ´は、低級アルキル、低級ア
ルキルフエニルおよびフエニルからなる群から選ばれた
基、ｎは１〜３の値を持つ整数である。）このようなシ
ランカップリング剤の具体例としては、γ−アミノプロ
ピル−トリエトキシシラン、Ｎ−β−アミノエチル−γ
−アミノプロピル−トリメトキシシラン、Ｎ−β−アミ
ノエチル−（α−メチル−γ−アミノプロピル）−ジメ
トキシメチルシランのようなアミノ−機能的脂肪族シラ
ンである。
【００２０】また、シランカップリング剤を使用したリ
ガンドの固相化の他にも、ポリエチレンイミンを化学的
共有結合で酸化シリコン被膜表面に導入し、グルタルア
ルデヒドで架橋することによりリガンドを固相化する方
法（特開昭第６２−２２６８０９号公報、特開昭６２−
２９８７６３号公報等）によって、リガンドを固相化す
ることもできる。
ガンドの固相化の他にも、ポリエチレンイミンを化学的
共有結合で酸化シリコン被膜表面に導入し、グルタルア
ルデヒドで架橋することによりリガンドを固相化する方
法（特開昭第６２−２２６８０９号公報、特開昭６２−
２９８７６３号公報等）によって、リガンドを固相化す
ることもできる。
【００２１】また、本発明の特異結合測定方法において
対照用支持体としては、特異結合反応用支持体と同一の
膜厚の酸化シリコン被膜を有するシリコン基板からなる
支持体であって、リガンドを固相化していないものを使
用することができる。また、測定対象物質と反応させて
いない特異結合反応用支持体であって、同一の膜厚の酸
化シリコン被膜を有するものを使用することもできる。
しかしながら後者は、酸化シリコン被膜の表面にリガン
ドを全く同一の状態で固相化することが困難であり、対
照用支持体としては前者の方が好ましい。
対照用支持体としては、特異結合反応用支持体と同一の
膜厚の酸化シリコン被膜を有するシリコン基板からなる
支持体であって、リガンドを固相化していないものを使
用することができる。また、測定対象物質と反応させて
いない特異結合反応用支持体であって、同一の膜厚の酸
化シリコン被膜を有するものを使用することもできる。
しかしながら後者は、酸化シリコン被膜の表面にリガン
ドを全く同一の状態で固相化することが困難であり、対
照用支持体としては前者の方が好ましい。
【００２２】また、特異結合反応用支持体で反射した第
２の反射光のうちの楕円偏光成分の測定方法としては、
例えば、反射型分光光度計による吸光度スペクトルの測
定や、ＣＣＤカメラ、フォトマルチプライヤーまたはフ
ォトダイオードにより光電変換して楕円偏光成分の光量
を測定する方法がある。
２の反射光のうちの楕円偏光成分の測定方法としては、
例えば、反射型分光光度計による吸光度スペクトルの測
定や、ＣＣＤカメラ、フォトマルチプライヤーまたはフ
ォトダイオードにより光電変換して楕円偏光成分の光量
を測定する方法がある。
【００２３】
【作用】本発明の特異結合反応用支持体によれば、シリ
コン基板上に酸化シリコン被膜を形成することにより容
易に均一な表面が得られると共に、酸化シリコン被膜の
膜圧を容易に制御することができる。また、酸化シリコ
ン被膜の膜厚を１０００ないし１９００Ａにすることに
よって、吸光度スペクトルのピークが可視光領域内に現
れる。これにより、光源として白色光を放射するものを
使用すれば足りる。また、ＣＣＤカメラ、フォトマルチ
プライヤーやフォトダイオード等で楕円偏光成分の光量
を測定する場合にも適当である。
コン基板上に酸化シリコン被膜を形成することにより容
易に均一な表面が得られると共に、酸化シリコン被膜の
膜圧を容易に制御することができる。また、酸化シリコ
ン被膜の膜厚を１０００ないし１９００Ａにすることに
よって、吸光度スペクトルのピークが可視光領域内に現
れる。これにより、光源として白色光を放射するものを
使用すれば足りる。また、ＣＣＤカメラ、フォトマルチ
プライヤーやフォトダイオード等で楕円偏光成分の光量
を測定する場合にも適当である。
【００２４】また、本発明の特異結合測定方法によれ
ば、対照用支持体に所定の入射角で入射された直線偏光
は、対照用支持体の表面状態に依存して偏光され、楕円
偏光の第１の反射光となる。この第１の反射光を、直線
偏光と同一の入射角で特異結合反応用支持体に入射され
ると、対照用支持体と特異結合反応用支持体の表面状態
が同一である場合には、第１の反射光は再び直線偏光に
戻る。しかし、対照用支持体と特異結合反応用支持体の
表面状態が異なる場合には、その差異が楕円偏光成分と
して第２の反射光内に現れる。従って、この楕円偏光成
分を測定することによって、固相化されたリガンドに結
合した測定対象物質を含む特異結合反応用支持体の表面
の状態を、対照用支持体の表面との差として正確に把握
することができる。
ば、対照用支持体に所定の入射角で入射された直線偏光
は、対照用支持体の表面状態に依存して偏光され、楕円
偏光の第１の反射光となる。この第１の反射光を、直線
偏光と同一の入射角で特異結合反応用支持体に入射され
ると、対照用支持体と特異結合反応用支持体の表面状態
が同一である場合には、第１の反射光は再び直線偏光に
戻る。しかし、対照用支持体と特異結合反応用支持体の
表面状態が異なる場合には、その差異が楕円偏光成分と
して第２の反射光内に現れる。従って、この楕円偏光成
分を測定することによって、固相化されたリガンドに結
合した測定対象物質を含む特異結合反応用支持体の表面
の状態を、対照用支持体の表面との差として正確に把握
することができる。
【００２５】
【実施例】以下、本発明の実施例について、本発明をヒ
トＩｇＧ抗原の測定に適用した場合を例にとって詳細に
説明する。
トＩｇＧ抗原の測定に適用した場合を例にとって詳細に
説明する。
【００２６】図１は、本発明の特異結合反応用支持体の
一例を示す説明図である。図中１１は、シリコン単結晶
基板である。シリコン単結晶基板１１の表面上には、膜
厚１５００Ａの酸化シリコン被膜１２が形成されてい
る。
一例を示す説明図である。図中１１は、シリコン単結晶
基板である。シリコン単結晶基板１１の表面上には、膜
厚１５００Ａの酸化シリコン被膜１２が形成されてい
る。
【００２７】このような構成からなる支持体本体１３の
表面上には、抗ヒトＩｇＧ抗体１４が固相化されてい
る。抗ヒトＩｇＧ抗体１４の固相化は次のようにして行
った。まず、支持体本体１３を、ＮＨ4 ＯＨ：Ｈ
2 Ｏ2 ：Ｈ2 Ｏ＝１：１：４の溶液中で３０分間煮沸し
た。次に、支持体本体１３を蒸留水で洗浄した後、エタ
ノールで水分を除去した。続いて、窒素ガス（流量１．
０ml／分）還流下、３００℃で３時間加熱した。支持体
本体１３を冷却した後、窒素ガス還流下、Ｐ2 Ｏ5 粉末
の入ったデシケーター中で３０分間放置した。
表面上には、抗ヒトＩｇＧ抗体１４が固相化されてい
る。抗ヒトＩｇＧ抗体１４の固相化は次のようにして行
った。まず、支持体本体１３を、ＮＨ4 ＯＨ：Ｈ
2 Ｏ2 ：Ｈ2 Ｏ＝１：１：４の溶液中で３０分間煮沸し
た。次に、支持体本体１３を蒸留水で洗浄した後、エタ
ノールで水分を除去した。続いて、窒素ガス（流量１．
０ml／分）還流下、３００℃で３時間加熱した。支持体
本体１３を冷却した後、窒素ガス還流下、Ｐ2 Ｏ5 粉末
の入ったデシケーター中で３０分間放置した。
【００２８】このようにして前処理を施した支持体本体
１３を、１容量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ンのトルエン溶液に２時間浸漬した。次に、支持体本体
１３をメタノール溶液中で３０秒ずつ２回超音波洗浄器
にかけた。このようにして、酸化シリコンとγ−アミノ
プロピルトリエトキシシランが結合して、酸化シリコン
被膜１２にアミノ基が導入された。
１３を、１容量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ンのトルエン溶液に２時間浸漬した。次に、支持体本体
１３をメタノール溶液中で３０秒ずつ２回超音波洗浄器
にかけた。このようにして、酸化シリコンとγ−アミノ
プロピルトリエトキシシランが結合して、酸化シリコン
被膜１２にアミノ基が導入された。
【００２９】その後、支持体本体１３を１容量％グルタ
ルアルデヒド溶液中に２時間浸漬した。次いで、１容量
％ツイン２０の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）
で、支持体本体１３を洗浄した。洗浄後の支持体本体１
３を、濃度１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／mlで抗ヒト
ＩｇＧ抗体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２０）
に溶解した抗ヒトＩｇＧ抗体溶液に、４℃で一昼夜、ま
たは室温（２５℃）で８時間浸漬した。次いで、抗ヒト
ＩｇＧ抗体が固相化された支持体本体１３を、１容量％
ツイン２０の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）で
洗浄した後、さらに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
２）で洗浄した。そして、１重量％牛血清アルブミンの
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）溶液に１時間浸
漬した後、再び、１容量％ツイン２０の１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ＝７．２）及び１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝７．２）で順次洗浄した。
ルアルデヒド溶液中に２時間浸漬した。次いで、１容量
％ツイン２０の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）
で、支持体本体１３を洗浄した。洗浄後の支持体本体１
３を、濃度１００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／mlで抗ヒト
ＩｇＧ抗体を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２０）
に溶解した抗ヒトＩｇＧ抗体溶液に、４℃で一昼夜、ま
たは室温（２５℃）で８時間浸漬した。次いで、抗ヒト
ＩｇＧ抗体が固相化された支持体本体１３を、１容量％
ツイン２０の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）で
洗浄した後、さらに１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．
２）で洗浄した。そして、１重量％牛血清アルブミンの
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）溶液に１時間浸
漬した後、再び、１容量％ツイン２０の１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ＝７．２）及び１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ＝７．２）で順次洗浄した。
【００３０】このようにして調製された特異結合反応用
支持体１５を用いて、次のようにしてヒトＩｇＧ抗原の
測定を行った。まず、ヒトＩｇＧ抗原を含む被測定溶液
に、特異結合反応用支持体１５を３０分間浸漬して、ヒ
トＩｇＧ抗原を支持体本体１３の上に固相化させた抗ヒ
トＩｇＧ抗体に結合させる。この後、このヒトＩｇＧ抗
原と反応させた特異結合反応用支持体１５を蒸留水で洗
浄して、さらにその表面に付着した水分を窒素ガスを噴
射して除去する。
支持体１５を用いて、次のようにしてヒトＩｇＧ抗原の
測定を行った。まず、ヒトＩｇＧ抗原を含む被測定溶液
に、特異結合反応用支持体１５を３０分間浸漬して、ヒ
トＩｇＧ抗原を支持体本体１３の上に固相化させた抗ヒ
トＩｇＧ抗体に結合させる。この後、このヒトＩｇＧ抗
原と反応させた特異結合反応用支持体１５を蒸留水で洗
浄して、さらにその表面に付着した水分を窒素ガスを噴
射して除去する。
【００３１】上述のようなヒトＩｇＧ抗原と反応させた
特異結合反応用支持体１５の表面で偏光が反射した際の
偏光状態の変化を次のようにして測定する。このような
偏光状態の変化の測定には、図２に示すような対照用支
持体を対照として使用するエリプソメータを使用した。
特異結合反応用支持体１５の表面で偏光が反射した際の
偏光状態の変化を次のようにして測定する。このような
偏光状態の変化の測定には、図２に示すような対照用支
持体を対照として使用するエリプソメータを使用した。
【００３２】図中２１は、白色光２２を放射する光源で
ある。光源２１から放射された白色光２２は、偏光子２
３を経て−４５°の直線偏光２４に偏光される。この直
線偏光２４を入射角θで対照用支持体２５に入射させ
る。対照用支持体２５としては、表面上に膜厚１５００
Ａの酸化シリコン被膜が形成されたシリコン単結晶基板
を使用した。
ある。光源２１から放射された白色光２２は、偏光子２
３を経て−４５°の直線偏光２４に偏光される。この直
線偏光２４を入射角θで対照用支持体２５に入射させ
る。対照用支持体２５としては、表面上に膜厚１５００
Ａの酸化シリコン被膜が形成されたシリコン単結晶基板
を使用した。
【００３３】入射された直線偏光２４は、対照用支持体
２５の表面状態に依存して楕円偏光されて反射し、第１
の反射光２６となる。この後、第１の反射光２６を、直
線偏光２４の入射角θと同一の入射角θで、測定対象物
質と反応させた特異結合反応用支持体２７の表面に入射
させる。このとき、対照用支持体２５と特異結合反応用
支持体２７とは、その入斜面が相互に直角になるように
配置されている。このため、第２の反射光２８の偏光方
向が９０°回転され、第２の反射光２８は＋４５°の直
線偏光となる。
２５の表面状態に依存して楕円偏光されて反射し、第１
の反射光２６となる。この後、第１の反射光２６を、直
線偏光２４の入射角θと同一の入射角θで、測定対象物
質と反応させた特異結合反応用支持体２７の表面に入射
させる。このとき、対照用支持体２５と特異結合反応用
支持体２７とは、その入斜面が相互に直角になるように
配置されている。このため、第２の反射光２８の偏光方
向が９０°回転され、第２の反射光２８は＋４５°の直
線偏光となる。
【００３４】このように第１の反射光２６を入射角θで
特異結合反応用支持体２７に入射させると、対照用支持
体２５と特異結合反応用支持体２７の表面状態が同一で
あれば、第１の反射光２６は再び直線偏光に戻り、第２
の反射光２８は直線偏光のみになる。しかし、特異結合
反応用支持体２７の表面状態は、対照用支持体２５とは
異なり、酸化シリコン被膜１２上に抗ヒトＩｇＧ抗体１
４が固相化されており、さらに被測定試料中のヒトＩｇ
Ｇ抗原が結合している。このため、このような表面状態
の差異が、第２の反射光２８の中に楕円偏光成分として
現れる。そして、特異結合反応用支持体２７の単位面積
当たりの、結合するＩｇＧ抗原の密度が高くなるほど、
第２の反射光２８のうちの楕円偏光成分が多くなる。
特異結合反応用支持体２７に入射させると、対照用支持
体２５と特異結合反応用支持体２７の表面状態が同一で
あれば、第１の反射光２６は再び直線偏光に戻り、第２
の反射光２８は直線偏光のみになる。しかし、特異結合
反応用支持体２７の表面状態は、対照用支持体２５とは
異なり、酸化シリコン被膜１２上に抗ヒトＩｇＧ抗体１
４が固相化されており、さらに被測定試料中のヒトＩｇ
Ｇ抗原が結合している。このため、このような表面状態
の差異が、第２の反射光２８の中に楕円偏光成分として
現れる。そして、特異結合反応用支持体２７の単位面積
当たりの、結合するＩｇＧ抗原の密度が高くなるほど、
第２の反射光２８のうちの楕円偏光成分が多くなる。
【００３５】このような楕円偏光成分を含む第２の反射
光２８を、第２の反射光の中の直線偏光成分（＋４５°
偏光）に対して直角をなす偏光方向を有する検光子２９
に導入する。すると、第２の反射光２８のうち＋４５°
の直線偏光成分は検光子２９を透過せず、楕円偏光成分
だけが検光子２９で透過する。このようにして楕円偏光
成分を検出器３０で検出する。検出器３０としては、例
えば、反射型分光光度計を使用して、吸光度スペクトル
を測定できる。また、検出器３０として、ＣＣＤカメ
ラ、ホトマルチプライヤー等を使用し、楕円偏光成分の
光量を測定することもできる。
光２８を、第２の反射光の中の直線偏光成分（＋４５°
偏光）に対して直角をなす偏光方向を有する検光子２９
に導入する。すると、第２の反射光２８のうち＋４５°
の直線偏光成分は検光子２９を透過せず、楕円偏光成分
だけが検光子２９で透過する。このようにして楕円偏光
成分を検出器３０で検出する。検出器３０としては、例
えば、反射型分光光度計を使用して、吸光度スペクトル
を測定できる。また、検出器３０として、ＣＣＤカメ
ラ、ホトマルチプライヤー等を使用し、楕円偏光成分の
光量を測定することもできる。
【００３６】以上説明した如く、本発明の特異結合測定
方法によれば、特異結合反応用支持体２７の上に固相化
された抗ヒトＩｇＧ抗体１４に結合した抗ヒトＩｇＧ抗
原の密度を、対照用支持体２５の表面との差として正確
に把握することができる。
方法によれば、特異結合反応用支持体２７の上に固相化
された抗ヒトＩｇＧ抗体１４に結合した抗ヒトＩｇＧ抗
原の密度を、対照用支持体２５の表面との差として正確
に把握することができる。
【００３７】試験例 上述の特異結合測定方法に従って、ヒトＩｇＧ抗原の濃
度が０、０．１、１．０、１０、１００、１０００ng/m
lである各種ヒトＩｇＧ抗原標準溶液に夫々特異結合測
定用支持体を３０分間浸漬し、ヒトＩｇＧ抗原を作用さ
せた各試料検体１〜６について、波長４００ｎｍ〜８０
０ｎｍにおける吸光度スペクトルを測定した結果を図３
に示す。なお、図３中、横軸は直線偏光２４の波長（単
位ｎｍ）を示し、縦軸は吸光度を示す。また、図３中、
特性線Ｉ〜VIは、夫々各試料検体１〜６についてのスペ
クトルを示すものである。
度が０、０．１、１．０、１０、１００、１０００ng/m
lである各種ヒトＩｇＧ抗原標準溶液に夫々特異結合測
定用支持体を３０分間浸漬し、ヒトＩｇＧ抗原を作用さ
せた各試料検体１〜６について、波長４００ｎｍ〜８０
０ｎｍにおける吸光度スペクトルを測定した結果を図３
に示す。なお、図３中、横軸は直線偏光２４の波長（単
位ｎｍ）を示し、縦軸は吸光度を示す。また、図３中、
特性線Ｉ〜VIは、夫々各試料検体１〜６についてのスペ
クトルを示すものである。
【００３８】図３から明らかな如く、各試料検体１〜６
についての吸光度スペクトルは、いずれも約６５０ｎｍ
にピークを持ち、そのピークにおける吸光度は、ヒトＩ
ｇＧ抗原標準溶液のヒトＩｇＧ抗原濃度が高いほど大き
い値を示した。これにより、特異結合反応用支持体上に
多くヒトＩｇＧ抗原が結合いているほど、言い換えれ
ば、特異結合反応用支持体の単位面積当たりの結合する
ヒトＩｇＧ抗原の密度が高いほど、ピークでの吸光度が
高くなることが確認された。
についての吸光度スペクトルは、いずれも約６５０ｎｍ
にピークを持ち、そのピークにおける吸光度は、ヒトＩ
ｇＧ抗原標準溶液のヒトＩｇＧ抗原濃度が高いほど大き
い値を示した。これにより、特異結合反応用支持体上に
多くヒトＩｇＧ抗原が結合いているほど、言い換えれ
ば、特異結合反応用支持体の単位面積当たりの結合する
ヒトＩｇＧ抗原の密度が高いほど、ピークでの吸光度が
高くなることが確認された。
【００３９】また、各試験検体１〜６の波長６５０ｎｍ
における吸光度と、各試験検体１〜６に対応するヒトＩ
ｇＧ抗原標準溶液のヒトＩｇＧ抗原濃度とから作成した
検量線を、図４に示す。なお、図４中、横軸はヒトＩｇ
Ｇ抗原濃度（単位ｎｇ／ml）を示し、縦軸は、波長６５
０ｎｍにおける吸光度を示す。
における吸光度と、各試験検体１〜６に対応するヒトＩ
ｇＧ抗原標準溶液のヒトＩｇＧ抗原濃度とから作成した
検量線を、図４に示す。なお、図４中、横軸はヒトＩｇ
Ｇ抗原濃度（単位ｎｇ／ml）を示し、縦軸は、波長６５
０ｎｍにおける吸光度を示す。
【００４０】図４から明らかな如く、ヒトＩｇＧ抗原濃
度と波長６５０ｎｍにおける吸光度との関係を、ヒトＩ
ｇＧ抗原濃度０．１〜１０００ng／mlの広い濃度範囲に
わたって検量線化することができる。従って、ヒトＩｇ
Ｇ抗原濃度が比較的高濃度の被測定試料についても、こ
の被測定試料を稀釈する必要がない。このため、測定操
作に要する時間を、従来の免疫測定方法よりも短縮する
ことができる。また、稀釈工程が不要であるため、測定
装置を自動化する場合にも装置を容易に簡略化すること
ができる。
度と波長６５０ｎｍにおける吸光度との関係を、ヒトＩ
ｇＧ抗原濃度０．１〜１０００ng／mlの広い濃度範囲に
わたって検量線化することができる。従って、ヒトＩｇ
Ｇ抗原濃度が比較的高濃度の被測定試料についても、こ
の被測定試料を稀釈する必要がない。このため、測定操
作に要する時間を、従来の免疫測定方法よりも短縮する
ことができる。また、稀釈工程が不要であるため、測定
装置を自動化する場合にも装置を容易に簡略化すること
ができる。
【００４１】
【発明の効果】以上説明した如くに、本発明の特異結合
反応用支持体及び特異結合測定方法によれば、ＦＩＡま
たはＥＩＡのような従来の特異結合測定方法に比べ、簡
単な操作で、かつ短時間で特異結合測定を行うことがで
きると共に、測定感度を容易に高めることができる等の
効果を奏するものである。
反応用支持体及び特異結合測定方法によれば、ＦＩＡま
たはＥＩＡのような従来の特異結合測定方法に比べ、簡
単な操作で、かつ短時間で特異結合測定を行うことがで
きると共に、測定感度を容易に高めることができる等の
効果を奏するものである。
【図１】本発明の特異結合反応用支持体の一例を示す説
明図。
明図。
【図２】本発明の特異結合測定方法に使用するエリプソ
メータの概要を示す説明図。
メータの概要を示す説明図。
【図３】本発明の特異結合測定方法の試験例に従って測
定された試料検体の吸光度スペクトルを示す特性図。
定された試料検体の吸光度スペクトルを示す特性図。
【図４】同試験例におけるヒトＩｇＧ抗原濃度と吸光度
の関係を示す検量線を示す特性図。
の関係を示す検量線を示す特性図。
【図５】従来のＥＩＡ法におけるマウスＩｇＧ抗原濃度
と吸光度の関係を示す検量線を示す特性図。
と吸光度の関係を示す検量線を示す特性図。
１１・・・シリコン単結晶基板、１２・・・酸化シリコン膜、
１３・・・支持体本体、１４・・・抗ヒトＩｇＧ抗体、１５・・
・特異結合反応用支持体、２１・・・光源、２２・・・白色
光、２３・・・偏光子、２４…直線偏光、２５…対象用支
持体、２６…第１の反射光、２７…特異結合反応支持
体、２８…第２の反射光、２９…検光子、３０…検出
器。
１３・・・支持体本体、１４・・・抗ヒトＩｇＧ抗体、１５・・
・特異結合反応用支持体、２１・・・光源、２２・・・白色
光、２３・・・偏光子、２４…直線偏光、２５…対象用支
持体、２６…第１の反射光、２７…特異結合反応支持
体、２８…第２の反射光、２９…検光子、３０…検出
器。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543 595 G01N 21/21 G01N 33/551 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (3)
- 【請求項１】 シリコン基板上に１０００ないし１９０
０オングストロームの膜厚を有する酸化シリコン被膜が
形成された支持体上にリガンドを固相化したことを特徴
とする特異結合反応用支持体。 - 【請求項２】 シリコン基板上に１０００ないし１９０
０オングストロームの膜厚を有する酸化シリコン被膜が
形成された支持体上にリガンドを固相化してなる特異結
合反応用支持体に被測定試料を接触させて、該被測定試
料中の測定対象物質と該リガンドとを反応させる工程
と、 前記特異結合反応用支持体と同一の支持体からなり、か
つ前記リガンドを固相化してない対照用支持体に、直線
偏光を所定の入射角で入射させる工程と、 該対照用支持体で反射した第１の反射光を前記直線偏光
の入射角と同一の入射角で、前記測定対象物質と反応さ
せた前記特異結合反応用支持体に入射させる工程と、前
記特異結合反応用支持体で反射した第２の反射光のうち
楕円偏光成分を測定する工程とを具備することを特徴と
する特異結合測定方法。 - 【請求項３】 測定対象物質と反応させた特異結合反応
用支持体を水洗し、次いで、付着した水滴を除去した後
に特異結合反応測定に供することを特徴とする請求項２
記載の特異結合測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03080124A JP3131459B2 (ja) | 1991-04-12 | 1991-04-12 | 特異結合反応用支持体及び特異結合測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03080124A JP3131459B2 (ja) | 1991-04-12 | 1991-04-12 | 特異結合反応用支持体及び特異結合測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04315051A JPH04315051A (ja) | 1992-11-06 |
| JP3131459B2 true JP3131459B2 (ja) | 2001-01-31 |
Family
ID=13709465
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03080124A Expired - Fee Related JP3131459B2 (ja) | 1991-04-12 | 1991-04-12 | 特異結合反応用支持体及び特異結合測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3131459B2 (ja) |
-
1991
- 1991-04-12 JP JP03080124A patent/JP3131459B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04315051A (ja) | 1992-11-06 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20001031 |
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