JPH04278100A - 測定用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、医学診断上、その他に
有用な、紫外部領域での吸光度変化を測定して、生体液
中の酵素活性を定量するための測定用組成物に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】血液などの生体液中の酵素活性の測定は
、医学上、診断及び病態把握の手段として日常的に広く
測定されている重要なものである。これら酵素活性測定
は、紫外部領域の吸光度変化に導いて測定する方法と、
可視部領域の吸光度変化に導いて測定する方法に大別す
ることができる。紫外部領域の吸光度変化に導く方法は
、最終的にニコチンアミドアデニンジヌクレオチドある
いはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸〔以
下、ＮＡＤ（Ｐ）＋　と略称する。〕の変化を測定する
もので、これまで多くの酵素活性がこの原理に基づいて
測定されてきた。

【０００３】例えば、血清中の酵素として、α−アミラ
ーゼ、クレアチンキナーゼ、グルタミン酸ピルビン酸ト
ランスアミナーゼ、グルタミン酸オキザロ酢酸トランス
アミナーゼ、乳酸脱水素酵素、ロイシンアミノペプチダ
ーゼ（以下、ＬＡＰと略称する。特開昭５９−６６８９
８号公報、特開昭６３−９４９９９号公報参照）、コリ
ンエステラーゼ、リパーゼ、ヒドロキシ酪酸脱水素酵素
、アルドラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、γ−グルタミル
トランスペプチダーゼ（以下、γＧＴＰと略称する。 特開昭６３−９４９９８号公報参照）、アリルアミダー
ゼ（以下、ＡＡと略称する。特開昭６３−９４９９６号
公報参照）などがある。これらの測定項目は、いずれも
、最終的にＮＡＤ（Ｐ）＋　と還元型ＮＡＤ（Ｐ）＋　
〔以下、ＮＡＤ（Ｐ）　Ｈと略称する。〕間の相互変換
に伴う単位時間当りの紫外部領域の吸収変化を測定する
ものである（３４０ｎｍ付近の吸光度変化を追跡するも
のが殆どである）。例えば、γＧＴＰ、ＬＡＰあるいは
ＡＡを例にとって言えば、各酵素は以下のそれぞれの反
応を触媒するものであり、それらの反応式に従って測定
されている。

【０００４】

【化１】

【０００５】

【化２】

【０００６】

【化３】

【０００７】上記反応式１〜３で生成したＬ−ロイシン
やＬ−アラニンなどのＬ−アミノ酸は、相当するアミノ
酸脱水素酵素の作用で反応式４に従ってＮＡＤ（Ｐ）＋
　からＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの変化に導いて３４０ｎｍの吸
収変化として測定することができる。

【０００８】

【化４】

【０００９】血清などの生体液中にはヘモグロビン、ビ
リルビンなどの有色成分やアスコルビン酸などの酸化還
元物質など、種々の共存物質が存在し、各種測定用組成
物による測定値に種々の影響を及ぼし、測定誤差の原因
となっている。可視部領域の吸光度変化に導く測定用組
成物では、これら共存物質による影響を受けやすく、種
々の方策が検討されている。例えば、ヘモグロビンによ
る影響を回避するためにチオ尿素の添加が有効と報告さ
れている（特開昭６２−２４８５００号公報参照）が、
完全には回避されていない。

【００１０】一方、紫外部領域の吸光度変化に導く測定
用組成物では、これら有色成分の吸収極大が４００〜４
５０ｎｍ付近にあり、紫外部領域とは吸収波長が異なっ
ているため、比較的影響を受けにくいとして従来殆ど対
策が施されていなかった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記共
存物質が生体液中に高濃度に存在する場合には、紫外部
領域の吸収変化に導く測定用組成物でも酵素活性測定値
に悪影響が生じ、測定誤差の原因となる現象が認められ
ていた。これは、溶血作用により生ずるヘモグロビン及
びその誘導体、あるいはビリルビンなどが測定用組成物
中で光や熱により徐々に分解するため、酵素活性測定中
の経時的な４００〜４５０ｎｍ付近の吸光度減少が紫外
部領域の波長にまで影響してきたことに寄因する。これ
らの現象は、近年の診断技術の高度化が進む中、臨床検
査の現場で日常的に使用するには信頼性に欠けるという
問題点を提起しているものであった。

【００１２】それ故に、本発明は上記の如き生体液中の
共存物質による影響を受けない、紫外部領域での吸収変
化を測定して生体液中の酵素活性を定量する測定用組成
物の提供を目的としている。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な要求を満足する測定用組成物を提供することを目的と
して種々検討した結果、測定用組成物中にヒドラジンを
用いることにより、上記の目的を達成し、本発明による
測定用組成物が日常検査に使用するのに充分な精度を有
する測定用組成物であることを見い出し、本発明を完成
するに到った。

【００１４】すなわち、本発明は、紫外部領域での吸光
度変化を測定して、生体液中の酵素活性を定量する測定
用組成物において、ヒドラジンを含有せしめた測定用組
成物を要旨とするものである。

【００１５】本発明の測定用組成物においては、ヒドラ
ジンを含有させることが必要である。ヒドラジンの含有
量は組成物に対し、０．１ｍＭ以上、２００ｍＭ以下で
あり、好ましくは０．３ｍＭ以上、２００ｍＭ以下であ
る。 含有量が０．１ｍＭ未満の場合は本発明の効果が発揮し
にくく、一方２００ｍＭを超える場合は、本発明の効果
が向上せず、むしろ、測定用組成物中の成分の不安定化
や悪影響の増悪をまねく傾向にある。使用するヒドラジ
ンの濃度については、検体としての血清の条件、使用す
る反応系、その他使用条件下における種々の要素により
適宜任意の至適濃度を決定すればよく、上記範囲であれ
ば特に限定されるものではない。

【００１６】測定用組成物にヒドラジンを含有させるに
は、水に溶解することによりヒドラジンを生成する化合
物を用いることができる。そのような化合物としては、
例えば、無水ヒドラジン、一塩酸ヒドラジン、二塩酸ヒ
ドラジン、抱水ヒドラジン、硫酸ヒドラジンなど、水に
溶解することによりヒドラジンを生成するものであれば
、いかなるものでも使用できる。これらの化合物は単独
で用いることもできるし、２種以上混合して使用するこ
ともできる。

【００１７】本発明の測定用組成物としては、紫外部領
域での吸収変化に導いて生体液中の酵素活性を定量する
測定用組成物であれば特に限定されるものではないが、
特に弱アルカリ側で測定する測定用組成物、例えば、γ
ＧＴＰ、ＬＡＰ、ＡＡ、乳酸脱水素酵素、コリンエステ
ラーゼなどの測定用組成物において本発明の効果が顕著
である。これら測定用組成物の他の構成成分は、これら
の目的とする測定酵素の種類により適宜選んで配合すれ
ばよい。測定用組成物中の各成分の起源及び濃度は公知
技術を適用すればよいが、上記反応式１〜４で示したγ
ＧＴＰ、ＬＡＰ、ＡＡの各測定用組成物を例にとって述
べれば以下の如くなる。

【００１８】γＧＴＰ、ＬＡＰ、ＡＡ各酵素活性の測定
用組成物に用いられる反応式４におけるアミノ酸脱水素
酵素としては、例えば、ロイシン脱水素酵素、アラニン
脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、バリン脱水素酵
素、セリン脱水素酵素があげられ、中でも、前３者が好
ましい。これらアミノ酸脱水素酵素の給源は特に限定さ
れるものではないが、例えばロイシン脱水素酵素の給源
はバチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｈ
ａｅｒｉｃｕｓ　）などの微生物由来のものなど、種々
の起源のものを使用することができる。中でも安定性、
保存性に富む好熱性細菌、例えば、バチルス・ステアロ
サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　）やクロストリジウム・サーモ
アセティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏ
ａｃｅｔｉｃｕｍ）由来のロイシン脱水素酵素が望まし
い。またアラニン脱水素酵素はバチルス・ズブチリス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　）、バチルス・
スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｈａｅｒｉｃｕ
ｓ　）などの微生物由来のものなど、種々の起源のもの
を使用することができる。中でも、安定性、保存性に富
む好熱性細菌、例えばバチルス・ステアロサーモフィル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ　）由来のアラニン脱水素酵素が望ましい。さ
らに、グルタミン酸脱水素酵素はプロテウス・インコン
スタンス（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｉｎｃｏｎｓｔａｎｓ）な
どの細菌、カビ、酵母などの微生物、あるいは植物など
、種々の起源のものを使用することができる。

【００１９】γＧＴＰ測定用組成物に用いられるγ−　
グルタミルジペプチド基質としては、例えば、γ−グル
タミル−Ｌ−ロイシン、γ−グルタミル−Ｌ−アラニン
、γ−グルタミル−Ｌ−グルタミン酸、γ−グルタミル
−Ｌ−フェニルアラニン、γ−グルタミル−グリシン、
γ−グルタミル−Ｌ−バリン、γ−グルタミル−Ｌ−セ
リンなどを用いることができるが、中でも、γ−グルタ
ミル−Ｌ−ロイシン、γ−グルタミル−Ｌ−アラニン、
γ−グルタミル−Ｌ−グルタミン酸などの使用が好まし
い。さらに、γＧＴＰ測定用組成物に用いられる受容体
としては種々のアミノ酸やジペプチドなどを用いること
ができるが、中でも、グリシルグリシンやグリシルアラ
ニンを使用するのが好ましい。

【００２０】ＬＡＰ測定用組成物に用いられる基質とし
ては種々のロイシンジペプチドやロイシンアミドを支障
なく用いることができるが、中でも、ロイシルアラニン
やロイシンアミドを使用するのが好ましい。

【００２１】さらに、ＡＡ測定用組成物に用いられる基
質としては、Ｎ末端がアラニンである種々のジもしくは
トリペプチド、アラニンアミドなどがあげられ、中でも
、アラニンアミド、アラニルアラニン、アラニルロイシ
ンなどの使用が好ましい。

【００２２】γＧＴＰ、ＬＡＰ及びＡＡの各測定用組成
物は上記アミノ酸脱水素酵素や基質以外に、ＮＡＤ（Ｐ
）＋　を主成分とし、その他に通常、促進剤、賦活剤な
どの添加剤なるものも含ませることもできる。添加剤と
しては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウムなどの
塩類やトリトンＸ−１００などの界面活性剤などを、ま
た、防腐剤としては、例えば、アジ化ナトリウムなどの
公知のものを支障なく使用することができる。

【００２３】γＧＴＰ測定用組成物の各成分の濃度とし
ては、γ−グルタミルジペプチドを３〜３００ｍＭ（例
えば、γ−グルタミル−Ｌ−ロイシンの場合、３〜１５
０ｍＭ、γ−グルタミル−Ｌ−アラニンの場合、１０〜
３００ｍＭ）、受容体を３〜５００ｍＭ、ＮＡＤ（Ｐ）
＋　を０．１〜２０ｍＭ、塩類を５〜５００ｍＭ、界面
活性剤を０．０１〜２％、アジ化ナトリウムを０．５〜
５０ｍＭ、アミノ酸脱水素酵素を０．１〜１００ユニッ
ト／ｍｌ　、硫酸ヒドラジンを０．５〜２００ｍＭとな
るように使用すればよく、さらに望ましくはγ−グルタ
ミルジペプチドを７．５〜２５０ｍＭ（例えば、γ−グ
ルタミル−Ｌ−ロイシンの場合、７．５〜１００ｍＭ、
γ−グルタミル−Ｌ−アラニンの場合、１５〜２５０ｍ
Ｍ、γ−グルタミル−Ｌ−グルタミン酸の場合、７．５
〜２５０ｍＭ）、受容体を５〜３５０ｍＭ、ＮＡＤ（Ｐ
）＋　を０．２〜１５ｍＭ、塩類を１０〜３５０ｍＭ、
界面活性剤を０．０２〜１．５％、アジ化ナトリウムを
１．０〜３０ｍＭ、アミノ酸脱水素酵素を０．２〜５０
ユニット／ｍｌ　、硫酸ヒドラジンを１．０〜２００ｍ
Ｍとなるように使用すればよい。

【００２４】さらに、ＬＡＰ及びＡＡ測定用組成物の各
成分の濃度としては、基質を１〜１００ｍＭ、　アミノ
酸脱水素酵素を０．５〜１００ユニット／ｍｌ　、　Ｎ
ＡＤ（Ｐ）＋　０．５〜３０ｍＭ、アジ化ナトリウムを
０．５〜５０ｍＭ、硫酸ヒドラジンを０．１〜１００ｍ
Ｍとなるように使用すればよく、さらに望ましくは基質
を５〜５０ｍＭ、アミノ酸脱水素酵素を１〜５０ユニッ
ト／ｍｌ　、ＮＡＤ（Ｐ）＋　を１〜１０ｍＭ、塩類を
５〜３５０ｍＭ、界面活性剤を０．　０２〜２％、アジ
化ナトリウムを１．０〜３０ｍＭ、硫酸ヒドラジンを０
．３〜８０ｍＭとなるように使用すればよい。

【００２５】γＧＴＰ、ＬＡＰ及びＡＡ測定用組成物で
は反応式１〜４に示した如く、γＧＴＰ、ＬＡＰ及びＡ
Ａの作用で生成したＬ−アミノ酸を相当するアミノ酸脱
水素酵素の作用で最終的にＮＡＤ（Ｐ）　Ｈに導き、３
４０ｎｍにおける吸光度増加を測定することにより各酵
素の活性を求めることができる。

【００２６】本発明の試薬を用いて血清や尿などの生体
液中の酵素活性を測定する時の反応温度としては、通常
の酵素反応での２０〜４５℃を使用すればよい。測定機
器としては紫外部領域の測定波長を有する分光光度計や
自動分析装置を使用すればよい。中でも、測定用組成物
を入れるセルを恒温に保つことのできる分光光度形や自
動分析装置の使用が好ましい。

【００２７】

【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。 実施例１、比較例１ γ−グルタミル−Ｌ−アラニン（バッケム社より購入）
５０ｍＭ、グリシルグリシン８０ｍＭ（ｐＨ８．５、ジ
エタノールアミン緩衝液８０ｍＭ）、　ＮＡＤ＋　〔ベ
ーリンガー・マンハイム山之内（株）　より購入〕５ｍ
Ｍ、アラニン脱水素酵素〔バチルス・ズブチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　）由来、シグマ社よ
り購入〕６ユニット／ｍｌ　、および硫酸ヒドラジン１
６ｍＭからなるγＧＴＰ測定用組成物を調製した（実施
例１）。

【００２８】実施例１から硫酸ヒドラジンを抜いた測定
用組成物を調製した（比較例１）。次に、試料として、
ヘモグロビン〔ヘモグロビンコントロール、ヘモコンＮ
、日本商事（株）　より購入〕を０、２００、４００、
６００、８００及び１０００ｍｇ／ｄｌ　の各濃度に含
む約１６ユニット／ｌ　のγＧＴＰ活性の標準血清を調
製した。

【００２９】上記で調製した測定用組成物３．０ｍｌ　
を光路長１ｃｍのセルにいれ、上記で調製した試料０．
０９ｍｌ　を添加し、セル室を３７℃の恒温に保った分
光光度計にて３４０ｎｍの吸光度変化を追跡した。約１
０分間にわたり吸光度変化を追跡し、１分間当りの吸光
度変化量を求め、この値から試料中のγＧＴＰ活性を求
めた。その結果を表１に示した。

【００３０】

【表１】

【００３１】このことから、本発明の測定用組成物は、
ヘモグロビンのような有色物質により殆ど影響を受けず
、実用に供するのに充分な性能を有していることが判っ
た。

【００３２】実施例２、比較例２ 実施例１及び比較例１と同様のγＧＴＰ測定用組成物を
調製した（実施例２、比較例２）。次に試料として、ア
スコルビン酸を０、５、１０、１５及び２０ｍｇ／ｄｌ
　の各濃度に含む約１８ユニット／ｌ　のγＧＴＰ活性
の標準血清を調製した。実施例１及び比較例１と同様の
手法でγＧＴＰ活性を測定し、その結果を表１に示した
。このことから、本発明の測定用組成物はアスコルビン
酸のような酸化還元物質により殆ど影響を受けず、実用
に供するのに充分な性能を有していることがわかった。

【００３３】実施例３ γ−グルタミル−Ｌ−ロイシン（バッケム社より購入）
２０ｍＭ、グリシルグリシン８０ｍＭ（ｐＨ８．５、ジ
エタノールアミン緩衝液８０ｍＭ）、ＮＡＤ＋　５ｍＭ
、ロイシン脱水素酵素〔バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．）由来、東洋紡績（株）より購入〕６ユニット／
ｍｌ　、および硫酸ヒドラジン２０ｍＭからなるγＧＴ
Ｐ測定用組成物を調製した（実施例３）。実施例１で調
製した試料を用い、上記の測定用組成物でγＧＴＰ活性
を測定した。その結果、１５．８、１５．９、１５．５
、１６．０、１６．０及び１６．５ユニット／ｌ　の測
定値が得られ、本発明の測定用組成物はヘモグロビンの
ような有色物質により殆ど影響を受けないことが判明し
た。

【００３４】実施例４、比較例３ Ｌ−ロイシルアラニン（アルドリッチ社より購入）２０
ｍＭ、ＮＡＤ＋　（ベーリンガー・マンハイム山之内社
より購入）６ｍＭ、アラニン脱水素酵素〔バチルス・ズ
ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　）由
来、　シグマ社より購入〕１２ユニット／ｍｌ　、グリ
シン−ＫＯＨ緩衝液１００ｍＭ（ｐＨ９．１）、ＫＣｌ
を２０ｍＭ、及び硫酸ヒドラジン４ｍＭよりなるＬＡＰ
測定用組成物を調製した（実施例４）。別に実施例４よ
り硫酸ヒドラジンを抜いた測定用組成物を調製した（比
較例３）。次に、試料として、種々の濃度のヘモグロビ
ンを含む約１３ユニット／ｌ　のＬＡＰ活性の標準血清
を調製した。上記で調製した測定用組成物３．０ｍｌ　
を光路長１ｃｍのセルに入れ、上記で調製した試料０．
１２ｍｌ　を添加し、セル室を３７℃の恒温に保った分
光光度計にて３４０ｎｍの吸光度変化を追跡した。約１
０分間にわたり、吸光度変化を追跡し、１分間当りの吸
光度変化量を求め、この値から試料中のＬＡＰ活性を求
めた。その結果を表２に示した。

【００３５】

【表２】

【００３６】このことから、本発明の測定用組成物はヘ
モグロビンなどの有色物質により殆ど影響を受けず、実
用に供するのに充分な性能を有していることがわかった
。

【００３７】実施例５ Ｌ−ロイシルアラニン２０ｍＭ、ＮＡＤ＋　６ｍＭ、ロ
イシン脱水素酵素〔バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｐ．）由来、東洋紡績（株）　より購入〕６ユニット／
ｍｌ　、グリシン−ＫＯＨ緩衝液１００ｍＭ（ｐＨ９．
０）、ＫＣｌを１００ｍＭ及び硫酸ヒドラジン４ｍＭよ
りなるＬＡＰ測定用組成物を調製した（実施例５）。次
に、試料として、種々の濃度のヘモグロビン（０、２０
０、４００、６００、８００、１０００ｍｇ／ｄｌ　）
とビリルビンＣ（干渉チェックＡ、国際試薬より購入）
（０、８、１６、２４、３２、４０ｍｇ／ｄｌ　）を含
む約１１ユニット／ｌ　のＬＡＰ活性の標準血清を調製
した。

【００３８】これら試料を用い、上記の測定用組成物で
ＬＡＰ活性を測定した。その結果、ヘモグロビンを含む
試料でのＬＡＰ活性測定値は、各々、１０．５、１０．
０、１１．０、１１．０、１１．０及び１１．５ユニッ
ト／ｌ　、またビリルビンＣを含む試料では１０．５、
１１．０、１１．０、１１．５、１０．０及び１１．５
ユニット／ｌ　と、殆ど影響を受けないことが判明した
。

【００３９】実施例６、比較例４ アラニンアミド（バッケム社より購入）３０ｍＭ、ＮＡ
Ｄ＋　６ｍＭ、グリシン−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０）
８０ｍＭ、アラニン脱水素酵素１０ユニット／ｍｌ及び
硫酸ヒドラジン１．６ｍＭからなるＡＡ測定用組成物を
調製した（実施例６）。別に実施例６から硫酸ヒドラジ
ンを抜いた測定用組成物を調製した（比較例４）。次に
、試料として、各々ヘモグロビン、およびビリルビンＣ
を含む約１５ユニット／ｌ　のＡＡ活性の標準血清を調
製した。

【００４０】上記で調製した測定用組成物３．０ｍｌ　
を光路長１ｃｍのセルに入れ、上記で調製した試料０．
０６ｍｌ　を添加し、セル室を３７℃の恒温に保った分
光光度計にて３４０ｎｍの吸光度変化を追跡した。約１
０分間にわたり、吸光度変化を追跡し、１分間当りの吸
光度変化量を求め、この値から試料中のＡＡ活性を求め
た。その結果を表３に示した。

【００４１】

【表３】

【００４２】このことから、本発明の測定用組成物は、
ヘモグロビンなどの有色物質により殆ど影響を受けず、
実用に供するのに充分な性能を有していることがわかっ
た。

【００４３】

【発明の効果】本発明の測定用組成物は、紫外部領域で
の吸光度を測定して血清や尿などの生体液中の酵素活性
を定量する測定用組成物で問題となっていた高濃度のヘ
モグロビンやビリルビンなどの有色物質や、アスコルビ
ン酸などの酸化還元物質による影響を大幅に改善できる
ものであり、その結果、臨床検査の現場での日常検査に
供するのに充分な信頼性のある結果を得ることができ、
又溶血した試料や黄疸患者の血清などでも通常の試料と
同等に操作性よく取り扱うことができる。このように、
本発明の測定用組成物は、臨床検査分野への寄与に多大
なものがある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　紫外部領域での吸光度変化を測定して
   、生体液中の酵素活性を定量する測定用組成物において
   、ヒドラジンを含有せしめたことを特徴とする測定用組
   成物。