JPH0427380A - 電磁スターラーを用いる細胞対象染色装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［０００１］

【産業上の利用分野】

本発明は、後に画像分析などに用いるための顕微鏡スラ
イド上の染色細胞または細胞対象の調製方法およびその
ための装置に関する。 ［０００２］

【従来の技術】

細胞対象の染色度の変化およびセルスライド上の細胞対
象の染色の不均一性は次の画像分析法による染色細胞対
象の定量における問題である。ここで用いる「細胞対象
」なる用語は、細胞と例えばＤＮＡのような細胞物質（
ｃｅｌｌｕａｒｍａｔｅｒｉａｌ　）とを意味するのみ
でなく、染色されたキャリブレーション物質として用い
られる、例えばビーズなどのような人工物質をも含むも
のとする。染色の均一性はスライド上の細胞物質の大ま
かなまたは肉眼による評価のためには重要ではないが、
例えば、細胞核内のＤＮＡのような小さい細胞対象の分
析には重要である。細胞対象は例えば１００μｍ２以下
の大きさのように、信じがたい程小さい。このような分
析では、微妙な染色変化による光透過率の小さいシフト
さ・えもが後の診断または予防に特別の変化をもならす
ことになる。これらの微妙な染色シフトはヒトの眼には
あまりにも微細であるか、またはヒトの眼および細胞対
象の手動分析が関与できない程に小さい。すなわち、ヒ
トの眼に対して薄切かつ十分な染色法は、例えば細胞核
のＤＮＡ含量の絶対値を測定する場合のような、グレイ
値（ｇｒｅｙ　ｖａｌｕｅ）の非常に微細な測定をする
、自動分析を用いる系が存在する場合にはもはや十分で
はない。 ［０００３］ 米国特許出願第０７６．６８５号（１９８７年７月２日
出願）と米国特許出願第１２１，６７４号（１９８７年
１１月１７日出願）は、多くの種類の染料と染色法とを
用いる、特に、例えばラット肝細胞のような細胞対象に
対するチオニンのように、染料によって細胞対象内のＤ
ＮＡを染色するために用いるホイルゲン染色法（Ｆｅｕ
ｌｇｅｎ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を
用いる染色キットを開示する。さらに、この画像分析法
に関する他の特許と出願に開示されるように、細胞核の
サイズと形状に関連した組織および／または細胞の核−
細胞質比の変化のような形態学的変化を分析することが
しばしば必要とされ、このような変化のすべてが性格で
均一な染色に依存する。 ［０００４］ 使用することのできる多くの有効な染色法が存在する。 例えば、チオニン、アズレ（Ａｚｕｒｅ）　Ａ、アズレ
Ｃ、パラロスアニリンおよびメチレンブルーのような染
料によって細胞対象内のＤＮＡを染色するためには、ホ
イルゲン染色法を用いることができる。タンパク質はコ
ンゴレッド、エオシン、エオシン／ヘマトキシリン組み
合わせまたは堅牢グリーン（ｆａｓｔ　ｇｒｅｅｎ）で
染色することができる。 酵素はジアミノベンジジンまたは３−アミノ−９−エチ
ルカルバゾールまたはアルカリホスファターゼと染料基
質との組み合わせによって目視可能にすることができる
。細胞オルガネラ（ｃｅｌｌ　ｏｒｇａｎｅｌｌｅ）は
メチレンブルーによって染色することができる、リポソ
ームはメチレンブルーによって、ミトコンドリアはギム
ザ染料によって染色することができる。さらに、ここで
用いる染料にはメチルグリーンのような対比染料をも含
む。胸部細胞癌では、これらの染料のいくつかをモノク
ローナル抗体と組み合わせて用いて、エストロゲンレセ
プターを検出する。 抗原分析はモノクローナル抗体の標本細胞対象と対照細
胞対象とへの結合段階を含む。後にモノクローナル抗体
は酵素染料と結合することもできる。次に蛍光染料は蛍
光を誘導する波長で励起して、これは蛍光を発する波長
で観察される。特定ウィルスに対して抗体を形成する場
合には、対照細胞標本対象をウィルスのゲツムに特異的
な核酸プローブによって処理する。 ［０００５］ 他の出願第１２１，６７４号（１９８７年１１月１７日
出願）に開示されているように、細胞集団の染色は特定
の細胞質抗原に対するモノクローナル抗体を用いるアル
カリホスファターゼ法による染色を含む。生じた染色は
細胞質に対して実質的に特異的であり、細胞の核を染色
しない。チオニンを用いるホイルゲン染色法を次に実施
して、各細胞の核内のＤＮＡを染色する。アルカリホス
ファターゼ染色法は、特定のモノクローナル抗体と結合
する細胞質抗原に特異的であり、核物質に害を与えない
ので、後の段階でホイルゲン染色法によって細胞質が分
解する前に、アルカリホスファターゼ染色を最初に実施
する。染色法のために選択されるクロモーゲンは２つの
理由から有利である堅牢赤色染料である。第１の理由と
して、沈殿する堅牢赤色染料はホイルゲン染色法による
洗浄に影響されず、このようにして光学的可視化のため
に残留する。第２の理由は、このクロモーゲンがホイル
ゲン染色法に用いられたブルーのチオニン染料から良好
に光学的に分解されるからである。 ［０００６］ スライド上の細胞対象の染色を後に例えば画像分析のよ
うな分析法に用いる上記方法に挙げて説明したもの以外
に、他の染料および着色剤が明らかに存在する。本発明
は上記の特定の染料もしくは着色剤、またはここに用い
た若しくは説明したまたは上記特許出願に述べられた特
定の分析に限定されるものではない。上記特許出願のそ
れぞれは、ここに完全に再現されたかのように、参考文
献としてここに引用する。本発明はむしろ、例えばＤＮ
Ａの絶対値の測定または小細胞面積もしくはピコグラム
での細胞質量の測定を実施する場合のように染色の均一
性が必要とされる顕微鏡スライド上の細胞対象のより均
一な染色法を提供することに関する。 ［０００７］ 好ましい測定の正確さを得るために、スライドにキャリ
ブレーション細胞対象を載せ、次に分析すべき標本細胞
対象を同じスライドに加える。キャリブレーション細胞
対象と標本細胞対象の両方を同時に染色し、次にキャリ
ブレーション細胞対象上の染色を所定の公知の標準と比
較することによって、画像分析装置を検定し、標準から
の染色偏差を調整する。上部にキャリブレーション細胞
対象を有するこのようなスライドは、ジャー中に複数の
垂直スライドを背中合わせに維持するための溝を有する
コブリン染色ジャーのような標準染色容器に挿入されて
いる。コプリンジャー内での染料の混合に注意するにも
がかわらず、例えばチオニ例えば、細胞を同じジャーに
入れるとしても、細胞は同じ量が染色されるとは限らな
い。この結果、品質制御問題が生ずる。チオニン染料が
水にあまり可溶ではなく、チオニン染料がときには異な
る相まなはレベルに分離して、異なるレベルの異なる染
料濃度を示すことが判明した。これは裸眼には明らかで
はないが、実際に事実であると思われる。コプリンジャ
ー内でスライドのいくつかを逆にしてそれらの上端にキ
ャリブレーション細胞を載せる場合に、これらのキャリ
ブレーション細胞は同じコプリンジャー内の他のスライ
ドの下端のキャリブレーション細胞とは異なる染料濃度
を有することが判明した。スライドは通常ガラススライ
ドであり、破壊されやすい。また、スライドとコプリン
ジャーとのサイズならびに染料量と染色法は既に開発さ
れている。したがって、同じスライド、染料およびコプ
リンジャーの使用を続けて、染料濃度の均一性を安価で
簡単な方法によって改良することが望ましい。 ［０００８］

【発明が解決しようとする課題】

従って、顕微鏡スライド上の細胞対象の染色の均一性を
改良するための装置と方法とを提供することが、本発明
の一般的な目的である。 ［０００９］

【課題を解決するための手段】

説明のための図面に示すように、顕微鏡スライド１６上
の、例えば標本細胞対象１５およびキャリブレーション
細胞対象１７のような、細胞対象を均一に染色する好ま
しい方法には、装置１０を用いる。染色のためにその上
部に細胞対象をそれぞれ有する複数のスライドを入れた
、例えばコプリンジャー１２のような容器に染料または
染色液１９を入れる。この場合にスライドはキヤリプレ
ーション細胞対象と標本細胞対象との両方を有するが、
単独の細胞対処または２群より多い細胞対処をスライド
に載せることも明らかに可能である。コプリンジャー内
の複数のリブ２２は染色が行われている間、垂直に配列
した一連のスライドを背中あわせに維持する。 ［００１０］ 裸眼には通常見られないカミ例えばチオニンのような幾
つかの染料１９が水ニあまり可溶でなく、２相に分離す
る傾向があり、異なるレベルの異なる染料濃度を生ずる
ことが判明している。キャリブレーション細胞対象１７
と標本細胞対象１５を同じ染色液によって同時に染色す
ることの目的の１つは、２種類の時間または２種類の染
料溶液による分析の変化を除くことである。それゆえ、
液体中の異なるレベルの異なる染料濃度はこのキャリブ
レーション法を妨害する。スライドがガラスであり、コ
プリンジャーに用いるための染料キットと染色法がすで
に定められているので、この装置または同等の装置を用
いながら、同じスライド上のまたは異なるスライド間の
細胞対象の不均一ながら染色を排除することが好ましい
。 ［００１１］ 本発明では、比較的定常な溶液濃度を維持し、不均一な
染色を生ずる相分離を阻止するために染料１９をアジテ
ートし、撹拌する電磁撹拌手段によって、顕微鏡スライ
ド１６上の細胞対象１５および／または１７のいっそう
均一な染色を実現する。コプリンジャーの底部に配置さ
れ、顕微鏡スライドの下端３３を支えるケージまたはハ
ウジング５０内に、好ましくはロッド５４として、電磁
スターラーを含めることによって、好ましい電磁撹拌が
達成される。ケージ５０は孔またはホールにおいて通じ
ており、孔を通して染色液を流入および流出させ、孔は
流入および流出する染色液の小乱流ジェットを形成し、
この乱流ジェットは上部に混合され、上方および下方並
びにコプリンジャー全体に一定の流れを生ずる。ケージ
はまた中空内部にスターラーロッド３４を含むので、ロ
ッドはスライドまたはその上部の細胞対象に衝突するこ
とが決してなく、電磁駆動装置と電磁カップリングする
状態に常にある。好ましいケージはコプリンジャー底部
と一般に同一の広がりを有するようにおかれた、非常に
小さい、通孔されたプラスチックのボックス形状体であ
る。スターラーロツドは非常に小さい、平たいボックス
状の単位内に含まれ、電磁駆動装置３６によって駆動さ
れ、駆動装置はコプリンジャーを支える。駆動装置３６
上の中心にコプリンジャーをおくと、駆動装置内の電磁
駆動アーム４０が磁力によってスターラーロッドに結合
して、ロッドを駆動装置の回転にあわせて回転させる。 従って、通常はガラス製のコプリンジャーの底部に孔は
なく、コプリンジャーは駆動装置の頂部に容易に配置さ
れ容易に持ち上げられる。 ［００１２］ 図示した装置をさらに詳しく説明すると、この装置は図
１に示すように、コプリンジャー１２の底部１４がおか
れたスターラーサブアセンブリー１０を含む。 コプリンジャーは反応容器であり、顕微鏡スライド１６
上の生物学的標本の染色にしばしば用いられる。ジャー
１２は比較的狭い底部１４と、テーパー状に底部分１４
と結合するけい部２０および口１８を有する外側に開い
た、広い開口部１８とを有する。ジャーの底部すなわち
底部壁は孔を有さす、ガラス製であるので磁束はこれを
通過して、スターラーロッド５４を電磁駆動アーム４０
に結合させる。リブ２２は底部１４から空隙２８内で側
壁２４と２６に沿って垂直に伸び間にスロワ）３０を有
するペアとして整列して、上部に細胞対象を有する標本
スライド１６を受容する。ジャー１２はプラットホーム
３４上に配置され、電磁スターラー駆動装置３６はプラ
ットホーム３４の下方に配置され、プラットホーム３４
の下方から操作可能である。電磁駆動装置３６は電磁駆
動アーム４０および可変速度制御装置４２とともにモー
ター３８を有する。装置４２はモーター３８と電源との
間に接続されて、電磁アーム４０の角速度を制御する。 電磁アームは説明のために永久磁石として示すカミ限定
的ではない。 ［００１３］ 図２に拡大図として示すスターラーサブアセンブリー１
０は室６０内の撹拌ロッド５４を示すために上面５２を
破壊したケージまたはハウジング５０を含む。 一般に長方形によって示されるハウジング５０はジャー
１２の底部１４上に配置され、ハウジング５２から室６
０に達する複数の孔５６を有する。孔５６の配置は規則
的な配向を示すカミ孔のオーダーまたは配置は限定的で
はない。 ［００１４］ 図２と図３の撹拌ロッド５４は例えばポリテトラフルオ
ロエチレン（テフロン）のような比較的非反応性物質製
のジャケット６４内に封入されたまたは被覆された磁極
体６２を含み、イラストとしてその上部に認められる磁
極６２を有する。磁極体６２は永久磁石であるカミ電磁
的に反応性の物質でもよい。 ［００１５］ スターラーアセンブリー１０は小型容器の利用によって
操作可能になる。さらに詳しくは図１のコプリンジャー
１２によって作用が実証される。図１の撹拌ロッド５４
、さらに詳しくは磁極体６２は室６０の電磁アーム４０
によって配向させられる。モーター３８は撹拌ロッド５
４の回転速度を制御する可変制御装置４２によって動力
を与えられる。ロッド５４が室６０内で回転すると、ジ
ャー空隙２８内の液体は孔５６を通る液体流によって撹
拌される。空隙２８内の液体の連続流または撹拌が溶液
中の溶質を比較的均一に分布させ、そのために大体均一
な溶液濃度が生ずる。 ［００１６］ 図１では、生物学的標本細胞１５を有するサンプルスラ
イド１５を空隙２８内のスロット３０の１つに配置し、
スライド１６はその下端をハウジング上面５２上に置く
。この図示した実施態様では、キャリブレーション細胞
対象１７は明らかにガラススライドの表面に単層をなす
ラット肝細胞であり、標本細胞対象１５はＤＮＡ含量に
関して分析すべき胸部腫瘍から採取されたヒト細胞であ
る。染色液を空隙２８に導入して、定量分析または定性
分析のために細胞対象１５および／または１７を染色す
る。できるかぎり均一に染色を行うために、染色液を連
続的に撹拌して、溶媒と溶質とを連続的に混合し、静止
液内で濃度勾配が生ずるのを阻止する。 ［００１７］ さらに、撹拌ロッド５４上のシース６４が磁極体６２が
溶液と反応して溶液を汚染し、溶質濃度を混乱させるこ
とを阻止する。スターラーアセンブリーの上記説明はコ
プリンジャー内でのその使用に関するものであるが、ハ
ウジング５０の特定の形状が小環境および一般に妥当な
形状に適応するように変化可能であることは明らかであ
る。 ［００１８］ 本発明の特定の実施態様のみを説明し、示したが、本発
明の範囲内で種々な変化および変更が可能であることは
明らかである。従って、本発明の範囲および本質に含ま
れるような変更および変化を包含するように、特許請求
の範囲では意図する。 ［００１９］

【発明の効果】

染色装置内の顕微鏡スターラーと染色液とを含む溶液内
に配置しな、通孔されたケージ内に電磁スターラーを配
置し、染色液を絶えず撹拌混合することにより顕微鏡ス
ライド上の細胞対象の均一な染色が保証される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 撹拌ロッドアセンブリーと電磁駆動手段とを備えたコプ
リンジャーの透視図である。

【図２】 ケージの部分断面の拡大透視図である。

【図３】 撹拌ロッドの部分耕両立面図である。

【図４】 上部にキャリブレーション細胞対象と標本細胞対象とを
載せた顕微鏡スライド図である。 なお、図面中の符号は以下のものを表す。 １０：染色装置　　　　　　　　１２：コプリンジャー
１５：標本細胞対象　　　　　　１７：キヤリプレーシ
ヨン細胞対象１９：染色液　　　　　　　　　３８：モ
ータ４０：電磁駆動アーム　　　　　５０：ハウジング
６２：磁極体

【書類者】

図面

【図１】 １１開平４−２７３８０　（１２）

【図２】

【図３】

【図４】

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の要素： 磁束を通過させる壁を有する染色液（ｌｉｑｕｉｄ　ｓ
   ｔａｉｎ）を含む容器；染色液中に入れるための細胞対
   象を有する少なくとも１個のスライド；中空内部と、染
   色液を流入および流出させる複数の孔とを有する、容器
   内に配置されるケージ； ケージに流入し、ケージから流出する染色液を撹拌し、
   アジテートして、容器内の染色液をより均質化するため
   のケージ内の電磁スターラー；および染色液が溶液内の
   スライド上の細胞対象を染色するときに、液体染料を撹
   拌し、混合するように電磁スターラーを回転させるため
   に、容器壁外に配置され、容器壁を通過する磁束を利用
   する電磁駆動装置；からなる細胞対象染色装置。
2. 【請求項２】 前記容器がガラス製コプリンジャー（Ｃｏｐｌｉｎ　ｊ
   ａｒ）である請求項１の装置。
3. 【請求項３】 前記スライドが一端にキャリブレーション細胞対象を、
   その他端に標本細胞対象を有し、前記染料がチオニン（
   Ｔｈｉｏｎｉｎ）である請求項１の装置。
4. 【請求項４】 電磁スターラーが小ロッドであり、前記ケージが複数の
   孔が設けられた壁を有するボックス形状である請求項１
   の装置。
5. 【請求項５】 電磁駆動装置が平らな上面を有し、前記容器が前記上面
   に配置され、前記上面から持ち上げられることができ、 スライドの下端がケージの頂部に固定される請求項１の
   装置。
6. 【請求項６】 標本およびサンプルの反応器内の溶液を撹拌させるため
   の電磁スターラー駆動装置によって操作可能な電磁スタ
   ーラーサブアセンブリーであって、次の要素：囲い（ｅ
   ｎｃｌｏｓｕｒｅ）に連通する複数の孔を備えた、囲い
   を画定するハウジングおよび、 撹拌ロッドを前記サンプルから単離するための前記ハウ
   ジング囲い内に保持され、回転可能である電磁気反応性
   撹拌ロッドを含み、 前記撹拌ロッドが前記電磁スターラー駆動装置によって
   、前記容器内の前記溶液をアジテートするように回転可
   能であるサブアセンブリー。
7. 【請求項７】 前記撹拌ロッドが非反応性ジャケット内に入れられる請
   求項６の電磁スターラーサブアセンブリー。
8. 【請求項８】 前記撹拌ロッドが磁性材料である請求項６の電磁スター
   ラーサブアセンブリー。
9. 【請求項９】 前記撹拌ロッドが永久磁石である請求項６の電磁スター
   ラーサブアセンブリー。
10. 【請求項１０】 前記反応器が底部と、少なくとも１個のサンプルスロッ
    トを有する側壁とを有するコプリンジャーであり、前記
    底部にスターラーアセンブリーが重ね入れられ前記サン
    プルスロットには少なくとも１個のサンプルが挿入され
    、前記ジャーが電磁駆動装置アセンブリーと前記電磁ス
    ターラーとの間の駆動関係のために配置され、前記電磁
    駆動装置が前記反応器を通してほぼ均一な溶質反応物質
    濃度を維持させるために前記撹拌ロッドを回転させて前
    記ジャー内の前記溶液を撹拌させるように操作可能であ
    る請求項６の電磁スターラーサブアセンブリー。
11. 【請求項１１】 前記非反応性ジャケットがプラスチックである請求項７
    の電磁スターラーサブアセンブリー。
12. 【請求項１２】 前記プラスチックがポリテトラフルオロエチレンである
    請求項１１の電磁スターラーサブアセンブリー。
13. 【請求項１３】 前記ハウジングが非反応性プラスチックである請求項６
    の電磁スターラーサブアセンブリー。