JPH0426629A

JPH0426629A - ヘモグロビン含有小胞体の製造法

Info

Publication number: JPH0426629A
Application number: JP2130313A
Authority: JP
Inventors: Hidetoshi Tsuchida; 英俊土田; Etsuo Hasegawa; 悦雄長谷川; Hiroyuki Nishide; 宏之西出
Original assignee: Research Institute for Production Development; Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp; Research Institute for Production Development
Priority date: 1990-05-22
Filing date: 1990-05-22
Publication date: 1992-01-29
Anticipated expiration: 2014-08-23
Also published as: JP2936109B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、酸素運搬体として開発されつつあるヘモグロ
ビン含有小胞体の製造法に関するものであり、医用分野
あるいは工業分野で利用される。

（従来の技術と発明が解決しようとする課題）人あるい
は哺乳動物（例えば牛など）のヘモグロビンを用い人工
血液を合成し、医療に役立てようとする試みは古くから
知られている。最近の試みとして例えば、ヘモグロビン
を適当な架橋剤で架橋し高分子量の化合物を得たり、あ
るいは適当な水溶性高分子化合物（例えば、デキストラ
ンやポリオキシエチレンなど）をヘモグロビンに結合す
るなどの試みが行われている（バイオマテリアルズ・ア
ーチフィシャル・セルズ・アーチフィシャル・オーガン
ズ、１６巻、１〜３号、１〜７０３頁、１９８８年など
）。

しかし、この種の試みで得られるいわゆる「修飾ヘモグ
ロビン」の場合、人工血液の膠質浸透圧を動物（特に人
）の血液の値に調節することが困難なため、ヘモグロビ
ン濃度が血液の半分以下にしか高められない。このため
、該人工血液の酸素溶解量は血液の半分以下であり、十
分な酸素運搬機能がないのが現状である。この点を解決
するため、新しい人工赤血球としてヘモグロビンを小胞
体内水相に含有したいわゆる［ヘモグロビン含有小胞体
」が開発され、人工血液用酸素運搬体として注目されて
いる（アービング・フランク・ミラーばか、特公昭６０
−２６０９２号公報；シー・アンソニー・ハント、特公
昭５８−１８３６２５号公報；鉛末はか、特公昭６２−
１７８５２１号公報）６ヘモグロビンを小胞体内に内抱する方法としては、大別
して例えば次の方法が知られている。

■小胞体を構成する脂質を水和させた後、あるいは脂質
粉末を直接ヘモグロビン水溶液に加え水和、ストマツカ
ーあるいはポルテックスミキサー等による混合、続いて
該分散液に適当な圧力を加えノズル、多孔膜のような小
孔（穴径：０．１ｔａないし数龍）を通過させて製造す
る方法（水和／細孔通過法）。

■水と混合しにくい溶媒（トリクロロトリフルオロエタ
ン、ジエチルエーテルなど）とヘモグロビン水溶液を混
合したエマルションを製造後、減圧下で有機溶媒を留去
して製造する方法（逆相蒸発法）。

しかし、■の方法では、使用した有機溶媒の完全な除去
が困難なため、残留有機溶媒による毒性が実際の生体へ
の使用に当たっては大きな問題となる。人工血液の安全
性という観点からは、従来知られる製造法のうち■の方
法がより好ましい。

しかしながら従来の方法では、常温（１５〜３０℃）で
製造を行うと、ヘモグロビン蛋白質の変性やメト化〔ヘ
モグロビンの補欠分子族であるプロトヘムの中心鉄が２
価から３価に酸化され（メトヘモグロビンの生成（メト
化））〕により酸素運搬機能を失う現象が起こりやすく
、これを防止する工夫が必要であった。

そのために、製造操作を低温（〜４℃）及び窒素ガス下
で実施せねばならなかった。従って、操作が極めて煩雑
であった。また、特に細孔通過操作に多孔性薄膜（例え
ば、ポリカーボネート性多孔膜（米国、ヌクレオポアー
・コーポレーション製））を用いる場合、カプセル化剤
として用いる脂質成分の二分子膜の相転移温度以上での
操作が、迅速かつ効率よい細孔通過に必要であり、相転
移温度以下の温度（例えば、〜４℃）でのヘモグロビン
小胞体製造が容易でなかった。

本発明は、いずれにしてもこのような「ヘモグロビン含
有小胞体」の製造、特にヘモグロビンの小胞体の内水相
へのカプセル化（内胞化）操作（水和操作過程、細孔操
作過程など）を行う際の問題点を解決するため、非冷却
下でヘモグロビンのメト化を抑制して酸素運搬機能のよ
り高いヘモグロビン含有小胞体を製造するための新しい
方法を提供することを目的とする。

（課題を解決するだめの手段）即ち、本発明は、ヘモグロビン溶液と脂質からなるヘモ
グロビン含有小胞体を製造する際、一酸化炭素ガス雰囲
気下で且つ非冷却下で操作することを特徴とするヘモグ
ロビンのメト化を抑制したヘモグロビン含有小胞体の製
造法である。

特に本発明は、リン脂質、コレステロール、あるいは脂
肪酸からなる小胞体の内水相にヘモグロビンを含有した
いわゆる［ヘモグロビン含有小胞体」の製造、さらに特
にヘモグロビンのカプセル化（内胞化）プロセスにおい
て、その操作を一酸化炭素ガス雰囲気下で且つ非冷却下
で行うことを特徴とする製造法である。

リン脂質は、飽和リン脂質、不飽和リン脂質のいずれで
も構わない。例えば、卵黄レシチン、水添レシチン、シ
ミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホ
スファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコ
リン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリルオイ
ルボスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファ
チジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール
、ホスファチジルイノシトールなどが利用できる。重合
性基（例えば、エン（二重結合）、イン（三重結合）、
ジエン、ジイン、スチレンなどの基）を有する重合性リ
ン脂質（例えば、１，２−ジ（オクタデカ−ｔｒａｎｓ
−２，ｔｒａｎｓ−４−ジエノイル）ホスファチジルコ
リン、■、２−ジ（オクタデカ−２゜４−ジエノイル）
ホスファチジン酸、ｌ、　２−ビスエレオステアロイル
ホスファチジルコリンなど）から選ばれる。

脂肪酸としては、炭素数１２ないし２０の飽和及び不飽
和脂肪酸が用いられる。例えば、ミリスチン酸、バルミ
チン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リル
ン酸、オクタデカ−２，４−ジエン酸などである。

リポソームを構成する上記二分子膜に適当な添加剤（例
えば、シアル酸、糖結合脂肪酸、ポリオキシエチレン結
合リン脂質、ポリオキシエチレン結合脂肪酸など）が少
量添加されても構わない。

精製ヘモグロビンは、既知の方法（日本生化学全編、続
生化学実験講座８巻「血液」上、東京化学同人、１９８
７年；　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ＋　Ｖｏｌｕｍｅ　７６＋　１９８１＋　Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅ１ｙ　ＹｏｒｋＨＴｈｅＣ
ｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ　ｏｆ　ＨｅｍｏｇＩｏｂ＋
ｎ１１９８３＋　Ｄｅｋｋｅｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋなど）を利用して製造することができ
る。

具体的なヘモグロビン含有小胞体の製造法としては、既
知の水和／細孔通過法による製造法（例えば、ビー・ビ
ー・ゲイバーら、ＦＥＢＳレター１５３巻、２８５頁、
１９８３年；ジェー・スツエベニら、バイオケミストリ
ー、２４巻、２８２７頁、１９８５年；銘木ら、人工臓
器、１７巻、７０８頁、１９８８年；エル・ジョルジェ
ピッチら、エクスバリメンタル・ヘマトロギー、８巻、
５８４頁、１９８０年；ビー・ヨプスキーら、バイオキ
ミ・バイオフィシ・アクタ、９７８巻、７９頁、１９８
９年；エム・シー・ファーマーら、メソソヅ・イン・エ
ンザイモロジー、１４９巻、１８４頁、１９８７年など
）が適用でき、ヘモグロビンのカプセル化（内抱化）操
作プロセスあるいはそれに付随するリポソーム粒径制御
操作の際に、操作を一酸化炭素ガス雰囲気下で且つ非冷
却下で行うことができる。

また、例えば以下のようにして行ってもよい。

リン脂質、コレステロールあるいは脂肪酸の混合物をパ
イレックスガラス製ナス形フラスコ中に秤量採取し、脱
水ベンゼンあるいは脱水ヘンインと無水メタノール（あ
るいはエタノール）の混合液（ベンゼン含Ｍ８０体積％
以上）を加え溶解（混合脂質濃度：１ないし１０重量％
）後、ドライアイス／メタノール浴で凍結する。これを
高真空下で凍結乾燥し、混合脂質粉末を調製する。

これとは別に、ストローマを含まない精製ヘモグロビン
水溶液（例えば、エル・ジョルジェピッチら、エクスパ
リメンタル・ヘマトロギー、８巻、５８４頁、１９８０
年；ジー・ニス・モスら、サージカル・ガイネコロジッ
ク・アンド・オブステトリソクス、１４２巻、３５７頁
、１９７６年；ニー・ニー・カチャトリアンら、プロブ
レムズ・ヘマトロジー、２４巻、５８頁、１９７９年；
銘木ら、人工臓器、１７巻、７０８真、１９８８年など
の方法で調製）を、ヘモグロビン濃度５ないし４５重量
％、好ましくは１５ないし３５重重量に調整し、そのま
ま、あるいは一酸化炭素ガスで溶液を置換しておいたヘ
モグロビン溶液を準備しておく。

このヘモグロビン溶液の所定量を一酸化炭素ガス雰囲気
下、非冷却のもとに１０ないし５０’ｃ、好ましくは１
０〜４０℃、更に好ましくは室温（１５ないし３０℃）
で、先に調製した混合脂質粉末に加える（この際、混合
脂質を有するフラスコ内を予め一酸化炭素ガスで置換し
ておく）。一酸化炭素ガスの雰囲気下、非冷却状態で１
０ないし５０’ｃ、好ましくは１０〜４０°Ｃ１更に好
ましくは室温（１５ないし３０℃）で所定時間（５分な
いし３時間（好ましくは１０分ないし３０分））静Ｎ（
好ましくは遮光下で）し、水和させた後、一酸化炭素ガ
ス（体積比は０．０１以上）雰囲気下、■ないし１５０
気圧（好ましくは１ないし３０気圧）のガス圧を加えて
ポリカーボネート多孔膜の細孔を通過させ（例えば、孔
径の大きい膜から小さい膜（例えば、孔径８．　５．　
３．　２゜１　、０．６．０．４．０．２７１１１１）
へと順次行ってゆくと操作が容易である）、所望の粒径
のヘモグロビン含有小胞体分散液を得る。

上記のようにして一酸化炭素ガス雰囲気下で調製したヘ
モグロビン含有小胞体のヘモグロビンのメト化率は、操
作ガス雰囲気を空気、窒素ガス、あるいはアルゴンガス
雰囲気下で行う以外には全く同じ条件下で調製したヘモ
グロビン含有小胞体のメト化率に比べ、低く、従って酸
素運搬能がより高い。

なお、既知の方法に従いヘモグロビンの酸素親和性制御
剤（例えば、２，３−ジボスホグリセリン酸、イノシト
ールヘキサリン酸、ピリドキサールリン酸など）を予め
適量（例えばヘモグロビン１モルに対し、酸素親和性制
御剤１モル程度）添加したヘモグロビン溶液、あるいは
還元剤（還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
（ＮＡＤＨ）、アスコルビン酸、グルタチオンなど）を
ヘモグロビンサブユニットに対し５ないし５０モル％添
加したヘモグロビン水溶液を原料として用いると、メト
化がより抑制されるので好ましい。

一酸化炭素ガスの除去は、次のようにして行えばよい。

例えば、得られたヘモグロビン含有小胞体分散水溶液を
４°Ｃ（例えば水浴中）で冷却しながら、白色光を照射
しながら酸素ガスあるいは空気を溶液内に所定時間吹き
込むことにより、一酸化炭素ガスを除去出来る。この例
を参考例１に示した。この確認は可視吸収スペクトルの
ヘモグロビンに基づく特性吸収帯（ソーレ帯、Ｑ帯）か
ら容易に確認できる（参考文献：イー・アントニニら、
ヘモグロビン・アンド・ミオグロビン・イン・ゼア・リ
アクションズ・ウィズ・リガンズ、ノースホランド・パ
ブリジング・カンパニ１９７１年はか）。

（発明の効果）本発明の製造法により、ヘモグロビン小胞体の製造にお
いて従来困難とされてきた製造時のヘモグロビンのメト
化を非冷却においても抑制し、メト化率の低いヘモグロ
ビンを含有する「ヘモグロビン含有小胞体」を製造する
とともに、非冷却下での製造操作を可能とすることで、
製造プロセスの簡易化、コストの低減化を図ることがで
きる。

（実施例）以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。

実施例１１Ｑｍｌナスフラスコの中にイノーシトール６リン酸（
ＩＨＰ）を等モル含んだ精製ヘモグロビン水溶液（１７
ｇ／ｄ１、メト化率２．６％）５ｍＲを加え、酸化炭素
ガスを十分吹き込む。これにガラスピーズ（粒径１ない
し２ｉｎ）１ｍｌを加え、次いで、混合脂質粉末〔１，
２−ジ（オクタデカ−ｔｒａｎｓ−２ｔｒａｎｓ−４−
ジエノイル）　−５ｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（
ＤＯＤＰＣ）／コレステロール（ｃｈｏｌ）／オクタデ
カーｔｒａｎｓ−２，ｔｒａｎｓ−４−ジエン酸（ＯＤ
Ａ）（モル比：　７／７／２）を予め乾燥ベンゼンから
凍結乾燥処理したもの）３００■を加え密栓した。

室温下で１５分間水和させ、その後、１５分間ポルテッ
クスミキサー（＠井内盛栄堂製、ＭＡ−１型）で撹拌処
理を行った。その後エクストルーダー（登録商標、リベ
ソクス・バイオメンブランズ・イン３−ボレイション、
カナダ）装置を用い、所定温度下、一酸化炭素ガス加圧
下（〜３ｋｇ／ｃＪ）で、上記ヘモグロビン／脂質懸濁
液をポリカーボネート膜（ヌクレオポアー・コーポレー
ション、米国）に穴径１，５．３．２−の順で通過させ
て処理した。エクストルーダー処理操作は２時間行った
。

こうして得られたリポソーム分散液５　ｍｌを５ｍＭＴ
ｒｉｓ緩衝水（ｐＨ７，４）で置換したセファロースゲ
ルカラム（半径３ｃｍ、長さ１５　ｃｍ　）で分画し、
遊離のヘモグロビンを除去し、ヘモグロビン含有リポソ
ーム分画を集めた。得られたヘモグロビン含有リポソー
ムのメト化率を松原らの方法（蛋白質、核酸、酵素、３
２巻、６７１頁、１９８７年）により定量した。結果を
表１に示す。

操作を一酸化炭素ガス雰囲気下で実施することにより、
３０℃、２０℃、４℃のいずれにおいてもメト化率の増
加を抑制出来ることが明らかである。

また、同様な操作を３ｍＭの還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を製造操作直前に添加
し溶解したヘモグロビン溶液を用いて実施し、ヘモグロ
ビン含有小胞体を製造し、メト化率を測定した。結果を
表１に併せて示す。その効果は原料ヘモグロビン水溶液
に予めＮＡＤＨを添加しておくことで増強された。

参考例１５　ｍｐ、ナスフラスコに実施例１で調製したヘモグロ
ビン含有小胞体−ＣＯ錯体を約４ｃｃ入れ、６０Ｗ白色
灯を照射しながら、水冷下で約２時間０□をバブルする
ことにより、０□錯体が得られた。一酸化炭素の除去の
確認は紫外可視分光光度計（＠品性製作所、ＭＳＰ−２
０００型）を用い、ヘモグロビン由来のソーレ帯および
Ｑ帯の特性吸収帯吸収極大波長（λｍａに）を測定、一
酸化炭素錯体（５４０，５６９゜４１９ｎｍ）から酸素
錯体（オキシヘモグロビン：５４Ｌ５７６、４１５ｎｍ
）への変化により行った。

実施例２ポリ袋中に精製ヘモグロビン水溶液（１７ｇ／ｄ１、メ
ト化率２．５％）５ｍｆｆｉを加え、一酸化炭素ガスを
十分に吹き込む。これに混合脂質粉末〔１，２−ジ（オ
クタデカ−ｔｒａｎｓ−２＋　ｔｒａｎｓ−４−ジエノ
イル）ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＤＰＣ
）／コレステロール（ｃｈｏｌ）／オクタデカーｔｒａ
ｎｓ−２＋ｔｒａｎｓ−４−ジエン酸（ＯＤＡ）（モル
比：　７／７／２）を予め乾燥ベンゼンから凍結乾燥処
理したもの〕２５０　ｍｇを加え密栓後、２０℃および
３０℃で１５分間永利きせた（ステップ１）。

次いでストマツカー（Ｓｅｗａｒｄ社、ストマンカー８
０）を用い２０℃および３０℃で１５分間処理を行った
。

（ステップ２）。

各段階におけるヘモグロビンのメト化率を血液ガス分析
装置（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、アイエルメーターＩＬＢＧＭＩ３１２）で測
定した。結果を表２に示す。

操作を一酸化炭素ガス雰囲気下で実施することにより、
ヘモグロビンメト化率の増加を抑制出来ることが明らか
である。

実施例３実施例２において混合脂質粉末として、１，２ジ（オク
タデカ−ｔｒａｎｓ−２，ｔｒａｎｓ−４−ジエノイル
）ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｄ　ＯＤ　Ｐ　
Ｃ）／コレステロール（ｃｈｏｌ）　／オクタデカーｔ
ｒａｎｓ−２ｔｒａｎｓ−４−ジエン酸（ＯＤＡ）に代
えて、水添レシチン／コレステロール／パルミチン酸（
モル比ニア／７／２）　２５０　ｍｇを用い、温度を２
０℃にした以外は、全（同様の方法でヘモグロビン小胞
体を製造し、各ステップにおけるヘモグロビンメト化率
を測定した。結果を表３に示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヘモグロビン溶液と脂質からなるヘモグロビン含
有小胞体を製造する際、一酸化炭素ガス雰囲気下で且つ
非冷却下で操作することを特徴とするヘモグロビンのメ
ト化を抑制したヘモグロビン含有小胞体の製造法。
（２）操作を１０〜４０℃の温度で行うことを特徴とす
る請求項１記載の製造法。
（３）脂質がリン脂質単独あるいは、リン脂質とコレス
テロールもしくは脂肪酸とからなる混合脂質である請求
項１または２記載の製造法。
（４）リン脂質が炭素数１４ないし２０の飽和あるいは
不飽和脂肪酸鎖を有するグリセロリン脂質である請求項
３記載の製造法。
（５）リン脂質が１，２−ジ（オクタデカ−ｔｒａｎｓ
−２、ｔｒａｎｓ−４−ジエノイル）−グリセロ−３−
ホスホコリンである請求項３記載の製造法。
（６）脂肪酸が炭素数１２ないし２０である請求項３記
載の製造法。
（７）脂肪酸がオクタデカ−ｔｒａｎｓ−２、ｔｒａｎ
ｓ−４−ジエン酸である請求項３記載の製造法。
（８）不飽和脂肪酸がオクタデカ−ｔｒａｎｓ−２、ｔ
ｒａｎｓ−４−ジエン酸である請求項４記載の製造法。