JPH02295933A

JPH02295933A - 封入純度の高いプラスミノーゲン活性化因子封入リポソームの製造法

Info

Publication number: JPH02295933A
Application number: JP1115164A
Authority: JP
Inventors: Akio Kimura; 章男木村; Kenji Endo; 健治遠藤; Toru Oguma; 徹小熊
Original assignee: Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Wakamoto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-05-10
Filing date: 1989-05-10
Publication date: 1990-12-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（１）産業上の利用分野本発明は封入純度の高いプラスミノーゲン活性化因子封
入リポソームの製造法に関するものである。プラスミノ
ーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼ、プロウロキナ
ーゼ、ストレプトキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活
性化因子等は血栓溶解剤として用いられるが、通常血中
で非常に不安定であり短時間で力価が低下する。

本発明による封入純度の高いプラスミノーゲン活性化因
子封入リポソームは血中で安定な徐放性の血栓溶解剤と
して有用である。

（２）従来の技術として、従来、種々検討されている。

例えば、ウロキナーゼ封入リポソームについてはリン脂
質を膜材とするもの（特開昭５７．８２３１０号、特開
昭５７．８２３１１号）、水素添加天然リン脂質を膜材
とするもの（特開昭５９．２２２４１０号）等が公知で
ある。また、リポソームに封入されなかった物質を分離
・除去し、封入純度の高いリポソームを得るには、透析
、ゲルろ過、遠心分離等が用いられており、その方法及
び特徴については、例えば「細胞工学Ｖ０１．２．ＮＯ
’、９．１１３６　（１９８３）　Ｊに詳しく紹介され
ている。

（３）発明が解決しようとする課題従来の方法によりウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ス
トレプトキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化因子
（以下ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化因子を封
入したリポソーム分散液から未封入のプラスミノーゲン
活性化因子を分離・除去するには、次のような問題があ
った。即ち、透析法では、タンパク質であるプラスミノ
ーゲン活性化因子自体未封入であっても、透析膜を透過
しないため不適である。ゲルろ適法及び遠心分離法はリ
ポソーム分散液が少量では有効であるが、その処理能力
に限界があり実用的ではない。リポソームに封入する物
質が、プラスミノーゲン活性化因子の場合、上記のよう
な従来の方法により未封入の物質を分離・除去すること
は、製造の面から問題が多い。そこで本発明者らは、封
入純度の高いプラスミノーゲン活性化因子封入リポソー
ムの工業的有利な製造法を確立することを目的として、
未封入プラスミノーゲン活性化因子の分離除去法を種々
検討し、アフィニティークロマトグラフィーが工業的に
最も適していることを見出し本発明を完成した。

（４）課題を解決するための手段本発明は、プラスミノーゲン活性化因子を封入したリポ
ソームの分散液中に存在する未封入のプラスミノーゲン
活性化因子をアフィニティークロマトグラフィー用担体
に吸着させて除去することを特徴とする封入純度の高い
プラスミノーゲン活性化因子封入リポソームの製造法及
びアフィニティークロマトグラフィーに用いる担体の親
和性基がｐ−アミノベンズアミジンであることを特徴と
する封入純度の高いリポソームの製造法に関するもので
ある。

本発明の製造法で用いるプラスミノーゲン活性化因子を
封入したリポソームの調製は、従来公知の方法例えば、
ボルテクシング法（Ａ、Ｄ、Ｂａｎｇｈａｍ。

Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１３．２３８（１９６５））
　、ソニケーション法（Ｃ，Ｈｕａｎｇ、　Ｂｉｏｃｈ
ｃ−ｍ、、８．３４４　（１９６９））　、コール酸除
去法（Ｔ、にａｇａｗａ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
、２４６．５４７７（１９７１））、凍結解凍法（時開
　昭５１−８６１１７　）　、凍結乾燥法（時開　昭５
３−１４２５１４）などがあるが、いずれの調製法を用
いてもよく、これらに限定されるものではない。

リポソームの膜材料としては、脂質二重膜を形成するも
のであればどのようなものでもよく、例えば、卵黄、大
豆、その他の動物・植物の組織に由来するホスファチジ
ルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファ
チジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィン
ゴミエリン等または、これらの混合物である卵黄レシチ
ン、大豆レシチン、またはそれらレシチンの水素添加物
あるいは、合成のリン脂質であるシミリストイルホスフ
ァチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン
、ジステアロイルホスファチジルコリン等の１種または
２種以上の混合物を用いることができ、また、コレステ
ロール等のステロールを膜の強化のために総脂質の５〜
５０％加えてもよく、また、ステアリルアミン、ジセチ
ルフォスフ工−ト、ホスファチジルグリセロール等を荷
電付与のために、あるいは、α−トコフェロール等を酸
化防止のために、総脂質の５〜２０％加えてもよい。

本発明で使用されるプラスミノーゲン活性化因子は、ヒ
ト尿または、腎臓細胞培養物または、哺乳動物細胞の培
養ろ液由来のウロキナーゼ、あるいは、ヒトまたは他の
哺乳動物からの健全または腫瘍細胞の培養物からのｔ−
ＰＡ、遺伝学的に組換えられた微生物、例えば、真植生
物、真菌類、酵母および、遺伝学的に組換えられた哺乳
動物細胞の培養物中から得られたｔ−ｐ八等、いずれで
もよく、これらに限定されるものではない。

プラスミノーゲン活性化因子封入リポソーム分散液調製
時のリン脂質例えば、卵黄ホスファチジルコリンとプラ
スミノーゲン活性化因子の重量比は、特に限定されない
が、好ましくは、卵黄ホスファチジルコリンｌに対し、
プラスミノーゲン活性化因子０．００１〜０．１が良い
。

このようにして調製したプラスミノーゲン活性化因子封
入リポソーム・分散液から、プラスミノーゲン活性化因
子に親和性を有するアフィニティークロマトグラフィ用
担体を用いて、リポソームに未封入のプラスミノーゲン
活性化因子を吸着除去し、封入純度の非常に高いプラス
ミノーゲン活性化因子封入リポソームを得ることができ
る。アフィニティークロマトグラフィ用担体としては、
例えば、ウロキナーゼあるいはｔ−ＰＡでは、ｐ−アミ
ノベンズアミジン（ｐ−ＡＢ）セファロースＣＬ−６Ｂ
　（特公昭６１−４８９１８　）　、あるいは、コンカ
ナバリンＡ　（Ｃｏｎ　Ａ　）セファロース等が用いら
れる。

得られたプラスミノーゲン活性化因子封入リポソームは
、必要とあれば限外ろ適法により濃縮することも可能で
ある。

以下、本発明の実施態様をさらに詳細に説明するため、
実施例を示す。

実施例１゜（１）　　卵黄レシチン０．２５　ｇおよび、コレステ
ロール０．０５　ｇをクロロホルム・メタノール（１０
：１）混液ＬＯ＋＋＋１に溶解したのち、エバポレータ
ーで溶媒を除去して薄膜を形成させ、さらにウロキナー
ゼを含む等張リン酸緩衝液（ｐｔｌ　？、　０　、２４
０００１１１／ｍ１）１０ｎｌを加えて剥離したのち、
室温でかくはんし、ウロキナーゼを封入したリポソーム
分散液を得た。

（２）　　（１）で得たウロキナーゼ封入リポソーム分
散液４ｍｌを凍結乾燥（−５０℃、　＜０．１ｔｏｒｒ
、　１６ｈｒ）　Ｌ／、リポソームの凍結乾燥品を得た
。

（３）　　（２）で得た凍結乾燥品に精製水４ｍｌを加
えしんとうした。続いて、ポアサイズ０．４５μｍのメ
ンブランフィルタ−を用いてろ過し、ウロキナーゼ封入
リポソームの再分散液を得た。このリポソームの封入純
度は１０．７％であった。

＋４）　　（３）で得た再分散液をアフィニティークロ
マトグラフィカラム（担体：　ｐ−ＡＢ−セファロース
ＣＬ−６Ｂ）にアプライし、ｐＨ７，０の等張リン酸緩
衝液でウロキナーゼ封入リポソームを流出した。担体に
吸着した未封入ウロキナーゼは、３．３３Ｘ　ＮａＨｚ
ＰＯ４水溶液（ｐＨ４，０）により流出した。流出する
溶液は５ｍｌを１フラクシヨンとして試験管に採取した
。

（５１（４）で得た各フラクションにトライトンＸ−１
００を加えたのち、合成基質法（Ｔ、Ｍｏｒｉｔａ、　
Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｃｍ、、８２．１４９５（１９７３））によ
りウロキナーゼ活性を測定し、各フラクションの総ウロ
キナーゼ活性とした。一方、トライトンＸ−１００処理
を行わず、測定した値を、未封入活性とした。封入純度
は以下の式より求めた。

封入純度・（総括性−未封入活性）／総括性Ｘ１００（
：）＋６）　　（４）においてｐＨ７，０のリン酸緩衝
液で流出してくる１〜３のフラクションの封入純度は９
６．０％であった。

実施例２゜（１）卵黄レシチン０．２５　ｇおよび、コレステロー
ル０．０５ｇをクロロホルム・メタノール（１０：１）
混液１０ｎ＋１に溶解したのち、エバポレーターで溶媒
を除去して薄膜を形成させ、さらにウロキナーゼを含む
等張リン酸緩衝液（ｐＨ７，０、６７０００１Ｕ／Ｉ＋
＋１）１０ｍｌを加えて剥離したのち、室温でかくはん
し、ウロキナーゼを封入したリポソーム分散液を得た。

（２１（１１で得たウロキナーゼ封入リポソーム分散液
ｌｌｌ１１を一４０℃で２４ｈｒ凍結保存した。

（３１（２１で得たウロキナーゼ封入リポソーム分散液
の凍結品を室温にて融解した。このリポソームの封入純
度は１５．７％であった。以下、実施例１゜（４）およ
び（５）の操作を行い、封入純度９４．７％のウロキナ
ーゼ封入リポソームを得た。

実施例３゜（１）　　シミリストイルホスファチジルコリン０．１
４ｇ１コレステロール０．０８　ｇ及びシミリストイル
ホスファチジルグリセロール０．０３ｇをクロロホルム
・メタノール（１０：１）混液１０ｍ１に溶解したのち
、エバポレーターで溶媒を除去して薄膜を形成させ、さ
らにウロキナーゼを含む等張リン酸緩衝液（ｐＨ７，０
，６７０００ＩＵ／ｍｌ）　１０ｍｌを加えてかくはん
し、ウロキナーゼを封入したリポソーム分散液を得た。

このリポソームの封入純度は２３．５　！ｌ≦であった
。

＋２）　　（１）で得たウロキナーゼ封入リポソーム分
散液を、実施例２．（２）以下の操作で処理し、封入純
度９５．３％のウロキナーゼ封入リポソームを得た。

実施例４゜（１）　　卵黄レシチン０．２５　ｇおよび、コレステ
ロ−ル０．０５ｇをクロロホルム・メタノール（１０：
１）１０ｍｌに溶解したのち、エバポレーターで溶媒を
除去して薄膜を形成させ、さらにｔ−ＰＡを含むリン酸
緩衝液（ｐＨ７，５，１００００１０／ｍｌ）　　１０
ｒａｌ加えて剥離したのち、室温でかくはんし、ｔ−Ｐ
Ａを封入したリポソーム分散液を得た。このリポソーム
の封入純度は１２．４％であった。

（２）　　（１）で得たｔ−ｐへ封入リポソーム分散液
を、実施例２．（２）に準じて処理し、ｔ−ＰＡ封入リ
ポソームの再分散液を得た。

（３）　　（２）で得た再分散液をアフィニティクロマ
トグラフィカラム（担体：　ｐ−ＡＢ−セファロースＣ
Ｌ６Ｂ）にアプライし、ｐ＋（７，５のリン酸緩衝液で
ｔ−ＰΔ封入リポソームを流出した。担体に吸着した未
封入ｔ−ｐへは、２０Ｍアルギニン塩酸塩を含むリン酸
３１衝液（ｐＨ７，５）により流出した。流出する液は
、５ｍｌを１フラクシヨンとして試験管に採取した。

（４）　　（３）で得た各フラクションを、実施例１ｉ
５）に準じて処理したところ、ｔ−ＰＡ封入リボソーム
の封入純度は９２．０％であった。

（５）発明の効果実施例１〜４の成績は、下記第１表で示すとおりである
。

第１表第１表の成績から明らかなように、本発明によれば封入
純度の非常に低いリポソーム分散液を出発材料とする場
合でも、容易に封入純度の高いプラスミノーゲン活性化
因子封入リポソームを製造することが出来る。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）プラスミノーゲン活性化因子を封入したリポソー
ムの分散液中に存在する未封入のプラスミノーゲン活性
化因子をアフィニティークロマトグラフィー用担体に吸
着させて除去することを特徴とする封入純度の高いプラ
スミノーゲン活性化因子封入リポソームの製造法。
（２）アフィニティークロマトグラフィーに用いる担体
の親和性基がｐ−アミノベンズアミジンであることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の封入純度の高いリ
ポソームの製造法。