DE69233491T2

DE69233491T2 - Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend S-Nitrosolipoproteine und deren Verwendung

Info

Publication number: DE69233491T2
Application number: DE69233491T
Authority: DE
Inventors: Jonathan Stamler; Joseph Loscalzo; Daniel Simon; David Singel
Original assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Current assignee: Brigham and Womens Hospital Inc
Priority date: 1991-11-14
Filing date: 1992-11-13
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2012-11-14
Also published as: DK0676964T3; AU2849497A; US5593876A; DE69233491D1; DE69231666T2; EP1023900A3; DE69231666D1; DK1023900T3; US6562344B1; CA2125037A1; EP0676964A1; EP0676964A4; DK1023905T3; AU3071592A; DE69233474T2; US20030007967A1; US5863890A; US7157500B2; AU709725B2; EP1023905A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein S-Nitroso-lipoprotein enthält, und deren Verwendung. Insbesondere betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an S-Nitroso-protein-Verbindungen, nämlich S-Nitroso-lipoproteinen, und ihre Verwendung als Mittel zur selektiven Regulation spezifischer Proteinfunktionen, zur selektiven Regulation von Zellfunktionen, zur Ausstattung eines Lipoproteins mit neuen Eigenschaften für die Relaxation glatter Muskulatur und zur Blutplättchenhemmung und zur Bereitstellung einer gezielten Zufuhr von Stickoxid zu speziellen Körperstellen.
Die therapeutischen Effekte können durch die Verabreichung nitrosylierter Lipoproteine, d. h. S-Nitroso-lipoproteine, als pharmazeutische Zusammensetzungen erreicht werden.
Kurze Beschreibung des technischen Hintergrunds
Die Reaktion zwischen Thiolen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Cystein, Homocystein und N-Acetylcystein, und Stickoxid (NO) ist in biologischen Systemen untersucht worden. Von NO ist gezeigt worden, dass es eine Relaxation von vaskulärer glatter Muskulatur induziert und eine Blutplättchenaggregation hemmt, wobei dies über die Aktivierung von Guanylat-cyclase und eine Erhöhung von Konzentrationen von cyclischem GMP geschieht. Es existieren Nachweise, dass Thiole mit niedrigem Molekulargewicht leicht unter Bildung von S-Nitrosothiolen mit NO reagieren, die signifikant stabiler als NO selbst sind und als potente Vasodilatatoren und Blutplättcheninhibitoren wirken. Diese Addukte sind auch als biologisch aktive Zwischenstufen beim Stoffwechsel organischer Nitrate vorgeschlagen worden (Ignaro et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 218: 739 (1981); Loscalzo et al., J. Clin Invest. 76: 966 (1985)).
Mellion et al., Mol. Pharmacol., 23: 265 (1983), beschreiben die antiaggregatorischen Effekte bestimmter Stickoxid-enthaltender Mittel, von denen angenommen wird, dass sie bei der Bildung von S-Nitrosothiol-Zwischenprodukten, wie dem S-Nitrosoderivat von N-Acetylpenicillamin, beteiligt sind. US-4 900 719 führt aus, dass S-Nitroso-glutathion als ein Zwischenprodukt bei der Blutdrucksenkung wirkt. Die Veröffentlichung von Mc Namara et al., Can. J. Physiol. Pharm., Bd. 58 (1980), S. 1446, führt aus, dass die Bildung von cAMP und cGMP durch Thiole und Stickoxide verstärkt wird. Loscalzo et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 249: 726 (1989) beschreiben ein S-nitrosyliertes Derivat von Captopril, das unter anderem eine Nitroso-Gefäßerweiterungswirkung aufweist.
Ferner führen Schmidt et al., Biochem. Biophys. Res. Commun, Bd. 172 (1990), S. 614 aus, dass die Aktivierung von löslicher Guanylat-cyclase durch Nitrovasodilatatoren durch Einwirkung von oxidierten Lipoproteinen niedriger Dichte gehemmt wird.
Viele Proteine von physiologischer Bedeutung weisen intramolekulare Thiole in der Form von Cysteinresten auf. Diese Thiolgruppen sind oft von kritischer Bedeutung bei den funktionellen Eigenschaften solcher Proteine. Diese Sulfhydrylgruppen sind hochspezialisiert und werden ausgiebig bei physiologischen Prozessen genutzt, wie der metabolischen Regulation, der strukturellen Stabilisierung, dem Transfer von Reduktionsäquivalenten, Entgiftungswegen und Enzymkatalyse (Gilbert, H. F., "Molecular and Cellular Aspects of Thiol-Disulfide Exchange", Advances in Enzymology, A. Miester, J. Wiley & Sons, Eds. New York 1990, S. 69–172).
Thiole liegen auch an solchen Proteinen vor, deren Funktion der Transport und die Zufuhr von spezifischen Molekülen zu bestimmten Körpergeweben ist. Zum Beispiel sind Lipoproteine globuläre Partikel von hohem Molekulargewicht, die unpolare Lipide durch das Plasma transportieren. Diese Proteine enthalten Thiole in dem Bereich des Proteins, der die zelluläre Aufnahme des Lipoproteins steuert (Mahley et al., JAMA 265: 78–83 (1991)). Hyperlipoproteinämien, die aus einer exzessiven Lipoprotein- (und somit Lipid-) Aufnahme resultieren, rufen lebensbedrohende Erkrankungen hervor, wie Atherosklerose und Pankreatitis.
Das im Hämoglobin enthaltene Thiol reguliert die Affinität des Hämoglobins für Sauerstoff und spielt somit eine kritische Rolle bei der Zufuhr von Sauerstoff zum Körpergewebe. Die Reaktion zwischen dem freien NO-Radikal erfolgt an der Eisenbindungsstelle des Hämoglobins und nicht am Thiol. Als Ergebnis wird Methämoglobin erzeugt, welches die Sauerstoff-Hämoglobin-Bindung und somit den Sauerstofftransport behindert. Andere Proteine, wie thrombolytische Mittel, Immunoglobuline und Albumin, weisen freie Thiolgruppen auf, die bei der Regulation der Proteinfunktion wichtig sind.
Proteinthiole können unter bestimmten pathophysiologischen Bedingungen bewirken, dass ein Protein einen nachteiligen Effekt ausübt. Zum Beispiel ist Cathepsin, ein am Abbau von Zellbestandteilen beteiligtes Sulfhydryl-enzym, für seine proteolytische Aktivität in kritischer Weise von Sulfhydrylgruppen abhängig. Eine durch dieses Enzym hervorgerufene unkontrollierte Proteolyse führt jedoch zu Gewebeschäden, speziell zu durch Rauchen hervorgerufene Lungenschäden.
Die Reaktion zwischen NO und den Thiolen von intakten Proteinmolekülen ist bisher nur in sehr beschränktem Ausmaß untersucht worden. Es gibt einige Anhaltspunkte für die in vivo-Reaktion zwischen Proteinen und Nitro(so)-haltigen Verbindungen. Forscher haben beobachtet, dass die Denitrifizierung von Nitroglycerin im Plasma durch das Thiol von Albumin katalysiert ist (Chong et al., Drug Met. and Disp. 18: 61 (1990)), wobei diese Autoren eine Analogie zwischen diesem Mechanismus und der thiolabhängigen enzymatischen Denitrifizierung von Nitroglycerin mit Glutathion S-transferase in einer Reaktion, die Thionitrate erzeugt, vorschlagen (Keene et al., JBC 251: 6183 (1976)). Außerdem ist von Hämoproteinen gezeigt worden, dass sie die Denitrifizierung von Nitroglycerin katalysieren und über Thiolgruppen mit bestimmten Nitrosoverbindungen als Teil des hypothetischen Detoxifizierungsweges für Arylhydroxylamine reagieren (Benett et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 237: 629 (1986); Umemoto et. al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 151: 1326 (1988)). Die chemische Identität von Zwischenstufen bei diesen Reaktionen ist nicht bekannt.
Eine Nitrosylierung von Aminosäuren kann auch an anderen Stellen als der Thiolgruppe bewirkt werden. Tyrosin, eine aromatische Aminosäure, die in Proteinen, Peptiden und anderen chemischen Verbindungen vorliegt, enthält einen phenolischen Ring, eine Hydroxylgruppe und eine Aminogruppe. Es ist allgemein bekannt, dass die Nitrierung von Phenol ortho-Nitrophenyl- und para-Nitrophenyl-C-nitrosylierungsprodukte liefert. Von der Nitrosylierung von Tyrosin unter Verwendung von salpetriger Säure ist gezeigt worden, dass sie C-nitrosyliertes Tyrosin ergibt (Reeve, R. M., Histochem. Cytochem. 16(3): 191–198 (1968)), und es ist vorgeschlagen worden, dass dieser Prozess O-Nitrosotyrosin als Vorprodukt erzeugt, welches sich dann zum C-nitrosylierten Produkt umlagert (Baliga, B. T., Org. Chem. 35(6): 2031–2032 (1970); Bonnet et al., J. C. S. Perkin Trans. I: 2261–2264 (1975)).
Die Chemie von Aminosäure-Seitenketten, wie solchen, die an Tyrosin und anderen aromatischen Aminosäuren zu finden sind, spielt eine kritische Rolle bei der Sicherstellung einer korrekten Enzymfunktion innerhalb des Körpers. Außerdem spielt die Hydroxylgruppe von Tyrosin eine zentrale Rolle in einer Vielzahl von zellregulierenden Funktionen, wobei die Phosphorylierung von Tyrosin ein derartiges kritisches, zellregulierendes Ereignis ist. Neben der Tatsache, dass diese aromatischen Aminosäuren bioaktive Seitenketten aufweisen, dienen sie als Vorstufen für zahlreiche wichtige Biomoleküle, wie Hormone, Vitamine, Coenzyme und Neurotransmitter.
Dem gegenwärtigen Stand der Technik fehlen chemische Verfahren zum Modifizieren der Aktivität und zum Regulieren des intermediären zellulären Metabolismus der Aminosäuren und Proteine, die eine kritische Rolle in biologischen Systemen spielen. Darüber hinaus blieb die Fähigkeit zur Regulation von Proteinfunktionen durch Nitrosylierung vor der vorliegenden Erfindung auf dem Fachgebiet unbeachtet.
Aus dem Stand der Technik ist es bekannt, dass sich Proteinmoleküle, infolge ihres erhöhten Molekulargewichts und ihrer Tertiärstruktur, signifikant von Thiolen mit niedrigem Molekulargewicht unterscheiden. Ferner war aufgrund dieser Unterschiede nicht zu erwarten, dass Proteinthiole erfolgreich auf dieselbe Weise wie Thiole mit niedrigem Molekulargewicht nitrosyliert werden können, oder dass sie in nitrosyliertem Zustand auf dieselbe Weise reagieren. Ferner war es gleichermaßen unerwartet, dass eine Nitrosylierung von zusätzlichen Stellen, wie Sauerstoff, Kohlenstoff und Stickstoff, ein Mittel zur Regulierung von Proteinfunktionen darstellt.
Aufgrund der großen Bedeutung von unterschiedlichen Proteinen und Aminosäuren in sämtlichen biologischen Systemen wäre es äußerst wünschenswert, über ein Verfahren zum Erzielen einer selektiven Regulierung von Protein- und Aminosäurefunktionen zu verfügen. Es gibt praktisch unbeschränkt viele Situationen, bei denen die Fähigkeit zur Regulierung von Aminosäure- und Proteinfunktionen durch Nitrosylierung von enormer therapeutischer Bedeutung ist. Nachstehend sind Beispiele für Wege, auf denen eine Regulierung oder Modifizierung von Funktionen erreicht werden könnte, aufgeführt: (1) Verbesserung oder Verlängerung der vorteilhaften Eigenschaften des Proteins oder der Aminosäure; (2) Ausstattung des Proteins oder der Aminosäure mit weiteren vorteilhaften Eigenschaften; (3) Beseitigung nachteiliger Eigenschaften eines Proteins oder einer Aminosäure; und (4) Veränderung des Metabolismus oder der Aufnahme von Proteinen oder Aminosäuren in physiologischen Systemen.
Die vorliegende Erfindung ist auf eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an einem S-Nitroso-lipoprotein gemäß Anspruch 1 abgestellt. Weitere Ausführungsformen sind in den Ansprüchen 2 und 3 angegeben. Ferner ist die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Abgabe von Stickoxid an spezifische Zielorte im Körper, zum Hemmen der Blutplättchenfunktion, zum Erzeugen einer Gefäßerweiterung, zur Therapie oder Prophylaxe von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, zum Entspannen von nicht-vaskulärem glatten Muskelgewebe und/oder zur Therapie oder Prophylaxe von Atmungserkrankungen abgestellt. Eine weitere Ausführungsform ist in Anspruch 5 angegeben.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung beruht auf dem Befund der Erfinder, dass eine Nitrosylierung von Thiolen, die an Lipoproteinen vorliegen, ein Mittel zum Erzielen einer selektiven Regulierung von Protein- und Aminosäurefunktionen bereitstellt. Dieses Konzept kann zur Erzeugung von S-Nitroso-lipoproteinen eingesetzt werden, die spezifische Eigenschaften besitzen, und kann in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur direkten Verabreichung an einen Patienten verwendet werden. Alternativ stellt die Erfindung ein Mittel zur in vivo-Regulierung von Protein- oder Aminosäurefunktionen durch Nitrosylierung bereit. Die Erfindung ist daher auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein S-Nitroso-lipoprotein enthält, und deren therapeutische Verwendungen, sowie auf die in vivo-Nitrosylierung von Proteinen abgestellt.
Gemäß Anspruch 2 ist die Erfindung auf Zusammensetzungen, die ein S-Nitroso-lipoprotein enthalten, gerichtet. Lipoproteine, die in der Zusammensetzung enthalten sein können, umfassen Chylomikronen, restliche Teilchen von Chylomikronen, Lipoprotein sehr niedriger Dichte (VLDL), Lipoprotein mittlerer Dichte (IDL), Lipoprotein niedriger Dichte (LDL), Lipoprotein hoher Dichte (HDL) und Lipoprotein (a).
Die Erfindung ist auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen gerichtet, die ein S-Nitroso-lipoprotein zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 bei Verfahren zur Herbeiführung von Gefäßerweiterung, Blutplättchenhemmung und Thrombolyse sowie zur Behandlung von kardiovaskulären Störungen gerichtet, wobei die Verfahren das Verabreichen der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen an ein Tier umfassen.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Herbeiführung von Gefäßerweiterung, Blutplättchenhemmung und Thrombolyse gerichtet, wobei das Verfahren die Verabreichung eines Nitrosylierungsmittels an ein Tier umfasst.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur in vivo-Regulierung einer Proteinfunktion gerichtet, wobei das Verfahren die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung an ein Tier umfasst.
Die Erfindung ist auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Verhinderung der Aufnahme eines Lipoproteins durch Zellen gerichtet, wobei das Verfahren die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzung an einen Patienten umfasst.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Herbeiführung einer Entspannung (Relaxation) von nicht-vaskulären glatten Muskeln gerichtet, wobei das Verfahren die Verabreichung der pharmazeutischen Zusammensetzungen an ein Tier umfasst.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Regulierung der Funktion von Lipoproteinen, bei denen das Thiol an eine Methylgruppe gebunden ist, gerichtet, wobei das Verfahren die Stufen der Entfernung der Methylgruppen aus dem Lipoprotein durch selektive Demethylierung und der Umsetzung der freien Thiolgruppen mit einem Nitrosylierungsmittel umfasst.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Regulierung der Funktion eines Proteins, dem eine freie Thiolgruppe fehlt, gerichtet, wobei das Verfahren die Stufen der Addition einer Thiolgruppe an das Protein und der Umsetzung der Thiolgruppe mit einem Nitrosylierungsmittel umfasst.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Regulierung der zellulären Funktion gerichtet, wobei das Verfahren die S-Nitrosylierung eines Lipoproteins, das eine zelluläre Komponente darstellt oder das eine zelluläre Funktion beeinflusst, umfasst.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Abgabe von Stickoxid an spezifische, zielgerichtete Stellen im Körper gerichtet, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen an ein Tier umfasst.
Die Erfindung beschreibt ferner die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung der Blutplättchenfunktion, wobei das Verfahren die Nitrosylierung eines Lipoproteins an anderen Stellen neben den Thiolgruppen, die am Lipoprotein vorliegen, umfasst.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Herbeiführung einer Gefäßerweiterung gerichtet, wobei das Verfahren die Nitrosylierung eines Lipoproteins an anderen Stellen neben den Thiolgruppen, die am Lipoprotein vorliegen, umfasst.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zum Entspannen von glatten Muskeln gerichtet, wobei das Verfahren die Nitrosylierung eines Lipoproteins an anderen Stellen neben den Thiolgruppen, die am Lipoprotein vorliegen, umfasst.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Regulierung der Zellfunktion gerichtet, wobei das Verfahren die Nitrosylierung eines Lipoproteins an anderen Stellen neben den Thiolgruppen, die am Lipoprotein vorliegen, umfasst.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Abgabe von Stickoxid an spezifische Zielstellen im Körper gerichtet, wobei das Verfahren die Nitrosylierung eines Lipoproteins an anderen Stellen neben den Thiolgruppen, die am Lipoprotein vorliegen, umfasst.
Die Stellen, die nitrosyliert werden, sind aus der Gruppe, die aus Sauerstoff, Kohlenstoff und Stickstoff besteht, ausgewählt.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung der Blutplättchenfunktion gerichtet, wobei das Verfahren die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfasst, die eine Verbindung enthält, die aus der Gruppe, die aus beliebigen S-Nitroso-lipoproteinen besteht, ausgewählt ist.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Herbeiführung einer Gefäßerweiterung gerichtet, wobei das Verfahren die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfasst, die eine Verbindung enthält, die aus der Gruppe, die aus beliebigen S-Nitroso-lipoproteinen besteht, ausgewählt ist.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Therapie oder Prophylaxe von kardiovaskulären Störungen gerichtet, wobei das Verfahren die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfasst, die eine Verbindung enthält, die aus der Gruppe, die aus beliebigen S-Nitroso-lipoproteinen besteht, ausgewählt ist.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Relaxation von nicht-vaskulärer glatter Muskulatur gerichtet, wobei das Verfahren die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfasst, die eine Verbindung enthält, die aus der Gruppe, die aus beliebigen S-Nitroso-lipoproteinen besteht, ausgewählt ist.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Therapie oder Prophylaxe von Atmungserkrankungen gerichtet, wobei das Verfahren die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfasst, die eine Verbindung enthält, die aus der Gruppe, die aus beliebigen S-Nitroso-lipoproteinen besteht, ausgewählt ist.
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung eines S-Nitroso-immunoglobulins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zur Abgabe von Stickoxid an bestimmte Zielstellen im Körper gerichtet, wobei das Verfahren die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung umfasst, die eine Verbindung enthält, die aus der Gruppe, die aus beliebigen S-Nitroso-lipoproteinen besteht, ausgewählt ist.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1: S-NO-t-PA Spektroskopie.
1a: Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von S-NO-t-PA (15 μM) relativ zu unmodifiziertem t-PA.
1b: Die chemische Verschiebung von S-[¹⁵N]O-t-PA (35 μM) bei 751 ppm relativ zu Nitrit unter Anwendung von [¹⁵N]-NMR.
2: Bestimmung der S-NO-Bindungsbildung bei der Synthese von S-NO-t-PA.
3: [¹⁵N]NMR-Spektrum von [¹⁵N]-markiertem S-Nitroso-BSA.
4: Konzentrationsabhängige Bindung von t-PA und S-NO-t-PA an Fibrinogen-beschichteten Vertiefungen.
5: Zweifach reziproke Diagramme für S-NO-t-PA. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Mittelwert ± S. D. (n = 3).
5a: Zweifach reziprokes Diagramm 1/v gegen 1/s für t-PA und S-NO-t-PA, erzeugt gegen das chromogene Substrat S2288.
5b: Die Kurven für die Aktivierung von Glu-Plasminogen (0,1–10 μM) durch t-PA und S-NO-t-PA, erzeugt unter Verwendung des für Plasmin spezifischen, chromogenen Substrats S2251.
6: Fibrinogenstimulierung der enzymatischen Aktivität von t-PA (nicht schraffierte Balken) und S-NO-t-PA (schraffierte Balken), verglichen im gekoppelten Enzymtest bei Plasminogen-Konzentrationen von 0,1 μM und 1,0 μM.
7: Durch S-NO-t-PA hervorgerufene Erhöhungen an intrazellulärem Blutplättchen-cyclo-GMP.
8: Hemmung der Blutplättchenaggregation durch S-NO-t-PA.
9: Vergleich der S-NO-t-PA-induzierten Vasorelaxation, hervorgerufen durch (a) t-PA (150 nM), (b) S-NO-t-PA (150 nM) und (c) S-NO-t-PA (150 nM).
10: Dosisabhängige Relaxation von glatten Gefäßmuskeln und Hemmung der Blutplättchenaggregation, hervorgerufen durch S-Nitroso-BSA (S-NO-BSA).
11: Repräsentativer Verlauf der Gefäßrelaxation und Blutplättchenhemmung, hervorgerufen durch S-Nitroso-BSA (S-NO-BSA).
11a: Beispielhafter Verlauf unter Vergleich der Blutplättchenhemmwirkungen von (a) S-NO-BSA; (b) NaNO₂; (c) BSA; (d) mit Iodacetamid behandeltes BSA, das mit aus angesäuertem NaNO₂ erzeugtem NO behandelt worden ist.
11b: Beispielhafter Verlauf der gefäßerweiternden Wirkungen von (a) BSA (1,4 μM); (b) mit Iodacetamid-behandeltem BSA, das mit aus angesäuertem NaNO₂ erzeugtem NO gemäß 3a behandelt worden ist; (c) S-NO-BSA (1,4 μM), wonach die Blutplättchen 10 Minuten mit 1 μM Methylenblau behandelt wurden; (d) S-NO-BSA (1,4 μM).
12: Koronare Durchblutung in betäubten Hunden im Anschluss nach Infusion von S-Nitroso-BSA.
13: Dauer der erhöhten koronaren Durchblutung im Anschluss an eine Infusion von S-Nitroso-BSA.
14: Koronare Gefäßerweiterung im Anschluss an eine Infusion von S-Nitroso-BSA.
15: Dosisabhängige gefäßerweiternde Reaktion, hervorgerufen durch S-Nitroso-cathepsin.
16: Verlauf der dosisabhängigen Hemmung der Blutplättchenaggregation, hervorgerufen durch S-Nitroso-LDL.
17: Repräsentativer Verlauf der Gefäßrelaxation, hervorgerufen durch S-Nitroso-LDL.
18: Verlauf der dosisabhängigen Hemmung der Blutplättchenaggregation, hervorgerufen durch S-Nitroso-Immunoglobulin.
19: Repräsentativer Verlauf der Gefäßrelaxation, hervorgerufen durch S-Nitroso-Immunoglobulin.
20: Konzentrationsabhängige Relaxation von glatten Luftwegmuskeln, hervorgerufen durch S-NO-BSA.
21: Nitrosylierung von L-Tyrosin.
21a: [¹⁵N]-NMR-Spektrum
21b: [¹H]-NMR-Spektrum
21c: FTIR-Spektrum
21d: UV-Spektrum für 1,8 mM Tyrosin
21e: UV-Spektrum für 34 mM Tyrosin
22: Nitrosylierung von L-Phenylalanin; [¹⁵N]-NMR-Spektrum
23: UV-Spektrum für die Nitrosylierung von Tryptophan
23a: 5-minütige Reaktionszeit
23b: 10-minütige Reaktionszeit
23c: 15-minütige Reaktionszeit
23d: 30-minütige Reaktionszeit
23e: 60-minütige Reaktionszeit
24: [¹⁵N]-NMR-Spektrum für nitrosyliertes Rinderserumalbumin.
25: UV-Spektrum für die zeitabhängige NO-Beladung von BSA.
25a: 1-minütige Reaktionszeit
25b: 5-minütige Reaktionszeit
25c: 30-minütige Reaktionszeit
26: Nitrosylierung von t-PA
27: Gefäßerweiterungswirkung von NO-beladenem BSA
28: S-Nitrosylierung von Hämoglobin
29: UV-Spektrum von Hämoglobin nach Inkubation mit S-Nitroso-N-Acetylcystein
30: Reaktion von Stickoxid an der Eisenbindungsstelle von Hämoglobin.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Hintergrund
Die Erfindung basiert auf dem Befund der Erfinder, dass eine Nitrosylierung von Lipoproteinen ein Mittel bereitstellt, durch welches Lipoproteinfunktionen selektiv reguliert, modifiziert oder verbessert werden können.
Der Ausdruck "Nitrosylierung" bezieht sich auf die Addition von NO an eine Thiolgruppe (SH) durch chemische Mittel. Bei der Quelle für NO kann es sich um endogenes NO oder vom Endothel abgeleiteten Relaxationsfaktor oder andere Nitrosylierungsagenzien, wie Nitroglycerin, Nitroprussid, Nitrosothiole, salpetrige Säure oder eine beliebige andere verwandte Verbindung, handeln.
Der Ausdruck "reguliert" bedeutet eine wirksame Steuerung der Aktivität eines Lipoproteins auf selektive Weise, um so das Lipoprotein zur Ausübung eines gewünschten physiologischen Effekts zu bringen.
Der Ausdruck "modifiziert" bedeutet die wirksame Veränderung der Aktivität eines Lipoproteins auf selektive Weise, um so das Lipoprotein zur Ausübung eines erwünschten physiologischen Effekts zu bringen. Der Ausdruck "verbessert" bedeutet die wirksame Veränderung der Aktivität eines Lipoproteins auf selektive Weise, um so eine Erhöhung oder Verbesserung der Aktivität des Lipoproteins zu bewirken, oder das Lipoprotein mit weiteren Fähigkeiten auszustatten.
Der Ausdruck "Aktivität" bezieht sich auf jede beliebige, durch das Lipoprotein ausgeübte Aktion, die zu einem physiologischen Effekt führt.
Die Erfinder haben die Reaktion von NO mit Proteinthiolen untersucht und gezeigt, dass eine Vielzahl von Lipoproteinen von biologischer Bedeutung und relativer Verbreitung S-nitrosyliert werden können. Eine S-Nitrosylierung von Lipoproteinen verleiht diesen Molekülen potente und lang andauernde, NO-ähnliche Wirkungen der Vasodilatation und Blutplättchenhemmung, welche durch Aktivierung von Guanylat-cyclase vermittelt werden, und stellt auch ein Mittel zum Erzielen einer selektiven Regulierung bestimmter Proteinfunktionen bereit.
Zur Entwicklung der in der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung verwendeten S-Nitroso-lipoprotein-Verbindungen wurden bestimmte thiolhaltige Lipoproteine, die repräsentativ für verschiedene funktionelle Klassen sind, nitrosyliert.
Die Daten zeigen: 1) NO kann mit Thiolgruppen in Proteinen unter Bildung von S-Nitrosothiolen reagieren; 2) diese Reaktion tritt unter physiologischen Bedingungen auf; 3) diese Verbindungen sind biologisch aktiv und zeigen vasodilatatorische und Antiblutplättcheneigenschaften, die unabhängig von dem Verfahren ihrer Synthese sind; 4) die langen chemischen Halbwertszeiten von S-Nitrosoproteinen gegenüber der Halbwertszeit von NO spiegeln sich in unterschiedlichen Relaxationskinetiken wieder: S-Nitrosoproteine, über Aktivierung von Guanylatcyclase, stehen in vollständiger Übereinstimmung mit anderen Nitrosoverbindungen; die Möglichkeit anderer Mechanismen, durch die S-NO-Proteine biologische Wirkungen erzeugen können, kann aber nicht ausgeschlossen werden, z. B. die Übertragung von NO auf ein anderes Proteinthiol, dessen Funktion dadurch moduliert wird (Craven et al., J. Biol. Chem. 253: 8433 (1978); Katsuki et al. J. Cyc. Nuc. Prot. Phos. Res. 3: 23 (1977); Osborne et al., J. Clin. Invest. 83: 465 (1989)).
Besondere Ausführungsformen
Eine nicht erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft S-Nitroso-enzymverbindungen, die von der Nitrosylierung enzymatischer Proteine abgeleitet sind.
Ein besonderer Aspekt dieser nicht erfindungsgemäßen Ausführungsform betrifft die Verbindung S-Nitroso-t-PA (S-NO-t-PA), abgeleitet von der Nitrosylierung des Plasminogenaktivators vom Gewebetyp (t-PA).
Akute Verschlusssituationen werden durch thrombogene Stimuli und Veränderungen in der Dynamik des Flusses innerhalb des Gefäßes hervorgerufen. Die Blutplättchenaktivierung, die verbesserte lokale Vasokonstriktion und das Heranziehen des Koagulationssystems spielen jeweils eine Hauptrolle bei der nachfolgenden Entwicklung eines Thrombus (Marder et al., New Engl. J. Med. 318: 1512, 1520 (1988)). t-PA ist eines der vom Blutgefäß-Endothel sezernierten Produkte, die spezifisch gegen diese thrombogenen Mechanismen wirken. t-PA, eine Serinprotease, wandelt Plasminogen in Plasmin an Fibrin und Blutplättchenthrombi um, welche wiederum eine Fibrinolyse und Blutplättchendisaggregation induzieren; Loscalzo et al., New Engl. J. Med. 319(14): 925–931 (1989); Loscalzo et al., J. Clin. Invest. 79: 1749–1755 (1987).
Es sind Versuche zur Verbesserung der thrombolytischen Effizienz und pharmakologischen Eigenschaften von Plasminogenaktivatoren, wie t-PA, unternommen worden. Im Licht der Rolle der Blutplättchen bei der Bildung von Blutgerinnseln und bei reokklusiven vaskulären Ereignissen betraf ein Hauptaspekt die Verwendung einer nebengeordneten Antiblutplättchentherapie. Ein gewisser Erfolg ist mit Aspirin erzielt worden (ISIS-2 Lancet 2: 349–360 (1988), und andere günstige Wirkungen sind für eine Reihe neuer Antiblutplättchenverbindungen berichtet worden (Gold, H. K., New Engl. J. Med. 323: 1483–1485 (1990)). Es wurden auch Versuche zur Verbesserung der funktionellen Eigenschaften des Plasminogenaktivators selbst über ortsgerichtete Mutagenese und Synthese von Hybridmolekülen und biochemischen Konjugaten unternommen (Runge et al., Circulation 79: 217–224 (1989); Vaughan et al., Trends Cardiovasc. Med. Jan/Feb: 1050–1738 (1991)).
Motiviert durch den Bedarf an einem Plasminogenaktivator mit verbesserter thrombolytischer Effizienz und antithrombogenen Eigenschaften fanden die Erfinder, dass eine Nitrosylierung von t-PA ein neues Molekül erzeugt (S-NO-t-PA), welches verbesserte thrombolytische Fähigkeiten (z. B. ist die enzymatische Aktivität des Enzyms verbessert) sowie einen vasodilatatorischen und blutplättchenhemmenden Effekt aufweist. Die Erfinder zeigten, dass eine S-Nitrosylierung die Bioaktivität von t-PA signifikant verbessert, ohne die katalytische Effizienz oder andere domänenspezifische funktionelle Eigenschaften des Enzyms zu beeinträchtigen.
Insbesondere verleiht eine S-Nitrosylierung von t-PA am freien Cystein cys 83, dem Enzym potente Antiblutplättchen- und vasodilatatorische Eigenschaften, ohne dessen katalytische Effizienz oder die Stimulation dieser Aktivität durch Fibrinogen) nachteilig zu beeinflussen. Außerdem scheint die S-Nitrosothiolgruppe nicht die spezifische Bindung von t-PA an Fibrinogen) oder die Wechselwirkung von t-PA mit seinem physiologischen Serin-Proteaseinhibitor, PAI-1, zu verändern. Die proteolytische Aktivität, die Fibrin(ogen)-Bindungseigenschaften und die Regionen für die Wechselwirkung mit PAI-1 liegen in verschiedenen funktionellen Domänen des Moleküls, die linear getrennt von der möglichen Stelle einer S-Nitrosylierung in der Wachstumsfaktordomäne (cys 83) sind. Somit ändert eine chemische Modifikation von t-PA durch NO in anderen Domänen residierende Eigenschaften von t-PA nicht in ausgeprägtem Maße. Außerdem verbessert eine S-Nitrosylierung die katalytische Effizienz von t-PA gegen Plasminogen und erhöht dessen Stimulation durch Fibrinogen.
NO ist hochgradig labil und unterliegt einer schnellen Inaktivierung im Plasma und im zellulären Milieu. Dies legt es nahe, dass die Reaktion zwischen NO und dem Proteinthiol ein Mittel zur Stabilisierung von NO in einer Form bietet, in der dessen Bioaktivität konserviert wird. Insbesondere ist S-NO-t-PA unter physiologischen Bedingungen ein stabiles Molekül und sehr ähnlich wie NO, ist es zur Vasodilatation und Blutplättchenhemmung fähig, die durch cyclisches GMP vermittelt werden. Eine Stabilisierung von NO in dieser besonderen bioaktiven Form erzeugt ein Molekül mit vasodilatatorischen, Antiblutplättchen- und fibrinolytischen Eigenschaften, welche eine Gegenwirkung gegen alle thrombogenen Hauptmechanismen ermöglichen.
Ein weiterer Aspekt dieser nicht erfindungsgemäßen Ausführungsform betrifft die Verabreichung von S-NO-t-PA als therapeutisches Mittel an ein Tier zur Therapie und Prophylaxe von Thrombose. Derzeitige thrombolytische Strategien basieren auf dem Verständnis des endogenen Mechanismus, gemäß dem das Endothel gegen thrombogene Tendenzen schützt. Insbesondere werden eine Blutplättchenhemmung und Nitrovasodilatation häufig als gleichzeitige Therapien eingesetzt, mit denen eine Reperfusion durch Plasminogenaktivatoren verstärkt sowie eine erneute Thrombose verhindert werden soll (Gold, H. K. New Engl. J. Med. 323: 1483–1485 (1990); Marder et al., New. Engl. J. Med. 318: 1512–1520 (1988)).
Die Verabreichung von S-NO-t-PA an einen Patienten, der dieses benötigt, stellt ein Mittel zum Erreichen einer "fibrinselektiven" Thrombolyse bereit, während gleichzeitig die verbleibende Thrombogenizität verringert wird, die aus einer gleichzeitigen Blutplättchenaktivierung und Thrombinerzeugung während der Thrombolyse resultiert. Ferner stellt S-NO-t-PA, aufgrund seiner Fibrinbindungseigenschaften, eine gezielte Zufuhr der Antiblutplättchenwirkungen von NO an den Ort der größten Blutplättchenaktivierung, dem aktuellen Fibrin-Blutplättchenthrombus, bereit. S-NO-t-PA findet eine therapeutische Anwendung bei der Therapie oder Prophylaxe von Zuständen, die aus einer Thrombogenese, wie Atherothrombose, Myokardinfarkt, Lungenembolie oder Schlaganfall resultieren oder dazu beitragen.
Zusammengefasst besitzt S-NO-t-PA besondere Eigenschaften, die das Auflösen von Blutgerinnseln erleichtern und eine weitere Thrombogenese verhindern. Das Auffinden dieses einzigartigen Moleküls eröffnet neue Einsichten in den oder die endogenen Mechanismen, durch die das Endothel die Gefäßdurchgängigkeit aufrechterhält und bietet einen neuen und vorteilhaften pharmakologischen Ansatz zur Auflösung von Thromben.
Ein weiterer Aspekt dieser nicht erfindungsgemäßen Ausführungsform betrifft die von der Nitrosylierung anderer thrombolytischer Agenzien, wie Streptokinase, Urokinase oder ein Komplex, der einen oder mehrere thrombolytische Agenzien enthält, wie Streptokinase, Urokinase oder t-PA, abgeleiteten Verbindungen. Diese Verbindungen können einem Tier ebenfalls auf dieselbe Weise wie S-NO-t-PA für die Therapie und Prophylaxe von Thrombose verabreicht werden.
Ein zusätzlicher Aspekt dieser nicht erfindungsgemäßen Ausführungsform betrifft die von der Nitrosylierung anderer Enzyme abgeleiteten Verbindungen. Eine besondere Verbindung ist S-NO-Cathepsin, abgeleitet von der Nitrosylierung von Cathepsin B, einer lysosomalen Cystein-protease. Die Erfinder haben gezeigt, dass S-NO-Cathepsin einen vasodilatatorischen und blutplättchenhemmenden Effekt ausübt. Somit kann diese Verbindung als therapeutisches Agens an ein Tier zur Förderung der Vasodilatation und Blutplättchenhemmung und zur Therapie oder Prophylaxe kardiovaskulärer Störungen verabreicht werden.
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die von der Nitrosylierung von Lipoproteinen abgeleiteten S-Nitroso-lipoprotein-Verbindungen. Derartige Lipoproteine umfassen Chylomikronen, restliche Teilchen von Chylomikronen, Lipoprotein von sehr niedriger Dichte (VDL), Lipoprotein niedriger Dichte (LDL), Lipoprotein mittlerer Dichte (IDL) und Lipoprotein hoher Dichte (HDL) sowie Lipoprotein (a). Die Erfinder haben gezeigt, dass S-Nitroso-lipoproteine eine gefäßerweiternde und blutplättchenhemmende Wirkung ausüben. Somit können diese Verbindungen als therapeutisches Mittel einem Tier verabreicht werden, um die Vasodilatation und Blutplättchenhemmung zu fördern und um kardiovaskuläre Störungen zu behandeln oder zu verhindern.
Eine weitere Ausführungsform beinhaltet die in vivo-Nitrosylierung von Lipoproteinen als Maßnahme zur Regulierung der zellulären Aufnahme von Lipoproteinen. Infolgedessen stellt die Nitrosylierung eine Maßnahme zur Regulierung der Lipid-Aufnahme und zur Therapie oder Prophylaxe von im Zusammenhang mit Hyperlipidämien stehenden Störungen, wie Atherosklerose, bereit.
Eine weitere, nicht-erfindungsgemäße Ausführungsform der Erfindung betrifft die von der Nitrosylierung von Immunoglobulinen abgeleiteten S-Nitroso-immunoglobulin-Verbindungen. Zu derartigen Immunoglobulinen können IgG, IgM, IgA, IgD oder IgE gehören. Die Erfinder haben gezeigt, dass diese Verbindungen eine gefäßerweiternde und blutplättchenhemmende Wirkung ausüben. Somit können diese Verbindungen als therapeutische Mittel einem Tier verabreicht werden, um die Gefäßerweiterung und die Blutplättchenhemmung zu fördern und um kardiovaskuläre Störungen zu behandeln oder zu verhindern. Die Halbwertszeiten dieser Verbindungen, die in der Größenordnung von 1 Tag liegen, ergeben besondere, lange anhaltende gefäßerweiternde Wirkungen, die sich erheblich von den Wirkungen niedermolekularer Nitroso-Verbindungen unterscheiden.
Eine weitere, nicht-erfindungsgemäße Ausführungsform ist die von der Nitrosylierung von Hämoglobin abgeleitete Verbindung S-Nitroso-hämoglobin. Diese Verbindung kann als therapeutisches Mittel zur Förderung der Gefäßerweiterung und Blutplättchenhemmung und zur Therapie oder Prophylaxe von kardiovaskulären Störungen verwendet werden.
Wie von den Erfindern dargelegt, erhöht die S-Nitrosylierung von Hämoglobin dessen Sauerstoffbindungskapazität. Hämoglobin ist ein globuläres Protein, das reversibel an Sauerstoff bindet, der durch passive Diffusion aus der Luft in die Lungen eintritt. Die Hämoglobin-Sauerstoff-Bindung erhöht in starkem Maße die Kapazität des Bluts zum Transport von Sauerstoff zu Körpergeweben. Somit stellt die Bindungsaffinität zwischen Hämoglobin und Sauerstoff einen kritischen Faktor bei der Bestimmung des Grades des Sauerstofftransports zu den Geweben dar. Die Thiolgruppe am Hämoglobin-Molekül reguliert die Affinität von Hämoglobin zu Sauerstoff. Die Erfinder haben gezeigt, dass einige S-Nitrosothiole, wie S-Nitrosoproteine, nicht mit der Eisenbindungsstelle von Hämoglobin reagieren, wie dies bei NO^• der Fall ist, sondern an die Thiolgruppe binden. Somit wird die Bildung von Methämoglobin verhindert und die Hämoglobin-Sauerstoff-Bindung bleibt unbeeinträchtigt.
Ferner haben die Erfinder gezeigt, dass die S-Nitrosylierung von Hämoglobin nicht nur die Beeinträchtigung der Bindung verhindert, sondern tatsächlich die Hämoglobin-Sauerstoff-Bindung erhöht. Somit beinhaltet eine weitere Ausführungsform der Erfindung die Verabreichung von S-NO-Hämoglobin oder die in vivo-Nitrosylierung von Hämoglobin, um die Sauerstofftransportkapazität des Blutes und den Sauerstofftransport zu Körpergeweben zu erhöhen. Infolgedessen eignen sich diese Verbindungen bei der Behandlung von Störungen, die mit einem unzureichenden Sauerstofftransport in Zusammenhang stehen, oder bei klinischen Situationen, bei denen ein erhöhter Sauerstofftransport benötigt wird. Zu Beispielen für derartige klinische Situationen gehören (ohne Beschränkung hierauf, hypoxische Störungen, die sich aufgrund von Pneumothorax, Luftwegobstruktionen, Paralyse oder Schwäche der Atemmuskeln, Hemmung der Atmungszentren durch Arzneistoffe oder andere Mittel oder in anderen Fällen einer verringerten pulmonalen Ventilation ergeben. Zu weiteren klinischen Indikationen gehören eine beeinträchtigte alveoläre Gasdiffusion, wie sie beispielsweise bei interstitieller Fibrose, Bronchiolenkonstriktion, pulmonalem Ödem, Pneumonie, Hämorraghie, Ertrinken, Anämien, arteriovenösen Shunts und Kohlenmonoxidvergiftung auftreten.
Ferner kann S-NO-Hämoglobin auch zur Modulation der Abgabe von Kohlenmonoxid oder Stickoxid (an Hämoglobin gebunden) an Körpergewebe verwendet werden.
Ferner können beliebige thiolhaltige Hämproteine nitrosyliert und zur Erhöhung der Sauerstofftransportkapazität des Blutes verwendet werden.
Eine weitere nicht-erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Verbindung S-Nitroso-myoglobin, die sich von der Nitrosylierung von Myoglobin, einem Protein, das ebenfalls Sauerstoff transportiert, ableitet. Diese Verbindung kann als therapeutisches Mittel zur Förderung der Gefäßerweiterung und Blutplättchenhemmung sowie zur Therapie oder Prophylaxe von kardiovaskulären Störungen verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung eines S-Nitroso-lipoproteins zur Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verwendung in einem Verfahren zum Einsatz von S-Nitroso-lipoproteinen als Mittel zur Bereitstellung einer zielgerichteten Abgabe von NO. Der Ausdruck "zielgerichtete Abgabe" bedeutet, dass NO absichtlich zu einer spezifischen und vorgesehenen Körperstelle transportiert und dort abgegeben wird. Eine zielgerichtete Abgabe von NO bietet eine Maßnahme zur Erzielung einer ortsspezifischen Relaxation von glatten Muskeln oder zur Erzielung anderer NO-vermittelter Effekte. Ferner kann die Abgabe dazu dienen, verschiedene, im Körper vorhandene Moleküle zu nitrosylieren. Beispielsweise geben S-Nitroso- lipoproteine NO ab und nitrosylieren somit Hämoglobin oder Myoglobin, um deren Sauerstoffbindung zu erhöhen.
Ein signifikanter Vorteil von S-Nitroso-lipoproteinen besteht darin, dass sie NO in seiner biologisch relevantesten und nicht-toxischen Form zuführen. Dies ist kritisch, weil die pharmakologische Effizienz von NO von der Form abhängt, in der es zugeführt wird. Dies trifft besonders in den Atemwegen zu, wo hohe Konzentrationen an O₂ und O₂-reaktiven Spezies eine schnelle Inaktivierung des NO-Restes begünstigen. Wie von den Erfindern gezeigt, führen S-Nitrosoproteine NO als die geladenen Spezies Nitrosonium (NO⁺) oder Nitroxyl (NO^–) zu, und nicht als das ungeladene NO-Radikal (NO^•). Dies ist wichtig, weil die geladenen Spezies in bezug auf die chemische Reaktivität sich im Vergleich zu NO^• sehr unterschiedlich verhalten.
Im Gegensatz zu NO^• reagieren Nitrosonium und Nitroxyl nicht mit O₂ oder O₂-Spezies und sind auch gegen eine Zersetzung in Gegenwart von Redoxmetallen beständig. Folglich führt eine Verabreichung von NO-Äquivalenten nicht zur Erzeugung toxischer Nebenprodukte oder zur Beseitigung des aktiven NO-Restes. Durch Zuführen von Nitrosonium oder Nitroxyl bieten S-Nitrosolipoproteine ein Mittel zum Erzielen der Relaxation der glatten Muskulatur und des Antiblutplättcheneffekts von NO und lindern gleichzeitig erhebliche schädliche Wirkungen, die früher mit einer NO-Therapie verbunden waren.
Eine weitere nicht-erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die Verabreichung von S-Nitrosoalbumin als therapeutisches Mittel zur Förderung der Blutplättchenhemmung oder zur Herbeiführung einer Relaxation der glatten Luftwegmuskulatur. Die Erfinder haben gezeigt, dass S-Nitroso-BSA eine blutplättchenhemmende Wirkung ausübt und auch eine lange anhaltende gefäßerweiternde Wirkung fördert, die von der Wirkung von NO oder der niedermolekularen Thiole unterschieden werden kann.
Die Erfinder haben ferner gezeigt, dass S-Nitroso-BSA die glatte Luftwegmuskulatur des Menschen entspannt. Wie vorstehend erörtert, bewirken S-Nitrosoproteine durch Abgabe von NO in Form von geladenen NO-Äquivalenten, wie Nitrosonium, eine Luftwegrelaxation und beseitigen ferner die nachteiligen Wirkungen, die bei Verabreichung anderer NO-Spezies auftreten können. Somit kann S-Nitrosoalbumin zur Therapie oder Prophylaxe von Atmungsstörungen verabreicht werden, einschließlich aller Unterarten von obstruktiven Lungenkrankheiten, wie Emphysem, Asthma, Bronchitis, Fibrose, übermäßige Schleimabsonderung und Lungenstörungen, die sich aus Komplikationen im Anschluss an Operationen ergeben. Ferner können diese Verbindungen als Antioxidationsmittel und somit zur Behandlung von Krankheiten, wie akutem Atemnotsyndrom (ARDS), verwendet werden.
Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Nitrosylierung solcher Proteine, denen freie Thiole fehlen. Dieses Verfahren beinhaltet ein Thiolieren des Proteins durch chemische Mittel, wie Homocystein-thiolacton (Kendall, BBA 257: 83 (1972)), gefolgt von einer Nitrosylierung auf dieselbe Weise wie bei den vorstehend erörterten Verbindungen. Ferner können rekombinante DNA-Verfahren verwendet werden, um Cysteinreste an ein Protein zu addieren oder diese zu substituieren.
Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Nitrosylierung solcher Proteine, bei denen das Thiol durch eine Methylgruppe blockiert ist. Dieses Verfahren beinhaltet eine selektive Demethylierung des Proteins durch chemische Mittel, wie einer Umsetzung mit Methyltransferase, gefolgt von einer Nitrosylierung auf dieselbe Weise wie bei den oben erörterten Verbindungen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung eines pharmazeutischen Präparats mit einem Gehalt an S-Nitroso-lipoproteinen zur Relaxation von nicht-vaskulärer glatter Muskulatur. Arten von glatter Muskulatur schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, Bronchien, Tracheen, Uterus, Eileiter, Blase, Harnleiter, Schwellkörper, Speiseröhre, Zwölffingerdarm, Ileum, Kolon, Sphincter Oddi, Bauchspeicheldrüse oder den Gallengang ein.
Eine weitere Ausführungsform beinhaltet die in vivo-Nitrosylierung von Proteinthiolen durch Verabreichung eines Nitrosylierungsmittels in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung. Eine in vivo-Nitrosylierung bietet eine Maßnahme zur Erzielung beliebiger physiologischer Effekte, wie vorstehend erörtert wurde, oder zur Regulierung weiterer Proteinfunktionen.
Außer den Thiolgruppen besitzen Proteine und Aminosäuren andere Stellen, die nitrosyliert werden können. Solche Stellen können zum Beispiel Sauerstoff, Stickstoff und Kohlenstoff einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Eine weitere, nicht erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft somit die Nitrosylierung zusätzlicher Stellen, wie Sauerstoff, Stickstoff und Kohlenstoff, die an Proteinen und Aminosäuren vorliegen, um beliebige der oben diskutierten physiologischen Wirkungen zu erzielen, oder um weitere Protein- und Aminosäurefunktionen zu regulieren. Die Erfinder haben gezeigt, dass aromatische Aminosäuren, wie Tyrosin, Phenylalanin und Tryptophan, an den Hydroxyl- und Aminogruppen nitrosyliert werden können, sowie am aromatischen Ring, wobei dies durch Kontaktieren mit Nitrosylierungsmitteln erfolgt, wie NaNO₂, NOCl, N₂O₃, N₂O₄ und NO⁺. Andere Aminosäuren, wie Serin und Threonin, können ebenfalls auf dieselbe Weise nitrosyliert werden.
Die Fähigkeit, NO an einer Vielzahl unterschiedlicher Stellen an einer Aminosäure oder einem Protein zu binden, stellt eine größere Konzentration von NO bereit und kann somit die Regulierung der Proteinfunktion verbessern, sowie auch andere NO-vermittelte Effekte, wie Relaxation der glatten Muskulatur und Blutplättchenhemmung. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft somit die Verwendung von Aminosäuren und Proteinen, die mehrere NO-Moleküle enthalten, zur Regulation von Protein- und Aminosäurefunktionen und zur Herbeiführung einer Relaxation der glatten Muskulatur und der Blutplättchenhemmung. Weitere therapeutische Verwendungen dieser Verbindungen schließen die Therapie oder Prophylaxe von Störungen, wie Herzinsuffizienz, Myokardinfarkt, Schock, Niereninsuffizienz, hepatorenales Syndrom, postkonoraren Bypass, Magen-Darmkrankheiten, Gefäßspasmen jeglicher Organbetten, Schlaganfall oder andere neurologische Erkrankungen und Krebs ein.
Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren zur Verwendung dieser nitrosylierten Proteine und Aminosäuren als Mittel zur Bereitstellung einer gezielten Zufuhr von NO an spezifische und vorgesehene Körperstellen. Diese Verbindungen besitzen das Vermögen, geladene NO-Äquivalente zuzuführen. Zum Beispiel werden Alkylnitrite der Formel X-CONO, die eine beta-Elektronen ziehende Gruppe besitzen, zur Zufuhr dieser geladenen NO-Äquivalente befähigt.
Die Hydroxylgruppe von Tyrosin spielt auch eine zentrale Rolle in einer Vielzahl von zellregulierenden Funktionen. Die Phosphorylierung von Tyrosin ist zum Beispiel ein kritischer zellregulierender Vorgang. Außerdem stellen Serinreste ebenfalls Phosphorylierungsstellen bereit. Ein besonderer Aspekt dieser Ausführungsform betrifft somit die Nitrosylierung von Aminosäuren, wie Tyrosin und Serin, um zelluläre Prozesse zu regulieren, wie die Phosphorylierung (ohne Beschränkung hierauf).
Eine weitere, nicht-erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die Anwendung der O-Nitrosylierung von Tyrosinresten an Rinderserumalbumin als ein Verfahren zur Erzielung einer Relaxation von glatter Muskulatur und von Blutplättchenhemmung.
Eine weitere, nicht-erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft die Nitrosylierung von t-PA an zusätzlichen Stellen, wie Sauerstoff. Zum Beispiel ändert eine O-Nitrosylierung von t-PA, zusätzlich zum Verleihen von vasodilatatorischen und blutplättchenhemmenden Eigenschaften, die Pharmakokinetik von t-PA auf solche Weise, dass t-PA nicht mehr als Substrat für seinen natürlichen Inhibitor, PA-I, zur Verfügung steht.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verabreichung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend ein beliebiges S-Nitroso-lipoprotein zur Hemmung der Blutplättchenfunktion, zur Bewirkung einer Vasodilatation und einer Relaxation der glatten Muskulatur, zur Zufuhr von Stickoxid an spezifische Zielstellen im Körper, oder für die Therapie oder Prophylaxe kardiovaskulärer oder respiratorischer Störungen.
Eine zusätzliche nicht-erfindungsgemäße Anwendung der vorliegenden Erfindung betrifft die Nitrosylierung weiterer Verbindungen, wie Peptide, Neurotransmitter, pharmakologische Mittel und andere chemische Verbindungen zu therapeutischen Zwecken. Zum Beispiel verbessert die Nitrosylierung von Dopamin, einem Neurotransmitter, das kardiologische Profil des Medikaments durch Verbesserung der Afterload-Verringerung und des Abfangens freier Radikale, während gleichzeitig Blutplättchen gehemmt werden und ein renaler Blutstrom bewahrt wird. Eine Nitrosylierung von Epinephrin und verwandten sympathomimetischen Medikamenten verändert die Halbwertszeit des Medikaments und beeinflusst dessen β-agonistische Selektivität.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an einem S-Nitroso-lipoprotein kann auf beliebige Art und Weise verabreicht werden, die eine Thrombolyse, Vasodilatation, Blutplättchenhemmung, Relaxation von nicht-vaskulärer glatter Muskulatur, eine andere Modifikation von Proteinfunktionen oder die Therapie oder Prophylaxe kardiovaskulärer Störungen oder beliebiger anderer Störungen, die sich aus der speziellen Aktivität eines Proteins oder einer Aminosäure ergeben, beeinflussen. Die Verabreichung kann zum Beispiel intravenös, intraarteriell, intramuskulär, subkutan, intraperitoneal, rektal, oral, transdermal oder bukkal erfolgen.
Erfindungsgemäß ist eine "therapeutisch wirksame Menge" einer therapeutischen Zusammensetzung eine Menge, die zum Erzielen eines gewünschten biologischen Effekts ausreicht. Allgemein kann die zur Bereitstellung einer wirksamen Menge der Zusammensetzung erforderliche Dosierung durch den Fachmann eingestellt werden und kann in Abhängigkeit vom Alter, der Gesundheit, dem Zustand, dem Geschlecht, dem Gewicht und dem Ausmaß der Erkrankung des Empfängers variieren. Außerdem kann die Dosierung auch von der Behandlungsfrequenz und der Natur des gewünschten Effekts abhängen.
Unter den Umfang der Erfindung fallende Zusammensetzungen schließen sämtliche Zusammensetzungen ein, bei denen das S-Nitroso-lipoprotein in einer zum Erreichen des beabsichtigten Zwecks wirksamen Menge enthalten ist. Obgleich individuelle Erfordernisse variieren, liegt die Bestimmung von optimalen Bereichen von wirksamen Mengen eines jeden Bestandteils innerhalb des Könnens des Fachmanns. Typische Dosierungsformen enthalten 1 bis 100 mMol/kg des S-Nitrosoproteins. Der Dosierungsbereich für das Nitrosylierungsagens hängt von dem speziellen Nitrosylierungsagens ab, das verwendet wird, und kann vom Fachmann bestimmt werden.
Zusätzlich zu den pharmakologisch wirksamen Verbindungen können die neuen pharmazeutischen Zubereitungen geeignete, pharmazeutisch verträgliche Träger enthalten, die Arzneimittelträger und Hilfsstoffe umfassen, welche die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu Zubereitungen erleichtern, die pharmazeutisch verwendet werden können. Vorzugsweise enthalten die Zubereitungen, insbesondere solche Zubereitungen, die oral verabreicht werden können und die für die bevorzugte Verabreichungsart verwendet werden können, wie Tabletten, Dragees und Kapseln, und auch Zubereitungen, die rektal verabreicht werden können, wie Suppositorien sowie geeignete Lösungen für eine Verabreichung durch Injektion oder auf oralem Wege etwa 0,01 bis 5%, und insbesondere etwa 0,1 bis 0,5% an aktiven Verbindungen) zusammen mit dem Arzneimittelträger.
Die pharmazeutischen Zubereitungen der vorliegenden Erfindung werden auf eine Weise hergestellt, die an sich bekannt ist, zum Beispiel mittels herkömmlicher Misch-, Granulierungs-, Drageeherstellungs-, Auflösungs- oder Lyophilisierungsverfahren. Somit können pharmazeutische Zubereitungen für eine orale Verwendung erhalten werden, indem man die Wirkstoffe mit festen Arzneimittelträgern vereinigt, gegebenenfalls das erhaltene Gemisch mahlt und die Granulatmischung nach Zugabe geeigneter Hilfsstoffe, wenn gewünscht oder notwendig, unter Bildung von Tabletten oder Drageekernen verarbeitet.
Geeignete Arzneimittelträger sind insbesondere Füllstoffe, wie Zucker, zum Beispiel Lactose oder Saccharose, Mannitol oder Sorbitol, Cellulosezubereitungen und/oder Calciumphosphate, zum Beispiel Tricalciumphosphat oder Calciumdydrogenphosphat, sowie Bindemittel, wie Stärke, Kleister, unter Verwendung von zum Beispiel Maisstärke, Weizenstärke, Reisstärke, Kartoffelstärke, Gelatine, Traganth, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon. Falls erwünscht, können Sprengmittel zugefügt werden, wie die oben genannten Stärken und auch Carboxymethylstärke, vernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder Salze davon, wie Natriumalginat. Bei Hilfsstoffen handelt es sich vor allem um flussregulierende Mittel und Gleitmittel, zum Beispiel Siliciumdioxid, Talkum, Stearinsäure oder Salze davon, wie Magnesiumstearat oder Calciumstearat, und/oder Polyethylenglycol. Drageekerne werden mit geeigneten Beschichtungen versehen, die, gegebenenfalls beständig gegen Magensaft sind. Für diesen Zweck können konzentrierte Zuckerlösungen verwendet werden, die gegebenenfalls Gummi arabicum, Talkum, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycol und/oder Titandioxid, Lacklösungen und geeignete organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische enthalten. Zur Erzeugung von Beschichtungen, die gegen Magensaft beständig sind, werden Lösungen geeigneter Cellulosezubereitungen verwendet, wie Acetylcellulosephthalat oder Hydroxypropylmethylcellulosephthalat. Farbstoffe oder Pigmente können den Tabletten oder Drageebeschichtungen zum Beispiel zur Identifikation oder zur Charakterisierung von Kombinationen von Dosierungen aktiver Verbindungen zugegeben werden.
Andere pharmazeutische Zubereitungen, die oral verwendet werden können, schließen aus Gelatine hergestellte Push-fit-Kapseln ein, sowie weiche, versiegelte Kapseln, die aus Gelatine und einem Weichmacher, wie Glycerol oder Sorbitol, hergestellt sind. Die Push-fit-Kapseln können die Wirkstoffe in granulierter Form enthalten, wobei diese mit Füllstoffen, wie Lactose, Bindemitteln, wie Stärken, und/oder Gleitmitteln, wie Talkum oder Magnesiumstearat, und, gegebenenfalls Stabilisatoren vermischt sein können. In weichen Kapseln werden die Wirkstoffe vorzugsweise in geeigneten Flüssigkeiten aufgelöst oder suspendiert, wie Fettölen oder flüssigem Paraffin. Außerdem können Stabilisatoren zugegeben werden.
Mögliche pharmazeutische Zubereitungen, die rektal verwendet werden können, umfassen beispielsweise Suppositorien, die aus einer Kombination der aktiven Wirkstoffe mit einer Suppositoriengrundlage bestehen. Geeignete Suppositoriengrundlagen sind z. B. natürliche oder synthetische Triglyceride oder Paraffinkohlenwasserstoffe. Außerdem ist es auch möglich, Rektalkapseln aus Gelatine zu verwenden, die aus einer Kombination der Wirkstoffe mit einem Grundstoff bestehen. Mögliche Grundstoffmaterialien schließen zum Beispiel flüssige Triglyceride, Polyethylenglycole oder Paraffinkohlenwasserstoffe ein.
Geeignete Formulierungen für eine parenterale Verabreichung schließen wässrige Lösungen der aktiven Verbindungen in wasserlöslicher Form ein, zum Beispiel wasserlösliche Salze. Außerdem können Suspensionen der aktiven Verbindungen als geeignete ölige Injektionssuspensionen verabreicht werden. Geeignete lipophile Lösungsmittel oder Vehikel schließen Fettöle ein, zum Beispiel Sesamöl oder synthetische Fettsäureester, wie Ethyloleat oder Triglyceride. Wässrige Injektionssuspensionen können Substanzen enthalten, die die Viskosität der Suspension erhöhen und schließen zum Beispiel Natriumcarboxymethylcellulose, Sorbitol und/oder Dextran ein. Gegebenenfalls kann die Suspension auch Stabilisatoren enthalten.
Nach der allgemeinen Beschreibung ergibt sich ein leichteres Verständnis der Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele.
Beispiele
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 1: Synthese von S-Nitroso-t-PA
A. Nitrosylierung von t-PA
1. Materialien
t-PA wurde freundlicherweise von Genentech, Inc. San Francisco, CA, bereitgestellt. Reaktivierter, gereinigter Plasminogenaktivator-Inhibitor-1 (PAI-1) und eine Reihe von sechs monoklonalen murinen anti-t-PA- Antikörpern wurden freundlicherweise von Dr. Douglas E. Vaughan bereitgestellt. Schaf-antimurin-Antikörper mit gebundener Meerrettichperoxidase wurden von der Amersham Corp., Arlington, II, bezogen. Natriumnitrit wurde von Fisher Scientific, Fairlawn, NJ, bezogen. H-D-Isoleucyl-L-prolyl-L-arginiyl-p-nitroanilid (S2288) und H-D-Valyl-L-leucyl-L-lysyl-p-nitroanilid (S2251) wurden von Kabi Vitrum, Stockholm, Schweden, bezogen. Humanes, von Plasminogen und von Willebrand-faktor gereinigtes Fibrinogen wurde von den Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN, erhalten. Epinephrin, ADP und Iodacetamid wurden von der Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, bezogen. Bovines Thrombin wurde von ICN, ImmunoBiologicals, (Liste, IL) bezogen. Radioimmunoassay-Testpackungen für die Bestimmung von cGMP wurden von New England Nuclear, Boston, MA, bezogen.
2. Plasminogenzubereitung
Glu-Plasminogen wurde aus frisch gefrorenem Plasma, das bei 37°C aufgetaut wurde, gereinigt, wobei eine Modifikation des Verfahrens von Deutsch und Mertz verwendet wurde (Deutsch et al., Science 170: 1095–1096 (1970), durch Bezugnahme aufgenommen). Plasma wurde über eine Lysin-Sepharose-Säule geleitet und die Säule wurde mit 0,3 M Natriumphosphat, pH 7,4, 3 mM EDTA, gewaschen. Plasminogen wurde mit 0,2 M epsilon-Aminocapronsäure, 3 mM EDTA, pH 7,4, von der Säule eluiert. Kontaminierendes Plasmin wurde durch Passage des Säuleneluats über Benzamidin-Sepharose 2B entfernt. Das erhaltene Plasminogen wurde sodann vor der Verwendung gegen 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 0,15 M NaCl, dialysiert.
3. Thiol-Derivatisierung
Das freie Thiol von t-PA wurde carboxyamidiert, indem man das Enzym mit einem 10-fachen Überschuss an Iodacetamid im Dunkeln 1 Stunde bei 37°C in 10 mM Tris, pH 7,4, 0,15 M NaCl (TBS) behandelte. t-PA wurde dann gründlich gegen 10 mM HCl dialysiert, um überschüssiges Iodacetamid zu entfernen.
4. Mikroträger-Endothel-Zellkultur
Endothelialzellen wurden aus der bovinen Aorta durch eingeführte Techniken (Schwartz, S. M., In vitro 14: 966–980 (1978), durch Bezugnahme aufgenommen) isoliert und auf einem Mikroträgersystem negativ geladener, sphärischer Kunststoffperlen (Biosilon) gemäß dem Verfahren von Davies und Kollegen (Davies et al., J. Cell Biol. 101: 871–879 (1985), durch Bezugnahme aufgenommen) isoliert.
5. Nitrosylierung
Zunächst wurde t-PA gegen einen großen Überschuss von 10 mM HCl 24 Stunden dialysiert, um überschüssiges, zur Solubilisierung des Proteins verwendetes L-Arginin zu entfernen. t-PA wurde sodann mit NO_x, das aus einer äquimolaren Menge NaNO₂ in 0,5 N HCl (angesäuertes NaNO₂) freigesetzt worden war oder in Kontrollexperimenten nur mit 0,5 N HCl 30 Minuten bei 37°C behandelt. Die Lösungen wurden mit gleichen Volumina 1,0 N NaOH und mit Tris gepufferter Kochsalzlösung (TBS), pH 7,4, 0,05 M L-Arginin, auf den pH-Wert 7,4 titiriert. Verdünnungen wurden sodann nach Bedarf in TBS hergestellt.
Für Vergleichszwecke und zur Illustration der potentiellen biologischen Relevanz von S-NO-t-PA wurde diese Verbindung mit authentischem EDRF in ausgewählten Experimenten synthetisiert. Bei diesem Verfahren wurde t-PA mit bovinen Endothelialzellen aus der Aorta inkubiert, die durch Einwirkung hoher Scherkräfte zur Sekretion von EDRF stimuliert worden waren, wie wir früher beschrieben haben (Stamler et al., Cir. Res. 65: 789 (1989), durch Bezugnahme aufgenommen). Aufgrund der Stabilität der S-NO-Bindung in S-NO-t-PA unter physiologischen Bedingungen (t_1/2 > 24 Stunden in TBS, pH 7,4, 20°C) wurden Proben im Verlauf der gesamten Experimente bei pH 7,4 auf Eis gelagert.
S-NO-t-PA wurde auch durch Einwirken von NO-Gas auf t-PA synthetisiert, wobei das NO in die gepufferte (TBS) Lösung des Enzyms eingeleitet wurde. Dies illustriert ferner das Potential für die S-Nitrosylierung durch Einwirken einer Vielzahl von Stickoxiden, einschließlich NOCl, N₂O₃, N₂O₄ und anderen Nitrosoäquivalenten, auf Proteine.
B. Bestätigung der S-NO-Bindung
1. Verfahren
Die Bildung und Stabilität der S-NO-Bindung wurde durch verschiedene, veröffentlichte analytische Verfahren bestätigt.
Als erstes wurde aus S-Nitrosothiolgruppen mit Hg²⁺ verdrängtes NO durch Diazotierung von Sulfanilamid und anschließendes Kuppeln mit dem Chromophor N-(1-Naphthyl)-ethylendiamin (Saville, B., Analyst 83: 670–672 (1958), durch Bezugnahme aufgenommen) untersucht. Als zweites wurde das charakteristische Absorptionsspektrum von S-Nitrosothiolen in dem Bereich von 320 nm bis 360 nm bestimmt (Stamler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA im Druck (1991); Oac et al., Org. Prep. Proc. Int. 15(3): 165–169 (1983)).
Als drittes wurde [¹⁵N]-NMR angewendet. Messungen von RS-NO-Verbindungen wurden gemäß dem Verfahren von Bonnett und Kollegen durchgeführt (Bonnett et al., JCS Perkins Trans. 1: 2261–2264 (1975), durch Bezugnahme aufgenommen). Die [¹⁵N]-NMR-Spektren wurden mit einem Brucker 500 MHz-Spektrometer, Billerica, MA, aufgenommen. Eine Deuterium-Sperre wurde mit [D]₂O bewirkt und die Spektren wurden auf ein natürliches [¹⁵N]-Verteilungsspektrum einer gesättigten Lösung von NaNO₂ bei 587 ppm bezogen. Die Spektren wurden bei 50,68 MHz aufgezeichnet und die neun Übergänge von 16k-Datenpunkten wurden mit einer 30°-Pulsweite und einer Relaxationsverzögerung von 10 Sekunden aufgezeichnet. Die Daten wurden vor der Fourier-Transformation mit einem exponentiellen 2-Hz-Linienverbreiterungsfaktor multipliziert.
Eine Bestätigung des obigen chemischen Nachweises einer Protein S-nitrosothiol-Synthese wurde durch UV-, NMR- und IR-Spektroskopie erhalten. Eine frühere Charakterisierung von S-Nitrosothiolen zeigte, dass sie UV-Absorptionsmaxima bei 320–360 nm, chemische Verschiebungen von ungefähr 750 ppm relativ zu Nitrit (Bonnett et al., JCS Perkins Trans. 1: 2261–2264 (1975)) und IR-Banden bei ungefähr 1160 cm^–1 und 1170 cm^–1 (Loscalzo et al., JPET 249: 726–729 (1989)) aufweisen.
2. Ergebnisse
In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen zeigte S-NO-t-PA ein Absorptionsmaximum bei 322 nm (1a) und eine chemische Verschiebung bei 751 ppm (relativ zu Nitrit) (1b); eine Eliminierung der chemischen Verschiebung wurde durch Probenbehandlung mit überschüssigem HgCl₂ erzielt. Außerdem steht die Gegenwart von zwei Absorptionsbanden bei 1153 cm^–1 und 1167 cm^–1 vollständig in Übereinstimmung mit der Bildung einer S-Nitrosothiolbindung (Myers et al., Nature 345: 161–163 (1990); Oac et al., Org. Prep. Proc. Int. 15(3): 165–169 (1983); Bonnett et al., JCS Perkins Trans. 1: 2261–2264 (1975)). Die quantitative Bestimmung von NO (Protein-NO und freies NO_x) in der Saville-Reaktion und die NMR-Ergebnisse, die eine einzige chemische Verschiebung zeigen, ergeben, dass das gesamte, an das Protein gebundene NO in der Form eines S-Nitrosothiols vorliegt.
2 erläutert die zeitabhängige Bildung von S-NO-t-PA. Aliquotanteile der NaNO₂ enthaltenden Lösung wurden nacheinander zur Bestimmung der -S-NO-Bindungsbildung entnommen (Schwartz, S. M., In Vitro 14: 966–980 (1978)). Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± S. D. (n = 3) angegeben. Nach 30 Minuten Behandlung mit angesäuertem NaNO₂ ist die S-Nitrosylierung im wesentlichen vollständig. Die Stöchiometrie von -S-NO/t-PA (mol/mol) ist am Reaktionsende 0,0 ± 0,1 (n = 3), wie gemäß dem Verfahren von Saville bestimmt wurde (Saville, B., Analyst 83: 670–672 (1958)). Eine Carboxyamidierung des freien Thiols von t-PA mit Iodacetamid verhindert vollständig eine Bildung von S-Nitrosothiol, wie durch dieses chemische Verfahren bestimmt wurde (Saville, B., Analyst 83: 670–672 (1958)).
2 erläutert ferner den Einfluss einer Säurebehandlung auf die amidolytische Aktivität von t-PA. In unterschiedlichen Intervallen wurden Aliquotanteile des nur mit 0,5 N HCl behandelten Enzyms neutralisiert und die amidolytische Aktivität wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats S2288 untersucht. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± S. D. (n = 3), relativ zu t-PA, das nicht mit 0,5 N HCl behandelt worden war, angegeben. Nach 30 Minuten, der Dauer der nachfolgend für die S-Nitrosothiol-Synthese herangezogenen Behandlung, ist die enzymatische Aktivität von t-PA größtenteils noch erhalten. Eine quantitative Bestimmung der S-NO-t-PA-Synthese mit authentischem EDRF wurde in gleicher Weise nach dem Verfahren von Saville durchgeführt (Saville, B., Analyst 83: 670–672 (1958)).
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 2: Synthese von S-Nitroso-BSA
A. Nitrosylierung
Im ersten Verfahren wurde eine Nitrosylierung von BSA durch 30-minütige Inkubation von BSA (200 mg/ml) mit aus einer äquimolaren NaNO₂-Menge in 0,5 N HCl (angesäuertes NaNO₂) erzeugtem NO bei Raumtemperatur bewirkt. Lösungen wurden mit gleichen Volumina 1,0 N NaOH und Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS), pH 7,4, 0,05 M L-Arginin, auf pH 7,4 titriert. Verdünnungen wurden dann nach Bedarf in TBS hergestellt.
Beim zweiten Verfahren wurde eine Nitrosylierung in mit Helium desoxygenierten Lösungen von 0,1 M Natriumphosphat (pH 7,4) durch Behandeln der Proteinlösung in Dialyseschläuchen mit authentischem NO-Gas erreicht, das 15 Minuten in das Dialysat eingeleitet wurde. Die Proteine wurden dann gegen einen großen Überschuss von 0,01 M Phosphatbuffer bei pH 7,4 dialysiert, um überschüssige Stickoxide zu entfernen.
Beim dritten Verfahren wurden Proteine mit bovinen Endothelialzellen aus der Aorta, die durch Einwirkung hoher Scherkräfte zur Sekretion von EDRF, wie in Beispiel 1 (A), stimuliert worden waren, inkubiert. Als logische Folge dieses Verfahrens wurden Proteine auch direkt mit NO-Synthase inkubiert, die aus bovinem Cerebellum isoliert worden war (Bredt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 682 (1990), durch Bezugnahme aufgenommen), wobei dies in der Gegenwart des Substrats L-Arginin und der für die Enzymaktivität erforderlichen Cofaktoren (Ca⁺⁺, Calmodulin und NADPH) erfolgte.
B. Bestätigung der S-Nitrosoprotein-Bildung
Die Bildung und Stabilität des S-Nitrosoproteins wurde durch mehrere veröffentlichte analytische Methoden bestätigt. Aus S-Nitrosothiolgruppen mit Hg²⁺ verdrängtes NO wurde durch Diazotierung von Sulfanilamid und nachfolgendes Kuppeln mit dem Chromophor N-(1-Naphthyl)-ethylendiamin untersucht (Mellion et al., Mol. Pharmacol. 23: 653 (1983); Saville, B., Analyst 83: 670 (1958). Die durch diese chemischen Verfahren bestimmte Stöchiometrie von S-NO-BSA ist in Tabelle 1 dargelegt.
Eine Bestätigung der S-Nitrosothiol-Bindungsbildung in Proteinen wurde mittels Spektrophotometrie erhalten; S-Nitrosothiole besitzen zwei Absorptionsmaxima bei 320–360 nm und ungefähr 550 nm (Oac et al., Organic Prep. und Proc. Int. 15: 165 (1983); Ignarro et al., J. Pharmacol., Exp. Ther. 218: 739 (1981), Mellion et al., Mol. Pharmacol. 23: 653 (1983); Loscalzo, J., Clin. Invest. 76: 966 (1985)).
Als weiteres, spezifischeres Messverfahren für die Protein-S-Nitrosylierung wurde die [¹⁵N]-NMR Spektroskopie eingesetzt. BSA wurde mit Na[¹⁵N]O₂ S-nitrosyliert. Das [¹⁵N]-NMR-Spektrum der erhaltenen Spezies ist in 3 dargestellt. 3 zeigt das [¹⁵N]-NMR-Spektrum von [¹⁵N]-markiertem S-Nitroso-BSA. Die chemische Verschiebung für S-Nitroso-BSA betrug 703,97, was unter den gleichen Bereich wie bei anderen S-Nitrosothiolen (z. B. S-Nitroso-L-cystein), die unter ähnlichen Bedingungen hergestellt worden waren, fällt (Bonnett et al., J. Chem. Soc. Perkins Trans. 1: 2261 (1975)). Das Spektrum wurde bei 50,68 MHz aufgenommen und die 9 Übergänge von 16 K-Datenpunkten wurden mit einer 30°-Pulsweite und einer Relaxationsverzögerung von 2,5 Sekunden aufgezeichnet. Die Daten wurden vor der Fourier-Transformation mit einem exponentiellen 2-Hz-Linienverbreiterungsfaktor multipliziert. Die Region von 590 bis 810 ppm ist dargestellt.
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 3: Synthese von S-Nitroso-cathepsin B
Die Nitrosylierung von Cathepsin und die Bestimmung der Bildung von S-Nitrosothiol wurden gemäß den in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren vorgenommen. Die Stöchiometrie der S-Nitrosothiol/Protein-Moleküle für Cathepsin ist in Tabelle 1 dargestellt.
Beispiel 4: Synthese von S-Nitroso-lipoprotein
Die Synthese wurde durch Nitrosylieren von gereinigtem Lipoprotein geringer Dichte (LDL) gemäß den in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Bildung von S-Nitrosoprotein wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 2 bestätigt. Die Stöchiometrie der S-Nitrosothiol/Protein-Moleküle für LDL ist in Tabelle 1 aufgeführt.
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 5
Synthese von S-Nitroso-immunoglobulin
Die Synthese wurde durch Nitrosylierung von gereinigtem gamma-Globulin (Sigma) gemäß den in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Bildung von S-Nitroso-protein wurde gemäß den Verfahren von Beispiel 2 bestätigt. Die Stöchiometrie der S-Nitrosothiol/Protein-Moleküle für Immunoglobulin ist in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle 1 Synthese von S-Nitroso-protein

-S-NO/Protein (mol/mol)

Rinderserumalbumin 0,85 ± 0,04

t-PA 0,88 ± 0,06

Cathepsin B 0,90 ± 0,02

humanes Plasma 0,87 ± 0,02

Immunoglobulin 0,35 ± 0,01

Lipoprotein (LDL) 1,80
Legende
Die Stöchiometrie für die einzelnen -S-NO/Protein-Molverhältnisse ist in der Tabelle angegeben. Bei den Werten handelt es sich um Mittelwerte ± Standardabweichungen für 3 bis 6 Bestimmungen.
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 6: Nachweis der thrombolytischen, Antiblutplättchen- und vasodilatatorischen Wirkung von S-NO-t-PA
A. Thrombolyse
1. Fibrinogenbindung
Die Bindung von t-PA und S-NO-t-PA an Fibrinogen wurde unter Verwendung von Polystyrol-Mikrotiter-Platten (Flachboden, hochgradig bindende EIA-Platten mit 96 Vertiefungen, Katalog Nr. 3590, Costar, Cambridge, MA) gemessen. Die Vertiefungen wurden mit Fibrinogen (0,08 μg/μl) beschichtet. Die verbliebenen Bindungsstellen wurden mit 2% Rinderserumalbumin besetzt. Die quantitative Bestimmung der t-PA-Bindung erfolgte unter Verwendung eines mit Meerrettichperoxidase verknüpften Schaf-anti-Maus-Antikörpers in einem kolorimetrischen Test in Gegenwart von o-Phenylendiamin, 0,014% H₂O₂. Die Farbänderung wurde spektrophotometrisch mit einem Dynatech MR500 Card Reader-Gerät (Dynatech, Chantilly, VA) bei 490 nm gemessen.
Die Bindung von t-PA ist reversibel und spezifisch. Eine Sättigung erfolgt bei 1500–3000 nM. Bei der Sättigung sind 18 ng t-PA pro Vertiefung gebunden (0,105 Mol t-PA pro Mol Fibrinogen) mit einem geschätzten K_D-Wert im Bereich von 15–650 nMol. Die Bindung von t-PA und S-NO-t-PA wurde mittels ELISA über den Konzentrationsbereich von 150–1500 nMol unter Verwendung einer Mischung, die sechs murine monoklonale anti-t-PA-Antikörper enthielt, quantitativ bestimmt.
a. Vergleich von t-PA und S-NO-t-PA
Für die Bindung von t-PA an Fibrinogen) ist die relative "Fibrin-Spezifität" des Enzyms im Vergleich zu bestimmten anderen Plasminogenaktivatoren verantwortlich (Loscalzo et al., New Engl. J. Med. 319(14): 925–931 (1989); Vaughan et al., Trends Cardovas. Med. Jan/Feb: 1050–1738 (1991)). Die Wirkung einer S-Nitrosylierung auf diese funktionelle Eigenschaft des Enzyms wurde daher untersucht. Die Bindungsisothermen für t-PA und seine S-nitrosylierten Derivate waren bei 2-Weg-ANOVA nicht signifikant voneinander verschieden. Daher wurden diese Daten einer einzigen "Best-curve-fit"-Bindungsisotherme (4) unterworfen. Aus einer Scatchard-Analyse ergab sich der ermittelte scheinbare D_D-Wert von S-NO-t-PA für oberflächengebundenes Fibrinogen zu 450 nm, was in den für t-PA angegebenen Bereich fällt (Ranby, M., Biochim. Biophysica Acta 704: 461–469 (1982)).
2. Messung von enzymatischer Aktivität
Die amidolytischen Aktivitäten von t-PA und seinen S-nitrosylierten Derivaten wurden unter Verwendung des relativ spezifischen chromogenen Substrats S2288 gemessen. Die Substrathydrolyse wurde spektrophotometrisch bei 405 nm mit einem Gilford Response-UV/Vis-Spectrophotometer (CIBA-Corning, Oberlin, OH) gemessen. Die Aktivität wurde bei 25°C in TBS unter Verwendung von variierenden Substratkonzentrationen von 0,1–2,0 mM und von t-PA in einer Konzentration von 100 nM gemessen. Kinetische Parameter wurden aus Anfangsgeschwindigkeiten durch Analyse von doppelt reziproken Diagrammen bestimmt. Die Bestimmung der Hemmung der enzymatischen Aktivität von t-PA und S-NO-t-PA durch PAI-1 wurde bei einer Enzymkonzentration von 10 nM und bei einem Molverhältnis von t-PA zu aktivem PAI-1 von 1,0 durchgeführt. Der Hemmgrad wurde relativ zu den Anfangsgeschwindigkeiten in Abwesenheit des Inhibitors bestimmt.
Beim gekuppelten Enzymtest wurden t-PA- und S-NO-t-PA-Aktivitäten unter Verwendung des nativen Substrats S2251 untersucht. In ausgewählten Experimenten wurde die Fibrinogenstimulierung der enzymatischen Aktivität bei Fibrinogenkonzentrationen von 0,1 mg/ml untersucht. Die Substrathydrolyse wurde spektrophotometrisch mit einem Dynatech MR5000 Card Reader-Gerät (Dynatech, Chantilly, VA) in TBS, pH 7,4 bei 25°C gemessen. Die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit wurde aus der Steigung der Absorptionskurve (bei 405 nm)/Zeit (Ranby, M., Biochim. Biophysica Acta 704: 461–469 (1982) unter Verwendung von Glu-Plasminogenkonzentrationen von 0,1–10 μM bei einer S2251-Konzentration von 0,8 mM bestimmt. Kinetische Parameter wurden aus den Anfangsgeschwindigkeiten durch doppelt reziprokes Auftragen bestimmt.
a. Vergleich von t-PA und S-NO-t-PA
Die amidolytische Aktivität von t-PA und S-NO-t-PA wurden zunächst gegen das chromogene Substrat S2288 verglichen. Aus einer Analyse des doppelt reziproken Diagramms wird deutlich, dass die kinetischen Parameter (K_m und V_max) und die katalytische Effizienz (K_cat/K_m) dieser Moleküle im wesentlichen identisch ist, wie in 5a dargestellt. Die Werte dieser kinetischen Konstanten sind in Tabelle 2 angegeben.
Die Auswirkung der S-Nitrosylierung auf die Fähigkeit von t-PA, sein physiologisches Substrat, Plasminogen, zu aktivieren, wurde in einem gekuppelten Enzymtest in Gegenwart und in Abwesenheit von Fibrinogen bestimmt. Wie aus dem Lineweaver-Burk-Diagramm (5b) und den abgeleiteten kinetischen Parametern (Tabelle 2) ersichtlich ist, besitzt S-NO-t-PA einen K_m-Wert für das Substrat ähnlich wie "Wildtyp"-t-PA. S-NO-t-PA besitzt jedoch einen geringfügig, aber signifikant größeren V_max-Wert, was eine katalytische Wirksamkeit ergibt, die 23% größer als die von nativem t-PA ist.
3. Diskussion
Sowohl Fibrin als auch Fibrinogen erhöhen die Aktivierungsgeschwindigkeit von Plasminogen durch t-PA. Die erhöhte enzymatische Aktivität von t-PA ist das Ergebnis seiner Fähigkeit, Fibrinogen) direkt zu binden, was zu einer Konformationsänderung, entweder bei t-PA oder Plasminogen führt, die die Wechselwirkung von t-PA mit seinem Substrat begünstigt (Loscalzo et al., New Engl. J. Med. 319(14): 925–931 (1989)).
Die Folgen einer S-Nitrosylierung auf diese wichtigen funktionellen Eigenschaften von t-PA wurden daher in einer Vergleichsanalyse mit t-PA in dem gekuppelten Enzymtest untersucht. Die Ergebnisse, die in 6 zusammengefasst sind, deuten darauf hin, dass S-NO-t-PA an Fibrinogen bindet, dass als Ergebnis dieser Bindung seine enzymatische Aktivität erhöht wird und dass in Gegenwart von physiologischen (1 μM) Plasminogenkonzentrationen der Stimulationsgrad dem von "Wildtyp"-t-PA äquivalent ist. Bei niedrigeren Plasminogenkonzentrationen (0,1 μM) war die Fibrinogenstimulierung von S-NO-t-PA 3,5-fach größer als von t-PA (1 μM) (p < 0,05). Die absoluten Geschwindigkeiten der Plasminogenaktivierung waren wiederum für S-NO-t-PA geringfügig größer (vergl. oben).
t-PA wird umgehend durch das damit verwandte Plasmaserpin, PAI-1, gehemmt (Loscalzo et al., New Engl. J. Med. 319(14): 925–931 (1989); Vaughan et al., Trends Cardiovasc. Med. Jan/Feb: 1050–1738 (1991)). Dadurch, dass es als Pseudosubstrat dient, reagiert PAI-1 stöchiometrisch mit t-PA unter Bildung eines inaktiven Komplexes. PAI-1 war gleichermaßen beim direkten chromogenen Test mit S2288 wirksam bei der Hemmung der hydrolytischen Aktivität von t-PA und S-NO-t-PA (n = 3; P = NS). Eine S-Nitrosylierung von t-PA scheint daher nicht dessen Wechselwirkung mit PAI-1 zu verändern.
B. Blutplättchenhemmung
1. Zubereitung von Blutplättchen
Venöses Blut, das einer Antikoagulationsbehandlung mit 1 mM Trinatriumcitrat unterzogen worden war, wurde von freiwilligen Versuchspersonen erhalten, die für wenigstens zehn Tage keine Acetylsalicylsäure eingenommen hatten. Blutplättchenreiches Plasma (PRP) wurde durch 10-minütiges Zentrifugieren mit 150 g bei 25°C hergestellt. Blutplättchenzählungen wurden mit einem Coulter Counter (Modell ZM; Coulter Electronics, Hialeah, FL) durchgeführt.
2. Blutplättchen-Gelfiltration und Aggregation
Blutplättchen wurden einer Gelfiltration an einer 4 × 10 cm-Säule mit Sepharose 2B in Tyrode Hepes-Puffer unterworfen (vergl. Hawiger et al., Nature 2831: 195–198 (1980), durch Bezugnahme aufgenommen). Die Blutplättchen wurden typischerweise in einer Konzentration von 1,5 × 10⁸/ml suspendiert und innerhalb von 30 Minuten nach der Zubereitung verwendet. Die Blutplättchenaggregation wurde unter Anwendung eines üblichen nephelometrischen Verfahrens aufgezeichnet (Born, et al., J. Physiol. 168: 178–195 (1963), durch Bezugnahme aufgenommen), wobei 0,3 ml-Aliquotanteile der gelfiltrierten Blutplättchen bei 37°C inkubiert und mit 1000 U/min in einem PAP-4-Aggregometer (Biodata, Hatboro, PA) inkubiert wurden. Gelfiltrierte Blutplättchen wurden bis zu 45 Minuten mit t-PA oder S-NO-t-PA vorinkubiert und Aggregationen wurden mit 5 μM ADP oder 0,025 U/ml Thrombin induziert.
Die Aggregationen wurden durch Messen der maximalen Geschwindigkeit oder des Ausmaßes der Lichttransmission gemessen und als auf Kontrollaggregationen normierter Wert angegeben.
3. Cyclo-Nucleotid-Tests
Die Antiblutplättchenwirkungen von S-Nitrosothiolen werden durch cyclisches GMP vermittelt. Messungen von cGMP wurden durch Radioimmunoassays durchgeführt. Gelfiltrierte Blutplättchen wurden 180 Sekunden mit S-NO-t-PA (9 μM) vorinkubiert. Entsprechende Kontrollen wurden mitgeführt. Reaktionen wurden durch Zugabe von 10% Trichloressigsäure beendet. Eine Acetylierung der Proben mit Essigsäureanhydrid wurde zur Erhöhung der Empfindlichkeit des Assays herangezogen.
Mit Blutplättchen für 180 Sekunden inkubiertes S-NO-t-PA induzierte eine 85%-ige Erhöhung des intrazellulären, cyclischen GMP über die Grundkonzentrationen in Gegenwart von t-PA (p < 0,01). Die Erhöhung von durch S-NO-t-PA induziertem, intrazellulärem Blutplättchen-cGMP wurde durch Vorinkubation der Blutplättchen mit dem Guanylat-cyclase-Inhibitor Methylenblau (10 μM, 10 Minuten (n = 3) (7) vollständig verhindert.
4. Diskussion
Die Wirkungen von S-NO-t-PA wurden mit einer gelfiltrierten Blutplättchenzubereitung untersucht. Bei diesen Experimenten besaß aus NaNO₂ erzeugtes NO_x keine signifikante Wirkung auf das Ausmaß der Blutplättchenaggregation (Verlauf nicht dargestellt). Die Mittelwerte der Hemmung durch S-NO-t-PA sind in Tabelle 4 angegeben.
8 erläutert die Blutplättchenhemmung, die durch S-NO-t-PA (333 nM) induziert wurde, das mit EDRF synthetisiert worden war. Bei diesen Untersuchungen wurde t-PA mit Endothelialzellen behandelt, die zur Sekretion von EDRF 15 Minuten stimuliert worden waren, wonach die Bildung von S-NO-t-PA gemäß dem Verfahren von Saville nachgewiesen wurde (Saville, B., Analyst 83: 670–672 (1958)). S-NO-t-PA wurde dann zehn Minuten mit Blutplättchen vorinkubiert, wonach eine Aggregation mit 5 μM ADP erfolgte. In Abwesenheit von t-PA besaß ein Ausfluss von Endothelialzellen, die zur Sekretion von EDRF stimuliert worden waren, keine signifikante Wirkung auf die Blutplättchenaggregation. S-NO-t-PA hemmte die Blutplättchenaggregation gegenüber 5 μM ADP in dosisabhängiger Weise, wobei eine Hemmungsrate von 50 ± 16% (Mittelwert ± S. D.) und ein Ausmaß der Aggregation bei 1,4 μM S-NO-t-PA beobachtet wurde (n = 4; p < 0,001 gegen eine Kontrolle). Die Hemmung einer durch ADP (5 μM) oder Thrombin (0,024 U/ml) induzierten Blutplättchenaggregation war bei Konzentrationen von S-NO-t-PA im pharmakologischen Bereich von 15–150 nM nachweisbar, wie in den erläuternden Aufzeichnungen der 8(a) und (b) und in Tabelle 4 gezeigt ist. Um die potentielle biologische Bedeutung von RS-NOs und die vergleichbare Bioaktivität von S-NO-t-PA, unabhängig von dessen Syntheseverfahren weiter zu belegen, ist die Hemmung der Blutplättchenaggregation durch S-NO-t-PA (333 nM) in 8(c) erläutert, wobei das S-NO-t-PA mit authentischem EDRF synthetisiert worden ist.
C. Vasodilatation
1. Vorbereitung der Blutgefäße
Weiße, weibliche Neuseelandkaninchen mit 3–4 kg Gewicht wurden mit 30 mg/kg Natriumpentobarbital intravenös anästhesiert. Die absteigenden Thoraxaorten wurden isoliert und sofort in eine kalte physiologische Salzlösung (Krebs) gegeben (mM): NaCl, 118; KCl, 4,7; CaCl₂, 2,5; MgSO₄, 1,2; KH₂PO₄, 1,2; NaHCO₃, 12,5; und D-Glucose, 11,0. Die Gefäße wurden von anhaftendem Bindegewebe gereinigt und das Endothel durch vorsichtiges Reiben mit einem in das Lumen eingeführten Tupferträger entfernt, wonach das Gefäß in 5 mm-Ringe geschnitten wurde. Die Ringe wurden auf Bügel aufgebracht und an Transducer (Modell FT03C Grass Instruments, Quincy, MA) angeschlossen, mit denen die Veränderungen der isometrischen Spannung aufgezeichnet wurden.
2. Bioassay
Proben wurden zu einem Standardbioassay gegeben, bei dem die Gefäßringe in Glaskammern aufgehängt wurden, die 7 ml oxygenierten Krebs-Puffer in einem Standardbioassay enthielten (Cook et al., Am. J. Physio. 28: H804 (1989), durch Bezugnahme aufgenommen). Anhaltende Kontraktionen auf 2 g Spannung wurden mit 1 μM Epinephrin induziert, wonach die Wirkungen von t-PA und S-NO-t-PA untersucht wurden. Bei bestimmten Experimenten wurde der Guanylatcyclase-Inhibitor Methylenblau mit den Gefäßringen 15 Minuten vor der Einleitung der Kontraktionen vorinkubiert.
3. Vaskuläre Relaxationen
Wie in den erläuternden Aufzeichnungen von 9 dargestellt, induziert S-NO-t-PA bei pharmakologischen Konzentrationen Relaxationen, die nicht mit äquimolaren Mengen des Reaktanten-Proteinthiols oder von NO alleine zu vergleichen waren. Ferner wurden in Übereinstimmung mit dem Mechanismus anderer Nitro(so)-Vasodilatatoren die Relaxationen durch den Guanylat-cyclase-Inhibitor Methylenblau, abgeschwächt. Tabelle 3 zeigt die Wirkung von S-NO-t-PA auf die Gefäßrelaxation bei mehreren solcher Experimente. Tabelle 2 Kinetische Parameter der S2288-Hydrolyse und GLU-Plasminogen (S2251)-Aktivierung durch t-PA und S-NO-t-PA
Tabelle 3 Gefäßrelaxation

* Relaxationen auf S-NO-t-PA waren signifikant stärker als solche, die durch NaNO₂ oder t-PA induziert worden waren, wie in dieser Tabelle für gleiche Konzentrationen dargestellt.

Mittelwerte (±S. D.; n = 4) der durch S-NO-t-PA induzierten Gefäßrelaxation und die durch äquivalente Konzentrationen von NO (erzeugt aus angesäuerten NaNO₂) und t-PA induzierte Relaxation. Tabelle 4 Blutplättchenhemmung % des normierten Aggregationsausmaßes

* p < 0,025 im Vergleich mit t-PA;
✝ p < 0,01 im Vergleich mit t-PA.

Mittelwerte (±S. D.; n = 13–17) der durch S-NO-t-PA vermittelten Blutplättchenhemmung gegenüber beiden ADP-induzierten Blutplättchenaggregationen. NO aus NaNO₂ (150 nM) besaß bei diesen Experimenten keine signifikante Wirkung auf die Blutplättchenhemmung (0,98 ± 0,11, n = 5).
Statistik
Die Bestimmung der statistischen Signifikanz wurde unter Verwendung eines nicht paarweisen t-Tests oder einer 2-Weg-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von einem Newman-Keul-Vergleich bestimmt.
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 7:
Nachweis der blutplättchenhemmenden und gefäßerweiternden Wirkung von S-Nitroso-BSA
A. Blutplättchenhemmung
Der Einfluss von S-Nitroso-BSA auf die Blutplättchenaggregation wurde untersucht, wobei ein gemäß Literaturangaben gelfiltriertes Blutplättchenpräparat (Hawiger et al., Nature 2831: 195 (1980)) verwendet wurde und in einer Konzentration von 150 000 Blutplättchen/μl in HEPES-Puffer, pH-Wert 7,35, suspendiert wurde. S-NO-BSA wurde 10 Minuten bei 37°C mit Blutplättchen in einem PAP-4-Aggregometer (BioData, Hatboro, PA) inkubiert, wonach Aggregationen mit 5 μM ADP induziert wurden. Aggregationen wurden quantitativ bestimmt, indem das Ausmaß der Veränderung der Lichttransmission gemessen wurde. Die Angaben erfolgten als normierte Werte im Vergleich zu Kontrollaggregationen.
Bei Kontrollexperimenten hatten weder NaNO₂ in Konzentrationen bis zu 15 μM noch der Ausfluß von Zellen, die zur Sekretion von EDRF in Abwesenheit von BSA simuliert worden waren, einen signifikanten Einfluss auf den Gefäßtonus oder die Blutplättchenaggregation. Sämtliche untersuchten, nicht-nitrosylierten Proteine hatten bei keiner der getesteten Konzentrationen einen signifikanten Einfluss auf die Blutplättchenaggregation.
Eine dosisabhängige Hemmung der ADP-induzierten Blutplättchenaggregation wurde im Bereich von 150 nM bis 15 μM S-Nitroso-protein beobachtet. Eine nitrosylierte Protein-Plasmafraktion wirkte noch stärker, da sie eine Hemmung bei geschätzten -S-NO-Konzentrationen von 150 pM zeigte. S-Nitroso-proteine, die mit angesäuertem NaNO₂, mit NO-Gas oder durch Einwirkung von Rinder-Aorta-Endothelialzellen, die zur Sekretion von EDRF stimuliert worden waren, synthetisiert wurden, waren im wesentlichen gleich stark, wie für S-Nitroso-BSA in 10 gezeigt ist. Ferner wurde die blutplättchenhemmende Wirkung von S-Nitroso-BSA (1,4 μM) sowohl in blutplättchenreichem Plasma als auch in Vollblut (im letztgenannten Fall durch Impedanz-Aggregometrie bestimmt) bestätigt (Chong et al., Drug Met. and Disp., 18: 61 (1990); durch Bezugnahme aufgenommen).
Repräsentative Mittelwerte und erläuternde Aggregationsaufzeichnungen für S-Nitroso-BSA sind in 10 bzw. 11a dargestellt. Eine Carboxyamidierung von Proteinthiolen mit Iodacetamid oder eine Vorbehandlung von Blutplättchen mit dem Guanylat-cyclase-Inhibitor Methylenblau beseitigte die Antiblutplättchen-Wirkungen von S-Nitroso-proteinen (11a). Ferner korrelierten die Antiblutplättchen-Wirkungen mit den Wirkungen für die Relaxation der glatten Gefäßmuskulatur.
B. Vasodilatation
1. Verfahren
Die gefäßerweiternden Wirkungen von S-Nitroso-BSA wurden in einem üblichen biologischen Test unter Verwendung von Kaninchen-Aortastreifen (von Endothel befreit) in Krebs-Puffer, pH-Wert 7,5, bei 37°C geprüft, wie in Beispiel 6 beschrieben wurde.
2. Ergebnisse
Dosisabhängige Relaxationen wurden im Bereich von 15 nM bis 15 μM S-Nitrosoproteinen beobachtet. Repräsentative Mittelwerte für S-Nitroso-BSA sind in 10 dargestellt. S-Nitroso-proteine, die mit angesäuertem NaNO₂, mit NO-Gas oder durch Einwirkung von Rinder-Aorta-Endothelzellen, die zur Sekretion von EDRF stimuliert worden waren, synthetisiert worden waren, wirkten im wesentlichen gleich stark. Dies wird wieder für S-Nitroso-BSA in 10 beispielhaft dargelegt.
Die Relaxationsreaktion auf S-Nitroso-BSA-Proteine unterschied sich von der Reaktion, die allgemein EDRF, authentischem NO und den relativ labilen niedermolekularen, biologischen S-Nitrosothiolen zugeschrieben wird, für die alle eine rasche, vorübergehende Relaxation charakteristisch ist. Im ausgeprägten Gegensatz dazu induzierte S-Nitroso-BSA eine weniger rasche, aber dauerhaftere Relaxationsreaktion (11b), was bestätigt, dass es als Vasodilatator mit lange anhaltender Wirkung dient.
Ferner benötigte BSA, das mit NO-Synthase in Gegenwart der für die Enzymaktivität erforderlichen Cofaktoren (Calmodulin, NADPH, Ca⁺⁺) inkubiert wurde, eine von L-Arginin abhängige Fähigkeit zur Induktion einer dauerhaften Vasorelaxation, die für S-Nitroso-proteine charakteristisch ist.
Die im biologischen Test bestimmte Halbwertszeit von S-Nitroso-BSA entsprach chemischen Messungen der Halbwertszeit und beträgt etwa 24 Stunden. Diese Halbwertszeit ist signifikant länger als die Halbwertszeiten von niedermolekularen S-Nitrosothiolen und lässt darauf schließen, dass das zeitliche Profil der Relaxationsreaktion für S-Nitrosothiole mit der Labilität der S-NO-Bindung korreliert.
Eine Blockade von Proteinthiolen durch Carboxyamidierung mit Iodacetamid verhinderte die S-Nitrosothiol-Bildung gemäß chemischer Bestimmung und machte die Proteine, die NO oder EDRF ausgesetzt waren, biologisch inaktiv (11b). Übereinstimmend mit dem Mechanismus von anderen Nitro(so)vasodilatatoren (Ignarro, L. J., Circ., Res. 65: 1 (1989)) wurden Relaxationen durch Methylenblau einem Inhibitor von Guanylat-cyclase, beseitigt (11a). Dieser Mechanismus wurde durch den Nachweis bestätigt, dass S-Nitroso-BSA (18 μM) einen 3,5-fachen Anstieg (n = 2) von cyclischem GMP gegenüber Grundkonzentrationen relativ zu BSA allein in gezüchteten RFL-6-Lungen-Fibroblasten mit einem Gehalt an löslicher Guanylat-cyclase, die ausschließlich gegenüber NO empfindlich ist (Forstermann et al., Mol. Pharmacol. 38: 7 (1990)), induziert. Eine Stimulation von Guanylat-cyclase durch S-Nitroso-BSA wurde durch Methylenblau abgeschwächt.
10 zeigt die dosisabhängige Relaxation der glatten Gefäßmuskulatur und die Hemmung der Blutplättchenaggregation mit S-Nitroso-BSA (S-NO-BSA). Dosis-Wirkungs-Kurven für die Gefäßrelaxation (
) und die Blutplättchenhemmung (•-•) wurden mit S-NO-BSA, das mit äquimolaren Mengen an NO (erzeugt aus angesäuertem NaNO₂ gemäß den Angaben im Text und anschließend auf pH-Wert 7,4 neutralisiert) hergestellt worden war. Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (n = 6,18) angegeben. Die leeren Symbole geben Experimente bei den Gefäß (⌷)- und Blutplättchen (o)-Bioassays wieder, wobei S-NO-BSA durch Einwirkung von Rinder-Aorta-Endothelzellen, die zur Sekretion von EDRF stimuliert worden waren, auf BSA synthetisiert wurde. Diese Daten sind in Form von Mittelwerten ± Standardabweichung (n = 3–8) angegeben, wobei die Fehlerbalken der X-Achse die Varianz der Konzentration von S-NO-BSA, das aus EDRF erzeugt worden ist, und die Fehlerbalken der Y-Achse die Varianz der Reaktion im biologischen Test angeben.
Bei den Gefäßexperimenten werden die Relaxationen auf S-NO-BSA als Prozentwerte des durch 1,0 μM Norepinephrin induzierten Tonus angegeben.
Eine Infusion von S-NO-BSA bei anästhetisierten Hunden gemäß aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren führte zu einer verlängerten Abnahme des Blutdrucks, die nicht in Übereinstimmung mit niedermolekularen S-Nitrosothiolen stand. Ferner erhöhte diese Verbindung die koronare Durchblutung, wodurch die Myokarddurchblutung erhalten blieb. Bei einem Hundemodell mit einem subtotalen koronaren Arterienverschluss hemmte S-NO-BSA die von Blutplättchen abhängige, cyclische Thrombusbildung und verlängerte signifikant die Blutungszeiten. Diese äußerst starken, jedoch reversiblen in vivo-Antiblutplättcheneigenschaften sind bei klassischen Nitraten nicht gegeben. Ferner steht die Verbesserung der koronaren Durchblutung in ausgeprägtem Gegensatz zu der klinisch eingesetzten Nitrosoverbindung Nitroprussid, die nachteilige Einflüsse auf die koronare Durchblutung hat. Wie in den 12–14 dargestellt, wird die Konstellation einer Antiblutplättchenwirkung, einer langen Wirkungsdauer und einer erhöhten koronaren Durchblutung durch andere Nitrosoverbindungen nicht erreicht. Somit weisen S-Nitroso-Proteine ganz besondere hämodynamische und bioaktive Profile auf.
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 8: Nachweis der gefäßerweiternden Wirkung von S-Nitroso-cathepsin
Die Wirkung von S-NO-Cathepsin wurde gemäß den in Beispiel 7a beschriebenen Verfahren untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten, dass S-NO-Cathepsin in einer Konzentration von 150 nM bis 1,5 μM die Blutplättchenaggregation hemmt.
Die Wirkung von S-NO-Cathepsin auf die Vasodilatation wurde gemäß den in Beispiel 7b beschriebenen Verfahren untersucht. Wie in den in 12 dargestellten Verlaufsuntersuchungen gezeigt, induziert S-NO-Cathepsin in einer Konzentration von 150 nM bis 1,5 μM eine Gefäßrelaxation, die durch äquimolare Mengen eines nicht-nitrosylierten Cathepsins nicht erreicht werden.
Beispiel 9: Nachweis der blutplättchenhemmenden Wirkung und gefäßerweiternden Wirkung von S-Nitroso-lipoprotein
Der Einfluss von S-NO-LDL auf die Blutplättchenaggregation wurde gemäß den in Beispiel 7a beschriebenen Verfahren untersucht. Die Aggregationen wurden quantitativ bestimmt, indem das Ausmaß der Veränderung der Lichtdurchlässigkeit gemessen wurde und als normierter Wert in bezug zu Kontrollaggregationen angegeben wurde. Wie in den in 13 dargestellten Verlaufsuntersuchungen gezeigt, ist die Blutplättchenaggregation in einer Konzentration von 1 μM S-NO-LDL nachweisbar.
Der Einfluss von S-NO-LDL auf die Gefäßerweiterung wurde gemäß den in Beispiel 7b beschriebenen Verfahren untersucht. Wie in 14 dargelegt, induziert S-NO-LDL eine Gefäßrelaxation, die durch äquimolare Mengen an nicht-nitrosyliertem LDL nicht erreicht wird.
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 10: Nachweis der Blutplättchenhemmwirkung und gefäßerweiternden Wirkung von S-Nitroso-immunoglobulin
Der Einfluss von S-NO-Ig auf die Blutplättchenaggregation wurde gemäß den in Beispiel 7a beschriebenen Verfahren untersucht. Die Aggregationen wurden quantitativ durch Messen des Ausmaßes der Veränderung der Lichttransmission bestimmt und als normierte Werte relativ zu Kontrollaggregationen angegeben. Wie in 15 gezeigt, ist die Hemmung der Blutplättchenaggregation bei S-NO-Ig-Konzentrationen im pharmakologischen Bereich von 150 nM bis 1,5 μM nachweisbar.
Der Einfluss von S-NO-Ig auf die Gefäßerweiterung wurde gemäß den in Beispiel 7b beschriebenen Verfahren untersucht. Wie in 15 gezeigt, induziert S-NO-Ig bei Konzentrationen im Bereich von 150 nM bis 1,5 μM eine Relaxation, die durch äquimolare Mengen von Immunoglobulin allein nicht erreicht wird.
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 11: Durch S-Nitroso-BSA hervorgerufene Relaxation der glatten Luftwegmuskulatur
1. Materialien
Glutathion, L-Cystein, DL-Homocystein, D-Penicillin, Hämoglobin (Rind), Methylenblau und Medium 199-Sets wurden von der Firma Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, bezogen. N-Acetylcystein wurde von der Firma Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, bezogen. Captopril wurde freundlicherweise von Dr. Victor Dzau bereitgestellt. Natriumnitrit, Histamin und Methacholin wurden von der Firma Fisher Scientific, Fairlawn, NJ, bezogen. Leukotrien D₄ wurde von der Firma Anaquest, BOC Inc., Madison, WI, bezogen. Ein antibiotisch/antimykotisches Gemisch (10 000 U/ml Penicillin G-natrium, 10 000 mg/ml Streptomycinsulfat, 25 mg/ml Amphotericin B) wurde von der Firma Gibco Laboratories, Grand Island, NY, bezogen. Radioimmunoassay-Testpackungen für die Bestimmung von cyclischem GMP wurden von der Firma New England Nuclear, Boston, MA, bezogen.
2. Präparation der Luftwege
Männliche Hartley-Meerschweinchen (500–600 g) wurden durch Inhalation von Enfluran betäubt, um eine chirurgische Anästhesieebene zu erreichen. Die Luftröhre wurde herausgeschnitten und in Krebs-Henseleit-Puffer (mM) gebracht: NaCl 118, KCl 5,4, NaH₂PO₄ 1,01, Glucose 11,1, NaHCO₃ 25,0, MgSO₄ 0,69, CaCl₂ 2,32, pH-Wert 7,4. Die Luftwege wurden sodann von umgebenden Fett- und Bindegewebe befreit und in Ringe von 2–4 mm Durchmesser zerschnitten. Die Luftröhrenringe wurden in steriles Medium 199 mit einem Gehalt an 1% des antibiotisch/antimykotischen Gemisches in einer Atmosphäre von 5% CO₂, 45% O₂, 55% N₂ gegeben und 48 Stunden in Gewebekultur gehalten. Die Experimente wurden ferner an humanen Luftwegen, die nach dem gleichen Verfahren isoliert worden waren, durchgeführt.
3. Bioassay
Luftröhrenringe wurden an Bügeln befestigt und an Transducer (Modell FT03C Grass) angeschlossen, mit denen Veränderungen der isometrischen Spannung gemessen wurden. Die Ringe wurden sodann in 10 cm³ oxygeniertem (95% O₂, 5% CO₂) Puffer suspendiert. Die Luftwegringe wurden 60 Minuten unter einer Last von 1 g äquilibriert und sodann zweimal durch Behandlung mit 100 μM Methacholin vorbehandelt. Die Ringe wurden mit verschiedenen Agonisten kontrahiert, und zwar in Konzentrationen, die so festgelegt waren, dass 50% (±16% S. D.) des maximalen Tonus erreicht wurde, wonach die Wirkung von S-NO-BSA bestimmt wurde. In ausgewählten Experimenten wurden die Relaxationsreaktionen in Gegenwart von Hämoglobin oder nach einer 30-minütigen Voreinwirkungszeit von Methylenblau auf die Ringe bestimmt.
4. Ergebnisse
Wie in 17 dargelegt, stellt S-NO-BSA ein starkes Relaxationsmittel der glatten Luftwegmuskulatur dar, da es in einer Konzentration von 0,01 μM eine 50%-ige Relaxation und bei einer Konzentration von 10 μM eine über 50%-ige Relaxation hervorruft.
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 12: Hemmung der enzymatischen Aktivität von Cathepsin B durch Nitrosylierung
Die enzymatische Aktivität von S-NO-Cathepsin B wurde gegen das chromogene Substrat S2251 beim pH-Wert 5 in Natriumacetatpuffer gemessen. Die S-Nitrosylierung führte zu einem Verlust von enzymatischer Aktivität.
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 13: Nitrosylierung von aromatischen Aminosäuren
1. Verfahren
a. Herstellung von Nitroso-tyrosin
50 mmol L-Tyrosin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) wurden in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst. 250 mmol Na¹⁵NO₂ (Natrium N-[15]-nitrit; MSD Isotopes, Merck Scientific, Rahway, NJ) wurden in 0,5 ml 1 N HCl (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) gelöst und sofort unter Rühren mit einem Vortex-Rührer in die wässrige Tyrosinlösung gegeben. Die Lösung wurde verschlossen und 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen.
NMR-Messungen wurden folgendermaßen durchgeführt:

(a) ¹⁵N-NMR: D₂O wurde zugesetzt und die Messungen wurden sofort durchgeführt.
(b) ¹H-NMR: Nach Beendigung der Aufnahme des ¹⁵N-NMR-Spektrums wurde die Lösung entnommen und in einen kleinen Rundkolben gebracht. Nach Entfernen des Wassers unter Vakuum wurde D₂O zum trockenen, gebrochenweißen Feststoff gegeben (dieses Mal als Lösungsmittel). Die Messungen wurden sofort durchgeführt.
(c) IR-Spektroskopie: Proben für die Fourier-Transformations-IR-Spektroskopie (FTIR) wurden durch Entfernung von Wasser (wie unter (b)) und anschließende Bildung eines Nujol-Flüssigpräparats unter Verwendung von Mineralöl zubereitet.
(d) Spektroskopie im UV- und sichtbaren Bereich (UV-Vis): Proben für die UV-Vis-Prüfung wurden wie bei der vorstehenden Präparation ohne weitere Modifikation verwendet. Die Proben wurden gegen destilliertes Wasser abgeglichen.

b. Nitrosylierung von Phenylalanin, Tyrosin und L-Boc-Tyr (Et)-OH
50 mmol L-Phenylalanin, L-Tyrosin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) oder L-boc-tyr(Et)-OH (Bachem Bioscientific Incorporated; Philadelphia, PA) wurden in 0,5 ml destilliertem Wasser gelöst. 250 mmol Na¹⁵NO₂ (Natrium N-[15]-nitrit) wurden in 0,5 ml wässriger 1 N HCl gelöst und sofort unter Rühren mit einem Vortex-Rührer in die wässrige Aminosäurelösung gegeben. Die Lösung wurde verschlossen und 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen. ¹⁵N-NMR- und ¹H-NMR-Spektren wurden wie vorstehend für Nitroso-tyrosin aufgenommen. Ein Referenzstandard von Tyrosin für die FTIR-Messung wurde als Nujol-Flüssigpräparat von reinem kristallinem L-Tyrosin hergestellt.
c. Nitrosylierung von Tryptophan
1,7 mmol Tryptophan wurden mit einer äquimolaren Menge NaNO₂ in 0,5 N HCl 5, 10, 15 und 60 Minuten bei 25°C umgesetzt.
2. Ergebnisse
a. ¹⁵N-NMR-Daten
Sämtliche NMR-Spektren [¹⁵N und ¹H) wurden an zwei Bruker AM-500 MgHz-Spektrometern aufgenommen. Eine Nitrosylierung von Tyrosin beim pH-Wert 0,3 ergibt Signale von etwa 730 ppm und 630 ppm relativ zu einer gesättigten Lösung von Natrium-N-[15]-nitrit mit einem Referenzsignal bei 587 ppm¹² (¹⁵NO₂) (21a). Ein Signal bei 353 ppm (wässriges NO¹²) wurde ebenfalls beobachtet. Eine Nitrosylierung von Phenylalanin unter den gleichen Bedingungen ergab das Signal bei etwa 630 ppm, jedoch trotz wiederholter Versuche nicht das Signal bei 730 ppm (22). Eine Nitrosylierung von Phenylalanin ergab ebenfalls Signale bei 587 ppm (überschüssiges, unprotoniertes Nitrit) und 353 ppm. Eine Nitrosylierung der O-blockierten Tyrosin-Modellverbindung boc-tyr(Et)-OH ergab ebenfalls ein Signal bei etwa 630 ppm und weitere Signale bei 587 und 353 ppm. Kleine Signale im Bereich von 450–495 ppm wurden für die Tyrosin-Modellverbindungen Phe und Boc-tyr(Et)-OH beobachtet.
b. ¹H-NMR-Daten
Um die Nitrosylierung der funktionellen Phenolgruppe von L-tyr weiter zu charakterisieren und eine C-Nitrosylierung auszuschließen, wurde ein Protonen-NMR-Spektrum an nitrosyliertem Tyrosin durchgeführt. Eine Modifikatin von L-tyr an der phenolischen OH-Gruppe würde aufgrund des Protonenaustausches mit dem deuterierten Lösungsmittel (D₂O) im Protonen-NMR nicht erscheinen. Eine Prüfung des Spektrums zeigte das klassische Dublett von Dubletten bei niedrigem Feld, was für p-disubstituiertes Benzol charakteristisch ist und somit eine aromatische Protonensubstitution ausschließt (21b). Diese und andere Werte im Spektrum waren für unmodifiziertes L-tyr charakteristisch.
c. FTIR-Daten
Sämtliche FTIR-Aufnahmen wurden mit einem Nicolet 5ZDX FT-IR-Spektrometer aufgenommen. FTIR eines Nujol-Flüssigpräparats von L-Tyrosin ergab eine sehr charakteristische und gut dokumentierte alkoholische Streckschwingung in Spektren aufgrund der phenolischen OH-Gruppe (1d, Einsatz). Diesem Spektrum fehlten jegliche Signale im Bereich von 1680–1610 cm^–1, der mit der O-N=O-Streckschwingung (nicht dargestellt) zusammenfällt. Das FTIR-Spektrum von nitrosyliertem L-Tyrosin ergab keine Anzeichen für alkoholische OH-Streckschwingungen und enthielt zwei kleine Banden im Bereich von 1680–1610 cm^–1, die möglicherweise für die erwartete O-N=O-Streckschwingung verantwortlich sein könnten (Wade, L. G., Organic Chemistry (1. Auflage) Prentice Hall Inc., Englewood Cliffs, NJ: 1987, S. 1334) (21c).
d. UV-Vis-Daten
Sämtliche UV-Vis-Spektren wurden mit einem Gilford Response-UV-Vis-Spektrophotometer (CIBA-Corning, Oberlin, OH) aufgenommen. Eine Behandlung von L-Tyrosin mit wässrigem Natriumnitrit bei pH-Wert 0,3 (0,5 N HCl) führte zu einer gelben Lösung mit einem Absorptionsmaximum bei 361 nM. Dieses Ergebnis ist ähnlich wie bei nitrosyliertem L-Tyrosin, unterscheidet sich aber von früheren Ergebnissen mit dieser Substanz. In ortho-Stellung ringsubstituiertes L-Nitro-tyrosin (Sigma) absorbiert beim pH-Wert 0,3 bei 356 nm.
Eine Behandlung von Phenylalanin mit Natriumnitrit beim pH-Wert 0,3 ergibt eine rasche Veränderung des UV-Spektrums, wobei nach 5 Minuten ein Peak mit einer steigenden Wellenlänge bei 318 nm auftritt und nach 30 Minuten ein sich nicht mehr verändernder Peak bei 527 nm vorliegt.
Die 23(a–e) zeigen die zeitabhängige Nitrosylierung von Tryptophan. Die Daten lassen darauf schließen, dass sowohl der aromatische Ring als auch die Aminogruppen nitrosyliert werden.
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 14: Nitrosylierung von BSA
BSA wurde in einer Menge von 200 mg/ml 30 Minuten bei Raumtemperatur in einem Verhältnis von 20:1 mit NO in 0,5 N HCl versetzt. Wie in 24 gezeigt, spricht der Peak bei 726 ppm für eine O-Nitrosylierung der Tyrosinreste an BSA. 24 liefert auch den Beweis der Nitrosylierung mehrerer anderer funktioneller Gruppen an BSA. Die Daten lassen ferner auf eine Ringnitrosylierung und eine Aminnitrosylierung (Peak bei 600 ppm) schließen.
Eine zeitabhängige NO-Beladung von BSA wurde durchgeführt, indem man BSA (200 mg/ml) in Phosphatpuffer (10 mM, pH-Wert 7,4) einer Behandlung mit NO, das als Gas in die BSA-Lösung für Zeitspannen von 1, 5 und 30 Minuten eingeleitet wurde, unterwarf. In 25 sind die spektralen UV-Daten aufgeführt, die eine NO-Beladung von BSA zeigen.
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 15: Nitrosylierung von t-PA: NO-Beladung
t-PA in einer Menge von 10 mg/ml wurde mit einem 10:1-Überschuss mit NaNO₂ in 0,5 N HCl behandelt. 26 zeigt die NO-Beladung von t-PA.
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 16: Gefäßerweiternde Wirkung von NO-beladenem BSA
BSA wurde gemäß dem in Beispiel 14 beschriebenen Verfahren mit NO beladen. Die gefäßerweiternde Wirkung wurde in einem biologischen Test mit Kaninchenaorta gemäß den in Beispiel 6C beschriebenen Verfahren untersucht. Wie in 27 dargestellt, führten zunehmende Konzentrationen an NO zu einem Anstieg der durch das erhaltene NO-BSA herbeigeführten Gefäßrelaxation.
Beispiel 17: Guanylat-cyclase-Inhibitoren hemmen in humanen Luftwegen nicht die durch S-Nitroso-protein induzierte Relaxation
Die Wirkung von Guanylat-cyclase-Inhibitoren auf die durch S-Nitroso-protein induzierte Luftwegrelaxation und der Anstieg an cGMP wurden unter Anwendung des vorstehend beschriebenen biologischen Tests und des Verfahrens zur Bestimmung von cyclischen Nucleotiden bestimmt. Die bronchienerweiternde Wirkung von S-Nitroso-albumin wurde ebenfalls an humanen Luftwegen (Außendurchmesser 5–12 mm) geprüft. Konzentrations-Wirkungs-Beziehungen für mit Methacholin (7 μM) kontrahierte Ringe führten zu IC₅₀-Werten von 22 μM, was etwa zwei Größenordnungen höher als bei Theophyllin ist.
S-Nitroso-albumin (100 μM) induzierte Anstiege gegenüber cGMP-Kontrollkonzentrationen in Luftwegen. Jedoch wurde die durch S-Nitroso-albumin induzierte Luftwegrelaxation nicht signifikant durch Methylenblau (10^–4) oder LY83583 (5 × 10^–5) gehemmt. Gleichermaßen hatte Hämoglobin (100 μM) nur einen geringen Einfluss auf die durch S-Nitroso-albumin induzierte Relaxation (P = NS).
Diese Ergebnisse belegen, dass der Mechanismus, gemäß dem S-Nitroso-protein eine Luftwegrelaxation hervorruft, nicht allein auf die Zunahme an cGMP zurückzuführen ist. Somit bewirken S-Nitroso-proteine eine Luftwegrelaxation sowohl durch einen Anstieg des cyclischen GMP als auch auf einem Weg, der von cGMP unabhängig ist. Somit stellen sie Mittel zur Erzielung einer Kombinationstherapie dar, indem die synergistischen Wirkungen von zwei getrennten Mechanismen maximiert werden.
Beispiel 18: S-Nitroso-proteine widerstehen der Zersetzung in Gegenwart von Redoxmetallen
Die Stabilität von S-Nitroso-albumin in Gegenwart von Sauerstoff und Redoxmetallen wurde geprüft. Bei Einwirkung unter Bedingungen mit 95% O₂ und einem pH-Wert von 7,4 ergab sich eine Halbwertszeit für diese Verbindung in der Größenordnung von Stunden, die erheblich größer als die Halbwertszeiten von NO oder NO^• waren, die unter gleichen Bedingungen in der Größenordnung von Sekunden liegen.
Ferner wurde die Stabilität von S-Nitroso-protein in Gegenwart verschiedener Redoxmetalle oder chelatbildender Mittel geprüft. S-Nitroso-albumin wurde nicht zersetzt, wenn Cu⁺, Fe²⁺ oder Cu²⁺ (50 μM) oder Defuroxamin oder EDTA (10 μM) zugegeben wurden. Somit belegen diese Experimente, dass S-Nitrosoproteine im Gegensatz zu NO^• weder in Gegenwart von Sauerstoff rasch inaktiviert werden, noch sich in Gegenwart von Redoxmetallen zersetzen.
Nicht-erfindungsgemäßes Beispiel 19: Eine S-Nitrosylierung von Hämoglobin verstärkt die Hämoglobin-Sauerstoff-Bindung
Zusätzliche Experimente wurden durchgeführt, um die Umsetzung zwischen S-Nitrosothiolen und Hämoglobin zu bewerten. Eine S-Nitrosylierung von Hämoglobin wurde durch Umsetzung von 12,5 μM Hämoglobin mit 12,5 μM für Zeiträume von 5 und 20 Minuten erreicht (pH-Wert 6,9). Die S-Nitrosylierung wurde mit üblichen Verfahren zum Nachweis von S-Nitrosothiolen bestätigt (Saville, Analyst, 83: 670–672 (1958)). Das Saville-Verfahren, in dem freies NO_x in Lösung bestimmt wird, beinhaltet eine Diazotierungsreaktion mit Sulfanilamid und eine anschließende Kupplung mit dem Chromophor N-(1-Naphtyl)-ethylendiamin. Die Spezifität für S-Nitrosothiole ergibt sich aus Testbestimmungen, die in Gegenwart und Abwesenheit von HgCl₂ durchgeführt wurden, wobei das letztgenannte Reagenz die Hydrolyse der S-NO-Bindung katalysiert. Eine Bestätigung für die Bildung der S-Nitrosothiol-Bindung wurde spektrophotometrisch erhalten, und zwar durch Nachweis des Absorptionsmaximums bei 450 nm, wie in 28 dargelegt ist. Dies wurde unter Verwendung von NO⁺-Äquivalenten in Form von SNOAC nachgewiesen.
Wie durch 29 dargelegt, zeigte das UV-Spektrum von Hämoglobin, das mit SNOAC inkubiert war, keine Reaktion am Redoxmetall (Eisenbindungsstelle) von Hämoglobin, und zwar im Zeitraum von 15 Minuten. Zu Vergleichszwecken wurden äquimolare Konzentrationen an Hämoglobin und NaNO₂ in 0,5 N HCl umgesetzt, um Nitrosyl-hämoglobin zu bilden. Das UV-Spektrum wurde aufgenommen. Wie in 30 gezeigt, reagierte NO sofort mit der Stelle des Redoxmetalls an Hämoglobin. Die Tatsache, dass S-Nitrosothiol nicht mit der Stelle des Redoxmetalls von Hämoglobin reagiert, stattdessen mit der Thiolgruppe, zeigt, dass es sich bei der reaktiven NO-Spezies, die durch das S-Nitrosothiol zur Verfügung gestellt wird, um Nitrosonium oder Nitroxyl handelt.
Eine S-Nitrosylierung von Hämoglobin führt nicht zur Bildung von Methhämoglobin und zu einer anschließenden Beeinträchtigung der Hämoglobin-Sauerstoff-Bindung. Ferner zeigte ein zusätzliches Experiment, dass eine S-Nitrosylierung von Hämoglobin eine Linksverschiebung der Hämoglobin-Sauerstoff-Assoziationskurve verursacht, was auf einen Anstieg der Sauerstoff-Bindung hinweist. Somit beseitigt die Umsetzung zwischen S-Nitrosothiolen und Hämoglobin nicht nur die Hemmung der Sauerstoffbindung, die bei der Umsetzung mit ungeladenem NO und der Erzeugung von Methhämoglobin erfolgt, sondern bewirkt tatsächlich eine Erhöhung der Sauerstoffbindung.

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein S-Nitroso-Lipoprotein.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Lipoprotein aus der Gruppe bestehend aus Chylomikronen, Chylomikron-Remnant-Partikeln, Lipoprotein mit sehr geringer Dichte, Lipoprotein mit mittlerer Dichte, Lipoprotein mit geringer Dichte, Lipoprotein mit hoher Dichte und Lipoprotein (a) ausgewählt ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung eines S-Nitroso-Lipoproteins zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Abgabe von Stickoxid an spezifische Zielorte im Körper zum Hemmen der Plättchenfunktion, zum Erzeugen von Gefäßerweiterung, zur Behandlung oder Vermeidung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen, zum Entspannen von nicht-vaskulärem glatten Muskelgewebe und/oder zur Behandlung oder Vermeidung von einer Atmungserkrankung.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zum Verabreichen über einen Verabreichungsweg, der orale, sublinguale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder Aerosol-Abgabe umfasst, hergestellt wird.