WO2005092362A2 - Pharmazeutisches kombinationspräparat enthaltend ein therapeutisches protein - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical combination preparation which contains a therapeutic protein with SH groups which are nitrosated.
  • Nitrogen oxide is a gaseous molecule that is synthesized, among other things, in endothelial cells under normal physiological conditions.
  • the endothelium-dependent relaxation of vascular smooth muscles is mainly due to NO.
  • NO is therefore essential for the regulation of vascular tone.
  • NO is also involved in a number of physiological and pathophysiological processes. For example, NO deficiency in ischemia / reperfusion for vasoconstriction and edema formation (Huk et al., Circulation 96 (1997), 667-675; Hallström et al., Circulation 105 (2002), 3032-3038).
  • S-nitrosothiols form a group of potent, bioactive compounds that stabilize physiologically formed NO and potentiate its biological effects. NO therefore does not work in biological systems per se, but also via biologically active redox adducts of NO, such as S-nitrosoproteins, S-nitrosoamino acids or other S-nitrosothiol compounds.
  • the first mechanism is an electrophilic attack by a reactive NO species, the nitrosonium cation (NO + ), on the nucleophilic sulfur atom (Stamler et al., Science 258 (1992d), 1898-1902).
  • a second, controversial, mechanism is that S-nitrosation occurs through NO via peroxynitrite (ONOO " ) or NO 2 (Pryor et al, J. Org. Chem. 47 (1982), 156-159; Mohr et al., FEBS Lett. 348 (1994), 223-227; Wu et al., Am. J. Physiol.
  • the third, newer mechanism describes that S-nitrosations of thiol compounds (albumin, reduced glutathione ) is caused by dinitrosyl iron complexes (Boese et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 29244-29249).
  • the fourth mechanism is an S-transnitrosation reaction or S-nitroso exchange reaction in which an NO- Group is transferred from an S-nitroso compound to a second thiol compound in exchange for an H group (Feelisch et al, J. Cardiovasc. Pharmacol. 17 (1991), Suppl. 3, S25-S33; Field et al., JCS Chem Commun.
  • the object of the present invention is to increase the physiological effect of proteins which contain nitrosated SH groups.
  • a pharmaceutical combination preparation which contains a therapeutic protein with SH groups which are nitrosated and a thiol group-containing compound with an average molecular weight of at most 10,000.
  • thiol groups means sulfhydrile groups (-SH) and disulfide groups (-S-S-).
  • a preferred embodiment of the combination preparation according to the invention consists in that at least 90% of the SH groups present are nitrosated.
  • S-nitroso-albumin, S-nitroso-orosomucoid, S-nitroso-plasminogen activator, S-nitroso-fibrinogen, S-nitroso-Lys-plasminogen or S is particularly preferred as therapeutic protein with nitrosated SH groups -Nitroso hemoglobin included.
  • Reduced glutathione, L-cysteine, N-acetyl-cysteine, L-cysteinylglycine, ⁇ -glutamylcysteine, penicillamine, penicillamide are particularly preferred as the thiol group-containing compound. Contain N-acetyl-penicillamine, N-acetyl-penicillamide, homocysteine, captopril, dehydroliponic acid and / or their oxidized form, which is reduced after administration in vivo.
  • a further preferred embodiment of the pharmaceutical combination preparation according to the invention contains reduced glutathione as therapeutic protein with nitrosated SH groups S-nitroso-albumin and as a compound containing thiol groups.
  • a thio group-containing compound is a human one.
  • Compound occurring in blood and tissue particularly reduced glutathione, L-cysteine, L-cysteinylglycine, ⁇ -glutamylcysteine or dehydroliponic acid is particularly preferred.
  • a further embodiment of the pharmaceutical combination preparation according to the invention consists in that it contains a therapeutic protein obtained by nitrosation, in which the degree of nitrosation is composed of at least 90% S-nitrosation and a maximum of 10% N, O, C-nitrosation.
  • the pharmaceutical preparation according to the invention for the protein component can contain any proteins with a "free" thiol group, but proteins which can be used therapeutically for the purposes of the present invention are preferred, with physiological or blood-derived human proteins, such as albumin, orosomucoid and plasminogen activator (eg t-PA), fibrinogen, Lys-plasminogen or hemoglobin or also mixtures of such nitrosable or nitrosated proteins according to the invention are to be regarded as particularly preferred.
  • physiological or blood-derived human proteins such as albumin, orosomucoid and plasminogen activator (eg t-PA), fibrinogen, Lys-plasminogen or hemoglobin or also mixtures of such nitrosable or nitrosated proteins according to the invention are to be regarded as particularly preferred.
  • the pharmaceutical preparation according to the invention for the low-molecular thiol component can contain any low-molecular thiol compound, such as reduced glutathione, L-cysteine, N-acetyl-L-cysteine, L-cysteinylglycine, ⁇ -glutamylcysteine, penicillamine or amides, N-acetyl Penicillamine or amides, homocysteine, captopril (D-2-methyl-3-mercaptopropanoyl-L-proli) and reduced thioctic acid (dehydroliponic acid), but preferred are low molecular weight thiol compounds in the blood (plasma) such as reduced glutathione, L-cysteine , L-cysteinylglycine, ⁇ -glutamylcysteine and dehydroliponic acid.
  • low molecular weight thiol compounds in the blood (plasma) such as reduced glutathione, L-cy
  • the nitrosation is preferably carried out in such a way that only the freely available thiol groups are nitrosated and external nitrosations are avoided (equimolar nitrosation). This succeeds because primarily free SH groups are preferentially nitrosated and foreign nitrosations of the N, O, C atoms of the proteins take place only when there is an excess of nitrosating agent.
  • N- and C-nitroso compounds are suspected of being carcinogenic and also have different NO group release kinetics than S-nitroso compounds (see Zhang et al, J. Biol. Chem. 271 (24) (1996), 14271-14279), which is why in a preferred embodiment of the preparation according to the invention an N, 0, C-nitrosation degree of the proteins in the preparation of at most 10% is provided.
  • the proteins are preferably made available in purified form.
  • the degree of purity should preferably be such that the proteins can be administered pharmaceutically. Therefore, a protein for nitrosation with a degree of purity of at least 80%, in particular at least 90% (w / w%), based on protein, is provided for the protein component of the preparation according to the invention.
  • This purified protein can of course be formulated with other proteins into a pharmaceutical preparation.
  • the protein component in the preparation according to the invention can thus be a mixture of different equimolar nitrosated proteins, but it can also be a mixture of a non-nitrosated and an equimolar nitrosated protein.
  • the pharmaceutical preparation preferably contains S-nitroso human serum albumin as a protein component and reduced glutathione.
  • the pharmaceutical preparation preferably contains S-nitroso human serum albumin and hemoglobin.
  • the protein component is preferably made available in a higher purity than the non-nitrosated protein component.
  • human serum albumin is often administered in a purity of at least 80% of total protein as a pharmaceutical preparation. On an analog or higher degree of purity is also preferred for the S-nitrosated protein in the preparation. Therefore, after the nitrosation of the protein component for the nitrosated protein, an additional cleaning step is added.
  • the low molecular weight thiol compounds are preferably made available in purified form.
  • the degree of purity should preferably be suitable such that the low molecular weight thiol compound can be administered pharmaceutically in the preparation. Therefore, a degree of purity of at least 90%, in particular at least 95% w / w, based on the low molecular weight thiol compound is provided for the low molecular weight thiol compound of the preparation according to the invention. Of course, higher values are also preferred.
  • the pharmaceutical preparation according to the invention is preferably formulated in a pharmaceutically acceptable buffer solution, optionally with pharmaceutically acceptable stabilizers.
  • a pharmaceutically acceptable buffer solution optionally with pharmaceutically acceptable stabilizers.
  • sodium caprylate and / or sodium acetyltryptophanate is used as a stabilizer.
  • the preparations can also be provided as a spray or in a form suitable for topical use.
  • the preparation is provided in a form suitable for intravenous administration.
  • an IV-compatible preparation is characterized in particular by a low aggregate content or is free of aggregates.
  • the preparation according to the invention is therefore preferably in frozen or lyophilized form for storage purposes, in which it has a sufficiently long shelf life.
  • Both the low-molecular thiol compound and the nitrosated protein of the preparation according to the invention can be stored in a common or separate form.
  • the pharmaceutical preparation based on a protein with nitrosated thiol groups and a low molecular weight thiol compound is stable when stored separately in the lyophilized state.
  • the nitrosation can preferably be carried out in such a way that only after determining the “free” thiol content of the proteins is nitrosated to this proportion of “free” thiol groups and at the same time a low molecular weight
  • Both native thiol-containing proteins and thiol-containing proteins in which the “free” thiol groups are de-blocked by a specific method can be considered as the protein component.
  • the reactants or the reaction products are separated off after the nitrosation reaction and preferably to a quantitative extent or to a value below the detection limit.
  • the preparation according to the invention is also distinguished by a low aggregate content of the protein component.
  • the proportion of aggregates in the pharmaceutical preparation is below 20%, preferably below 10%, most preferably below 5%.
  • the nitrosation of the thiol-containing proteins is carried out under aerobic conditions, especially when working with acidic sodium nitrite.
  • the nitrosation is preferably carried out with an agent selected from HNO 2 , HNO, NOC1, NO + , RNO 2 , N 2 O 3 , N 2 O 4 , NO 2 - and NO radical, and in an acidic medium.
  • Organic NO donors can also be used.
  • the nitrosation should be carried out with an agent related to the release of NO equimolar to the "free" thiol group content of the protein.
  • a smaller ratio of agent for the nitrosation can also be used based on the thiol group content of the protein, but a ratio of 1: 1 is preferred.
  • an equimolar nitrosation means a minimal N- and The degree of nitrosation of the protein is guaranteed, and the duration of the nitrosation should be as short as possible.
  • the nitrosation is therefore preferably carried out for a period of from 2 minutes to several hours, preferably 30 minutes, at a temperature between 15-30 ° C., preferably at room temperature in an aqueous solution at pH 0.3 to 3.5, most preferably at pH 1.0 to 3.0, preferably in acid n range up to pH 1.5.
  • All types of protein fractions can be used as the starting material for the protein component, in particular also blood, plasma, serum, a plasma fraction or a purified protein fraction, but also culture supernatants or corresponding extracts. If, however, substances are contained in the starting material which can adversely affect the nitrosation step, such as, for example, low molecular weight thiol group-containing proteins or thiol group-containing compounds, these should preferably be separated off.
  • Preferred plasma fractions are those after the Colin fractionation and in particular the Cohn II and III fraction or the Cohn IV fraction.
  • a further purification step selected from precipitation, gel filtration, diafiltration, ultrafiltration and chromatographic purification, can be provided.
  • albumin is purified using ion exchange chromatography.
  • a purification step is carried out after the nitrosation of the protein, so that the substances used there do not influence one another and are also not present in the finished nitrosated protein component.
  • This purification step is preferably carried out in the form of a chromatographic purification, in particular by means of gel permeation chromatography
  • a treatment for inactivating viruses is preferably carried out before the nitrosation, but it can also be carried out terminally, ie after the nitrosation.
  • the protein component of the combination preparation according to the invention can be processed into a pharmaceutical-eutomatic preparation in a manner known per se.
  • the Hegel adheres to the formulation instructions (see Pharmacopoeia) for the non-nitrosated protein preparation.
  • the low molecular weight thiol compound preferably reduced glutathione or L-cysteine, is provided in a pharmaceutically administrable form as the pure substance b and is administered simultaneously with the purified, nitrosated protein component i.v. apply.
  • this combination preparation according to the invention includes the preparation of a combination preparation for improving perfusion or microcirculation, preferably in vital organs such as e.g. in the G-brain (cerebral ischemia, ischemic insult), in the heart (myocardial infarction), in the kidney or in the extremities or in the whole organism.
  • the combination preparation according to the invention can thus generally be used to prevent or treat ischemia and reperfusion damage.
  • the combination preparation according to the invention is also suitable for the treatment of shock, in particular traumatic, hypovolemic or hemorrhagic or neurogenic shock.
  • the combination preparation according to the present invention can be used in various surgical fields, for example in transplant surgery and in all surgical procedures with subsequent reperfusion. It is particularly suitable for the treatment and / or prophylaxis of restenosis after angioplasty.
  • the combination preparation can also be used for the treatment and / or prophylaxis of thrombotic conditions, ie those which are associated with platelet adhesion / aggregation.
  • the S-NO tissue plasminogen activator can be used as a thrombolytic agent.
  • the combination preparation is also used to relax the non-vascular, smooth muscles, e.g. the smooth muscles of the airways, usable. Therefore, the preparation according to the present invention can be used for the treatment and / or prophylaxis of respiratory diseases. It can also be useful for diagnosing and / or treating male erectile dysfunction.
  • a further, essentially preferred, medical use of the combination preparation according to the invention comprises the production of a combination preparation for the controlled reduction of blood pressure, e.g. in hypertensive crises (i.e. chronic or acute hypertension crises).
  • a higher dosage is used than for the prevention or treatment of ischemia and reperfusion damage.
  • the medical combination preparation is preferably provided with respect to the protein component in a dose which, except for albumin, corresponds to that of the non-nitrosated protein.
  • albumin as a protein component, the dose depends primarily on the medical indication. In the prevention or treatment of ischemia and reperfusion damage, depending on the S-nitrosograd of the albumin preparation, a dosage of 0.035-1.0 ⁇ mol / kg / h is recommended. When reducing blood pressure, higher doses should be used (e.g. up to 10 ⁇ mol / kg / h of S-NO albumin with an S-nitrosation level of ⁇ 26%).
  • a dose of 12-140 ⁇ mol / kg / h is recommended for the low molecular weight thiol compound (e.g. reduced glutathione).
  • the amount or dose to be administered depends on the requirements of the patient, for example on parameters such as hematocrit, oxygenation, mean arterial and venous blood pressure or pulmonary arterial pressure, and can vary considerably from case to case. Significantly lower doses can also be used for the platelet adhesion / anti-aggregation effect.
  • a particular advantage of the combination preparation according to the invention is that at least the same efficiency is achieved with proteins containing thiol groups as with Monopreparations of thiol group-containing proteins, in which the freely available thiol group was increased to 90% free SH groups per mole of protein by reductive pretreatment. In terms of process engineering, the reductive pretreatment is avoided. Equimolar nitrosation to the freely available thiol group guarantees the same degree of purity of the active component of the protein preparation (N-, C-, O-nitrosierang ⁇ 5%). Both albumin (4-5 g / dL plasma) and reduced L-glutathione ( ⁇ 5 ⁇ mol / L) are naturally occurring plasma components.
  • the naturally occurring transnitrosation reaction is limited by the physiologically occurring reduced L-glutathione level in the plasma.
  • reduced L-glutathione By providing reduced L-glutathione, the release of the active substance NO of the S -nitrosized protein component can even be controlled in a dose-dependent manner from the reduced L-glutathione.
  • combination preparation according to the invention can of course also be used for any indication of the non-nitrosated proteins in general, since their physiological effect is retained despite nitrosation.
  • conditions which require the provision of an increased NO content are preferred indications for the combination preparations according to the invention.
  • the ratio of free SH groups per mole of protein was determined using the Ellman reagent (Ellman G.L., Arch. Biochem. Biophys. 82 (1959), 70-77) according to Sedlak and Lindsay, Anal. Biochem. 25: 192-205 (1968).
  • the nitrosation of the albumin preparations was carried out equimolar to the content of the free SH groups (ratio: 1: 1 to a maximum of 1: 1, 2 molar to the determined value) with NaNO 2 in 0.2 mol / L HC1 at pH 1.5-2. 5 for a period of 15-30 min at room temperature. The mixture was then neutralized with 1 mol / L NaOH.
  • preparative gel permeation chromatography was carried out using a stationary phase of beads with a heteroporous, swollen network of a Toyopearl TSK HW 40 (F) gel. Elution was carried out with bidistilled water at 4 ° C. The purified fraction containing S-nitroso-albumin (S-NO-albumin / albumin) was then lyophilized.
  • the analysis can be carried out before or after the purification by means of preparative gel permeation chromatography.
  • preparative gel permeation chromatography With this method, if available, excess nitrosating agent and buffer substances are separated from the S-NO albumin / albumin using a gel permeation column (Toyopearl TSK HW-40-S). Subsequently, in a post-column derivatization process using the Saville reaction (Saville B., Analyst 83 (1958), 670-672), the NO group is selectively split off from the RS-NO by Hg 2+ . Simultaneously, the nitrite formed is photometrically detected at 541 nm by a color reaction (Griess reaction; Griess, Ber.Dtsch. Chem. Ges.
  • the chromatograms show equimolar nitrosated S-NO-HSA preparations with different S-nitroso degrees: a) human albumin nitrosated equimolar to the free SH group with a free SH group content per mol protein of 26%; b) human albumin nitrosated equimolar to the free SH group, which had a free SH group content per mole protein of 74% by reductive pretreatment; c) analogous to b), the nitrosation was not carried out equimolar but with a 6-fold molar excess of nitrosation agent.
  • Reduced glutathione produced by peptide synthesis with a purity of at least 95% was made available as a low molecular weight thiol compound.
  • example 1 the lowering of the mean arterial pressure by application of a combination preparation according to the invention consisting of a nitrosed serum albumin preparation and reduced glutathione is shown on the rabbit model.
  • a combination preparation according to the invention consisting of a nitrosed serum albumin preparation and reduced glutathione is shown on the rabbit model.
  • the effect of a nitrosated serum albumin preparation is shown, which was applied without reduced glutathione.
  • the rabbit was anesthetized, initiating anesthesia with ketaset (50 mg / kg; bolus) and xylasin (5 mg / kg; bolus) and with continuous infusion via the vena auricularis of Ketaset (35 mg / kg / h) and 5 mg Maintain xylasin (5 mg / kg / h) dissolved in physiological saline (5 mL / h).
  • FIG. 1 a shows the dose-dependent comparison of the lowering of the mean arterial pressure (MAP) in the rabbits after bolus administration of nitrosed serum albumin with and without simultaneous continuous infusion of reduced glutathione (2.2 ⁇ mol / kg / min).
  • Infusion: Vena femoralis (n 3 per data point; mean ⁇ standard deviation).
  • Fig. 1b is a representative example of the lowering of the mean arterial pressure with a bolus infusion of 0.1 ⁇ mol / kg S-NO-HSA with and without continuous infusion of reduced glutathione (2.2 ⁇ mol / kg / min).
  • FIG. 1e is a representative example of the lowering of the mean arterial pressure by bolus injections of 0.1 ⁇ mol / kg S-NO-HSA with variable concentrations of GSH in vivo. Infusion: femoral vein.
  • FIG. 1f is a representative example of the lowering of the mean arterial pressure by simultaneous, continuous infusion of 0.05 ⁇ mol / kg / min S-NO-HSA with increasing concentration of reduced glutathione (a: 0.0 ⁇ mol GSH / kg / min , b: 0.1 ⁇ mol GSH / kg / min, c: 0.3 ⁇ mol GSH / kg / min).
  • S-NO-HSA was infused through the jugular vein and reduced glutathione through the second auricular vein (or vena femoralis).
  • Example 2 shows the potentiation of the NO release of a nitrosated serum albumin preparation by providing a low-molecular thiol compound using the example of reduced glutathione. The NO concentration was measured in vitro.
  • FIG. 2b shows a representative example of the in vitro measurement of the potentiation of the NO release of a nitrosated serum albumin preparation by reduced glutathione.
  • Example 3 shows the effect of a preferred embodiment of the combination preparation according to the invention on platelet aggregation.
  • the platelet aggregation was carried out with human platelet-rich plasma (TRP) in a dual-channel chronolog aggregometer in principle according to the method of Born (1969).
  • TRP human platelet-rich plasma
  • the exact dose of collagen for which collagen-induced aggregation ( ⁇ l ⁇ g collagen / mL TRP) was determined (95-100% inhibition of collagen-induced aggregation by 300 ⁇ mol / L acetylsalicylic acid).
  • increasing concentrations of reduced glutathione were primarily pre-incubated with TRP in the aggregometer for one minute and S-NO-HSA (2-4 ⁇ mol / L; concentration that causes 20% inhibition of collagen-induced aggregation) was added after one minute.

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Abstract

Pharmazeutisches Kombinationspräparat enthaltend ein therapeutisches Protein mit SH-Gruppen, die nitrosiert sind, und eine Thiolgruppen-hältige Verbindung mit einem Mittleren Molekulargewicht von maximal 10.000. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Kombinationspräparat s-Nitroso-Albumin als therapeutisches Protein und reduziertes Glutathion als Thiolgruppen-haltige Verbindung. Die erfindungsgemässe Kombinationspräparation allgemein zur Verhinderung bzw. Behandlung von Ischämie - und Reperfusionsschäden eingesetzt werden. Die erfindungsgemässe Kombinationspräparation ist auch zur behandlung von Schock, insbesondere traumatischem, hypovolämischen bzw. Hämorrhagischem oder neurogenem Schock geeignet.

Description

Pharmazeutisches Kombinationspräparat enthaltend ein therapeutisches Protein
Die vorliegende Erfindung betrifft ein pharmazeutisches Kombinationspräparat, welches ein therapeutisches Protein mit SH-Gruppen enthält, die nitrosiert sind.
Stickoxid (NO) ist ein gasförmiges Molekül, welches unter anderem in Endothelzellen unter normalen physiologischen Bedingungen synthetisiert wird. Die Endothel-abhängige Relaxation von vaskulär glatter Muskulatur ist hauptsächlich auf NO zurückzuführen. Somit ist NO wesentlich für die Regulation des Gefäßtonus. NO ist ferner in einer Reihe von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen involviert. So führt z.B. NO-Mangel im Ischämie/Reperfusions-Geschehen zur Vasokonstriktion und Ödembildung (Huk et al., Circulation 96 (1997), 667-675; Hallström et al., Circulation 105 (2002), 3032-3038).
In Präparationen von Proteinen mit potentiell freien Thiolgruppen liegen nur 20-35% tatsächlich in der freien, reduzierten SH-Form vor. Die übrigen 65 bis 80% sind - insbesondere bei Proteinpräparationen, welche aus Blut abgeleitet sind, oder welche im Rahmen ihres Herstellungsverfahrens mit Plasma oder Plasmaderivaten kontaktiert werden - blockiert, meist durch gemischte S-S Bindungen mit kleinen Thiolgruppen-tragenden Verbindungen, beispielsweise freiem L-Cystein bzw. Glutathion (Katachalski et al., J. Am. Chem. Soc. 79 (1957), 4096-4099; DeMaster et al, Biochemistry 34 (1995), 11494-11499).
Allgemein ist bei den Schwefel-hältigen Gruppierungen in Proteinen grundsätzlich zu unterscheiden zwischen solchen, die in fest gebundener bzw. assoziierter Form, beispielsweise als intramolekulare abgesättigte Disulfid-Bindungen vorliegen und für die Konformation der Proteine entscheidend sind, und jenen, die die potentiell freie(n) Thiolgruppe(n) darstellen. Letztere sind für das jeweilige Protein eine bekannte Größe. Humanes Serumalbumin beispielsweise weist im nativen Zustand eine einzige potentiell freie Thiolgruppe pro Molekül auf, nämlich das Cystein in Position 34. Diese potentiell freien Thiolgruppen neigen jedoch zur Bildung von intermolekularen Disulfiden, weshalb sie auch als gemischte Disulfide bezeichnet werden. Im Plasma liegen bis zu 80% dieser Thiolgruppen als gemischte Disulfide vor und sind also nicht unmittelbar als freie Thiolgruppen verfügbar.
Reaktionen der Sulfhydrylgruppe von niedermolekularen sowie hochmolekularen Thiolverbindungen mit NO, NO2, NO+ oder NO" in Gegenwart von Sauerstoff führen zur Bildung von S-Nitrosoverbindungen, sogenannten S-Nitrosothiolen. S-Nitrosothiole bilden eine Gruppe potenter, bioaktiver Verbindungen, die physiologisch gebildetes NO stabilisieren und dessen biologische Effekte potenzieren. NO wirkt somit in biologischen Systemen nicht per se, sondern auch über biologisch aktive Redox-Addukte von NO, wie S- Nitrosoproteinen, S-Nitrosoaminosäuren oder anderen S-Nitrosothiolverbindungen.
Die Fachwelt vermutet, dass die in vivo Synthese von S-Nitrosothiolverbindungen durch Nitrosierung von endogenen Thiol-enthaltenden Molekülen erfolgt, wie zum Beispiel reduziertes Glutathion, L-Cystein, und Serum Albumin (Stamler et al., PNAS 89 (1992a), 7674-7677; Stamler et al., PNAS 89 (1992b), 444-448). Die reversible S-Nitrosierung dieser Moleküle könnte ein wichtiger zellulär regulatorischer Mechanismus sein. Wesentliche Wirkungen auf biologische Funktionen für einige thiolhältige Moleküle sind tatsächlich auf die S-Nitrosierungen zuräckgeführt worden. So wird unter anderem die protektive Blockierung des N-mefhyl-D-aspartat-Rezeptors in exitatorischen Neuronen (Lei et al., Neuron 8 (1992), 1087-1099; Lipton et al., Nature 364 (1993), 626-632), Inaktivierung von Proteinkinase C (Gopalakrishna et al., J. Biol. Chem. 268 (1993), 27180-27185) und bestimmte Eigenschaften von Hämoglobin auf S-Nitrosierungen (Stamler et al., Science 276 (1997), 2034-2037; Gow and Stamler, Nature 391 (1998), 169-173) zurückgeführt worden. Jedoch ist der molekulare Mechanismus für die in vivo S-Nitrosierung weitgehend unbekannt.
In der Literatur werden derzeit zumindest vier mögliche Mechanismen für die S-Nitrosierung von freien Thiolgruppen-hältigen Verbindungen durch NO diskutiert. Der erste Mechanismus ist ein elektrophiler Angriff einer reaktiven NO-Spezies, das Nitrosoniumkation (NO+), auf das nucleophile Schwefelatom (Stamler et al., Science 258 (1992d), 1898-1902). Ein zweiter, zwar kontroversiell diskutierter Mechanismus ist, dass S-Nitrosierung durch NO via Peroxynitrit (ONOO") oderNO2 erfolgt (Pryor et al, J. Org. Chem. 47 (1982), 156-159; Mohr et al., FEBS Lett. 348 (1994), 223-227; Wu et al., Am. J. Physiol. 266 (1994), H2108-2113). Der dritte, neuere Mechanismus beschreibt, dass S-Nitrosierungen von Thiolverbindungen (Albumin, reduziertes Glutathion) durch Dinitrosyl-Eisen Komplexe bewirkt wird (Boese et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 29244-29249). Der vierte Mechanismus ist eine S- Transnitrosierungsreaktion oder S-Nitroso-Austauschreaktion, bei denen eine NO-Gruppe von einer S-Nitrosoverbindung auf eine zweite Thiolverbindung im Austausch für eine H-Gruppe übertragen wird (Feelisch et al, J. Cardiovasc. Pharmacol. 17 (1991), Suppl. 3, S25-S33; Field et al., JCS Chem. Commun. 6 (1978), 249-250). Diese Reaktion erfolgt rasch in vitro und die Bildung von S-Nitrosoglutathion ist unter physiologischen Bedingungen kinetisch wesentlich bevorzugt. (Feelisch et al., (1991); Meyer et al, FEBS Lett. 345 (1994), 177-180; Singh et al., J. Biol. Chem. 271 (1996), 18596-18603; Tsikas et al, Anal. Biochem. 270 (1999), 231-241).
Es wird angenommen, dass S-Transnitrosierungsreaktionen wesentlich für die biologischen Effekte von S-Nitrosoglutathion verantwortlich sind, wobei vermutet wird, dass dieser Prozess weiter zu S-Nitrosierung von thiolhältigen Proteinen führt (Mohr et al., FEBS Lett. (1994). Es ist gezeigt worden, dass es auch in vivo zu S-Transnitrosierungsreaktionen zwischen S-Nitrosoproteinen und niedermolekularen Thiolverbindungen (zB. L-Cystein und N-Acetyl-L-Cystein) kommt (Scharfstein et al., J. Clin. Invest. 94 (1994), 1432-1439). Ein direkter Nachweis {in vivo) der Potenzierung der Wirkung, wie zum Beispiel auf den Blutdruckabfall, ist jedoch nicht beschrieben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die physiologische Wirkung von Proteinen, welche nitrosierte SH-Gruppen enthalten, zu verstärken.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein pharmazeutisches Kombinationspräparat gelöst, welches ein therapeutisches Protein mit SH-Gruppen, die nitrosiert sind, und eine Thiolgruppen-hältige Verbindung mit einem mittleren Molekulargewicht von maximal 10.000 enthält. Unter dem Begriff „Thiolgruppen" werden Sulfhydrilgruppen (-SH) und Disulfidgruppen (-S-S-) verstanden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kombinationspräparat besteht darin, dass mindestens 90% der vorhandenen SH-Gruppen nitrosiert sind.
Im erfindungsgemäßen pharmazeutischen Kombinationspräparat ist als therapeutisches Protein mit nitrosierten SH-Gruppen besonders bevorzugt S-Nitroso-Albumin, S-Nitroso- Orosomucoid, S-Nitroso-Plasminogen-Aktivator, S-Nitroso-Fibrinogen, S-Nitroso-Lys- Plasminogen oder S-Nitroso-Hämoglobin enthalten.
Als Thiolgruppen-hältige Verbindung ist besonders bevorzugt reduziertes Glutathion, L- Cystein, N-Acetyl-Cystein, L-Cysteinylglycin, γ-Glutamylcystein, Penicillamin, Penicillamid, N-Acetyl-Penicillamin, N-Acetyl-Penicillamid, Homocystein, Captopril, Dehydroliponsäure und/oder deren oxidierte Form, die nach Verabreichung in vivo reduziert wird, enthalten.
Es hat sich gezeigt, dass eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Kombinationspräparates als therapeutisches Protein mit nitrosierten SH- Gruppen S-Nitroso-Albumin und als Thiolgruppen-hältige Verbindung reduziertes Glutathion enthält.
Ferner ist als Thiogruppen-hältige Verbindung ein in menschlichem. Blut und Gewebe vorkommende Verbindung, insbesondere reduziertes Glutathion, L-Cystein, L- Cysteinylglycin, γ-Glutamylcystein oder Dehydroliponsäure besonders bevorzugt.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen pharmazeutischen Kombinationspräparat besteht darin, daß ein durch Nitrosierung erhaltenes therapeutisches Protein enthalten ist, bei welchem sich der Nitrosierungsgrad zu mindestens 90% aus S- Nitrosierung und zu maximal 10% aus N,O,C-Nitrosierung zusammensetzt.
Prinzipiell kann die erfϊndungsgemäße pharmazeutische Präparatio für die Proteinkomponente jegliche Proteine mit einer „freien" Thiolgruppe enthalten, bevorzugt sind aber für die Zwecke der vorliegenden Erfindung therapeutisch einsetzbare Proteine, wobei physiologische bzw. aus Blut abgeleitete humane Proteine, wie Albumin, Orosomucoid, Plasminogen- Aktivator (z.B. t-PA), Fibrinogen, Lys-Plasminogen oder Hämoglobin oder auch Mischungen derartiger erfindungsgemäß nitrosierbarer bzw. nitrosierter Proteine, als besonders bevorzugt anzusehen sind.
Demgemäß kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Praparation für die niedermolekulare Thiolkomponente jegliche niedermolekulare Thiol Verbindung enthalten, wie reduziertes Glutathion, L-Cystein, N-Acetyl-L-Cystein, L-Cysteinylglycin, γ- Glutamylcystein, Penicillamin bzw. -amide, N-Acetyl-Penicillamin bzw. -amide, Homocystein, Captopril (D-2-methyl-3-mercaptopropanoyl-L-proli ) und reduzierte Thioctsäure (Dehydroliponsäure), bevorzugt sind aber im Blut (Plasma) vorkommende niedermolekulare Thiolverbindungen wie z.B. reduziertes Glutathion, L-Cystein, L- Cysteinylglycin, γ-Glutamylcystein und Dehydroliponsäure. Die Herstellung von nitrosierte Thiolgruppen hältigen Proteinen ist z.B. in der EP-A 0 853 944 beschrieben.
Bevorzugt wird die Nitrosierung so ausgeführt, dass lediglich die frei verfügbaren Thiolgruppen nitrosiert werden und Fremdnitrosierungen vermieden werden (äquimolare Nitrosierung). Dies gelingt, da primär bevorzugt freie SH-Gruppen nitrosiert werden und erst bei Überschuß an Nitrosierungsagens Fremdnitrosierungen an N,O,C-Atomen der Proteine erfolgen. Beispielsweise stehen N- und C- Nitrosoverbindungen in Verdacht, krebserregend zu sein, und weisen auch eine andere Abgabenkinetik der NO-Gruppe auf als S- Nitrosoverbindungen (siehe Zhang et al, J. Biol. Chem. 271 (24) (1996), 14271-14279), weshalb in einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Präparation ein N,0,C-Nitrosierungsgrad der Proteine in der Präparation von maximal 10% vorgesehen wird.
Obgleich es für die Proteinkomponente möglich ist, auch rohe Fraktionen, -wie Plasma oder frühe Plasmafraktionen bzw. Kulturflüssigkeiten der equimolaren Nitrosierung zu unterwerfen, werden die Proteine bevorzugterweise in gereinigter Form zur Verfügung gestellt. Der Reinheitsgrad sollte vorzugsweise geeignet sein, dass die Proteine pharmazeutisch verabreicht werden können. Daher wird für die Proteinkomponente der erfindungsgemäßen Präparation ein Protein zur Nitrosierung mit einem Reinheitsgrad von zumindest 80%, insbesondere von zumindest 90% (Gew/Gew%), bezogen auf Protein, zur Verfügung gestellt. Höhere Werte sind natürlich ebenfalls bevorzugt. Dieses gereinigte Protein kann natürlich mit weiteren Proteinen zu einer pharmazeutischen Präparation formuliert werden.
Die Proteinkomponente in der erfindungsgemäßen Präparation kann also eine Mischung verschiedener equimolar nitrosierter Proteine, sie kann aber auch eine Mischung aus einem nicht nitrosierten und einem equimolar nitrosierten Protein darstellen. Bevorzugterweise enthält die pharmazeutische Präparation S-Nitroso Human Serum Albumin als Proteinkomponente und reduziertes Glutathion. Für eine Mischform der Proteinkomponente enthält die pharmazeutische Präparation bevorzugterweise S-Nitroso Human Serum Albumin und Hämoglobin. Für die erfϊndungsgemäße Präparation wird die Proteinkomponente vorzugsweise in einer höheren Reinheit zur Verfügung gestellt, als die nicht nitrosierte Proteinkomponente. So wird beispielsweise Humanes Serum Albumin oft in einer Reinheit von mindestens 80% an Gesamtprotein als pharmazeutische Präparation verabreicht. Ein analoger oder höherer Grad der Reinheit ist auch für das S-nitrosierte Protein in der Präparation bevorzugt. Daher wird nach der Nitrosierung der Proteinkomponente für das nitrosierte Protein noch ein zusätzlicher Reinigungsschritt nachgeschaltet.
Im erfindungsgemäßen Kombinationspräparat werden die niedermolekularen Thiolverbindungen bevorzugterweise in gereinigter Form zur Verfügung gestellt. Der Reinheitsgrad sollte vorzugsweise geeignet sein, dass die niedermolekulare Thiolverbindung in der Präparation pharmazeutisch verabreicht werden kann. Daher wird für die niedermolekulare Thiolverbindung der erfmdungsgemäßen Präparation ein Reinheitsgrad von zumindest 90%, insbesonders von zumindest 95% Gew/Gew%, bezogen auf die niedermolekulare Thiolverbindung zur Verfügung gestellt. Höhere Werte sind natürlich ebenfalls bevorzugt.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Präparation ist vorzugsweise in einer pharmazeutisch akzeptablen Pufferlösung formuliert, gegebenenfalls mit pharmazeutisch akzeptablen Stabilisatoren. Beispielsweise wird als Stabilisator Natriumcaprylat und/oder Natriumacetyltryptophanat verwendet. In der Regel wird man dabei auf Formulierungen, wie sie für den Einsatz der Proteinkomponente als nicht nitrosiertes Produkt angewendet werden, zurückgreifen können. Die Präparationen können auch als Spray oder in einer für die topische Anwendung geeigneten Form zur Verfügung gestellt werden. Insbesondere wird die Präparation in einer für die intravenöse Verabreichung geeigneten Form zur Verfügung gestellt. Bezüglich der Proteinkomponente zeichnet sich eine i.v.-verträgliche Präparation insbesondere durch einen niedrigen Aggregatgehalt aus bzw. ist frei von Aggregaten.
Selbstverständlich müssen auch für die Lagerung der erfindungsgemäßen Präparation oft Vorkehrungen getroffen werden, sodass diese Präparation über einen längeren Zeitraum stabil bleiben. Die erfindungsgemäße Präparation liegt daher zu Lagerzwecken vorzugsweise in gefrorener oder lyophilisierter Form vor, in welcher sie eine ausreichend lange Haltbarkeit aufweist. Dabei ist sowohl eine Lagerung der niedermolekularen Thiolverbindung und des nitrosierten Proteins der erfmdungsgemäßen Präparation in gemeinsamer als auch getrennter Form möglich.
Es hat sich gezeigt, dass beispielsweise für die aus Plasma oder Blut abgeleiteten Proteine, insbesondere für Albumin oder Hämoglobin, die Stabilität in Lösung bei einem pH- ert zwischen ungefähr 6 und 7 in einem geeigneten Puffersystem (z.B. Ringerlösung) am größten ist. Für die niedermolekularen Thiolverbindungen, insbesondere für reduziertes Glutathion und L-Cystein, hat sich anderseits gezeigt, dass die Stabilität in Lösung unter einem pH- ert von 7 am größten ist.
Die pharmazeutische Präparation auf Basis eines Proteins mit nitrosierten Thiolgruppen und einer niedermolekularen Thiolverbindung ist, im lyophilisiertem Zustand getrennt gelagert, stabil.
Die Nitrosierung kann im Unterschied zum bekannten Verfahren (z.B.: Stamler et al., (1992a) bevorzugt so durchgeführt werden, dass ausschließlich nach Bestimmung des „freien" Thiolgehaltes der Proteine equimolar zu diesem Anteil an „freien" Thiolgruppen nitrosiert wird und gleichzeitig eine niedermolekulare Thiolverbindung bereitgestellt wird. Dabei kommen als Proteinkomponente sowohl native thiolhältige Proteine als auch thiolhältige Proteine, bei denen die „freien" Thiolgruppen durch einen spezifisches Verfahren de-blockiert werden, in Betracht.
Die Abtrennung der Reaktionsmittel bzw. der Reaktionsprodukte erfolgt nach der Nitrosierungsreaktion und vorzugsweise in einem quantitativen Ausmaß bzw. bis zu einem Wert unter der Nachweisgrenze.
Die erfindungsgemäße Präparation zeichnet sich in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform auch durch einen niedrigen Aggregatgehalt der Proteinkomponente aus. Insbesondere liegt der Anteil an Aggregaten in der pharmazeutischen Präparation unter 20°/o, bevorzugterweise unter 10%, am meisten bevorzugt unter 5%.
Die Nitrosierung der thiolhältigen Proteine wird unter aeroben Bedingungen vorgenommen, insbesondere wenn mit saurem Natriumnitrit gearbeitet wird.
Die Nitrosierung wird vorzugsweise mit einem Agens, ausgewählt aus HNO2, HNO, NOC1, NO+, RNO2, N2O3, N2O4, NO2- und NO-Radikal, und in einem sauren Medium durchgeführt. Auch organische NO-Donoren können eingesetzt werden. Um den Grad der N- und C-Nitrosierung möglichst gering zu halten, sollte die Nitrosierung mit einem Agens bezogen auf Freisetzung von NO equimolar zum „freien" Thiolgruppen- Gehalt des Proteins vorgenommen werden. Natürlich kann auch ein kleineres Verhältnis an Agens für die Nitrosierung bezogen auf den Thiolgruppen-Gehalt des Proteins zugesetzt werden, bevorzugt ist aber ein Verhältnis von 1 :1. Da die S-Nitrosierung bevorzugt und wesentlich schneller als die N- und C-Nitrosierungen abläuft, ist durch eine equimolare Nitrosierung ein minimaler N-und C-Nitrosierungsgrad des Proteins garantiert. Auch sollte die Zeitdauer der Nitrosierung möglichst knapp bemessen werden. Bevorzugterweise wird daher die Nitrosierung während einer Zeitdauer von 2 Minuten bis mehreren Stunden, vorzugsweise 30 Minuten, bei einer Temperatur zwischen 15-30 °C, vorzugsweise bei Raumtemperatur in einer wässrigen Lösung bei pH 0,3 bis 3,5, am meisten bevorzugt bei pH 1,0 bis 3,0 vorzugsweise im sauren Bereich bis pH 1,5 durchgeführt.
Als Ausgangsmaterial für die Proteinkomponente können sämtliche Arten von Proteinfraktionen verwendet werden, also insbesondere auch Blut, Plasma, Serum, eine Plasmafraktion oder eine gereinigte Proteinfraktion, aber auch Kulturüberstände oder entsprechende Extrakte. Falls jedoch Substanzen im Ausgangsmaterial enthalten sind, welche den Nitrosierungsschritt negativ beeinträchtigen können, wie beispielsweise niedermolekulare Thiolgruppen-hältige Proteine oder Thiolgruppen-hältige Verbindungen, sollten diese vorzugsweise abgetrennt werden. Bevorzugte Plasmafraktionen sind solche nach der Colin Fraktionierung und insbesondere die Cohn II- und III-Fraktion oder die Cohn IV-Fraktion.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens können für die Proteinkomponente auch eine ganze Reihe weiterer Reinigungsschritte in beliebigen Punkten des Verfahrens vorgesehen werden.
Ein weiterer Reinigungsschritt, ausgewählt aus Fällung, Gelfiltration, Diafiltration, Ultrafiltration und chromatographische Reinigung, kann vorgesehen werden. Beispielsweise wird Albumin mittels einer Ionenaustauschchromatographie gereinigt.
Insbesondere kann vorgesehen werden, dass ein Reinigungsschritt nach der Nitrosierung des Proteins durchgeführt wird, so dass sich die dort eingesetzten Substanzen nicht gegenseitig beeinflussen und auch nicht in der fertigen nitrosierten Proteinkomponente vorhanden sind. Vorzugsweise wird dieser Reinigungsschritt in Form einer chromatographischen Reinigung, insbesondere mittels Gelpermeationschromatographie, durchgeführt
Eine Behandlung zur Inaktivierung von Viren wird vorzugsweise bereits vor der Nitrosierung durchgeführt, sie kann aber auch terminal, also anschließend an die Nitrosierung, vorgenommen werden.
Nach der Nitrosierung kann die Proteinkomponente des erfϊndungsgeroäßen Kombinationspräparates in an sich bekannter Weise zu einem pharmaz-eutischen Präparat aufgearbeitet werden. Für die Proteinkomponente hält man sich in der Hegel an die Formulierungsvorschriften (siehe Pharmakopöe) für die nicht-nitrosierte Proteinpräparation.
Die niedermolekulare Thiolverbindung, bevorzugt reduziertes Glutathion oder L-Cystein, wird in einer pharmazeutisch verabreichbaren Form als Reinsubstanz b ereitgestellt und mit der gereinigten, nitrosierten Proteinkomponente simultan i.v. applizier .
Bevorzugte medizinische Verwendungen dieses erfindungsgemäßen Kombinationspräparates umfassen die Herstellung einer Kombinationspräparation zur Verbesserung der Perfusion bzw. Mikrozirkulation, vorzugsweise in vitalen Organen wie z.B. im G-ehirn (zerebrale Ischämie, ischämischen Insult), im Herz (Myokardinfarkt), in der Niere oder in den Extremitäten bzw. im Gesamtorganismus. Damit kann die erfindungsgemäße Kombinationspräparation allgemein zur Verhinderung bzw. Behandlun-g von Ischämie- und Reperfusionsschäden eingesetzt werden. Die erfindungsgemäße Kombinationspräparation ist auch zur Behandlung von Schock, insbesondere traumatischem, hypovolämischem bzw. hämorrhagischem oder neurogenem Schock geeignet.
Die Kombinationspräparation gemäß der vorliegenden Erfindung kann auf verschiedenen chirurgischen Gebieten verwendet werden, beispielsweise in der Transplantationschirurgie und bei allen chirurgischen Eingriffen mit nachfolgender Reperfusion. Sie ist besonders zur Behandlung und/oder Prophylaxe einer Restenose nach Angioplastie geeignet. Die Kombinationspräparation kann auch zur Behandlung und/oder Prophylaxe thrombotischer Zustände verwendet werden, d.h. solcher, die mit einer Blutplättchenadhäsion/-aggregation verbunden sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann der S-NO- Gewebsplasminogen-Aktivator als thrombolytisches Mittel verwendet werden.
Die Kombinationspräparation ist weiters zur Relaxierung der nicht-vaskulären, glatten Muskulatur, wie z.B. der glatten Muskulatur der Luftwege, verwendbar. Daher kann die Präparation gemäß der vorliegenden Erfindung zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Atemwegserkrankungen verwendet werden. Sie karm auch zur Diagnose und/oder Behandlung von Erektionsstörungen des Mannes nützlich sein.
Eine weitere, wesentlich bevorzugte, medizinische Verwendung des erfindungsgemäßen Kombinationspräparates umfasst die Herstellung einer Kombinationspräparation zur kontrollierten Reduktion des Blutdruckes, wie z.B. bei hypertonen Krisen (d.h. chronische bzw. akute Bluthochdruckkrisen). Dabei wird in der Regel eine höhere Dosierung eingesetzt werden, als zur Verhinderung bzw. Behandlung von Ischämie- und Reperfusionsschäden.
Die medizinische Kombinationspräparation wird vorzugsweise bezüglich der Proteinkomponente in einer Dosis bereitgestellt, die, außer bei Albumin, jener des nicht- nitrosierten Proteins entspricht. Bei Albumin als Proteinkomponente ist die Dosis vor allem von der medizinischen Indikation abhängig. Bei der Verhinderung bzw. Behandlung von Ischämie- und Reperfusionsschäden wird, je nach S-Nitrosograd des Albuminpräparates, eine Dosierung von 0,035-1,0 μmol/kg/h empfohlen. Bei der Reduktion des Blutdruckes sind höhere Dosierungen anzuwenden (z.B. bis zu 10 μmol/kg/h von S-NO- Albumin mit einem S- Nitrosierungsgrad von ~ 26%). Für die niedermolekulare Thiolverbindung (z.B. reduziertes Glutathion) wird eine Dosis von 12-140 μmol/kg/h empfohlen. Die zu verabreichende Menge bzw. Dosis hängt von den Anforderungen des Patienten ab, beispielsweise von Parametern wie Hämatokrit, Oxygenierung, mittlerer arterieller und venöser Blutdruck bzw. pulmonal arterieller Druck, und kann von Fall zu Fall recht unterschiedlich sein. Für die Plättchenadhäsions/aggregationshemmende Wirkung können auch wesentlich geringere Dosierungen eingesetzt werden.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Kombinationspräparates ist, dass mindestens der gleiche Wirkungsgrad mit Thiolgruppen-hältigen Proteinen erzielt wird, als mit Monopräparationen von Thiolgruppen-hältigen Proteinen, bei denen die frei verfügbare Thiolgruppe durch reduktive Vorbehandlung auf 90% freie SH-Gruppen pro Mol Protein erhöht wurde. Verfahrenstechnisch wird dabei die reduktive Vorbehandlung vermieden. Eine equimolare Nitrosierung zur frei verfügbaren Thiolgruppe garantiert den gleichen Reinheitsgrad der Wirkkomponente der Proteinpräparation (N-, C-, O-Nitrosierang <5%). Sowohl Albumin (4-5 g/dL Plasma) als auch reduziertes L-Glutathion (< 5 μmol/L) sind natürlich vorkommende Plasmakomponenten. Eine Limitierung der natürlich auftretenden Transnitrosierungsreaktion ist durch den physiologisch vorkommenden reduzierten L- Glutathionspiegel im Plasma gegeben. Durch Bereitstellung von reduziertem L-Glutathion ist die Freisetzung der Wirksubstanz NO der S -Nitrosierten Proteinkomponente sogar dosisabhängig vom reduzierten L-Glutathion steuerbar.
Selbstverständlich können allgemein bezüglich der Proteinkomponente die erfindungsgemäße Kombinationspräparation auch für jegliche Indikation der nicht-nitrosierten Proteine verwendet werden, da ihre physiologische Wirkung trotz Nitrosierung erhalten bleibt. Zusätzlich jedoch stellen Zustände, welche das Zurverfügungstellen eines erhöhten NO- Gehaltes erfordern, bevorzugte Indikationen für die erfindungsgemäßen Kombinationspräparate dar.
Herstellung von equimolar zur frei verfügbaren Thiolgruppe nitrosiertem Human Serum Albumin und Bereitstellung von reduziertem Glutathion:
a) Bestimmung des Verhältnisses von freien SH-Gruppen pro Mol Protein vor der Nitrosierung.
Das Verhältnis von freien SH-Gruppen pro Mol Protein wurde mittels des Ellmanreagens (Ellman G.L., Arch. Biochem. Biophys. 82 (1959), 70-77) nach Sedlak and Lindsay, Anal. Biochem. 25 (1968), 192-205, bestimmt.
So ist für Human Albumin 20% (Hersteller: Baxter) ein SH-Gruppengehalt von 26% (mol/mol, SH-Gruppengehalt zu Protein) festgestellt worden. Nach reduktiver Vorbehandlung einer weiteren Human Albumin Präparation (AT 405 135; US 6 124 255 und US 6 358 918) sind Werte bis zu 95% erreich- und nachweisbar. b) Eqimolare Nitrosierierung zum freien SH-Gruppengehalt der jeweiligen Human Albumin Präparation
Die Nitrosierung der Albuminpräparationen erfolgte equimolar zum Gehalt der freien SH- Gruppen (Verhältnis: 1 : 1 bis maximal 1 : 1 ,2 molar zum ermittelten Wert) mit NaNO2 in 0,2 mol/L HC1 bei pH 1,5-2,5 für eine Zeitdauer von 15-30 min bei Raumtemperatur. Anschließend wurde mit 1 mol/L NaOH neutralisiert. Zur Abtrennung unerwünschter Reaktanten wurde eine präparative Gelpermeationschromatographie, unter Verwendung einer stationären Phase aus Perlen mit einem heteroporösen, gequollenen Netzwerk eines Toyopearl TSK HW 40 (F) Gels, durchgeführt. Die Elution erfolgte mit bidestilliertem Wasser bei 4°C. Anschließend wurde die gereinigte S-Nitroso-Albumin enthaltende Fraktion (S-NO-Albumin/ Albumin) lyophilisiert.
S-Nitrosogradbestimmung der Proteinfraktion mit HPLC unter Verwendung der Saville- und Griess Reaktion
Die Analyse kann vor oder nach der Reinigung mittels präparativer Gelpermeationschromatographie erfolgen. Bei dieser Methode werden, falls vorhanden, überschüssiges Nitrosierungsagens und Puffersubstanzen mittels einer Gelpermeationssäule (Toyopearl TSK HW-40-S) vom S-NO-Albumin/ Albumin getrennt. Anschließend erfolgt in einem Nachsäulenderivatisierungsverfahren mittels der Saville-Reaktion (Saville B., Analyst 83 (1958), 670-672) eine selektive Abspaltung der NO-Gruppe vom RS-NO durch Hg2+. Simultan wird das entstandene Nitrit durch eine Farbreaktion (Griess-Reaktion; Griess, Ber.Dtsch. Chem. Ges. 12 (1897), 426-428) photometrisch bei 541 nm delektiert. Die Chromatogramme (Fig. 4) zeigen equimolar nitrosierte S-NO-HSA Präparationen mit unterschiedlichem S-Nitrosograd: a) equimolar zur freien SH-Gruppe nitrosiertes Human Albumin mit einem freien SH-Gruppen Anteil pro mol Protein von 26%; b) equimolar zur freien SH-Gruppe nitrosiertes Human Albumin, welches durch reduktive Vorbehandlung einen freien SH-Gruppen Anteil pro Mol Protein von 74 % aufwies; c) analog zu b) nur erfolgte die Nitrosierung nicht equimolar sondern mit einem 6-fachen molaren Überschuss an Nitrosierungsagens .
Die angeführten Prozentsätze sind nach dem Saville-Prinzip die tatsächlichen S- Nitrosierungsgrade am Protein. Bei der Bestimmung des S-Nitrosierungsgrades vor der präparativen Reinigung resultiert ein möglicher zweiter Peak im Chromatogramm vom überschüssigen Nitrosierungsagens (Chromatogramm c). Bei equimolar zur freien SH-Gruppe nitrosierte Albuminpräparationen ist Nitrit nur in Spuren nachweisbar.
Bereitstellung von reduziertem Glutathion
Als niedermolekulare Thiolverbindung wurde durch Peptidsynthese hergestelltes reduziertes Glutathion mit einem Reinheitsgrad von mindestens 95% zur Verfügung gestellt.
Die Wirkung des erfindungsgemäßen Kombinationspräparates wird nachfolgend an einer bevorzugten Ausführungsform beschrieben.
Beispiel 1
Im Beispiel 1 wird am Kaninchenmodell die Absenkung des mittleren arteriellen Druckes durch Applikation eines erfindungsgemäßen Kombinationspräparates bestehend aus einer nitrosierten Serum-Albumin-Präparation und reduziertem Glutathion gezeigt. Zum Vergleich wird die Wirkung einer nitrosierten Serum- Albumin-Präparation gezeigt, die ohne reduziertem Glutathion appliziert wurde.
Das Kaninchen wurde anästhesiert, wobei die Anästhesie mit Ketaset (50 mg/kg; bolus) und Xylasin (5mg/kg; bolus) eingeleitet und mit einer kontinuierlichen Infusion via die Vena auricularis von Ketaset (35 mg/kg/h) und 5 mg Xylasin (5 mg/kg/h) gelöst in physiologischer Kochsalzlösung (5 mL/h) aufrechterhalten. Nach der Tracheotomie und Intubation wurden die Kaninchen an das Beatmungsgerät (Ventilator Harvard Apparatus- INSPIRA ASV) angeschlossen (Tidal volume = 0,0062 x Körpergewicht (kg)1'0 , Respirationsrate = 53,5 x Körpergewicht (kg)"0'26).
Der mittlere arterielle Druck (MAP) wurde mittels eines Drucktransducers in der Arterie femoralis gemessen (Verstärkereinheit - TAM-A und Isotec Drucktransducer; Hugo Sachs Elektronik). Die Ergebnisse sind in den Figuren la-f dargestellt. Die Fig. la zeigt den Dosis-abhängigen Vergleich der Absenkung des mittleren arteriellen Druckes (MAP) in den Kaninchen nach Bolusgaben von nitrosiertem Serum Albumin mit und ohne gleichzeitige kontinuierliche Infusion von reduziertem Glutathion (2,2 μmol/kg/min). Infusion: Vena femoralis (n = 3 per Datenpunkt; Mittelwert ± Standardabweichung).
Die Fig. lb ist ein repräsentatives Beispiel der Absenkung des mittleren arteriellen Druckes bei einer Bolusinfusion von 0,1 μmol/kg S-NO-HSA mit und ohne kontinuierliche Infusion von reduziertem Glutathion (2,2 μmol/kg/min).
Die Figuren lc und ld zeigen die Absenkung des mittleren arteriellen Druckes bei zwei verschiedenen Dosen einer nitrosierten Serum Albumin Präparation mit hohem Nitroserungsgrad (70%) und einem equimolar zur frei verfügbaren Thiolgruppe nitrosierten nativen Serum Albumin mit niedrigem Nitrosierungsgrad (26%) mit gleichzeitiger Infusion von reduziertem Glutathion (n = 3 per Datenpunkt; Mittelwert ± Standardabweichung).
Die Figur 1 e ist ein repräsentatives Beispiel der Absenkung des mittleren arteriellen Druckes durch Bolusinjektionen von 0,1 μmol/kg S-NO-HSA mit variablen Konzentrationen von GSH in vivo. Infusion: Vena femoralis.
Die Figur lf ist ein repräsentatives Beispiel der Absenkung des mittleren arteriellen Druckes durch simultane, kontinuierliche Infusion von 0,05 μmol/kg/min S-NO-HSA mit steigender Konzentration von reduziertem Glutathion (a: 0,0 μmol GSH/kg/min, b: 0,1 μmol GSH/kg/min, c: 0,3 μmol GSH/kg/min). S-NO-HSA wurde über die Vena jugularis und reduziertes Glutathion über die zweite Vena auricularis (oder Vena femoralis) infundiert.
Beispiel 2
Im Beispiel 2 wird die Potenzierung der NO-Freisetzung einer nitrosierten Serum Albumin Präparation durch Bereitstellung einer niedermolekularen Thiolverbindung am Beispiel von reduziertem Glutathion gezeigt. Die NO-Konzentration wurde in vitro gemessen.
Die Figur 2a zeigt die konzentrationsabhängige Potenzierung der NO-Freisetzung einer nitrosierten Serum Albumin Präparation durch reduziertes Glutathion, gemessen mit einem porphyrinischen Mikrosensor in vitro (S-NO-HSA: 30 μmol/L; n=6, Mittelwert ± Standardabweichung; *P < 0,05 vs S-NO-HSA; nP < 0,05 vs 25 μmol/L GSH).
Die Figur 2b zeigt ein repräsentatives Beispiel der in vitro Messung der Potenzierung der NO- Freisetzung einer nitrosierten Serum Albumin Präparation durch reduziertes Glutathion.
Beispiel 3
Mit dem Beispiel 3 wird die Wirkung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kombinationspräparates auf die Thrombozyten- Aggregation gezeigt.
Die Thrombozyten- Aggregation wurde mit humanem Thrombozyten-reichen Plasma (TRP) in einem Dual Kanal Chronolog Aggregometer in Prinzip nach der Methode von Born (1969) durchgeführt. Zu Beginn jedes Experimentes wurde die exakte Dosis an Kollagen, für die durch Kollagen induzierte Aggregation (~ lμg Kollagen/mL TRP ) bestimmt (95-100% Inhibition der Kollagen induzierten Aggregation durch 300 μmol/L Acetylsalicylsaure). In den Experimenten wurden steigende Konzentrationen reduziertes Glutathion primär mit TRP eine Minute im Aggregometer vorinkubiert und nach einer Minute S-NO-HSA (2 - 4 μmol/L; Konzentration, die eine 20% Inhibition der Kollagen induzierte Aggregation bewirkt) versetzt. Nach einer weiteren Minute wurde die Aggregation mit Kollagen induziert. Kontrollexperimente mit Kollagen allein wurden nach jeder zweiten bis dritten Messung durchgeführt. Die Ergebnisse werden als % Aggregation relativ zu der durch Kollagen induzierten Aggregation (100 %) dargestellt (Mittelwert ± Standardfehler). In den Abbildungen sind die Endkonzentrationen im Aggregationsgefäß angegeben. Bei Experimenten mit anderen thiol- und nichtthiolhältigen Substanzen ( N-Acetyl-L-cystein , Ascorbinsäure, DL-Homocystein, Taurin, L-Cystein) wurde analog zu den Versuchen mit reduziertem Glutathion primär mit diesen Substanzen vorinkubiert.
Die Figur 3 a zeigt die dosisabhängige Potenzierung der Inhibierung der Kollagen induzierten Thrombozytenaggregation durch S-NO-HSA (2- 4 μmol/L) mit reduziertem Glutathion (n=6; *P< 0.05 versus S-NO-HSA). Die Figur 3b zeigt die Wirkung von N-Acetylcystein (1 mmol/L), Ascorbinsäure (Vit.C; 200 μmol/L), reduziertes Glutathion, Homocystein, Taurin und Cystein (alle 1 mmol/L) auf die Inhibierung der Kollagen induzierten Thrombozytenaggregation durch S-NO-HSA (2- 4 μmol/L) n > 5 (Taurin, n=3); *P< 0.01 versus S-NO-HSA.

Claims

Patentansprüche:
1. Pharmazeutisches Kombinationspräparat enthaltend ein therapeutisches Protein mit SH-Gruppen, die nitrosiert sind, und eine Thiolgruppen-hältige Verbindung mit einem mittleren Molekulargewicht von maximal 10.000.
2. Pharmazeutisches Kombinationspräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens 90% der vorhandenen SH-Gruppen nitrosiert sind.
3. Pharmazeutisches Kombinationspräparat nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als therapeutisches Protein mit nitrosierten SH-Gruppen S-Nitroso- Albumin, S-Nitroso-Orosomucoid, S-Nitroso-Plasminogen-Aktivator, S-Nitroso-Fibrinogen, S-Nitroso-Lys-Plasminogen oder S-Nitroso-Hämoglobin enthalten ist.
4. Pharmazeutisches Kombinationspräparat nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Thiolgruppen-hältige Verbindung reduziertes Glutathion, L-Cystein, N-Acetyl-Cystein, L-Cysteinylglycin, γ-Glutamylcystein, Penicillamin, Penicillamid, N- Acetyl-Penicillamin, N-Acetyl-Penicillamid, Homocystein, Captopril, Dehydroliponsäure und/oder deren oxidierte Form, die nach Verabreichung in vivo reduziert wird, enthalten ist.
5. Pharmazeutisches Kombinationspräparat nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass als therapeutisches Protein mit nitrosierten SH-Gruppen S-Nitroso- Albumin und als Thiolgruppen-hältige Verbindung reduziertes Glutathion enthalten ist.
6. Pharmazeutisches Kombinationspräparat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Thiogruppen-hältige Verbindung ein in menschlichem Blut und Gewebe vorkommende Verbindung, insbesondere reduziertes Glutathion, L-Cystein, L- Cysteinylglycin, γ-Glutamylcystein oder Dehydroliponsäure, enthalten ist.
7. Pharmazeutisches Kombinationspräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein durch Nitrosierung erhaltenes therapeutisches Protein enthalten ist, bei welchem sich der Nitrosierungsgrad zu mindestens 90% aus S-Nitrosierung und zu maximal 10% aus N,O,C-Nitrosierung zusammensetzt.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016166524A1 (en) * 2015-04-13 2016-10-20 Jellagen Pty Ltd Modified collagen, methods of manufacture thereof

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017525370A (ja) 2014-08-21 2017-09-07 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 腫瘍壊死因子スーパーファミリーおよびｔｎｆ様リガンドムテインならびに腫瘍壊死因子スーパーファミリーおよびｔｎｆ様リガンドムテインを調製および使用する方法
US20160367620A1 (en) 2015-06-19 2016-12-22 Harry B. Demopoulos Glutathione
SI3331902T1 (sl) 2015-08-07 2021-09-30 ALX Oncology Inc. Konstrukti z domeno SIRP-alfa ali njegove različice
EA034582B1 (ru) 2015-08-07 2020-02-21 АЭлЭкс ОНКОЛОДЖИ ИНК. Конструкции варианта sirp-альфа и их применение
BR112021024003A2 (pt) 2019-05-31 2022-04-19 Alx Oncology Inc Métodos de tratamento de câncer com fusão sirp alfa-fc em combinação com um inibidor de checkpoint imunológico

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0853944A2 (de) * 1997-01-17 1998-07-22 IMMUNO Aktiengesellschaft Präparation umfassend Thiolgruppen-hältige Proteine
WO2001065935A1 (en) * 2000-03-08 2001-09-13 Yoram Vodovotz Kidney perfusion solution containing nitric oxide donor

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0486621A4 (en) * 1989-08-09 1993-03-31 The Children's Medical Center Corporation Nmda oxidizing agents for protecting neurons from injury
US6896899B2 (en) * 1996-12-31 2005-05-24 Antioxidant Pharmaceuticals Corp. Pharmaceutical preparations of glutathione and methods of administration thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0853944A2 (de) * 1997-01-17 1998-07-22 IMMUNO Aktiengesellschaft Präparation umfassend Thiolgruppen-hältige Proteine
WO2001065935A1 (en) * 2000-03-08 2001-09-13 Yoram Vodovotz Kidney perfusion solution containing nitric oxide donor

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CRANE MICHAEL S ET AL: "Novel role for low molecular weight plasma thiols in nitric oxide-mediated control of platelet function." THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 6 DEC 2002, Bd. 277, Nr. 49, 6. Dezember 2002 (2002-12-06), Seiten 46858-46863, XP002338092 ISSN: 0021-9258 *
MEYER D J ET AL: "Kinetics and equilibria of S-nitrosothiol-thiol exchange between glutathione, cysteine, penicillamines and serum albumin" FEBS LETTERS 1994 NETHERLANDS, Bd. 345, Nr. 2-3, 1994, Seiten 177-180, XP002338093 ISSN: 0014-5793 *
RICHARDSON G ET AL: "Potential therapeutic uses for S-nitrosothiols." CLINICAL SCIENCE (LONDON, ENGLAND : 1979) JAN 2002, Bd. 102, Nr. 1, Januar 2002 (2002-01), Seiten 99-105, XP002338091 ISSN: 0143-5221 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016166524A1 (en) * 2015-04-13 2016-10-20 Jellagen Pty Ltd Modified collagen, methods of manufacture thereof
US11485772B2 (en) 2015-04-13 2022-11-01 Jellagen Pty Ltd Modified collagen, methods of manufacture thereof

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