JPH04262799A - 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット - Google Patents
核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キットInfo
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- JPH04262799A JPH04262799A JP4619391A JP4619391A JPH04262799A JP H04262799 A JPH04262799 A JP H04262799A JP 4619391 A JP4619391 A JP 4619391A JP 4619391 A JP4619391 A JP 4619391A JP H04262799 A JPH04262799 A JP H04262799A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸の増幅方法およびそ
のための試薬キットに関する。この発明は特に、塩基配
列が既知の核酸を、その初期に存在する量に比較して、
より大量に生成させる方法に関する。本発明を実施する
ことにより、遺伝病、癌、感染症などの診断を行うこと
が容易となる。
のための試薬キットに関する。この発明は特に、塩基配
列が既知の核酸を、その初期に存在する量に比較して、
より大量に生成させる方法に関する。本発明を実施する
ことにより、遺伝病、癌、感染症などの診断を行うこと
が容易となる。
【０００２】
【従来技術】近年、ハイブリダイゼーションによる核酸
の検出は遺伝病、癌、感染症などの診断のために有効な
手段として汎用されるようになってきた。核酸検出法に
おいて、標的とする塩基配列は、対象となる核酸のほん
の僅かな部分である場合があり、非放射性標識プローブ
や末端を放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いた検出法では、感度上の問題等によりその
検出が困難である。そのため、プローブ検出システムの
感度を向上させるための努力が多くなされている（ＷＯ
８７／０３６２２など）。また、感度向上の手段として
、標的とする核酸をＤＮＡポリメラーゼにより増幅させ
る方法（特開昭６１−２７４６９７号公報；以下「ＰＣ
Ｒ」と略すことがある）が開示されている。しかし、こ
の方法では複雑な温度の調節が必要であり、専用の機器
を必要とするという欠点がある。 ＤＮＡリガー
ゼを用いる増幅法も開示されている（ＷＯ８９／１２６
９６ 、特開平２−２９３４号公報など） 。しかし、
これらの方法ではＤＮＡリガーゼが平滑末端を連結する
反応 （ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ） に
より非特異的増幅が起こる。この問題の回避法として、
ＷＯ８９／１２６９６では３組以上のプローブを用いて
いるが、プローブ数が多くコスト高となってしまう欠点
がある。また、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡより
ＲＮＡが生成されることは周知であり、ＲＮＡポリメラ
ーゼを用いて核酸の増幅を行う方法も開示されている（
ＷＯ８９／０１０５０）。しかしながら、この方法では
ＲＮＡポリメラーゼによる転写増幅のみでは充分な増幅
は困難である。従って、生成したＲＮＡに再度逆転写酵
素を作用させＤＮＡを生成させる操作を実施している。 一方、標的とする核酸にプローブをハイブリダイズさせ
た後、正しくハイブリダイズしたプローブのみを増幅す
る方法（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ｖｏｌ．６，
１１９７， １９８８）も知られている。しかしこの
方法では、非特異反応により結合したプローブも増幅さ
れ、ブランク値の上昇をきたすという問題がある。
の検出は遺伝病、癌、感染症などの診断のために有効な
手段として汎用されるようになってきた。核酸検出法に
おいて、標的とする塩基配列は、対象となる核酸のほん
の僅かな部分である場合があり、非放射性標識プローブ
や末端を放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いた検出法では、感度上の問題等によりその
検出が困難である。そのため、プローブ検出システムの
感度を向上させるための努力が多くなされている（ＷＯ
８７／０３６２２など）。また、感度向上の手段として
、標的とする核酸をＤＮＡポリメラーゼにより増幅させ
る方法（特開昭６１−２７４６９７号公報；以下「ＰＣ
Ｒ」と略すことがある）が開示されている。しかし、こ
の方法では複雑な温度の調節が必要であり、専用の機器
を必要とするという欠点がある。 ＤＮＡリガー
ゼを用いる増幅法も開示されている（ＷＯ８９／１２６
９６ 、特開平２−２９３４号公報など） 。しかし、
これらの方法ではＤＮＡリガーゼが平滑末端を連結する
反応 （ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ） に
より非特異的増幅が起こる。この問題の回避法として、
ＷＯ８９／１２６９６では３組以上のプローブを用いて
いるが、プローブ数が多くコスト高となってしまう欠点
がある。また、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡより
ＲＮＡが生成されることは周知であり、ＲＮＡポリメラ
ーゼを用いて核酸の増幅を行う方法も開示されている（
ＷＯ８９／０１０５０）。しかしながら、この方法では
ＲＮＡポリメラーゼによる転写増幅のみでは充分な増幅
は困難である。従って、生成したＲＮＡに再度逆転写酵
素を作用させＤＮＡを生成させる操作を実施している。 一方、標的とする核酸にプローブをハイブリダイズさせ
た後、正しくハイブリダイズしたプローブのみを増幅す
る方法（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ｖｏｌ．６，
１１９７， １９８８）も知られている。しかしこの
方法では、非特異反応により結合したプローブも増幅さ
れ、ブランク値の上昇をきたすという問題がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、標的
とする核酸を簡便に増幅させる方法を提供することであ
る。
とする核酸を簡便に増幅させる方法を提供することであ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、プローブとして
標的核酸の存在下でのみ環状となりうるヌクレオチドを
用いることにより、上記課題が解決されることを見出し
て、本発明を完成させるに到った。即ち、本発明は検体
試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在の結果として環状化
するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌク
レオチド（Ｂ）と、少なくともこの直鎖状プローブヌク
レオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を有するプライ
マーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、標的核酸配列（Ａ）
に直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）をハイブリダイズ
させ、直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）を環状化し、
生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型とし
、プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し、鋳型と相補
的な配列の繰り返した配列を有する一本鎖核酸を生成さ
せることにより、核酸配列を増幅させることを特徴とす
る核配列の増幅方法である。また本発明の核酸を増幅す
るための試薬キットは、検体試料中の標的核酸配列（Ａ
）の存在の結果として環状化するように設計された配列
を有する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、該直鎖状
プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を
有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）、連結手段、核酸
ポリメラーゼおよびヌクレオチド三リン酸を含む核酸増
幅用試薬キットである。
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、プローブとして
標的核酸の存在下でのみ環状となりうるヌクレオチドを
用いることにより、上記課題が解決されることを見出し
て、本発明を完成させるに到った。即ち、本発明は検体
試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在の結果として環状化
するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌク
レオチド（Ｂ）と、少なくともこの直鎖状プローブヌク
レオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を有するプライ
マーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、標的核酸配列（Ａ）
に直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）をハイブリダイズ
させ、直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）を環状化し、
生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型とし
、プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し、鋳型と相補
的な配列の繰り返した配列を有する一本鎖核酸を生成さ
せることにより、核酸配列を増幅させることを特徴とす
る核配列の増幅方法である。また本発明の核酸を増幅す
るための試薬キットは、検体試料中の標的核酸配列（Ａ
）の存在の結果として環状化するように設計された配列
を有する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、該直鎖状
プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を
有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）、連結手段、核酸
ポリメラーゼおよびヌクレオチド三リン酸を含む核酸増
幅用試薬キットである。
【０００５】本発明では、検出したい標的配列とハイブ
リッドを形成することにより、リガ９ ゼを用いて環状
化することが可能となるように設計された核酸分子を使
用し、該環状化した核酸分子を鋳型として、ポリメラー
ゼ反応により核酸配列を増幅させる。本発明における標
的核酸（Ａ）は、単鎖でも二重鎖でもよく、比較的純粋
な状態であっても、核酸の混合物の一成分であってもよ
い。本発明に関する標的核酸の配列は長さ、構造等に特
に制限されない。
リッドを形成することにより、リガ９ ゼを用いて環状
化することが可能となるように設計された核酸分子を使
用し、該環状化した核酸分子を鋳型として、ポリメラー
ゼ反応により核酸配列を増幅させる。本発明における標
的核酸（Ａ）は、単鎖でも二重鎖でもよく、比較的純粋
な状態であっても、核酸の混合物の一成分であってもよ
い。本発明に関する標的核酸の配列は長さ、構造等に特
に制限されない。
【０００６】本発明におけるプローブヌクレオチド（Ｂ
）とは、検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在の結果
として環状化するように設計された配列を有する直鎖状
プローブヌクレオチドである（図１および図２のＢ参照
）。プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
は図２に示されるように、標的核酸とアニールする部分
を有する。該アニール部分は、それぞれ６〜４０ヌクレ
オチド、好ましくは各々１０〜３０ヌクレオチドの長さ
が使用される。５’末端と３’末端に位置する上記アニ
ール部分間を結ぶ配列の長さは、一般的に１〜１０００
個、好ましくは１０〜１００ 個のヌクレオチドであれ
ばよい。また、この領域にＲＮＡポリメラーゼのアンチ
プロモーター配列を含ませることも可能である。このＲ
ＮＡポリメラーゼのアンチプロモーター配列を持ったプ
ローブヌクレオチドを用いた場合、プライマーヌクレオ
チドとしてＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を持
つヌクレオチドを用いることにより、プロモーターに応
じたＲＮＡポリメラーゼ、およびリボヌクレオチド（Ａ
ＴＰ， ＣＴＰ， ＧＴＰ， ＵＴＰ）を作用させれば
、プローブヌクレオチドの相補鎖が繰り返し並んだＲＮ
Ａを合成することが可能である。
）とは、検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在の結果
として環状化するように設計された配列を有する直鎖状
プローブヌクレオチドである（図１および図２のＢ参照
）。プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
は図２に示されるように、標的核酸とアニールする部分
を有する。該アニール部分は、それぞれ６〜４０ヌクレ
オチド、好ましくは各々１０〜３０ヌクレオチドの長さ
が使用される。５’末端と３’末端に位置する上記アニ
ール部分間を結ぶ配列の長さは、一般的に１〜１０００
個、好ましくは１０〜１００ 個のヌクレオチドであれ
ばよい。また、この領域にＲＮＡポリメラーゼのアンチ
プロモーター配列を含ませることも可能である。このＲ
ＮＡポリメラーゼのアンチプロモーター配列を持ったプ
ローブヌクレオチドを用いた場合、プライマーヌクレオ
チドとしてＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を持
つヌクレオチドを用いることにより、プロモーターに応
じたＲＮＡポリメラーゼ、およびリボヌクレオチド（Ａ
ＴＰ， ＣＴＰ， ＧＴＰ， ＵＴＰ）を作用させれば
、プローブヌクレオチドの相補鎖が繰り返し並んだＲＮ
Ａを合成することが可能である。
【０００７】本発明のプライマーヌクレオチド（Ｃ）は
、プローブヌクレオチド（Ｂ）と少なくとも部分的に相
補的な配列を有していれば、構造、長さなどに制限され
ない。長さは一般的には、６〜４０ヌクレオチド、好ま
しくは１０〜３０ヌクレオチドが使用される。また、プ
ローブヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのアンチプロ
モーター配列を含む場合には、プライマーヌクレオチド
にプロモーター配列を含ませたものを使用することが可
能である。これらのオリゴヌクレオチド（Ｂ）および（
Ｃ）は、例えばＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ． ）のＤＮＡシンセサイザー ３
９１型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる
。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、
チオホスファイト法等いかなる方法で合成してもよい。 また、生物学的起源、例えば制限エンドヌクレアーゼ消
化物から単離してもよい。プローブヌクレオチド（Ｂ）
の５’末端にはリン酸基を付加しておくことが好ましい
。リン酸基の付加は、例えばＡＴＰの存在下で、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼにより行うことができる。
、プローブヌクレオチド（Ｂ）と少なくとも部分的に相
補的な配列を有していれば、構造、長さなどに制限され
ない。長さは一般的には、６〜４０ヌクレオチド、好ま
しくは１０〜３０ヌクレオチドが使用される。また、プ
ローブヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのアンチプロ
モーター配列を含む場合には、プライマーヌクレオチド
にプロモーター配列を含ませたものを使用することが可
能である。これらのオリゴヌクレオチド（Ｂ）および（
Ｃ）は、例えばＡＢＩ社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ． ）のＤＮＡシンセサイザー ３
９１型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる
。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、
チオホスファイト法等いかなる方法で合成してもよい。 また、生物学的起源、例えば制限エンドヌクレアーゼ消
化物から単離してもよい。プローブヌクレオチド（Ｂ）
の５’末端にはリン酸基を付加しておくことが好ましい
。リン酸基の付加は、例えばＡＴＰの存在下で、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼにより行うことができる。
【０００８】本発明で使用される核酸ポリメラーゼは、
ヘリカーゼ様活性を持つ核酸ポリメラーゼであれば、Ｄ
ＮＡポリメラーゼであっても、ＲＮＡポリメラーゼであ
ってもよい。例えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いれ
ば、環状核酸分子を鋳型として、鋳型と相補的な配列が
繰り返し並んだ核酸を合成することが可能である（Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４， ８９３５， １９
８９ ）。他にも、Ｍ２ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ． ｃ
ｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ 、Ｔ７ＲＮＡポリ
メラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリ
メラーゼなどが利用できる。
ヘリカーゼ様活性を持つ核酸ポリメラーゼであれば、Ｄ
ＮＡポリメラーゼであっても、ＲＮＡポリメラーゼであ
ってもよい。例えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いれ
ば、環状核酸分子を鋳型として、鋳型と相補的な配列が
繰り返し並んだ核酸を合成することが可能である（Ｊ．
Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４， ８９３５， １９
８９ ）。他にも、Ｍ２ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ． ｃ
ｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ 、Ｔ７ＲＮＡポリ
メラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリ
メラーゼなどが利用できる。
【０００９】本発明の核酸増幅方法は、標的核酸配列（
Ａ）に上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）をハイブ
リダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）を環
状化し、生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）を
鋳型として、プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し、
鋳型と相補的な配列の繰り返した配列を有する一本鎖核
酸を生成させることにより核酸配列を増幅させる。
Ａ）に上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）をハイブ
リダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）を環
状化し、生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）を
鋳型として、プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し、
鋳型と相補的な配列の繰り返した配列を有する一本鎖核
酸を生成させることにより核酸配列を増幅させる。
【００１０】本発明の核酸増幅法としては、次のような
実施態様が挙げられる。（１）検体試料中の標的核酸配
列（Ａ）の存在の結果として環状化するように設計され
た配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、
少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分
的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ
）を用いて、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特
徴とする核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作（ａ
）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド（
Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１
回繰り返す。
実施態様が挙げられる。（１）検体試料中の標的核酸配
列（Ａ）の存在の結果として環状化するように設計され
た配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、
少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分
的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ
）を用いて、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特
徴とする核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作（ａ
）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド（
Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１
回繰り返す。
【００１１】（２）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて
、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする核
酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
プライマーヌクレオチド（Ｃ）とのハイブリッドを形成
させる。 操作（ｂ）：検体試料中の標的核酸（Ａ）を、操作（ａ
）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド（
Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ ）で生成したアニール物中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１
回繰り返す。
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて
、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする核
酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
プライマーヌクレオチド（Ｃ）とのハイブリッドを形成
させる。 操作（ｂ）：検体試料中の標的核酸（Ａ）を、操作（ａ
）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド（
Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ ）で生成したアニール物中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１
回繰り返す。
【００１２】（３）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて
、下記の操作（ａ）〜（ｄ）を行うことを特徴とする核
酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）およびプライマーヌクレオチド（Ｃ
）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１
回繰り返す。
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて
、下記の操作（ａ）〜（ｄ）を行うことを特徴とする核
酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）およびプライマーヌクレオチド（Ｃ
）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１
回繰り返す。
【００１３】（４）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド （Ｂ）と部分的に相
補的な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用
いて、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とす
る核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と
３’末端を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする
。 操作（ｃ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作（ｂ
）で生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）とアニ
ールさせる。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１
回繰り返す。
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド （Ｂ）と部分的に相
補的な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用
いて、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とす
る核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と
３’末端を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする
。 操作（ｃ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作（ｂ
）で生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）とアニ
ールさせる。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１
回繰り返す。
【００１４】本発明の上記実施態様（３）の理解のため
に、図２に本発明の原理を模式的に示す。以下、図を用
いて本発明を説明する。尚、図中Ａは標的核酸、Ｂは直
鎖状プローブヌクレオチド、Ｂ’は環状化プローブヌク
レオチド、Ｃはプライマーヌクレオチド、Ｄは核酸ポリ
メラーゼを示す。 操作（ａ）：直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）中の検
出配列と標的核酸（Ａ）中の標的配列とのハイブリッド
を形成させる。同時に又は別々にプライマーヌクレオチ
ド（Ｃ）を該プローブヌクレオチド（Ｂ）にアニールさ
せる（図２（ａ）参照）。標的核酸が二重鎖の場合は加
熱、アルカリ処理、酸処理などにより変性して一本鎖と
する。加熱変性は例えば８０〜１０５ ℃で１〜５分間
処理することで実施できる。アルカリ処理は例えば、０
．２ 〜１規定のＮａＯＨ存在下で、１〜３０分間処理
し、等量のＨＣｌで中和して用いることができる。酸処
理は例えば０．０１〜１規定のＨＣｌ存在下で、１〜３
０分処理し、ＮａＯＨで中和して用いることができる。 他の方法として酵素的に鎖分解を行なうこともできる。 アニールは、好ましくはプローブヌクレオチド（Ｂ）お
よびプライマーヌクレオチド（Ｃ）について、それぞれ
、最大のアニール選択性をもたらすように、選択された
温度において行う。 一般的には標的核酸（Ａ）とプローブヌクレオチド（Ｂ
）、およびプローブヌクレオチド（Ｂ）とプライマーヌ
クレオチド（Ｃ）がそれぞれ特異的に結合し、且つミス
マッチによる非特異的結合が最小となるように、昇温さ
せて行われる。
に、図２に本発明の原理を模式的に示す。以下、図を用
いて本発明を説明する。尚、図中Ａは標的核酸、Ｂは直
鎖状プローブヌクレオチド、Ｂ’は環状化プローブヌク
レオチド、Ｃはプライマーヌクレオチド、Ｄは核酸ポリ
メラーゼを示す。 操作（ａ）：直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）中の検
出配列と標的核酸（Ａ）中の標的配列とのハイブリッド
を形成させる。同時に又は別々にプライマーヌクレオチ
ド（Ｃ）を該プローブヌクレオチド（Ｂ）にアニールさ
せる（図２（ａ）参照）。標的核酸が二重鎖の場合は加
熱、アルカリ処理、酸処理などにより変性して一本鎖と
する。加熱変性は例えば８０〜１０５ ℃で１〜５分間
処理することで実施できる。アルカリ処理は例えば、０
．２ 〜１規定のＮａＯＨ存在下で、１〜３０分間処理
し、等量のＨＣｌで中和して用いることができる。酸処
理は例えば０．０１〜１規定のＨＣｌ存在下で、１〜３
０分処理し、ＮａＯＨで中和して用いることができる。 他の方法として酵素的に鎖分解を行なうこともできる。 アニールは、好ましくはプローブヌクレオチド（Ｂ）お
よびプライマーヌクレオチド（Ｃ）について、それぞれ
、最大のアニール選択性をもたらすように、選択された
温度において行う。 一般的には標的核酸（Ａ）とプローブヌクレオチド（Ｂ
）、およびプローブヌクレオチド（Ｂ）とプライマーヌ
クレオチド（Ｃ）がそれぞれ特異的に結合し、且つミス
マッチによる非特異的結合が最小となるように、昇温さ
せて行われる。
【００１５】操作（ｂ）：上記プローブヌクレオチド（
Ｂ）の５’末端と３’末端を連結させ、環状化プローブ
ヌクレオチド（Ｂ’）とする（図２（ｂ）参照）。該プ
ローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端がハイ
ブリッド形成の結果、隣接する場合、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）
ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ＤＮＡリガーゼ等の連結酵素を使用する方法
が好ましい。また互いに隣接していない場合、ＤＮＡポ
リメラーゼおよび／または逆転写酵素によりギャップを
埋めた後、連結酵素により連結することができる。この
場合、ギャップ部分がＡ−Ｔペアのみ、またはＣ−Ｇペ
アのみで構成されるようにプローブヌクレオチド（Ｂ）
を設計しておけば、添加するモノヌクレオチドをそれぞ
れＡ，ＴまたはＣ，Ｇのみとすることでミスマッチによ
りアニールしたオリゴヌクレオチドが間違って伸長され
ることを防止する方法もとることができる。連結酵素を
使用する連結方法については、特開昭６３−２２１９７
号公報および ＷＯ９０／０１０６９ に開示の方法等
、公知の手法により行うことができる。本発明において
、標的核酸とアニールするオリゴヌクレオチド部分は６
〜４０ヌクレオチド、好ましくは１０〜３０ヌクレオチ
ドの長さのものが使用される。
Ｂ）の５’末端と３’末端を連結させ、環状化プローブ
ヌクレオチド（Ｂ’）とする（図２（ｂ）参照）。該プ
ローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端がハイ
ブリッド形成の結果、隣接する場合、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）
ＤＮＡリガーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ＤＮＡリガーゼ等の連結酵素を使用する方法
が好ましい。また互いに隣接していない場合、ＤＮＡポ
リメラーゼおよび／または逆転写酵素によりギャップを
埋めた後、連結酵素により連結することができる。この
場合、ギャップ部分がＡ−Ｔペアのみ、またはＣ−Ｇペ
アのみで構成されるようにプローブヌクレオチド（Ｂ）
を設計しておけば、添加するモノヌクレオチドをそれぞ
れＡ，ＴまたはＣ，Ｇのみとすることでミスマッチによ
りアニールしたオリゴヌクレオチドが間違って伸長され
ることを防止する方法もとることができる。連結酵素を
使用する連結方法については、特開昭６３−２２１９７
号公報および ＷＯ９０／０１０６９ に開示の方法等
、公知の手法により行うことができる。本発明において
、標的核酸とアニールするオリゴヌクレオチド部分は６
〜４０ヌクレオチド、好ましくは１０〜３０ヌクレオチ
ドの長さのものが使用される。
【００１６】操作（ｃ）：操作（ｂ）で環状化したプロ
ーブヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型に、また該プローブヌ
クレオチド（Ｂ’）にアニールしたプライマーヌクレオ
チド（Ｃ）を利用して、核酸ポリメラーゼ（Ｄ）を用い
て核酸合成反応を行う（図２（Ｃ）参照）。該操作は、
例えばｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ，
ｄＴＴＰ の４ 種のデオキシリボヌクレオチド）
およびＤＮＡポリメラーゼ（例えばφ２９ＤＮＡポリメ
ラーゼ、Ｍ２ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ ＤＮＡポリメラーゼ等の核酸合成能力の高い酵素
）を用いて、上記環状ヌクレオチドを鋳型にして伸長反
応を行わせることによって行われる。この方法は、例え
ばジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ； ５６， ３４１−３６１， １９７１ ）に記
載されている技術及び条件を用いることができる。これ
らの酵素は、ＤＮＡの二重鎖の部分を剥しながらプライ
マー伸長物の合成をすすめていくことができるので、当
該操作に先だって、必ずしも標的核酸（Ａ）と環状化プ
ローブヌクレオチド（Ｂ’）を分離する必要はない。プ
ライマー伸長物は、標的配列と相同な配列を有するので
、該伸長物は操作（ａ）における標的核酸（Ａ）と同様
にプローブヌクレオチド（Ｂ）の標的核酸として利用さ
れうる。この一連の操作を繰り返すことにより核酸の特
定の配列を簡便に大量に得ることができる。また、プロ
ーブヌクレオチド（Ｂ）、プライマーヌクレオチド（Ｃ
）にそれぞれアンチプロモーター配列、プロモーター配
列が含まれている場合には、核酸ポリメラーゼとして、
プロモーターに応じたＲＮＡポリメラーゼを用いること
ができる。当該操作は、ＮＴＰ（ＡＴＰ， ＣＴＰ，
ＧＴＰ， ＵＴＰの４種のリボヌクレオチド）およびＲ
ＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼな
ど）を用いて該環状ヌクレオチドを鋳型にしてＲＮＡ合
成反応を行わせることにより行われる。ＲＮＡポリメラ
ーゼ反応の結果として、プローブヌクレオチド（Ｂ）の
相補鎖が繰り返し並んだＲＮＡが合成されるが、このＲ
ＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し
、このｃＤＮＡにプライマーヌクレオチド（Ｃ）をアニ
ールさせることにより、繰り返しＲＮＡポリメラーゼを
作用させて大量にＲＮＡを合成することも可能である。 操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも一回
繰り返す。
ーブヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型に、また該プローブヌ
クレオチド（Ｂ’）にアニールしたプライマーヌクレオ
チド（Ｃ）を利用して、核酸ポリメラーゼ（Ｄ）を用い
て核酸合成反応を行う（図２（Ｃ）参照）。該操作は、
例えばｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＧＴＰ，
ｄＴＴＰ の４ 種のデオキシリボヌクレオチド）
およびＤＮＡポリメラーゼ（例えばφ２９ＤＮＡポリメ
ラーゼ、Ｍ２ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラ
ーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポ
リメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ ＤＮＡポリメラーゼ等の核酸合成能力の高い酵素
）を用いて、上記環状ヌクレオチドを鋳型にして伸長反
応を行わせることによって行われる。この方法は、例え
ばジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ； ５６， ３４１−３６１， １９７１ ）に記
載されている技術及び条件を用いることができる。これ
らの酵素は、ＤＮＡの二重鎖の部分を剥しながらプライ
マー伸長物の合成をすすめていくことができるので、当
該操作に先だって、必ずしも標的核酸（Ａ）と環状化プ
ローブヌクレオチド（Ｂ’）を分離する必要はない。プ
ライマー伸長物は、標的配列と相同な配列を有するので
、該伸長物は操作（ａ）における標的核酸（Ａ）と同様
にプローブヌクレオチド（Ｂ）の標的核酸として利用さ
れうる。この一連の操作を繰り返すことにより核酸の特
定の配列を簡便に大量に得ることができる。また、プロ
ーブヌクレオチド（Ｂ）、プライマーヌクレオチド（Ｃ
）にそれぞれアンチプロモーター配列、プロモーター配
列が含まれている場合には、核酸ポリメラーゼとして、
プロモーターに応じたＲＮＡポリメラーゼを用いること
ができる。当該操作は、ＮＴＰ（ＡＴＰ， ＣＴＰ，
ＧＴＰ， ＵＴＰの４種のリボヌクレオチド）およびＲ
ＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼな
ど）を用いて該環状ヌクレオチドを鋳型にしてＲＮＡ合
成反応を行わせることにより行われる。ＲＮＡポリメラ
ーゼ反応の結果として、プローブヌクレオチド（Ｂ）の
相補鎖が繰り返し並んだＲＮＡが合成されるが、このＲ
ＮＡを鋳型として逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し
、このｃＤＮＡにプライマーヌクレオチド（Ｃ）をアニ
ールさせることにより、繰り返しＲＮＡポリメラーゼを
作用させて大量にＲＮＡを合成することも可能である。 操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも一回
繰り返す。
【００１７】
【発明の効果】本発明の増幅法によれば、プローブヌク
レオチド（Ｂ）の２つの末端が標的核酸（Ａ）にアニー
ルして連結された場合にのみ増幅反応が行われる。した
がってオリゴヌクレオチドの塩基配列による特異性と、
２つの末端が連結される条件を満たす特異性の２つの特
異性が要求され、それだけ非特異反応が抑制される。し
たがって核酸の特定の配列のみを増幅することが可能で
ある。また、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラー
ゼを用いることにより、環状化したプローブヌクレオチ
ド１分子から複数の核酸配列が生成されるので、効率よ
く増幅することが可能である。生成した核酸配列を利用
して反応をサイクル化することにより、より大量に増幅
することもまた可能である。さらに、本発明の増幅法は
プローブを増幅する方法ではないので、ミスマッチや非
特異的ハイブリダイゼーションにより残存したプローブ
の増幅がなく、Ｓ／Ｎ（Ｓｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ）比
を増加させることができる。
レオチド（Ｂ）の２つの末端が標的核酸（Ａ）にアニー
ルして連結された場合にのみ増幅反応が行われる。した
がってオリゴヌクレオチドの塩基配列による特異性と、
２つの末端が連結される条件を満たす特異性の２つの特
異性が要求され、それだけ非特異反応が抑制される。し
たがって核酸の特定の配列のみを増幅することが可能で
ある。また、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラー
ゼを用いることにより、環状化したプローブヌクレオチ
ド１分子から複数の核酸配列が生成されるので、効率よ
く増幅することが可能である。生成した核酸配列を利用
して反応をサイクル化することにより、より大量に増幅
することもまた可能である。さらに、本発明の増幅法は
プローブを増幅する方法ではないので、ミスマッチや非
特異的ハイブリダイゼーションにより残存したプローブ
の増幅がなく、Ｓ／Ｎ（Ｓｉｇｎａｌ／Ｎｏｉｓｅ）比
を増加させることができる。
【００１８】
【実施例】以下に、本発明の実施例及び比較例を例示す
ることによって、本発明の効果をより一層明確なものと
するが、本発明はこれらの実施例によって限定されない
。 （実施例１ ）各種オリゴヌクレオチドの合成ＡＢＩ
社ＤＮＡ シンセサイザー３９１ 型を用いて、ホスホ
アミダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを合成
した。■プローブヌクレオチド（第一オリゴヌクレオチ
ド■）：本オリゴヌクレオチドは腸炎ビブリオＴＤＨ（
Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈａｅｍｏ
ｌｙｓｉｎ） 遺伝子の８７番目から １０４番目、お
よび １０５番目から １２６番目のヌクレオチド配列
、Ｔ７プロモーター配列と相補的な配列を有する（配列
表１ ）。また、５’末端にリン酸基が結合している。 ■プライマーヌクレオチド（第二オリゴヌクレオチド■
）：本オリゴヌクレオチドはＴ７プロモーターの配列を
有する（配列表２ ）。手法はＡＢＩ 社マニュアルに
従い、０．２ μＭ スケールで実施した。各種オリゴ
ヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃で一夜実
施した。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで逆相カラム
にて実施した。なお合成したオリゴヌクレオチドは必要
により以下の方法で５’末端にリン酸基を結合させた。 オリゴヌクレオチド ５
〜 ２０ ｐｍｏｌｅｓ１０×Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ緩衝液 １０ μｌ １ ｍＭ
ＡＴＰ
１ μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ １０ 単位水を加
えて全量を１００ μｌ として、３７℃で １時間反
応させる。ここで、１０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ緩衝液とは、 ０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ０．１
Ｍ ＭｇＣｌ２ ０．１Ｍ ２−メルカプトエタノールを示す。
ることによって、本発明の効果をより一層明確なものと
するが、本発明はこれらの実施例によって限定されない
。 （実施例１ ）各種オリゴヌクレオチドの合成ＡＢＩ
社ＤＮＡ シンセサイザー３９１ 型を用いて、ホスホ
アミダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを合成
した。■プローブヌクレオチド（第一オリゴヌクレオチ
ド■）：本オリゴヌクレオチドは腸炎ビブリオＴＤＨ（
Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈａｅｍｏ
ｌｙｓｉｎ） 遺伝子の８７番目から １０４番目、お
よび １０５番目から １２６番目のヌクレオチド配列
、Ｔ７プロモーター配列と相補的な配列を有する（配列
表１ ）。また、５’末端にリン酸基が結合している。 ■プライマーヌクレオチド（第二オリゴヌクレオチド■
）：本オリゴヌクレオチドはＴ７プロモーターの配列を
有する（配列表２ ）。手法はＡＢＩ 社マニュアルに
従い、０．２ μＭ スケールで実施した。各種オリゴ
ヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃で一夜実
施した。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで逆相カラム
にて実施した。なお合成したオリゴヌクレオチドは必要
により以下の方法で５’末端にリン酸基を結合させた。 オリゴヌクレオチド ５
〜 ２０ ｐｍｏｌｅｓ１０×Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ緩衝液 １０ μｌ １ ｍＭ
ＡＴＰ
１ μｌ Ｔ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼ １０ 単位水を加
えて全量を１００ μｌ として、３７℃で １時間反
応させる。ここで、１０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ緩衝液とは、 ０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ０．１
Ｍ ＭｇＣｌ２ ０．１Ｍ ２−メルカプトエタノールを示す。
【００１９】（実施例２ ）標的核酸を増幅するための
キット （ア）実施例１ の第一オリゴヌクレオチド■（イ）実
施例１ の第二オリゴヌクレオチド■（ウ）Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼ（東洋紡製）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（
東洋紡製）、ＡＴＰ 、ＣＴＰ 、ＧＴＰ 、ＵＴＰ
キット （ア）実施例１ の第一オリゴヌクレオチド■（イ）実
施例１ の第二オリゴヌクレオチド■（ウ）Ｔ４ ＤＮ
Ａリガーゼ（東洋紡製）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（
東洋紡製）、ＡＴＰ 、ＣＴＰ 、ＧＴＰ 、ＵＴＰ
【００２０】（実施例３）実施例２ のキットを用いた
標的核酸の増幅方法（１） 操作（ａ） 実施例１ の第一オリゴヌクレオチド■０
．１ｍｏｌ と、ＴＤＨ 産性腸炎ビブリオの培養菌体
から分離、部分精製したゲノム核酸１ μｇ とを共に
１０μｌ のリガーゼ用反応液に加えた。９４℃に ２
分間保った後、５０℃に５ 分間保温し、アニールさせ
た。リガーゼ用反応液６６ ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．６）６．６ ｍＭ ＭｇＣｌ
２ １０ ｍＭ ジチオスレイトール６６μＭ
ＡＴＰ 操作（ｂ） 上記反応液１０μｌ に、第二オリゴヌク
レオチド■０．１ｎｍｏｌ を加え、操作（ａ） と同
様の操作により、環状化した第一オリゴヌクレオチド■
にアニールさせた。 操作（ｃ） 次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １単位（東
洋紡製）を加え、３７℃で １時間反応させ、第一オリ
ゴヌクレオチドの５’末端と３’末端を連結させた。 操作（ｄ）上記反応液に水４０μｌ 、Ｔ７ ＲＮＡポ
リメラーゼ反応液５０μｌ 、およびＴ７ ＲＮＡポリ
メラーゼ １０ 単位を加え、操作（ｂ） で連結した
環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、３７℃で３０分
間保温することにより増幅反応を実施した。 Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ反応液 ８０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０
） １０ ｍＭ ジチオスレイトール４
ｍＭ スペルミジン ８ ｍＭ ＭｇＣｌ２ ５０ ｍＭ ＮａＣｌ １６０ μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ０．０２ ％ トリトン Ｘ−１００２
ｍＭ ＡＴＰ， ＣＴＰ， ＧＴＰ， ＵＴ
Ｐ操作（ｅ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、
エチジウムブロマイド染色法により合成された ＲＮＡ
を確認した。結果は１１３ｍｅｒより高分子側に、スメ
ア上にＲＮＡ が合成されていた。これは、第一オリゴ
ヌクレオチドが連結され、この環状分子を鋳型として鋳
型より長いＲＮＡ 分子が合成されたことを示している
。
標的核酸の増幅方法（１） 操作（ａ） 実施例１ の第一オリゴヌクレオチド■０
．１ｍｏｌ と、ＴＤＨ 産性腸炎ビブリオの培養菌体
から分離、部分精製したゲノム核酸１ μｇ とを共に
１０μｌ のリガーゼ用反応液に加えた。９４℃に ２
分間保った後、５０℃に５ 分間保温し、アニールさせ
た。リガーゼ用反応液６６ ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．６）６．６ ｍＭ ＭｇＣｌ
２ １０ ｍＭ ジチオスレイトール６６μＭ
ＡＴＰ 操作（ｂ） 上記反応液１０μｌ に、第二オリゴヌク
レオチド■０．１ｎｍｏｌ を加え、操作（ａ） と同
様の操作により、環状化した第一オリゴヌクレオチド■
にアニールさせた。 操作（ｃ） 次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １単位（東
洋紡製）を加え、３７℃で １時間反応させ、第一オリ
ゴヌクレオチドの５’末端と３’末端を連結させた。 操作（ｄ）上記反応液に水４０μｌ 、Ｔ７ ＲＮＡポ
リメラーゼ反応液５０μｌ 、およびＴ７ ＲＮＡポリ
メラーゼ １０ 単位を加え、操作（ｂ） で連結した
環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、３７℃で３０分
間保温することにより増幅反応を実施した。 Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ反応液 ８０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０
） １０ ｍＭ ジチオスレイトール４
ｍＭ スペルミジン ８ ｍＭ ＭｇＣｌ２ ５０ ｍＭ ＮａＣｌ １６０ μｇ／ｍｌ ＢＳＡ ０．０２ ％ トリトン Ｘ−１００２
ｍＭ ＡＴＰ， ＣＴＰ， ＧＴＰ， ＵＴ
Ｐ操作（ｅ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、
エチジウムブロマイド染色法により合成された ＲＮＡ
を確認した。結果は１１３ｍｅｒより高分子側に、スメ
ア上にＲＮＡ が合成されていた。これは、第一オリゴ
ヌクレオチドが連結され、この環状分子を鋳型として鋳
型より長いＲＮＡ 分子が合成されたことを示している
。
【００２１】（実施例４）実施例２ のキットを用いた
標的核酸の増幅方法（２） 操作（ａ） 実施例１ の第一オリゴヌクレオチド■０
．１ｎｍｏｌと第二オリゴヌクレオチド■ ０．１ｎｍ
ｏｌとを１０μｌ のリガーゼ用反応液に加えた。９４
℃に２ 分間保った後５０℃に５ 分間保温し、アニー
ルさせた。 操作（ｂ） 上記反応液に、ＴＤＨ 産性腸炎ビブリオ
の培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸１ μｇ
を加え第一オリゴヌクレオチド■とアニールさせ、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼ１単位（東洋紡製）を加え、３７℃
で１ 時間反応させることにより、第一オリゴヌクレオ
チドの５’末端と３’末端を連結させた。 操作（ｃ） 上記反応液１０μｌ に水４０μｌ 、Ｔ
７ ＲＮＡポリメラーゼ反応液５０μｌ 、およびＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ １０ 単位を加え、操作（ｂ）
で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、３
７℃で３０分間保温することにより増幅反応を実施した
。 操作（ｄ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色法により合成されたＲＮＡ を
確認した。結果は１１３ｍｅｒより高分子側に、スメア
上にＲＮＡ が合成されていた。これは、第一オリゴヌ
クレオチドが連結され、この環状分子を鋳型として鋳型
より長いＲＮＡ 分子が合成されたことを示している。
標的核酸の増幅方法（２） 操作（ａ） 実施例１ の第一オリゴヌクレオチド■０
．１ｎｍｏｌと第二オリゴヌクレオチド■ ０．１ｎｍ
ｏｌとを１０μｌ のリガーゼ用反応液に加えた。９４
℃に２ 分間保った後５０℃に５ 分間保温し、アニー
ルさせた。 操作（ｂ） 上記反応液に、ＴＤＨ 産性腸炎ビブリオ
の培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸１ μｇ
を加え第一オリゴヌクレオチド■とアニールさせ、Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼ１単位（東洋紡製）を加え、３７℃
で１ 時間反応させることにより、第一オリゴヌクレオ
チドの５’末端と３’末端を連結させた。 操作（ｃ） 上記反応液１０μｌ に水４０μｌ 、Ｔ
７ ＲＮＡポリメラーゼ反応液５０μｌ 、およびＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ １０ 単位を加え、操作（ｂ）
で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、３
７℃で３０分間保温することにより増幅反応を実施した
。 操作（ｄ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色法により合成されたＲＮＡ を
確認した。結果は１１３ｍｅｒより高分子側に、スメア
上にＲＮＡ が合成されていた。これは、第一オリゴヌ
クレオチドが連結され、この環状分子を鋳型として鋳型
より長いＲＮＡ 分子が合成されたことを示している。
【００２２】（実施例５ ）実施例２ のキットを用い
た標的核酸の増幅方法（３） 操作（ａ） 実施例１ の第一オリゴヌクレオチド■０
．１ｍｏｌ と第二オリゴヌクレオチド■ ０．１ｎｍ
ｏｌとを、ＴＤＨ 産性腸炎ビブリオの培養菌体から分
離、部分精製したゲノム核酸 １μｇ と共に１０μｌ
のリガーゼ用反応液に加えた。９４℃に２ 分間保っ
た後、５０℃に５ 分間保温し、アニールさせた。 操作（ｂ） 次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １単位（東
洋紡製）を加え、３７℃で １時間反応させ、第一オリ
ゴヌクレオチドの５’末端と３’末端を連結させた。 操作（ｃ） 上記反応液１０μｌ に水４０μｌ 、下
記反応液５０μｌ 、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ
１０ 単位を加え、操作（ｂ） で連結した環状オリゴ
ヌクレオチドを鋳型として、増幅反応を実施した。 操作（ｄ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色法により合成されたＲＮＡ を
確認した。結果は１１３ｍｅｒより高分子側に、スメア
上にＲＮＡ が合成されていた。これは、第一オリゴヌ
クレオチドが連結され、この環状分子を鋳型として鋳型
より長いＲＮＡ分子が合成されたことを示している。
た標的核酸の増幅方法（３） 操作（ａ） 実施例１ の第一オリゴヌクレオチド■０
．１ｍｏｌ と第二オリゴヌクレオチド■ ０．１ｎｍ
ｏｌとを、ＴＤＨ 産性腸炎ビブリオの培養菌体から分
離、部分精製したゲノム核酸 １μｇ と共に１０μｌ
のリガーゼ用反応液に加えた。９４℃に２ 分間保っ
た後、５０℃に５ 分間保温し、アニールさせた。 操作（ｂ） 次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １単位（東
洋紡製）を加え、３７℃で １時間反応させ、第一オリ
ゴヌクレオチドの５’末端と３’末端を連結させた。 操作（ｃ） 上記反応液１０μｌ に水４０μｌ 、下
記反応液５０μｌ 、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ
１０ 単位を加え、操作（ｂ） で連結した環状オリゴ
ヌクレオチドを鋳型として、増幅反応を実施した。 操作（ｄ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色法により合成されたＲＮＡ を
確認した。結果は１１３ｍｅｒより高分子側に、スメア
上にＲＮＡ が合成されていた。これは、第一オリゴヌ
クレオチドが連結され、この環状分子を鋳型として鋳型
より長いＲＮＡ分子が合成されたことを示している。
【００２３】（実施例６ ）実施例２ のキットを用い
た標的核酸の増幅方法（４） 操作（ａ） 実施例１ の第一オリゴヌクレオチド■０
．１ｍｏｌ と、ＴＤＨ 産性腸炎ビブリオの培養菌体
から分離、部分精製したゲノム核酸１ μｇ とを共に
１０μｌ のリガーゼ用反応液に加えた。９４℃に２
分間保った後５０℃に５ 分間保温し、アニールさせた
。 操作（ｂ） 次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １単位（東洋紡製）を加
え３７℃で １時間反応させ、第一オリゴヌクレオチド
の５’末端と３’末端を連結させた。 操作（ｃ） 上記反応液１０μｌ に、第二オリゴヌクレオチド■０
．１ｎｍｏｌを加え、操作（ａ） と同様の操作により
、環状化した第一オリゴヌクレオチド■にアニールさせ
た。次に反応液に水４０μｌ 、下記反応液５０μｌ
、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ １０ 単位を加え
、操作（ｂ） で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳
型として、３７℃で３０分間保温することにより増幅反
応を実施した。 操作（ｄ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたＤＮＡ を確認した。結
果は１１３ｍｅｒより高分子側に、スメア上にＲＮＡ
が合成されていた。これは、第一オリゴヌクレオチドが
連結され、この環状分子を鋳型として鋳型より長いＲＮ
Ａ 分子が合成されたことを示している。
た標的核酸の増幅方法（４） 操作（ａ） 実施例１ の第一オリゴヌクレオチド■０
．１ｍｏｌ と、ＴＤＨ 産性腸炎ビブリオの培養菌体
から分離、部分精製したゲノム核酸１ μｇ とを共に
１０μｌ のリガーゼ用反応液に加えた。９４℃に２
分間保った後５０℃に５ 分間保温し、アニールさせた
。 操作（ｂ） 次に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ １単位（東洋紡製）を加
え３７℃で １時間反応させ、第一オリゴヌクレオチド
の５’末端と３’末端を連結させた。 操作（ｃ） 上記反応液１０μｌ に、第二オリゴヌクレオチド■０
．１ｎｍｏｌを加え、操作（ａ） と同様の操作により
、環状化した第一オリゴヌクレオチド■にアニールさせ
た。次に反応液に水４０μｌ 、下記反応液５０μｌ
、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ １０ 単位を加え
、操作（ｂ） で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳
型として、３７℃で３０分間保温することにより増幅反
応を実施した。 操作（ｄ） その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたＤＮＡ を確認した。結
果は１１３ｍｅｒより高分子側に、スメア上にＲＮＡ
が合成されていた。これは、第一オリゴヌクレオチドが
連結され、この環状分子を鋳型として鋳型より長いＲＮ
Ａ 分子が合成されたことを示している。
【００２４】配列番号：１
配列の長さ：１１３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ
存在位置：２２．．３８
特徴を決定した方法：Ｓ
他の特徴：Ｔ７プロモーター配列と相補的な配列存在位
置：１．．１８ 他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂ
ｌｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ） 遺伝子
の１０５ 番目から １２６番目の配列と相補的な配列 存在位置：９２．．１１３ 他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂ
ｌｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ） 遺伝子
の８７番目から １０４番目の配列と相補的な配列 配列 ＧＡＴＧＡＧＡＴＡＴ ＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴ ＴＣＡ
ＡＡＴＣＴＣＣ ＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧ ＴＣＧＴＡＴ
ＴＡＡＡ ＡＣＴＡＴＴＣＴＡＴ ６０ＡＧＴ
ＧＴＣＡＣＣＴ ＡＡＡＴＧＡＴＣＣＡ ＣＴＡＧＴＴ
ＣＴＡＧ ＡＧＣＧＧＴＴＴＣＣ ＴＧＣＣＣＣＣＧＧ
Ｔ ＴＣＴ １１３
置：１．．１８ 他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂ
ｌｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ） 遺伝子
の１０５ 番目から １２６番目の配列と相補的な配列 存在位置：９２．．１１３ 他の特徴：腸炎ビブリオＴＤＨ（Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂ
ｌｅ Ｄｉｒｅｃｔ Ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ） 遺伝子
の８７番目から １０４番目の配列と相補的な配列 配列 ＧＡＴＧＡＧＡＴＡＴ ＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴ ＴＣＡ
ＡＡＴＣＴＣＣ ＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧ ＴＣＧＴＡＴ
ＴＡＡＡ ＡＣＴＡＴＴＣＴＡＴ ６０ＡＧＴ
ＧＴＣＡＣＣＴ ＡＡＡＴＧＡＴＣＣＡ ＣＴＡＧＴＴ
ＣＴＡＧ ＡＧＣＧＧＴＴＴＣＣ ＴＧＣＣＣＣＣＧＧ
Ｔ ＴＣＴ １１３
【００２５】配列番号：２
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
トポロジー：一本鎖
配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｒｏｍｏｔｅｒ
存在位置：１．．１７
特徴を決定した方法：Ｓ
他の特徴：Ｔ７プロモーターの配列を有する配列
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴ ＣＡＣＴＡＴＡ
１７
１７
【図１】第一オリゴヌクレオチド（プローブヌクレオチ
ド）の構造を示した図である。
ド）の構造を示した図である。
【図２】本発明の原理を模式的に示した図である。
【図３】実施例３、４、５ および６ において合成さ
れたＲＮＡの電気泳動パターンを示す。
れたＲＮＡの電気泳動パターンを示す。
図２中、Ａは標的核酸、Ｂは第一オリゴヌクレオチド（
プローブヌクレオチド）、Ｂ’は環状化した第一オリゴ
ヌクレオチド、Ｃは第二オリゴヌクレオチド（プライマ
ーヌクレオチド）およびＤは核酸ポリメラーゼを示す。 図３中、レーン１、２、３および４はそれぞれ実施例３
、４、５および６の試料に対応している。矢印は、鋳型
として用いた第一オリゴヌクレオチドの位置を示す。
プローブヌクレオチド）、Ｂ’は環状化した第一オリゴ
ヌクレオチド、Ｃは第二オリゴヌクレオチド（プライマ
ーヌクレオチド）およびＤは核酸ポリメラーゼを示す。 図３中、レーン１、２、３および４はそれぞれ実施例３
、４、５および６の試料に対応している。矢印は、鋳型
として用いた第一オリゴヌクレオチドの位置を示す。
Claims (6)
- 【請求項１】 検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくともこ
の直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて
、標的核酸配列（Ａ）に直鎖状プローブヌクレオチド（
Ｂ）をハイブリダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオチ
ド（Ｂ）を環状化し、生成した環状プローブヌクレオチ
ド（Ｂ’）を鋳型として、プライマーヌクレオチド（Ｃ
）を利用し、鋳型と相補的な配列の繰り返した配列を有
する一本鎖核酸を生成させることにより、核酸配列を増
幅させることを特徴とする核酸配列の増幅方法。 - 【請求項２】 検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、
下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする核酸
配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作（ａ
）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド（
Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１
回繰り返す。 - 【請求項３】 検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、
下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする核酸
配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
プライマーヌクレオチド（Ｃ）とのハイブリッドを形成
させる。 操作（ｂ）：検体試料中の標的核酸（Ａ）を、操作（ａ
）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチド（
Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１
回繰り返す。 - 【請求項４】 検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、
下記の操作（ａ）〜（ｄ）を行うことを特徴とする核酸
配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）およびプライマーヌクレオチド（Ｃ
）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１
回繰り返す。 - 【請求項５】 検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、
下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする核酸
配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と
３’末端を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする
。 操作（ｃ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作（ｂ
）で生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）とアニ
ールさせる。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド（
Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリ
メラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し
て核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも１
回繰り返す。 - 【請求項６】 検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存
在の結果として環状化するように設計された配列を有す
る直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、該直鎖状プロー
ブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を有する
プライマーヌクレオチド（Ｃ）、連結手段、核酸ポリメ
ラーゼおよびヌクレオチド三リン酸を含む核酸増幅用試
薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03046193A JP3080178B2 (ja) | 1991-02-18 | 1991-02-18 | 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03046193A JP3080178B2 (ja) | 1991-02-18 | 1991-02-18 | 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04262799A true JPH04262799A (ja) | 1992-09-18 |
| JP3080178B2 JP3080178B2 (ja) | 2000-08-21 |
Family
ID=12740228
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03046193A Expired - Lifetime JP3080178B2 (ja) | 1991-02-18 | 1991-02-18 | 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3080178B2 (ja) |
Cited By (114)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996003525A1 (en) * | 1994-07-25 | 1996-02-08 | Raggio-Italgene S.P.A. | Method and reagents for the detection of target nucleic acid sequences |
| WO1997035970A1 (fr) * | 1996-03-26 | 1997-10-02 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Oligonucleotides utilises pour detecter vibrio parahaemolyticus et procede de detection |
| US5854033A (en) * | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
| US5866336A (en) * | 1996-07-16 | 1999-02-02 | Oncor, Inc. | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
| US5871921A (en) * | 1994-02-16 | 1999-02-16 | Landegren; Ulf | Circularizing nucleic acid probe able to interlock with a target sequence through catenation |
| US5942391A (en) * | 1994-06-22 | 1999-08-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM) |
| US5942609A (en) * | 1998-11-12 | 1999-08-24 | The Porkin-Elmer Corporation | Ligation assembly and detection of polynucleotides on solid-support |
| US5952201A (en) * | 1994-11-07 | 1999-09-14 | Landegren; Ulf | Method of preparing oligonucleotide probes or primers, vector therefor and use thereof |
| US6090552A (en) * | 1996-07-16 | 2000-07-18 | Intergen Company | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
| US6096880A (en) * | 1993-04-15 | 2000-08-01 | University Of Rochester | Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA |
| US6143495A (en) * | 1995-11-21 | 2000-11-07 | Yale University | Unimolecular segment amplification and sequencing |
| US6255082B1 (en) | 1998-09-15 | 2001-07-03 | Yale University | Artificial long terminal repeat vectors |
| US6287824B1 (en) | 1998-09-15 | 2001-09-11 | Yale University | Molecular cloning using rolling circle amplification |
| US6316229B1 (en) | 1998-07-20 | 2001-11-13 | Yale University | Single molecule analysis target-mediated ligation of bipartite primers |
| WO2003004642A1 (fr) * | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd. | Procede d'amplification d'un fragment d'acide nucleique non cyclique |
| US6573051B2 (en) | 2001-03-09 | 2003-06-03 | Molecular Staging, Inc. | Open circle probes with intramolecular stem structures |
| US6593086B2 (en) | 1996-05-20 | 2003-07-15 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Nucleic acid amplification methods |
| US6610481B2 (en) | 1995-12-05 | 2003-08-26 | Koch Joern Erland | Cascade nucleic acid amplification reaction |
| USRE38442E1 (en) * | 1994-06-22 | 2004-02-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM) |
| WO2006047777A2 (en) | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Cepheid | Closed-system multi-stage nucleic acid amplification reactions |
| EP1681358A1 (en) | 2005-01-18 | 2006-07-19 | Affymetrix, Inc. | Identification of rare alleles by enzymatic enrichment of mismatched heteroduplexes |
| WO2006086210A2 (en) | 2005-02-10 | 2006-08-17 | Compass Genetics, Llc | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
| US7135312B2 (en) | 1993-04-15 | 2006-11-14 | University Of Rochester | Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA |
| WO2006138284A2 (en) | 2005-06-15 | 2006-12-28 | Callida Genomics, Inc. | Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments |
| WO2008092213A1 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-07 | Genera Biosystems Pty Ltd | Generation of nucleic acid molecules |
| US7618780B2 (en) | 2004-05-20 | 2009-11-17 | Trillion Genomics Limited | Use of mass labelled probes to detect target nucleic acids using mass spectrometry |
| US7700323B2 (en) | 2000-10-24 | 2010-04-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method for detecting and amplifying target DNA |
| US7838270B2 (en) | 2001-05-22 | 2010-11-23 | The University Of Chicago | Target-dependent transcription using deletion mutants of N4 RNA polymerase |
| WO2010133972A1 (en) | 2009-05-22 | 2010-11-25 | Population Genetics Technologies Ltd | Sorting asymmetrically tagged nucleic acids by selective primer extension |
| WO2011021102A2 (en) | 2009-08-20 | 2011-02-24 | Population Genetics Technologies Ltd | Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement |
| US7910304B2 (en) | 2003-02-26 | 2011-03-22 | Callida Genomics, Inc. | Random array DNA analysis by hybridization |
| WO2011055232A2 (en) | 2009-11-04 | 2011-05-12 | Population Genetics Technologies Ltd. | Base-by-base mutation screening |
| US7989166B2 (en) | 2005-04-12 | 2011-08-02 | In Situ Rcp A/S | Circle probes and their use in the identification of biomolecules |
| WO2011101744A2 (en) | 2010-02-22 | 2011-08-25 | Population Genetics Technologies Ltd. | Region of interest extraction and normalization methods |
| WO2011107887A2 (en) | 2010-03-02 | 2011-09-09 | Population Genetic Technologies Ltd. | Methods for replicating polynucleotides with secondary structure |
| WO2011139371A1 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Sequenta, Inc. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| EP2395113A1 (en) | 2007-06-29 | 2011-12-14 | Population Genetics Technologies Ltd. | Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants |
| US8080393B2 (en) | 2005-04-12 | 2011-12-20 | Olink Ab | Methods for production of oligonucleotides |
| WO2011161549A2 (en) | 2010-06-24 | 2011-12-29 | Population Genetics Technologies Ltd. | Methods and compositions for polynucleotide library production, immortalization and region of interest extraction |
| US8093030B2 (en) | 2005-10-06 | 2012-01-10 | Lucigen Corporation | Thermostable viral polymerases and methods of use |
| US8119352B2 (en) | 2006-06-20 | 2012-02-21 | Cepheld | Multi-stage amplification reactions by control of sequence replication times |
| WO2012038839A2 (en) | 2010-09-21 | 2012-03-29 | Population Genetics Technologies Ltd. | Increasing confidence of allele calls with molecular counting |
| EP2546360A1 (en) | 2005-10-07 | 2013-01-16 | Callida Genomics, Inc. | Self-assembled single molecule arrays and uses thereof |
| WO2013090469A1 (en) | 2011-12-13 | 2013-06-20 | Sequenta, Inc. | Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes |
| WO2013124743A1 (en) | 2012-02-22 | 2013-08-29 | Population Genetics Technologies Ltd. | Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement ii |
| WO2013128281A1 (en) | 2012-02-28 | 2013-09-06 | Population Genetics Technologies Ltd | Method for attaching a counter sequence to a nucleic acid sample |
| WO2013134162A2 (en) | 2012-03-05 | 2013-09-12 | Sequenta, Inc. | Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits |
| US8647577B2 (en) | 2010-08-18 | 2014-02-11 | Life Technologies Corporation | Chemical coating of microwell for electrochemical detection device |
| US8771950B2 (en) | 2006-02-07 | 2014-07-08 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for making nucleotide probes for sequencing and synthesis |
| US8790873B2 (en) | 2009-01-16 | 2014-07-29 | Affymetrix, Inc. | DNA ligation on RNA template |
| WO2014153408A1 (en) | 2013-03-19 | 2014-09-25 | Directed Genomics, Llc | Enrichment of target sequences |
| US8900828B2 (en) | 2006-05-01 | 2014-12-02 | Cepheid | Methods and apparatus for sequential amplification reactions |
| US8951731B2 (en) | 2007-10-15 | 2015-02-10 | Complete Genomics, Inc. | Sequence analysis using decorated nucleic acids |
| WO2015083004A1 (en) | 2013-12-02 | 2015-06-11 | Population Genetics Technologies Ltd. | Method for evaluating minority variants in a sample |
| US9194840B2 (en) | 2012-01-19 | 2015-11-24 | Life Technologies Corporation | Sensor arrays and methods for making same |
| US9222132B2 (en) | 2008-01-28 | 2015-12-29 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions |
| US9228228B2 (en) | 2006-10-27 | 2016-01-05 | Complete Genomics, Inc. | Efficient arrays of amplified polynucleotides |
| US9238834B2 (en) | 2007-11-29 | 2016-01-19 | Complete Genomics, Inc. | Efficient shotgun sequencing methods |
| US9267172B2 (en) | 2007-11-05 | 2016-02-23 | Complete Genomics, Inc. | Efficient base determination in sequencing reactions |
| US9334490B2 (en) | 2006-11-09 | 2016-05-10 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for large-scale analysis of nucleic acids using DNA deletions |
| WO2016093838A1 (en) | 2014-12-11 | 2016-06-16 | New England Biolabs, Inc. | Enrichment of target sequences |
| WO2016161273A1 (en) | 2015-04-01 | 2016-10-06 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target |
| US9476853B2 (en) | 2013-12-10 | 2016-10-25 | Life Technologies Corporation | System and method for forming microwells |
| US9499863B2 (en) | 2007-12-05 | 2016-11-22 | Complete Genomics, Inc. | Reducing GC bias in DNA sequencing using nucleotide analogs |
| US9524369B2 (en) | 2009-06-15 | 2016-12-20 | Complete Genomics, Inc. | Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data |
| US9594870B2 (en) | 2010-12-29 | 2017-03-14 | Life Technologies Corporation | Time-warped background signal for sequencing-by-synthesis operations |
| US9618510B2 (en) | 2013-03-13 | 2017-04-11 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay methods |
| US9624538B2 (en) | 2005-11-14 | 2017-04-18 | President And Fellows Of Harvard College | Nanogrid rolling circle DNA sequencing |
| US9683255B2 (en) | 2005-09-09 | 2017-06-20 | Qiagen Gmbh | Method for activating a nucleic acid for a polymerase reaction |
| US9708657B2 (en) | 2013-07-01 | 2017-07-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method for generating clonotype profiles using sequence tags |
| US9809813B2 (en) | 2009-06-25 | 2017-11-07 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Method of measuring adaptive immunity |
| US9824179B2 (en) | 2011-12-09 | 2017-11-21 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection |
| US9914968B2 (en) | 2012-09-26 | 2018-03-13 | Cepheid | Honeycomb tube |
| WO2018057928A1 (en) | 2016-09-23 | 2018-03-29 | Grail, Inc. | Methods of preparing and analyzing cell-free nucleic acid sequencing libraries |
| EP3301104A1 (en) | 2009-05-29 | 2018-04-04 | Life Technologies Corporation | Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using |
| WO2018085862A2 (en) | 2016-11-07 | 2018-05-11 | Grail, Inc. | Methods of identifying somatic mutational signatures for early cancer detection |
| WO2018111872A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Grail, Inc. | Methods for tagging and amplifying rna template molecules for preparing sequencing libraries |
| WO2018119399A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Grail, Inc. | Methods for high efficiency library preparation using double-stranded adapters |
| WO2018132459A1 (en) | 2017-01-10 | 2018-07-19 | Paragon Genomics, Inc. | Methods and compositions for reducing redundant molecular barcodes created in primer extension reactions |
| US10066265B2 (en) | 2014-04-01 | 2018-09-04 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining antigen-specific t-cells |
| WO2018183897A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Grail, Inc. | Higher target capture efficiency using probe extension |
| WO2018183942A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Grail, Inc. | Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification |
| WO2018183918A1 (en) | 2017-03-30 | 2018-10-04 | Grail, Inc. | Enhanced ligation in sequencing library preparation |
| US10114015B2 (en) | 2013-03-13 | 2018-10-30 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay methods |
| US10146906B2 (en) | 2010-12-30 | 2018-12-04 | Life Technologies Corporation | Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations |
| US10150996B2 (en) | 2012-10-19 | 2018-12-11 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells |
| US10155992B2 (en) | 2008-11-07 | 2018-12-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| US10214770B2 (en) | 2012-05-08 | 2019-02-26 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed PCR reactions |
| US10221461B2 (en) | 2012-10-01 | 2019-03-05 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization |
| WO2019055819A1 (en) | 2017-09-14 | 2019-03-21 | Grail, Inc. | METHODS FOR PREPARING A SEQUENCING LIBRARY FROM SINGLE STRANDED DNA |
| US10241075B2 (en) | 2010-12-30 | 2019-03-26 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing |
| US10246752B2 (en) | 2008-11-07 | 2019-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Methods of monitoring conditions by sequence analysis |
| US10246701B2 (en) | 2014-11-14 | 2019-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture |
| WO2019067973A1 (en) | 2017-09-28 | 2019-04-04 | Grail, Inc. | ENRICHMENT OF SHORT NUCLEIC ACID FRAGMENTS IN THE PREPARATION OF SEQUENCING LIBRARIES |
| US10323276B2 (en) | 2009-01-15 | 2019-06-18 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Adaptive immunity profiling and methods for generation of monoclonal antibodies |
| WO2019118925A1 (en) | 2017-12-15 | 2019-06-20 | Grail, Inc. | Methods for enriching for duplex reads in sequencing and error correction |
| WO2019126803A1 (en) | 2017-12-22 | 2019-06-27 | Grail, Inc. | Error removal using improved library preparation methods |
| US10410739B2 (en) | 2013-10-04 | 2019-09-10 | Life Technologies Corporation | Methods and systems for modeling phasing effects in sequencing using termination chemistry |
| US10428325B1 (en) | 2016-09-21 | 2019-10-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Identification of antigen-specific B cell receptors |
| US10679724B2 (en) | 2012-05-11 | 2020-06-09 | Life Technologies Corporation | Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations |
| WO2020120442A2 (en) | 2018-12-13 | 2020-06-18 | Dna Script | Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules |
| WO2020141143A1 (en) | 2019-01-03 | 2020-07-09 | Dna Script | One pot synthesis of sets of oligonucleotides |
| US10941453B1 (en) | 2020-05-20 | 2021-03-09 | Paragon Genomics, Inc. | High throughput detection of pathogen RNA in clinical specimens |
| US11047008B2 (en) | 2015-02-24 | 2021-06-29 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing |
| WO2021180665A1 (en) | 2020-03-09 | 2021-09-16 | Janssen Pharmaceutica Nv | Compositions and methods for quantifying integration of recombinant vector nucleic acid |
| US11248253B2 (en) | 2014-03-05 | 2022-02-15 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods using randomer-containing synthetic molecules |
| US11254980B1 (en) | 2017-11-29 | 2022-02-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements |
| US11390921B2 (en) | 2014-04-01 | 2022-07-19 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs) |
| US11474070B2 (en) | 2010-12-30 | 2022-10-18 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer readable media for making base calls in nucleic acid sequencing |
| US11512349B2 (en) | 2018-12-18 | 2022-11-29 | Grail, Llc | Methods for detecting disease using analysis of RNA |
| US11525825B2 (en) | 2014-05-15 | 2022-12-13 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay kits |
| WO2023283452A2 (en) | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Cepheid | High-level multiplexing reaction vessel, reagent spotting device and associated methods |
| US11680293B1 (en) | 2022-04-21 | 2023-06-20 | Paragon Genomics, Inc. | Methods and compositions for amplifying DNA and generating DNA sequencing results from target-enriched DNA molecules |
| WO2024003332A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Controlling for tagmentation sequencing library insert size using archaeal histone-like proteins |
-
1991
- 1991-02-18 JP JP03046193A patent/JP3080178B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (194)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6368802B1 (en) | 1993-04-15 | 2002-04-09 | University Of Rochester | Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA |
| US7906490B2 (en) | 1993-04-15 | 2011-03-15 | University Of Rochester | Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA |
| US7135312B2 (en) | 1993-04-15 | 2006-11-14 | University Of Rochester | Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA |
| US6096880A (en) * | 1993-04-15 | 2000-08-01 | University Of Rochester | Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA |
| US5871921A (en) * | 1994-02-16 | 1999-02-16 | Landegren; Ulf | Circularizing nucleic acid probe able to interlock with a target sequence through catenation |
| US6235472B1 (en) | 1994-02-16 | 2001-05-22 | Ulf Landegren | Nucleic acid detecting reagent |
| US8632999B1 (en) | 1994-06-22 | 2014-01-21 | David Y. Zhang | Nucleic acid amplification methods |
| US6569647B1 (en) | 1994-06-22 | 2003-05-27 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM) |
| US5942391A (en) * | 1994-06-22 | 1999-08-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM) |
| USRE38442E1 (en) * | 1994-06-22 | 2004-02-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM) |
| US6855523B2 (en) | 1994-06-22 | 2005-02-15 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM) |
| WO1996003525A1 (en) * | 1994-07-25 | 1996-02-08 | Raggio-Italgene S.P.A. | Method and reagents for the detection of target nucleic acid sequences |
| US5952201A (en) * | 1994-11-07 | 1999-09-14 | Landegren; Ulf | Method of preparing oligonucleotide probes or primers, vector therefor and use thereof |
| US6632609B2 (en) | 1995-11-21 | 2003-10-14 | Yale University | Unimolecular segment amplification and sequencing |
| US6183960B1 (en) | 1995-11-21 | 2001-02-06 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
| US6210884B1 (en) | 1995-11-21 | 2001-04-03 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
| US6143495A (en) * | 1995-11-21 | 2000-11-07 | Yale University | Unimolecular segment amplification and sequencing |
| US6797474B2 (en) | 1995-11-21 | 2004-09-28 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
| US6329150B1 (en) | 1995-11-21 | 2001-12-11 | Yale University | Unimolecular segment amplification and sequencing |
| US6344329B1 (en) | 1995-11-21 | 2002-02-05 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
| US5854033A (en) * | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
| US6610481B2 (en) | 1995-12-05 | 2003-08-26 | Koch Joern Erland | Cascade nucleic acid amplification reaction |
| US6048697A (en) * | 1996-03-26 | 2000-04-11 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Oligonucleotides used for detecting vibrio parahaemolyticus and method of detection therewith |
| WO1997035970A1 (fr) * | 1996-03-26 | 1997-10-02 | Nippon Suisan Kaisha, Ltd. | Oligonucleotides utilises pour detecter vibrio parahaemolyticus et procede de detection |
| US6593086B2 (en) | 1996-05-20 | 2003-07-15 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Nucleic acid amplification methods |
| US6117635A (en) * | 1996-07-16 | 2000-09-12 | Intergen Company | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
| US6090552A (en) * | 1996-07-16 | 2000-07-18 | Intergen Company | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
| US5866336A (en) * | 1996-07-16 | 1999-02-02 | Oncor, Inc. | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
| US6316229B1 (en) | 1998-07-20 | 2001-11-13 | Yale University | Single molecule analysis target-mediated ligation of bipartite primers |
| US6255082B1 (en) | 1998-09-15 | 2001-07-03 | Yale University | Artificial long terminal repeat vectors |
| US6287824B1 (en) | 1998-09-15 | 2001-09-11 | Yale University | Molecular cloning using rolling circle amplification |
| US5942609A (en) * | 1998-11-12 | 1999-08-24 | The Porkin-Elmer Corporation | Ligation assembly and detection of polynucleotides on solid-support |
| US7700323B2 (en) | 2000-10-24 | 2010-04-20 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Method for detecting and amplifying target DNA |
| US7993880B2 (en) | 2000-10-24 | 2011-08-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Precircle probe nucleic acid amplification methods |
| US8383348B2 (en) | 2000-10-24 | 2013-02-26 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Precircle probe nucleic acid amplification methods |
| US6573051B2 (en) | 2001-03-09 | 2003-06-03 | Molecular Staging, Inc. | Open circle probes with intramolecular stem structures |
| US7838270B2 (en) | 2001-05-22 | 2010-11-23 | The University Of Chicago | Target-dependent transcription using deletion mutants of N4 RNA polymerase |
| WO2003004642A1 (fr) * | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Wakunaga Pharmaceutical Co., Ltd. | Procede d'amplification d'un fragment d'acide nucleique non cyclique |
| US8278039B2 (en) | 2003-02-26 | 2012-10-02 | Complete Genomics, Inc. | Random array DNA analysis by hybridization |
| US8105771B2 (en) | 2003-02-26 | 2012-01-31 | Callida Genomics, Inc. | Random array DNA analysis by hybridization |
| US7910304B2 (en) | 2003-02-26 | 2011-03-22 | Callida Genomics, Inc. | Random array DNA analysis by hybridization |
| US7618780B2 (en) | 2004-05-20 | 2009-11-17 | Trillion Genomics Limited | Use of mass labelled probes to detect target nucleic acids using mass spectrometry |
| WO2006047777A2 (en) | 2004-10-27 | 2006-05-04 | Cepheid | Closed-system multi-stage nucleic acid amplification reactions |
| EP1681358A1 (en) | 2005-01-18 | 2006-07-19 | Affymetrix, Inc. | Identification of rare alleles by enzymatic enrichment of mismatched heteroduplexes |
| WO2006086210A2 (en) | 2005-02-10 | 2006-08-17 | Compass Genetics, Llc | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
| US8080393B2 (en) | 2005-04-12 | 2011-12-20 | Olink Ab | Methods for production of oligonucleotides |
| US7989166B2 (en) | 2005-04-12 | 2011-08-02 | In Situ Rcp A/S | Circle probes and their use in the identification of biomolecules |
| EP2463386A2 (en) | 2005-06-15 | 2012-06-13 | Callida Genomics, Inc. | Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments |
| US10125392B2 (en) | 2005-06-15 | 2018-11-13 | Complete Genomics, Inc. | Preparing a DNA fragment library for sequencing using tagged primers |
| US9637785B2 (en) | 2005-06-15 | 2017-05-02 | Complete Genomics, Inc. | Tagged fragment library configured for genome or cDNA sequence analysis |
| EP2865766A1 (en) | 2005-06-15 | 2015-04-29 | Callida Genomics, Inc. | Single molecule arrays for genetic and chemical analysis |
| US9637784B2 (en) | 2005-06-15 | 2017-05-02 | Complete Genomics, Inc. | Methods for DNA sequencing and analysis using multiple tiers of aliquots |
| US11414702B2 (en) | 2005-06-15 | 2022-08-16 | Complete Genomics, Inc. | Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments |
| EP3257949A1 (en) | 2005-06-15 | 2017-12-20 | Complete Genomics Inc. | Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments |
| US10351909B2 (en) | 2005-06-15 | 2019-07-16 | Complete Genomics, Inc. | DNA sequencing from high density DNA arrays using asynchronous reactions |
| EP2620510A1 (en) | 2005-06-15 | 2013-07-31 | Callida Genomics, Inc. | Single molecule arrays for genetic and chemical analysis |
| EP3492602A1 (en) | 2005-06-15 | 2019-06-05 | Complete Genomics, Inc. | Single molecule arrays for genetic and chemical analysis |
| WO2006138284A2 (en) | 2005-06-15 | 2006-12-28 | Callida Genomics, Inc. | Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments |
| US9683255B2 (en) | 2005-09-09 | 2017-06-20 | Qiagen Gmbh | Method for activating a nucleic acid for a polymerase reaction |
| US8093030B2 (en) | 2005-10-06 | 2012-01-10 | Lucigen Corporation | Thermostable viral polymerases and methods of use |
| EP2546360A1 (en) | 2005-10-07 | 2013-01-16 | Callida Genomics, Inc. | Self-assembled single molecule arrays and uses thereof |
| US9624538B2 (en) | 2005-11-14 | 2017-04-18 | President And Fellows Of Harvard College | Nanogrid rolling circle DNA sequencing |
| US8771950B2 (en) | 2006-02-07 | 2014-07-08 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for making nucleotide probes for sequencing and synthesis |
| US10907202B2 (en) | 2006-05-01 | 2021-02-02 | Cepheid | Methods and apparatus for sequential amplification reactions |
| US8900828B2 (en) | 2006-05-01 | 2014-12-02 | Cepheid | Methods and apparatus for sequential amplification reactions |
| US9873909B2 (en) | 2006-05-01 | 2018-01-23 | Cepheid | Methods and apparatus for sequential amplification reactions |
| US8119352B2 (en) | 2006-06-20 | 2012-02-21 | Cepheld | Multi-stage amplification reactions by control of sequence replication times |
| US9228228B2 (en) | 2006-10-27 | 2016-01-05 | Complete Genomics, Inc. | Efficient arrays of amplified polynucleotides |
| US9334490B2 (en) | 2006-11-09 | 2016-05-10 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for large-scale analysis of nucleic acids using DNA deletions |
| WO2008092213A1 (en) | 2007-02-02 | 2008-08-07 | Genera Biosystems Pty Ltd | Generation of nucleic acid molecules |
| EP2395113A1 (en) | 2007-06-29 | 2011-12-14 | Population Genetics Technologies Ltd. | Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants |
| US8951731B2 (en) | 2007-10-15 | 2015-02-10 | Complete Genomics, Inc. | Sequence analysis using decorated nucleic acids |
| US9267172B2 (en) | 2007-11-05 | 2016-02-23 | Complete Genomics, Inc. | Efficient base determination in sequencing reactions |
| US9238834B2 (en) | 2007-11-29 | 2016-01-19 | Complete Genomics, Inc. | Efficient shotgun sequencing methods |
| US11389779B2 (en) | 2007-12-05 | 2022-07-19 | Complete Genomics, Inc. | Methods of preparing a library of nucleic acid fragments tagged with oligonucleotide bar code sequences |
| US9499863B2 (en) | 2007-12-05 | 2016-11-22 | Complete Genomics, Inc. | Reducing GC bias in DNA sequencing using nucleotide analogs |
| US9523125B2 (en) | 2008-01-28 | 2016-12-20 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions |
| US9222132B2 (en) | 2008-01-28 | 2015-12-29 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions |
| US10865453B2 (en) | 2008-11-07 | 2020-12-15 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| US10266901B2 (en) | 2008-11-07 | 2019-04-23 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Methods of monitoring conditions by sequence analysis |
| US10519511B2 (en) | 2008-11-07 | 2019-12-31 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| US11001895B2 (en) | 2008-11-07 | 2021-05-11 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods of monitoring conditions by sequence analysis |
| US10155992B2 (en) | 2008-11-07 | 2018-12-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| US11021757B2 (en) | 2008-11-07 | 2021-06-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| US10246752B2 (en) | 2008-11-07 | 2019-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Methods of monitoring conditions by sequence analysis |
| US10760133B2 (en) | 2008-11-07 | 2020-09-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| US10323276B2 (en) | 2009-01-15 | 2019-06-18 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Adaptive immunity profiling and methods for generation of monoclonal antibodies |
| US8790873B2 (en) | 2009-01-16 | 2014-07-29 | Affymetrix, Inc. | DNA ligation on RNA template |
| US10648021B2 (en) | 2009-01-16 | 2020-05-12 | Affymetrix, Inc. | DNA ligation on RNA template |
| WO2010133972A1 (en) | 2009-05-22 | 2010-11-25 | Population Genetics Technologies Ltd | Sorting asymmetrically tagged nucleic acids by selective primer extension |
| EP3301104A1 (en) | 2009-05-29 | 2018-04-04 | Life Technologies Corporation | Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using |
| EP3663750A1 (en) | 2009-05-29 | 2020-06-10 | Life Technologies Corporation | Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using |
| US9524369B2 (en) | 2009-06-15 | 2016-12-20 | Complete Genomics, Inc. | Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data |
| US11214793B2 (en) | 2009-06-25 | 2022-01-04 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Method of measuring adaptive immunity |
| US9809813B2 (en) | 2009-06-25 | 2017-11-07 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Method of measuring adaptive immunity |
| US11905511B2 (en) | 2009-06-25 | 2024-02-20 | Fred Hutchinson Cancer Center | Method of measuring adaptive immunity |
| EP3029141A1 (en) | 2009-08-20 | 2016-06-08 | Population Genetics Technologies Ltd. | Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement |
| WO2011021102A2 (en) | 2009-08-20 | 2011-02-24 | Population Genetics Technologies Ltd | Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement |
| WO2011055232A2 (en) | 2009-11-04 | 2011-05-12 | Population Genetics Technologies Ltd. | Base-by-base mutation screening |
| WO2011101744A2 (en) | 2010-02-22 | 2011-08-25 | Population Genetics Technologies Ltd. | Region of interest extraction and normalization methods |
| WO2011107887A2 (en) | 2010-03-02 | 2011-09-09 | Population Genetic Technologies Ltd. | Methods for replicating polynucleotides with secondary structure |
| WO2011139371A1 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Sequenta, Inc. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| EP4219759A2 (en) | 2010-05-06 | 2023-08-02 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| EP3456847A1 (en) | 2010-05-06 | 2019-03-20 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Monitoring solid transplant rejection using clonotype profiles |
| EP3144673A1 (en) | 2010-05-06 | 2017-03-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Monitoring lymphoid neoplasm status using clonotype profiles |
| WO2011161549A2 (en) | 2010-06-24 | 2011-12-29 | Population Genetics Technologies Ltd. | Methods and compositions for polynucleotide library production, immortalization and region of interest extraction |
| US9891190B2 (en) | 2010-08-18 | 2018-02-13 | Life Technologies Corporation | Chemical coating of microwell for electrochemical detection device |
| US8647577B2 (en) | 2010-08-18 | 2014-02-11 | Life Technologies Corporation | Chemical coating of microwell for electrochemical detection device |
| US9404887B2 (en) | 2010-08-18 | 2016-08-02 | Life Technologies Corporation | Chemical coating of microwell for electrochemical detection device |
| WO2012038839A2 (en) | 2010-09-21 | 2012-03-29 | Population Genetics Technologies Ltd. | Increasing confidence of allele calls with molecular counting |
| EP3115468A1 (en) | 2010-09-21 | 2017-01-11 | Population Genetics Technologies Ltd. | Increasing confidence of allele calls with molecular counting |
| EP2623613A1 (en) | 2010-09-21 | 2013-08-07 | Population Genetics Technologies Ltd. | Increasing confidence of allele calls with molecular counting |
| US9594870B2 (en) | 2010-12-29 | 2017-03-14 | Life Technologies Corporation | Time-warped background signal for sequencing-by-synthesis operations |
| US10832798B2 (en) | 2010-12-29 | 2020-11-10 | Life Technologies Corporation | Time-warped background signal for sequencing-by-synthesis operations |
| US11474070B2 (en) | 2010-12-30 | 2022-10-18 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer readable media for making base calls in nucleic acid sequencing |
| US10241075B2 (en) | 2010-12-30 | 2019-03-26 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing |
| US11255813B2 (en) | 2010-12-30 | 2022-02-22 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing |
| US11386978B2 (en) | 2010-12-30 | 2022-07-12 | Life Technologies Corporation | Fluidic chemFET polynucleotide sequencing systems with confinement regions and hydrogen ion rate and ratio parameters |
| US10146906B2 (en) | 2010-12-30 | 2018-12-04 | Life Technologies Corporation | Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations |
| US9824179B2 (en) | 2011-12-09 | 2017-11-21 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection |
| WO2013090469A1 (en) | 2011-12-13 | 2013-06-20 | Sequenta, Inc. | Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes |
| EP3460076A1 (en) | 2011-12-13 | 2019-03-27 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes |
| US9194840B2 (en) | 2012-01-19 | 2015-11-24 | Life Technologies Corporation | Sensor arrays and methods for making same |
| US9528962B2 (en) | 2012-01-19 | 2016-12-27 | Life Technologies Corporation | Sensor arrays and methods for making same |
| WO2013124743A1 (en) | 2012-02-22 | 2013-08-29 | Population Genetics Technologies Ltd. | Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement ii |
| WO2013128281A1 (en) | 2012-02-28 | 2013-09-06 | Population Genetics Technologies Ltd | Method for attaching a counter sequence to a nucleic acid sample |
| EP3287531A1 (en) | 2012-02-28 | 2018-02-28 | Agilent Technologies, Inc. | Method for attaching a counter sequence to a nucleic acid sample |
| US10077478B2 (en) | 2012-03-05 | 2018-09-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits |
| WO2013134162A2 (en) | 2012-03-05 | 2013-09-12 | Sequenta, Inc. | Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits |
| EP3372694A1 (en) | 2012-03-05 | 2018-09-12 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits |
| US10894977B2 (en) | 2012-05-08 | 2021-01-19 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Compositions and methods for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed PCR reactions |
| US10214770B2 (en) | 2012-05-08 | 2019-02-26 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed PCR reactions |
| US10679724B2 (en) | 2012-05-11 | 2020-06-09 | Life Technologies Corporation | Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations |
| US11657893B2 (en) | 2012-05-11 | 2023-05-23 | Life Technologies Corporation | Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations |
| US11795506B2 (en) | 2012-09-26 | 2023-10-24 | Cepheid | Honeycomb tube |
| US11739383B2 (en) | 2012-09-26 | 2023-08-29 | Cepheid | Honeycomb tube |
| US10870884B2 (en) | 2012-09-26 | 2020-12-22 | Cepheid | Honeycomb tube |
| US10190165B2 (en) | 2012-09-26 | 2019-01-29 | Cepheid | Honeycomb tube |
| US10767226B2 (en) | 2012-09-26 | 2020-09-08 | Cepheid | Honeycomb tube |
| US9914968B2 (en) | 2012-09-26 | 2018-03-13 | Cepheid | Honeycomb tube |
| US10221461B2 (en) | 2012-10-01 | 2019-03-05 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization |
| US11180813B2 (en) | 2012-10-01 | 2021-11-23 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization |
| US10150996B2 (en) | 2012-10-19 | 2018-12-11 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells |
| US11697840B2 (en) | 2013-03-13 | 2023-07-11 | Meso Scale Technologies, Llc. | Method of detecting analyte in a sample with binding reagent, first detection reagent, and second detection reagent |
| US10908157B2 (en) | 2013-03-13 | 2021-02-02 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay methods |
| US10114015B2 (en) | 2013-03-13 | 2018-10-30 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay methods |
| US9618510B2 (en) | 2013-03-13 | 2017-04-11 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay methods |
| EP3312295A1 (en) | 2013-03-19 | 2018-04-25 | Directed Genomics, LLC | Enrichment of target sequences |
| WO2014153408A1 (en) | 2013-03-19 | 2014-09-25 | Directed Genomics, Llc | Enrichment of target sequences |
| US10077473B2 (en) | 2013-07-01 | 2018-09-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method for genotyping clonotype profiles using sequence tags |
| US10526650B2 (en) | 2013-07-01 | 2020-01-07 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Method for genotyping clonotype profiles using sequence tags |
| EP3486327A1 (en) | 2013-07-01 | 2019-05-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Large-scale biomolecular analysis with sequence tags |
| US9708657B2 (en) | 2013-07-01 | 2017-07-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method for generating clonotype profiles using sequence tags |
| US10410739B2 (en) | 2013-10-04 | 2019-09-10 | Life Technologies Corporation | Methods and systems for modeling phasing effects in sequencing using termination chemistry |
| US11636922B2 (en) | 2013-10-04 | 2023-04-25 | Life Technologies Corporation | Methods and systems for modeling phasing effects in sequencing using termination chemistry |
| WO2015083004A1 (en) | 2013-12-02 | 2015-06-11 | Population Genetics Technologies Ltd. | Method for evaluating minority variants in a sample |
| US9476853B2 (en) | 2013-12-10 | 2016-10-25 | Life Technologies Corporation | System and method for forming microwells |
| US11248253B2 (en) | 2014-03-05 | 2022-02-15 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods using randomer-containing synthetic molecules |
| US11261490B2 (en) | 2014-04-01 | 2022-03-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Determining antigen-specific T-cells |
| EP3674415A1 (en) | 2014-04-01 | 2020-07-01 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining antigen-specific t-cells and b-cells |
| US11390921B2 (en) | 2014-04-01 | 2022-07-19 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs) |
| US10435745B2 (en) | 2014-04-01 | 2019-10-08 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining antigen-specific T-cells |
| US10066265B2 (en) | 2014-04-01 | 2018-09-04 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining antigen-specific t-cells |
| US11525825B2 (en) | 2014-05-15 | 2022-12-13 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay kits |
| US10246701B2 (en) | 2014-11-14 | 2019-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture |
| WO2016093838A1 (en) | 2014-12-11 | 2016-06-16 | New England Biolabs, Inc. | Enrichment of target sequences |
| US11047008B2 (en) | 2015-02-24 | 2021-06-29 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing |
| WO2016161273A1 (en) | 2015-04-01 | 2016-10-06 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target |
| US11041202B2 (en) | 2015-04-01 | 2021-06-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Method of identifying human compatible T cell receptors specific for an antigenic target |
| US10428325B1 (en) | 2016-09-21 | 2019-10-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Identification of antigen-specific B cell receptors |
| WO2018057928A1 (en) | 2016-09-23 | 2018-03-29 | Grail, Inc. | Methods of preparing and analyzing cell-free nucleic acid sequencing libraries |
| WO2018085862A2 (en) | 2016-11-07 | 2018-05-11 | Grail, Inc. | Methods of identifying somatic mutational signatures for early cancer detection |
| WO2018111872A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Grail, Inc. | Methods for tagging and amplifying rna template molecules for preparing sequencing libraries |
| WO2018119399A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Grail, Inc. | Methods for high efficiency library preparation using double-stranded adapters |
| WO2018132459A1 (en) | 2017-01-10 | 2018-07-19 | Paragon Genomics, Inc. | Methods and compositions for reducing redundant molecular barcodes created in primer extension reactions |
| WO2018183918A1 (en) | 2017-03-30 | 2018-10-04 | Grail, Inc. | Enhanced ligation in sequencing library preparation |
| WO2018183942A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Grail, Inc. | Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification |
| WO2018183897A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Grail, Inc. | Higher target capture efficiency using probe extension |
| WO2019055819A1 (en) | 2017-09-14 | 2019-03-21 | Grail, Inc. | METHODS FOR PREPARING A SEQUENCING LIBRARY FROM SINGLE STRANDED DNA |
| EP4026915A1 (en) | 2017-09-28 | 2022-07-13 | Grail, LLC | Enrichment of short nucleic acid fragments in sequencing library preparation |
| EP4269583A2 (en) | 2017-09-28 | 2023-11-01 | Grail, LLC | Enrichment of short nucleic acid fragments in sequencing library preparation |
| WO2019067973A1 (en) | 2017-09-28 | 2019-04-04 | Grail, Inc. | ENRICHMENT OF SHORT NUCLEIC ACID FRAGMENTS IN THE PREPARATION OF SEQUENCING LIBRARIES |
| US11254980B1 (en) | 2017-11-29 | 2022-02-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements |
| WO2019118925A1 (en) | 2017-12-15 | 2019-06-20 | Grail, Inc. | Methods for enriching for duplex reads in sequencing and error correction |
| WO2019126803A1 (en) | 2017-12-22 | 2019-06-27 | Grail, Inc. | Error removal using improved library preparation methods |
| WO2020120442A2 (en) | 2018-12-13 | 2020-06-18 | Dna Script | Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules |
| US11268091B2 (en) | 2018-12-13 | 2022-03-08 | Dna Script Sas | Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules |
| US11512349B2 (en) | 2018-12-18 | 2022-11-29 | Grail, Llc | Methods for detecting disease using analysis of RNA |
| WO2020141143A1 (en) | 2019-01-03 | 2020-07-09 | Dna Script | One pot synthesis of sets of oligonucleotides |
| WO2021180665A1 (en) | 2020-03-09 | 2021-09-16 | Janssen Pharmaceutica Nv | Compositions and methods for quantifying integration of recombinant vector nucleic acid |
| US10941453B1 (en) | 2020-05-20 | 2021-03-09 | Paragon Genomics, Inc. | High throughput detection of pathogen RNA in clinical specimens |
| WO2023283452A2 (en) | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Cepheid | High-level multiplexing reaction vessel, reagent spotting device and associated methods |
| US11680293B1 (en) | 2022-04-21 | 2023-06-20 | Paragon Genomics, Inc. | Methods and compositions for amplifying DNA and generating DNA sequencing results from target-enriched DNA molecules |
| WO2024003332A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Controlling for tagmentation sequencing library insert size using archaeal histone-like proteins |
Also Published As
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